KR0138531B1 - 항응고요법을 위한 활성물질인 암블리옴민 - Google Patents

항응고요법을 위한 활성물질인 암블리옴민

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Abstract

내용없음.

Description

항응고요법을 위한 활성물질인 암블리옴민
본 발명은 항응고요법을 위한 신규한 활성물질인 암브리옴민(amblyommin), 및 이의 분리방법에 관한 것이다. 항응고제는 의학분야에서 매우 중요하다. 의학에 있어서 중요한 문제들의 예로서, 혈전증의 예방, 동맥 폐색증의 예방, 혈전증, 소모성 응혈이상증 및 체외순환의 치료문제를 언급할 수 있다. 현재, 통상적인 항응고치료제들은 예를 들면 헤파린 작용계로 관측되는 바와 같은 일부 바람직하지 않은 단점, 예를 들면, 출혈의 위험, 혈소판 감소, CNS에 대한 작용, 불내성(intolerance) 또는 간접적 영향을 종종 나타낸다. 문헌[참조 : Walsmann and Markwardt, Die Pharmazie vol. 36(1981) page 653]에는 하루도 메디시날리스(Hirudo medicinalis)로부터 수득되는 히루딘의 약제학적 중요성이 기술되어 있다. 히루딘은 64 내지 65개 아미노산을 지닌 폴리펩타이드[참조 : Chan, FEEBS vol. 164(1983) page 307 ; 미합중국 특허 제4,668,662호]이다. 이 펩타이드는 고도의 특이적 트롬빈 억제제로서, 이 특이성이 없으면 약리학적으로 불활성인 것으로 나타난다. 이 화합물의 단점은 화합물의 반감기가 비교적 짧고 비경구적 투여형태라는 점이다.
더우기, 항트롬빈 활성을 갖고 있으며 상기의 단점이 없는 화합물이 바람직하다. 그러므로, 상기의 의학적 문제를 적절히 취급하는 또다른 항응고제를 탐색할 필요가 있다.
참진드기과의 하드 참진드기(hard tick)는 모든 발육 단계에서, 파충류, 조류, 포유동물 및 사람의 일시적인 흡혈 외부기생체이다. 성체 암컷 참진드기는 보통 수일간 숙주에 남아서 자신 체중의 100배까지 혈액을 흡인한다. 이를 위해, 참진드기는 관통 및 흡인을 위한, 쌍으로 정렬된 협각(chelicer)과 하구(hypostome)로 이루어진 주둥이 부분을 갖고 있다. 참진드기는 협각과 사지의 절단 메카니즘을 사용하여 표피중에 상처를 내어, 여에 협각과 하구를 삽입하여 흡인로를 형성시킨다. 대부분의 참진드기종의 타액선(salivary gland)은 상처에 방출되는 백악질이라 하는 단백질을 생산하고 이 상처에 하구의 치아를 고정시킨후, 영양분을 흡입하기 위해 숙주에 참진드기를 고정화시킨다.
또한, 추가로 참진드기는 이의 타액선으로부터 항응고제를 함유하는 분비물을 방출한다.
흡협을 위해, 참진드기의 주둥이 부분은 직접 모세혈관을 침투하지 않고 조직을 침투한다. 이들은 타액선 효소를 사용하여 조직을 분해시켜 미세한 모세혈관에 손상을 주어 이로부터 혈액이 방출되도록 한다. 타액선 분비물의 항응고 효과로 인해, 손상된 혈관은 잠시 출혈을 한 후, 조직 액포를 생산하고, 이로부터 참진드기는 그들의 영양분을 유도해 낸다.
즉, 참진드기의 타액선이 항응고 특성을 갖는 물질을 얻는 것으로 연구되었다.
본 발명은 하드 참진드기로부터 분리되며, 트롬빈 불활성화를 통해 혈액의 응고를 억제하는 단백질 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염에 관한 것이다.
