JPH0232100A - トロンビン阻害作用を有するアンブリオミン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は抗凝血剤療法に用いるための新規゛ｂ：活性活
性物質アンプリフミンびＫその単離法に関する。抗凝血
剤は医薬にとって大変重要である。医薬上中心的な問題
と１−てあげられ得るものには例えば、血栓症の予防、
動脈再閉塞の予防、血栓症の治療、消費性凝固障害およ
び体外循環がある。抗凝血剤療法に現在慣用される薬剤
はしばＩ−ば望まｌ−からぬ欠点をいくつか有する。例
えば出血の危険、血小板の減少、ＣＮ３−”−。

の作用、不耐性または例えばヘノＲＩＪンの作用によ？
いて観察されるような間接的な作用である。

ＷａｌｓｍａｎｎおよびＭａｒｋｗａｒｄｔ　（Ｄｊ、
ｎ　Ｐｈａｒｍａ、ｚｉｓ　３６（１９８１）　６５３
）は薬用ヒル（Ｈｊ、ｒｕｄｏ　ｍｅｄｉｅｉｎａｌｉ
ｓ）カ［’）　得られたヒルジンの医薬上の重要性につ
いて記載して（・る。このものは６４〜６５個のアミノ
酸を有するポリペプチドである（ｃｈａｎ、　ＦＦＸＢ
５１６４　（１９８３）　３０７；米国特許第４，６６
８，６６２）このベプチｌ？は特異性の高いトロンビン
インヒビタ′−でありそれ以外は薬理学的に不活性であ
ると思われる。この化合物の欠点は七の半減期が比較的
短いことおよび非経口投与形にある。

何等前記した欠点のない、抗血栓活性を有する化合物が
望ましい。それゆえ前記した医学的問題点を最適に解決
するものである他の抗凝血剤を探すことも価値がある。

マダニ科（Ｉｘｏｄｉｄａ、ｎ）のマダニはすべての発
達段階で爬虫類、鳥類、哺乳類およびヒトの一時的な吸
血性外部寄生虫である。成虫雌ダニは通常数日間宿主に
１留Ｉ〜そして自分の体重の１００倍までの血液を吸う
。マダニはその目的のために対をなした挟角および下口
片からなるつき刺しおよび吸引する口部を有する。マダ
ニは挟角、足指の穿刺メカニズムを用いて表皮を切りつ
けて創傷をこしらえ、その中１（挟角それ自体および下
口片を挿入１〜、このようにして吸引回路を作る。マダ
；の大抵の種の唾液腺はセメントど呼ばれるタン・ぐり
質を産成し、これが集中に排出され、創傷の中に下口片
が固定され、か＜ｌ−てマダニが宿主に固定されて栄養
を摂取する。

さらにマダニは唾液腺から抗凝血剤を含有する分泌物を
排出する。

吸血のためには、マダニの口器が毛細管中に直接ではな
く組織中に侵入する。そこで唾液腺酵素により組織が溶
解され、そして非常に微細な毛細管を損傷し、そこから
出血する。唾液腺分泌物が抗凝血作用を有するゆえに損
傷１−だ血管からしばらくの間出血１２従って組織空胞
が生じ、そこからマダニが栄養を摂取する。

従って、抗凝血性質を有する物質を得たためにマダニの
唾液腺が研究された。

本発明はマを二から単離され、トロンビン不活化により
血液凝固を阻害するものであるタンパク質またはその製
剤ト受容されうる塩に関する。

このタンパク質およびヒルジンは同じ基質を攻撃するが
、これら２種のタン・ｑり質は驚くべきことと相互とは
っきりと相異する。このととはアンプリオミンと呼ばれ
る本発明によるタンパク質がヒルジンのそれとは異なる
医学的重要性を発１’ｌ　Ｌようにとを示唆し、ている
。アン！リオミンは新規なタンパク質である。このもの
は南アフリカボントキララマダニの唾液腺から単離され
た最初の活性物質である。