비록, 이 단백질과 히루딘이 동일한 기질을 공격하지만 이 두개의 단백은 서로 놀라울 정도로 상이하다. 즉, 이는 본 발명에 따르는 단백질(암블리옴민)은 하루딘과 다르게 의학적으로 중요하다는 것을 나타낸다. 암블리옴민은 신규 단백질이다. 이것은 남아프리카의 본트(bont) 참진드기의 타액선으로부터 분리되는 주요 활성물질이다.
암브리옴민은 하기의 물리적 성질을 갖고 있다: 이는 Coomassie Brilliant Blue R250 Bio-Rad에 대한 친화도가 비교적 낮다. 동결건조시킨후 단지 물에만 약간 녹는다. 이 단백질은 사용된 모든 완충제에 안정하다. HPLC 정제후의 용출액을 -80℃에서 동결시킨후 활성은 감소하지 않는다. 이 화합물은 40℃에서 더욱 안정하다. 또한 pH1.8에서 아세톤(아세트산 또는 트리클로로아세트산)으로 침전시킬 수 있다. 이 침전물의 용액은 최소한 12일후에도 완전히 활성을 지니는 것으로 관측되었다. HPLC 분석을 위해 Waters 600다용매(multisolvent) 전달 시스템과 Biorad RP 304 크로마토그래피 컬럼을 사용하여, 80％ A 내지 20％ B의 구배(A는 0.1％ TFA이고 B는 HPLC 물중 80％ 아세토니트릴중의 0.1％ TFA이다)를 적용하는 경우, 작동 40분후 50％ B에 도달한다. 암블리옴민에 대해 측정된 체류시간은 27분이다. G75 초미세 물질 상에서 겔 여과에 의하면 이 단백질의 분자량은 20,000 내지 30,000달톤이다. SDS 폴리아크릴아미드 겔중에서 측정한 경우, 분자량은 26,000±2000 달톤이다. 등전점은 약 5.35±0.이다. 마지막으로, 다음과 같은 부분적인 아미노산 서열이 확인되었다.
-I1e-Leu-Phe-Thr-Gle-Gly-Asn-X-Gly-Gln-Leu-Glu-Asn-X-Phe-Glu-Lys-I1e-Leu-Phe-X-Gln-Gly- 및 -Ala-Ser-Tyr-I1e-Val-X-Ser-Glu-Ser-I1e-Gln-I1e-Leu-X-Leu-Ser-Glu-Gly-I1e-
상기 서열에서, 라디칼 X는 각각 동일하거나 상이할 수 있고, 각각은, 예를 들면, Tyr, Ser, Thr, Glu, Asp, Asn 또는 해독후 변형된 아미노산(예 : 트리메틸라이신 또는 γ-카복시글루탐산)과 같은 천연 아미노산이다.
특이한 생물학적 특성은 트롬빈의 특이적 억제 성질이다. 따라서, 본 발명에 따르는 단백질은 의학분야에서 항트롬빈제로서 사용된다.
[실시예 1]
[참진드기 타액선의 분리]
참진드기의 타액선은 쌍으로된 기관이며 신체의 전신반구의 우측 및 좌측에 화살 방향으로 위치한다. 기능상태에 따라, 타액선은 절식한 종에서는 작거나, 섭식시킨 참진드기류에서는 매우 크다. 사용된 참진드기는 남아프리카의 본트 참진드기류의 일종인 암블리옴마 헤브레움(Amblyomma hebraeum) 및 리피세팔루스 에버트시(Rhipicephalus evertsi)로서, 이 두집단은 실험실에서 공지방법에 따라 몇년간 사육되었다.
부분적으로 섭식된 체중 150 내지 400mg 범위의 암컷 참진드기를 숙주 동물로부터 취한 후, 즉시 페트리 디쉬에서 양면 접착 테이프로 참진드기의 등을 고정하여 입체현미경하에서 절개한 다음 PBS 완충액(Ph 7.2)으로 덮는다. 참진드기의 주변을 따라 날카로운 외고용 메스로 절개한 후, 상체 및 하체를 개열시키고, 조심스럽게 타액선을 꺼내어 질소중에 급속 동결시킨다.
[실시예 2]
[참진드기 타액선으로부터 활성물질의 추출]
암클리옴마 헤브레움 속의 참진드기로부터 타액선을 분리한후, 질소하에서 미세한 분말로 분쇄시킨다. 이 균질물을 물에 용해시킨후, 동결건조시킨다. 건조된 잔류물을 40℃의 40％ 아세톤에서 30분간 강렬히 진탕시킨다. 혼합물을 150000g에서 10분간 원심분리한다. 침전물을 상기한 바와 같이 다시 추출하고, 상등액을 첫번째 추출물과 혼합한 후, 1M 아세트산을 서서히 가하여, pH가 1.81이 될때까지 아세톤중의 10％ 트리클로로 아세트산을 사응액에 가한다. 10배 용적의 빙냉시킨 아세톤을 가한후, -20℃에서 3.5시간동안 침전시킨다. 소발(Sorvall) 냉각 원심분리기중 6000rpm에서 10분간 원심분리하여 침전물을 제거한다. 침전물을 빙냉시킨 아세톤 및 에테르로 세척한후 물에 재현탁시킨다. 현탁액을 -80℃에서 동결시킨후, 진공 회전 증발기상에서 동결건조시킨다. 건조된 잔류물을 완충액(0.05M 트리에탄올아민, HC1, 0.4M NaC1, pH7.8)에 용해시킨다.
[실시예 3]
[겔 여과]
실시예 2에서 제조한 단백질 혼합물을 겔여과하여 정제시킨다. 이를 위해 직경 1.6cm, 높이 78.3cm의 컬럼을 G75 초미세물질(제조원 : Pharmacia)로 충전시킨다. 유동속도는 10ml/시간이다. 컬럼은 겔 여과 평형키트(calbration kit)(Pharmacia, Cat. No. 17-0442-01)를 사용하여 보정시켰다. 20,000 내지 30,000달톤의 분자량으로 지정된 분획물에서 트롬빈 억제활성이 발견되었다.
[실시예 4]
[혈장의 응고억제]
각각의 G75 분획물 50μ1 H2O 50㎕ 및 ml당 트롬빈 3U를 함유한 시트레이트-처리된 개의 혈장 100μ1와 혼합한후, 트롬빈을 측정한다. 방법은 문헌[참조 : Markwardt et al., Pharmazie 43(1988) 202; Fol. Haematol. 115(1988) 70]에 따라 수행한다.
[실시예 5]
[크로모자임 TH의 트롬빈-촉매에 의한 절단의 억제]
문헌[참조 : Griesbach et al., Thromb. Res. 37(1985), 347-50]의 방법에 따라 측정을 수행한다. 이 방법은 반응을 최종 용량이 0.2ml인 미세역가 플레이트 웰에서 수행하는 변형된 방법이다. 측정된 Elisa 판독 장치를 사용하여 405nm에서 수행한다.
[실시예 6]
[트롬빈 친화 컬럼 크로마토그래피에 의한 정제]
문헌[참조 : Walsmann, P., Pharmazie 36(1981), 860-861]의 방법에 따라 트롬빈-세파로스를 제조한다. 활성을 나타내는 G75 분획물을 혼합하고 동결건조시킨후, 동결건조물을 0.1M 아세트산에 용해시킨다. 냉각된 G25 컬럼상에서 샘플로부터 염을 제거한후, 실시예 6에서와 같이 용출액의 활성을 분석한다. 활성 분획물을 혼합한후 동결건조시킨다. 건조된 잔유물을 0.05M 트리스-HC1(pH 8)에 용해시킨 후, 준비된 트롬빈 컬럼상에 로오딩한다. 모든 단계는 4℃에서 수행한다. 컬럼을 0.05M 트리스 완충용액(pH 8)으로 2회 세척한후, 0.05M 트리스-HC1(pH 8)중의 5M 벤즈아미디늄 클로라이드로 용출시킨다. 분획물들을 수집한후, 일정량들을 취하여 혼합하고 H2O에 대해 투석시킨 다음 트롬빈 억제에 대해 분석한다 가장 높은 활성을 나타내는 분획물들을 투석한후, 동결건조시킨다. 동결건조물을 SDS 폴리아크릴라이드 겔 전기영동하여 분석한후, Bio-Rad의 염색 키트를 사용하여 은 염색시킨다. 분자량 약 25,000달톤 범위의 단백질 밴드가 발견되었으나, 참진드기 샘플을 앞서 로오딩하지 않은 컬럼의 용출물에서는 관찰되지 않았다.