アンプリオミ／は下記の物理的性質を有する。

このものはクマシーブリリアントブルーＲ２５０（旧ｏ
−Ｒａ　ｄ　）に対するアフィニティが比較的低い。

このものを凍結乾燥すると、水には溶解し難い。

このタンノック質は用いられるすべての緩衝液中で安定
である。−８０℃でＨＰＬＣ精製後に溶出液を凍結乾燥
１〜でも何ら活性の低下は見出されなかった。その上こ
の化合物は４０℃で安定である。このものはｐ）（１，
８（酢酸またはトリクロロ酢酸）でアセトンを用いて沈
殿されうろ、との沈殿の溶液は少くとも１２日後ですら
も完全な活性を有することが観察される。ウォーターズ
（Ｖａｔθｒｒ＋）　６ｏｏマルチソルベント供給系お
よびＢｉｏｒａｄ　ＲＰ　Ｆｉ０４クロマトグラフィー
−カラムをＨＰＬＣ分析に使用しそして８０％八〜へ０
％Ｂ（Ａ−０゜１％ＴＦＡそしてＢ　＝　Ｆ（ＰＬＣ水
中の８０％アセト二ｌ−ＩＪル中０．１％ＴＦＡ　）の
グラ・ジエントを用いた場合４０分操作後Ｋ　５０％Ｂ
に到達し、アンプリオミンの保持時間は２７分であるこ
とが測定される。このタン７ξり質はＧ７５スーツぐ一
７フイン物質でのゲル濾過により分子量２０，０１：）
０〜３０．０００ダルトンであるとされた。ＳＤＳポリ
アクリルアミＰゲルでは分子量２６，０００ｄｔ±２Ｊ
）００ｄｔと測定されろ。等電点を測定すると約５．５
５±０．３である。終りに下記の部分的アミノ酸配列丁
１ｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−０１ｙ−Ａｓ
ｎ−Ｘ−Ｇ４ｙ４１ｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｘ−
Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｌｙｔ１３−　Ｉ　１ｅ−Ｌｅｕ−Ｐ
ｈｅ−Ｘ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−およびＡｌａ−３ｅｒ−Ｔ
ｙｒ−１１ｅ−Ｖａｌ−Ｘ−３ｅｒ−Ｇｌｕ−８ｅｒ　
ｌ１ｅ−Ｇｌｎ−１１ｓ−Ｌｅｕ−Ｘ−Ｌｅｕ−３ｅｒ
−０１ｕ−Ｇｌｙ−１１ｓ（ここで各Ｘは同一または相
異なることができそしてそれぞれ天然に存在するアミノ
酸例えばＴｙｒ　、　８ｅｒ　、　’ｒｈｒ　、　Ｇｌ
ｕ　、　Ａｓｐ　、　Ａｓｎまたは翻訳後に修飾された
任意のアミノ酸例えばトリメチルリ・クンまたはγ−カ
ルボキシグルタミン酸を表わす）を有することが確認さ
れた。

その顕著な生物学的性質はトロンビンを特異的に阻害す
ることである。それゆえ本発明（てよるタンパク質は抗
血栓剤とｌ−て医薬中に使用される。

実施例　１ ダニの唾液腺の単離 ダニの唾液腺は対をｈ＋−だ器官であり、そ（−て身体
の前半部の右側および左側に矢状縫合の方向に存在する
。機能状態の如何に応じ、唾液腺は絶食状態のものでは
小さく、栄養摂取中のダニでは極端に大きい。用いられ
たダニは南アフリカボントギララマダニであるアンブリ
オマ・ヘブラエウム（Ａｍｂｌｙｏｍｍａ　ｈｅｂｒａ
８ｕｍ）およびリビセファルス・エパーツイ（Ｒｈｉｐ
ｉｃｅｐｈａｌｕｓ　５ｖｅｒ−ｔ、ｓｉ）であり、こ
れら２種のコロニーは実験室で既知方法で数年間飼育し
たものである。