[실시예 7]
[참진드기의 성장]
리피세팔루스 에버트시 종의 3개 숙주의 참진드기를 문헌[참조 : Th. Hiepe(Lehrbuch der Parasitologie)(Parasitology Texbook) vol. 4, Gustav Fischer Verlag Stuttagart 1982, pages 46et seq.]에 기술된 바와 같이 성장시킨다. 약 3 내지 4개월간 성장시킨다. 암컷 참진드기는 산란을 위해 28℃의 온도 및 90％ 이상의 습도하에 보관한다. 유충이 부화된후, 첫번째 흡혈(blood meal)을 위해 이것을 래비트에 놓는다. 흡혈후, 애벌레로 탈피하면 절식시킨다. 이것을 다시 두번째 흡혈을 위해 래비트에 놓는다. 실컷 포식한 애벌레는 성장한 숫컷 및 암컷으로 되는 분화단계로 진입한다. 분화가 완결된후 성체 동물을 사용한다.
[실시예 8]
[성체 참진드기로부터 암브릴옴민의 분리]
성체 참진드기를 장치[Ultra-Turrax 장치, Janke and Kunkel로부터 구입]중 물중에서 균질화시킨다. 참진드기 균질물을 40℃에서 40분간 배양한후, 5℃ 및 10000rpm의 소발 원심분리기 내에서 30분간 원심분리한다. 침전물을 물에 재현탁시키고 다시 40℃에서 30분간 배양한후 원심분리한다. 2회의 원심분리 단계로부터 생성된 상등액을 혼합하여 블루 리본(blue ribbon) 여과기를 통해 여과한다. 투명한 상등액을 동결건조시킨후, 잔유물을 20mM 트리스. HC1(pH7.5)에 용해시키고 Q-세파로스 급속 유동 크로마토그래피로 정제한다(20mM 트리스-HC1(pH7.5)중 0 내지 1M NaC1 구배). 암블리옴민-함유 분획물을 실시예 5에서와 같이 확인한후, 동결건조시키고, 실시예 3에서와 같이 G75 초미세컬럼상으로 로오딩한다. 항트롬빈 활성을 지닌 분획물들을 분자량 20 내지 30000달톤의 범위로 용출시킨다. 이들을 혼합한후, Bio-Rad RP 304 컬럼상의 역상 HPLC를 통해 정제한다. 사용된 장치는 Waters 600 다용매 전달 시스템이다. 다음과 같은 구배로 수행한다:
80％ A-20％ B(A는 0.1％ TFA이고 B는 80％ 아세토니트릴중의 0.1％ TFA이다)에서 출발하여 작동시간 60분만에 100％B에 도달된다. 항트롬빈 활성을 지닌 분획물을 혼합하고 동결건조시킨후, 다시 역상 HPLC를 통해 정제한다. 하기의 구배가 적용된다:
80％ A : 20％ B(A는 0.1％ TFA, B는 80％ 아세토니트릴중의 0.1％ TFA)에서 출발한다. 작동시간 40분후 50％ B에 도달된다. 이 조건하에서 암블리옴민을 위한 체류시간은 27분이다.
[실시예 9]
[암블리옴민의 분자량 측정]
체류시간 27분때의 HPLC 분획물을 17.5％ SDS 폴리아크릴 아미드겔상에서 분석한다. 분자량 마커(marker)로서 전기영동 보정 키트(Pharmacia, Cat. No. 17-0446-01)를 사용한다. 이 시스템에서 암블리옴민은 분자량이 30,000달톤인 것으로 공지된 탄산 탈수효소 아래에서 단거리 이동한다. 암블리옴민의 분자량은 26,000±2,000달톤으로 밝혀졌다.
[실시예 10]
[등전점의 측정]
실시예 8에서와 같이 분리된 암블리옴민을 LKB Instruments GmbH의 슐트(Schulte) 박사등에 의해 제시된 울트라 박층 포커싱(Ultrathin-layer-focusing)시킨다. 등전점은 5.35±0.3을 밝혀졌다.
[실시예 11]
[암블리옴민 단백질의 서열 분석]
본 발명자들은 성체 참진드기로부터 분리가 순수한 단백질의 N-말단 아미노산의 서열을 측정할 수 없었다. 그러므로, 분석물질을 트립신 분해시킨다. 정량적인 트립신 분해를 위해, 우선 카복시메틸화 반응을 통해 단백질을 유도체화시킨다. 이를 위해, 단백질을 완충용액(8M 구아니디늄 HCl, 10mM 트리스, 1mM EDTA) 24μ1에 용해시킨후, 완충용액 4μ1중 DTE 51μg 및 완충용액 5μ1중 2-머캅토에탄올 4.52μg을 가한다. 반응 혼합물을 37℃에서 1시간동안 배양한후, 요오도 아세트아미드 용액(0.25M 요오도아세트아미드, KOH를 사용하여 pH를 8.0으로 조정) 8.3μ1를 가하고, 혼합물을 실온에서 1시간 동안 배양한다. 물 59μ1를 가하여 희석시키고 에탄올 400μ1를 가한후, 강렬히 진탕시킨 다음 12,000rpm에서 침전 및 원심분리를 수행한다. 침전물을 CHCl3100μ1와 함께 진탕시킨후, 물 300μ1를 가하고 반복해서 원심분리한다. 상부층을 에탄올 300μ1와 혼합시킨다. 혼합물을 원심분리시키고, 트립신 분해시키기 위해 침전물을 0.2M n-메틸모폴린(아세트산으로 pH8.5로 조정) 66μ1에 용해시킨다. 트립신 용액(N-메틸모플린 완충용액중 트립신 3.3㎍) 5μ1를 가한후, 혼합물을 실온에서 2시간 동안 배양한다. 단편 혼합물을 마이크로-보어(microbore) 역상 HPLC 단계에서 분리한다(마이크로-보어 컬럼 : 1mm×25cm Braun-Lee사 제조). 이를 위해, 10％ A-60％ B의 선형구배를 적용시킨다(A는 HPLC 물중 10％ 아세토니트릴＋0.1％ TFA : B는 아세토니트릴중 0％ H2O＋0.1％ TFA). 3개의 피크 분획물들을 쉽게 분리할 수 있다. 이 분획물을 각각 기체상 시컨서(sequencer) 중의 유리 섬유 여과기상에서 건조시킨후, 서열분석을 한다. 이를 위해, 온라인 PTH 확인 시스템을 갖춘 470A 기체상 단백질 시컨서(Applied Biosystem사)를 사용한다.
하기의 부분적인 아미노산 서열(a),(b) 및 (c)가 확인되었으며, 여기서 X는 천연 아미노산을 나타낸다.
a) Ile-Leu-Phe-Thr-Gln-Gly-Asn-X-Gly-Gln-Leu-Glu-Asn-X-Phe-Glu,
b) Lye-Ile-Leu-Phe-X-Gln-Gly
c) Ala-Ser-Tyr-Ile-Val-X-Ser-Glu-Ser-Ile-Gln-Ile-Leu-X-Leeu-Ser-Glu-Gly-Ile.

Claims (8)

  1. 하드(hard) 참진드기로부터 분리되며, 분자량이 20,000 내지 330,000달톤이고, 등전점이 5.05 내지 5.65이며, 부분적인 아미노산 서열이 하기와 같은 단백질 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
    -Ile-Leu-Phe-Thr-Gln-Gly-Asn-X-Gly-Gln-Leu-Glu-Asn-X-Phe-Glu--Lys-Ile-Leu-Phe-X-Gln-Gly- 및 -Ala-Ser-Tyr-Ile-Val-X-Ser-Glu-Ser-Ile-Gle-Ile-Leu-X-Leeu-Ser-Glu-Gly-Ile-
    상기 서열에서, 라디칼 X는 각각 동일하거나 상이할 수 있고, 각각 천연 아미노산을 나타낸다.