宿主動物から体重１５０〜４００■の一部摂食中の雌を
採り、そして直ちにダニを背面の両面接着テープで４ト
リ皿に固定しそしてｐＨ７，２のＰＢＳ緩衝液で覆うこ
とにより立体顕微鏡下に解剖した。ダニの外部構造に沿
って微細なメスで切開したのち−Ｆ部半分および下部半
分を開き、唾液腺を注意深くとり出して窒素中で急速冷
凍した。

実施例　２ ダニの腺からの活性物質の抽出 アンブリオマ・ヘブラエウム属のダニから唾液腺を単離
しそｌ−て次に窒素の下粉砕して微細な粉末とする。こ
のホモシネ−・トな水に溶解させ、凍結乾燥する。乾燥
残留物を４０％アセトン中４０℃で３０分間はげｌ−１
＜振盪するゆ次にこの混合物を１５ＤＯＯｆで１０分間
遠心する。沈降物を前記のように再び抽出し、上清を第
１回の抽出液と合し、そして−１が５とｔ［る寸で１Ｍ
酢酸をゆっくりと加える。生成する沈殿を遠心により除
去し、そして透明な上清をサイフオンで吸い上げる。上
清にアセトン中の１０％トリクロロ酢酸をｐＨ１８１と
なるまで添加する。次に１０倍量の水冷アセトンを加え
、そして−２０℃で五５時間沈殿させる。この沈殿をソ
ーパル（ｓｏｒｖａｌｌ）冷却遠心器中６００　Ｏｒｐ
ｍで１０分間遠心することにより分離する。この沈殿物
を水冷アセトンおよびエーテルで洗い、そして水中に再
懸濁する。この懸濁液を一８０℃で冷凍し次に真空ロー
タリー蒸発器で凍結乾燥する。この乾燥された残留物を
緩衝液（１０５Ｍトリエタノールアミン・ＨＣｔ、　０
．４Ｍ　Ｎａ、Ｃ１％ｆ７．８　）中ととる。

実施例　６ ゲルい過 実施例２で調製されたタンパク質混合物をゲルＦ　ｊＭ
　Ｋ　ｊり精製する。この目的には、直径１．６副、高
さ７８．３ｍのカラムにＰｈａｒｍａｅｉａ社製Ｇ７５
スーパーファイン物質を充填する。流速毎時１゜ｄであ
る。カラムはＰｈａｒｍａｃｉａ社のゲルｐ過検量キッ
ト（カタログ朧１７−０４４２−０１’）を用い【目盛
定めされている。トロンビン阻害活性は分子量２０．０
００−３０．ＤＯＯｄｔが割当てられうるフラクション
で見出された。

実施例　４ 血漿凝固の阻害 Ｇ７５フラクションそれぞれの５０μｇずつをＨ２Ｏ５
０μｌおよびクエン酸塩処理された犬の血漿（トロンビ
ン５　Ｕ／だｔ含有）１００μｅと混合１−そしてトロ
ンビン時間を測定する。操作はｈ／ａｒｋｗａｒｄｔ他
の記載（Ｐｈａｒｍａｚｉｅ　４３　（１９８８）　２
０２　；Ｆｏｌ、　Ｈａｅｍａｔｏｌ、　１１５　（１
９８８）　７　Ｄ　）による。

実施例　５ クロモザイムＴＨのトロンビンにより触媒された開裂の
阻害 Ｇｒｉｅｓｂａ−ａｈ他の記載（Ｔｈｒｏｍｂ、　Ｒｅ
ｓ、　３７（１９８５）、５４７−ｓｏ）と同様にして
測定を行う。この方法を反応がマイクロタイターウェル
中で行われ、最Ｐ要量が０２−であるように改良する。

　Ｅ１１Ｓａ読み取り装置を用いて４０５　ｎｍで評価
する。

実施例　６ トロンビンアフイニテイカラムクロマトグラフイーによ
る精製 Ｗａｌｓｍａｎｎ　、　Ｐ、の方法（Ｐｈａｒｍａｚｉ
ｅ　３Ｒ５（１９Ｂ１）Ｂ２Ｏ−８６１）Ｋ、Ｊ二りト
ロンヒ゛ンーセファロ・−スを調製する。活性を示す０
７５フラクシヨンを合して凍結乾燥し、そして凍結乾燥
物を０．１Ｍ酢酸中にとる。冷却された０２５カラムで
検体から脱塩し６実施例５におけるようにして活性の有
無に関し溶出液をアッセイする。活性フラクションを合
して凍結乾燥する。乾燥残留物を０．０５Ｍ１・リス−
ＨＣｔ（ｐＨ８）中にとり、調製ずみのトロンビンカラ
ムと負荷する。全ての工程を４℃で実施する。このカラ
ムを０．０５Ｍ）リス緩衝液（ｐｉ（８）で２回洗い次
に［３，０５Ｍ　トリス−Ｈｃｔ（−Ｂ）中の５Ｍベン
ズアミジニウムクロライｒを用いて溶離する。フラクシ
ョンを採集し、一部分を採り、合しセしてＨ２Ｏで透析
し次いでトロンビン阻害についてアッセイする。最も活
性の高いフラクションを透析しそして凍結乾燥する。凍
結乾燥物を８ＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に続
いてＢｉｂ−Ｒａｄ製染色キットを用いる銀染色法とよ
り分析する。タンパク質パンｌ？はＭＷ約２５００ｒ）
ｄｔにおいて見出さね、予め−でグーの検体を負荷しな
かったカラムを溶ｍ　ｔ、−（モ夕７　／”り質パンｒ
は観察されなかった。

実施例　７ ダニの生育 リヒセファルス・エパーツイ種の３宿主マイ二をＴｈ、
　Ｈｌｅｐｅ　（ＬｅｈｒｂｕＣｈ　ｄｅｒ　Ｐａｒａ
ｓｊ、ｔｏｌｏｇｉｅ（Ｐａｒａｓｉ　ｔｏｌ、ｎｇｙ
　Ｔｓｘｔ、ｂｏｏｋ）第４巻、　ＧｕｓｔａｖＦｉ８
ｅｈｅｒ　Ｖｅｒｌａｇ　Ｓｔ、ｕｔｔｇａｒｔ、　１
９Ｂ２．第４６以下）に記載されるように１〜て生育さ
せる。これには約６〜４か月を要する。雌のダニを２８
℃および９０％を越える湿度で保持ｌ−て産卵させろ。

幼虫に　化したのちこれをウサギに置いて第１回Ｈの血
液摂食させる。食事蕾若鬼への脱皮が絶食下に行われる
。この若虫をウサギに置いて第２回ｒ］の血液摂食させ
る。飽食した若虫はそこで成虫の雄と雌に分化する段階
に入る。分化完了後の成虫を用いる。

実施例　８ 成虫マダニからのアンプリオミンの単離成虫マダニヲＪ
ａｎｋｅお↓びに、ｕｎｋｅｌのウルトラ・ツラツクス
（Ｕｌ　ｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘ：）装置中でＨ２Ｏ中で
ホモジナイズする。このマダニホモジネートを４０℃で
４０分間インキュベートし次に１３ｏｒｖａ］−１遠心
話中１０ＤＯＯｒｐｍおよび５℃で３０分間遠心する。

沈降物をＨ２Ｏ中に再懸濁させそして再び４０℃で５０
分間インキュベートし、次に遠心する。

２回の遠心工程からの上清を合してブルーリボンフィル
ターで濾過する。透明な上清を凍結乾燥し、残留物を２
０　ｍＭ　）リス−ＨＣｔ（４７，５）中にとりモして
Ｑ−セファロース高速流クロマトグラフィー（２０＋ｎ
Ｍ　）リス−Ｈｃｚ　（ｐＨ７，５）中Ｏ〜１　Ｍ　Ｎ
ａＣ１のグラジェント）Ｋより精製する。