  2. 제1항에 있어서, 분자량이 26,000±2,000달톤인 단백질 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 등전점이 5.35인 단백질 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 부분적인 아미노산 서열이 하기와 같은 단백질 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
    -Ile-Leu-Phe-Thr-Gln-Gly-Asn-X-Gly-Gln-Leu-Glu-Asn-X-Phe-Glu-,-Lys-Ile-Leu-Phe-X-Gln-Gly- 및 -Ala-Ser-Tyr-Ile-Val-X-Ser-Glu-Ser-Ile-Gln-Iln-Leu-X-Leeu-Ser-Glu-Gly-Ile-
    상기 서열에서, 라디칼 X는 각각 동일하거나 상이할 수 있고, 각각 Tyr, Ser, Thr, Gln, Asp, Asn, 또는 트리메틸라이신 또는 카복시글루탐산을 포함하는 해독후 변형된 아미노산을 나타낸다.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 리피세팔루스 에버트시(Rhipicephalus evertsi)로부터 분리된 단백질 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 암블리옴마 헤브레움(Amblyomma hebraeum)으로부터 분리된 단백질 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  7. 추출방법 및 크로마토그래피 방법을 혼합사용하는 방법에 따라 분리공정을 수행하며, 경우에 따라, 단백질을 효소적으로 분해시키고, 또한 경우에 따라, 생성된 단백질을 이의 생리학적으로 허용되는 염으로 전환시킴을 특징으로 하여, 제1항에서 청구항 정제된 단백질을 분리하는 방법.
  8. 제1항에서 청구항 단백질 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염을 포함하는 항트롬빈제로서 유용한 약제학적 조성물.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5385885A (en) * 1988-01-15 1995-01-31 Gasic; Gregory P. Inhibition of smooth muscle cell proliferation by antistasin and tick anticoagulant peptide
DE3931839A1 (de) * 1989-09-23 1991-04-04 Basf Ag Neue proteine und ihre herstellung
DE4136513A1 (de) * 1991-11-06 1993-05-13 Basf Ag Neues thrombininhibitorisches protein aus raubwanzen
US5321010A (en) * 1991-12-10 1994-06-14 Merck & Co., Inc. Proteins for inhibiting adhesion of platelets to collagen
CA2150909A1 (en) * 1992-12-04 1994-06-23 Christiane Noeske-Jungblut Clotting inhibitor made from protostomia saliva
GB2304048A (en) * 1995-08-12 1997-03-12 John William Carson Medicament containing saliva extract
US20050033022A1 (en) * 1997-09-26 2005-02-10 Smithkline Beecham Biologicals Sa Fusion proteins comprising HIV-1 Tat and/or Nef proteins
BRPI0406057B1 (pt) * 2004-09-15 2021-10-26 União Química Farmacêutica Nacional S/A Sequência nucleotídica de um inibidor de proteases do tipo kunitz obtida a partir de uma biblioteca de cdna de glândulas salivarares de carrapatos amblyomma cajennese uso da proteína recombinante
KR102429287B1 (ko) 2015-12-10 2022-08-05 가부시끼가이샤 메니콘 펩티드 조성물

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3438296A1 (de) * 1984-04-18 1985-11-07 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt Neue polypeptide mit blutgerinnungshemmender wirkung, verfahren zu deren herstellung bzw. gewinnung, deren verwendung und diese enthaltende mittel
NO170430C (no) * 1986-09-18 1992-10-14 Pennsylvania Hospital Fremgangsmaate for fremstilling av et protein som har antikoagulerende og anti-metastatiske egenskaper
US4832849A (en) * 1988-06-16 1989-05-23 Merrell Dow Pharmaceuticals Inc. Extraction and purification of an anticoagulant principle from the south american leech, haementeria ghilianii
CA2024697A1 (en) * 1989-09-07 1991-03-08 George P. Vlasuk Protein having anticoagulant properties

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