アンプリオミンを含有するフラクションを実施例５に記
載されるように１〜て確認し、凍結乾燥しそして実施例
乙におけるようＫして０７５スー・ゼーファインカラム
に負荷する。抗血栓作用を有するフラクションは分子量
２０〜５０．０００ｄｔの範囲で溶離する。これらを合
し、Ｂｉｎ−Ｒａｄ　’ＲＰ３０４カラムでの逆相ＨＰ
ＬＣにより精製する。用いられる装置はＷａｔｅｒｓ　
６００マルチソルベント供給系である。下記グラジェン
トをつけて操作する、すなわち当初８０％八〜２０％Ｂ
　（Ａ＝Ｏ５１％ＴＦＡセしてＢ＝８０％アセトニトリ
ル中の［１１％ＴＦＡ　）から６０分の操作時間中に１
００％Ｂまで。

抗血栓活性を有するフラクションを合し、凍結乾燥しそ
して再び逆相ＨＰＬＣにより精製する。下記グラジェン
トが適用される、すなわち当初８０％Ａ〜２０％Ｂ（Ａ
＝０．１％ＴＦＡ、　、　Ｂ＝８０％アセトニトリル中
の０．１％ＴＦＡ　）。操作時間４０分で５０％Ｂに達
する。これらφ件下でアンプリオミンフラクションの保
持時間は２７分で多）る。

実施例　９ アンプリオミンの分子量測定 保持時間２７分のＨＰＬＣフラクションを１７．５％Ｓ
ＤＳポリアクリルアミｒゲルで分析する。Ｐｂ、ａｒ−
ｍａｅｉａ社の電気泳動検量キット（カタログ潟１７−
０４４５−０１　）を分子量マーカーと１〜て用いる。

この系においてアンプリオミンは分子！３０．０００ａ
ｔ。

を有すると記載されるカルボニックアンヒドラーゼの少
し下せで移動する。アンプリオミンの分子量は２６．０
００＋２，０ＯＯｄｔである。

実施例　１０ 等電点の測定 実施例８におけるよ５ＫＮ、て単離されたアンプリオミ
ンをＬＫＢ　Ｉｎｑｔｒｕｍｅｎｔｓ社のＤｒ、　５ｅ
ｈｕｌｔｅ他により示唆される」、うに１．２て超薄層
７オーカスにかける。等電点は５，３５±０．５で力）
る。

実施例　１１ アンプリオミンタンパク質配列の分析 成虫マダニから単離された真正タンパク質のＮ−末端は
配列決定できなかった。それゆえ得られる物質をトリデ
シン開裂にかけた。定量的にトリプシンにより開裂させ
ろために初めにタンパク質をカルボキシメチル化反応に
より誘導体形成させる。この目的にはそのものを緩衝液
（９Ｍグアニ・クニウムＨＣ４，１０ｍＭ　トリス、１
ｍＭ　ＥＤＴＡ　）　２４μｌ中に溶解させ、そして緩
衝液４μｌ中のＤＴＥ５１μ？および５ｔｔｌ！中の２
−メルカプトエタノール４．５２μ２を加える。この反
応混合物を６７℃で１時間インキュベートし次にヨー−
アセトアミド俗液（０，２５Ｍヨーヨー上トアミ）’、
　ＫＯＩ（ｆｐＨ８，Ｏニｉｄ整）８．３．Ｊｌ！を加
え、コノ混合物を室温で１時間インキュペ・−卜する。

次にＨ２Ｏ５９μＩを加えて希釈しそして、Ｃ２Ｈ５０
Ｈ４００μｇを添加してはげしく振盪したのち、沈殿さ
せそして１２．００　Ｏｒｐｍで遠心分離する。次に沈
降物をＣＨＣｌ、！ｌ１ｏＯμｌと振盪し、そｌ−てＨ
２Ｏ３００μｌを加えて再び遠心分離する。上部層をＣ
２Ｈ５０１１３００μｌと混合する。この混合物を遠心
し、そしてトリプシンにより開裂さぜるために沈降物を
１２Ｍｎ−メチルモルホリン（酢酸でｐＨ８，５に調整
）６６μｌ中に溶解させる。次にトリプシン溶液（Ｎ−
メチルモルホリン緩衝液中トリプシン５．３μｉ）の５
μｌを加え、この混合物を室温で２時間インキュベート
する。このフラグメント混合物をここでミクロボア（ｍ
ｉｃｒｏ−ｂｏｒｅ）逆相１（ＰＴｆ工程により分離す
る（ミクロボアカラム＝１−×２５備、Ｂｒａｕｎ−Ｌ
ｅｓ社製）。この目的洗は、１０％Ａ〜６０％Ｂ　（Ａ
　＝　Ｈｐｒ−ｃ水中の１０％アセトニトリル＋〇、１
％ＴＦＡ　；　Ｂ　＝アセトニトリル中の１０％Ｈ２０
＋　０．１％ＴＦＡ　）の直線状グラ・ジエントが適用
される。３種のピークフラクションが容易に単離されう
る。これらをガス相シークエンサー中のがラス繊維フィ
ルター上でそれぞれ乾燥さぜそ１−て配列分析にかけろ
。この目的に使用されるのはオンラインＰＴＨ同定シス
テムを備えたＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社
の４７ＯＡガス相タンノぞり質シークエンザーである。

下記アミノ酸部分配列が確認された。又は天然に存在す
るアミノ酸により占められる部位を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）マダニから単離されたものであり、トロンビン阻害
   作用を有するタンパク質またはその製剤上受容されうる
   塩。 ２）前記タンパク質が分子量２０，０００〜３０，００
   ０ダルトン、等電点５．０５〜５．６５および下記アミ
   ノ酸部分配列 【遺伝子配列があります】、 【遺伝子配列があります】および 【遺伝子配列があります】 （ここで各Ｘは同一または相異なることができそしてそ
   れぞれ天然に存在するアミノ酸を表わす）を有すること
   からなる請求項１記載のタンパク質またはその製剤上受
   容されうる塩。 ３）前記タンパク質が分子量２６，０００〜２，０００
   ダルトンを有することからなる請求項１または２記載の
   タンパク質またはその製剤上受容されうる塩。 ４）前記タンパク質が等電点５．３５を有することから
   なる請求項１〜３のいずれかに記載のタンパク質または
   その製剤上受容されうる塩。 ５）前記タンパク質がアミノ酸部分配列 【遺伝子配列があります】、 【遺伝子配列があります】および 【遺伝子配列があります】 （ここで各Ｘは同一または相異なることができそしてそ
   れぞれＴｙｒ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ａｓ
   ｎまたは翻訳後に修飾された任意のアミノ酸例えばトリ
   メチルリジンまたはカルボキシグルタミン酸を表わす）
   を有することからなる請求項１〜４のいずれかに記載の
   タンパク質またはその製剤上受容されうる塩。 ６）前記タンパク質がリピセフアルス・エバーツイから
   単離されたものであることからなる請求項１〜５のいず
   れかに記載のタンパク質またはその製剤上受容されうる
   塩。 ７）前記タンパク質がアンブリオマ・ヘブラエウムから
   単離されたものであることからなる請求項１〜３のいず
   れかに記載のタンパク質またはその製剤上受容されうる
   塩。 ８）抽出法およびクロマトグラフイー法を組み合わせて
   単離を行い、必要な場合はタンパク質の酵素による分解
   ならびに必要な場合は生成したタンパク質のその生理学
   的に受容されうる塩への変換をも包含することからなる
   請求項１〜７のいずれかに記載の精製されたタンパク質
   の単離法。 ９）請求項１〜７のいずれかに記載のタンパク質の医薬
   としての使用。 １０）請求項１〜７のいずれかに記載のタンパク質の抗
   血栓剤としての使用。