FI93697C - Menetelmä trombiinia inhiboivan vaikutuksen omaavan amblyommiinin eristämiseksi - Google Patents

Description

93697

Menetelmä trombiinia inhiboivan vaikutuksen omaavan ambly-ommiinin eristämiseksi

Keksintö koskee menetelmää trombiinia inhiboivan 5 vaikutuksen omaavan proteiinin tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävän suolan eristämiseksi, jonka proteiinin mole-kyylipaino on 20 000 - 30 000 Daltonia ja isoelektrinen piste on 5,05 - 5,65 ja joka sisältää aminohappo-osasekvenssit -Ile-Leu-Phe-Thr-Gln-Gly-Asn-X-Gly-Glu-Leu-Glu-10 Asn-X-Phe-Glu-, -Lys-Ile-Leu-Phe-X-Gln-Gly- ja -Ala-Ser-Tyr-Ile-Val-X-Ser-Glu-Ser-Ile-Gln-Ile-Leu-X-Leu-Ser-Glu-Gly-Ile-, joissa kukin ryhmä X voi olla samanlainen tai erilainen ja on jokin luonnossa esiintyvä aminohappo tai mikä tahansa translaation jälkeen modifioitu aminohappo, 15 kuten trimetyylilysiini tai karboksiglutamiinihappo. Uudella proteiinilla on veren hyytymistä estävä vaikutus ja se on siten käyttökelpoinen hyytymisenestohoitoon.

Hyytymisenestoaineilla on suuri merkitys lääketieteessä. Keskeisinä lääketieteellisinä ongelmina voidaan 20 mainita esim. verisuonitukosten ennaltaehkäisy, valtimoiden tukkeutumisen ehkäisy, verisuonitukosten hoito, koagu-lopatiakäyttö ja kehon ulkopuolinen verenkierto. Hyytymi-senestohoidossa nykyisin käytössä olevilla aineilla on usein joitakin ei-toivottuja haittoja kuten esim. veren-** 25 purkaumariski, trombosyyttien määrän lasku, vaikutus kes kushermostoon, huono siedettävyys tai havaitaan epäsuora vaikutus esim. hepariinin vaikutukseen. Walsmann ja Mark-wardt [Die Pharmazie, osa 36 (1981) s. 653] kuvaavat Hiru-do medicinalisista eristetyn hirudiinin lääketieteellistä 30 merkitystä. Tämä aine on 64 - 65 aminohappoa sisältävä polypeptidi [Chan, FEBS osa 164 (1983) s. 307; US-patent-tijulkaisu 4 668 662]. Peptidi on erittäin spesifinen trombiininestäjä, joka näyttää muuten olevan farmakologisesti inertti. Yhdisteen haittoina ovat sen suhteellisen 35 lyhyt puoliintumisaika ja parenteraalinen antomuoto.

2 93697

Sen vuoksi on toivottavaa löytää verisuonitukoksia estävä aine, jolla ei ole mainittuja haittoja. On siis mielekästä etsiä muita hyytymistä estäviä aineita, jotka kattavat edellä mainitun lääketieteellisen ongelmakentän 5 ihanteellisesti.

Heimoon Ixodidae (puutiaiset) kuuluvat kuoripunkit ovat kaikkina kehitysasteinaan satunnaisia verta imeviä matelijoiden, lintujen, nisäkkäiden ja ihmisten ulkoloi-sia. Täysikasvuiset naaraspunkit pysyvät tavallisesti 10 useita päiviä isännässä ja imevät jopa satoja kertoja oman painonsa verta. Tähän tarkoitukseen punkeilla on imevät pistokärsät, jotka koostuvat parittain sijoittuneista ke-likeereistä ja hypostoomasta. Kelikeerien leikkausmekanis-milla, "hampailla", punkit leikkaavat haavan orvasketeen, 15 johon viedään itse kelikeerit ja hypostooma, jolloin muo dostuu imuputki. Yleisimpien punkkilajien sylkirauhaset tuottavat proteiinia, niin kutsuttua sementtiä, joka jää haavaan ja johon hypostooman hampaat kiinnittyvät ja siten kiinnittävät punkit ottamaan ravintoa isännästä.

20 Lisäksi punkit luovuttavat sylkirauhastensa eritet tä, joka sisältää hyytymisenestoaineita.

Veren imemiseksi punkkien suun osat eivät tunkeudu suoraan hiussuoniin vaan kudokseen. Sylkirauhasentsyymien vaikutuksesta ne hajottavat siellä kudoksia ja vahingoit-25 tavat hienoimpia hiussuonia, joista veri virtaa pois. Syl-kirauhaseritteen verenvuotoa ehkäisevän vaikutuksen vuoksi vahingoittuneista kudoksista vuotaa verta jonkin aikaa ja siten muodostuu kudossolurakkula, josta punkit ottavat ravintonsa.

·. 30 Aineiden, joilla on verenvuotoa ehkäiseviä ominai suuksia, eristämiseksi tutkittiin punkkien sylkirauhasia.

Keksintö koskee menetelmää proteiinin tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävän suolan eristämiseksi, jota proteiinia eristetään kuoripunkeista ja joka estää veren 35 hyytymisen inaktivoimalla trombiinin.

li 3 93697

Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että proteiini uutetaan kuoripunkeista ja puhdistetaan geelifiltraatiolla.

Vaikka tämä proteiini ja hirudiini vaikuttavat sa-5 maan substraattiin, molemmat proteiinit erovat yllättävästi toisistaan. Tämän perusteella voidaan odottaa, että keksinnön mukaisesti saatu proteiini - jota kutsutaan am-blyommiiniksi - saa aikaan hirudiiniin verrattuna erilaisen lääketieteellisen vaikutuksen. Amblyommiini on uusi 10 proteiini. Se on ensimmäinen eteläafrikkalaisten kirjo-punkkien sylkirauhasista eristetty tehoaine.

Amblyommiinille ovat tyypillisiä seuraavat fysikaaliset ominaisuudet. Sillä on suhteellisen vähäinen vaikutus RCoomassie Brillant Blue R250 Bio-Rad*iin. Lyofilisoin-15 nin jälkeen se liukenee vain heikosti veteen. Proteiini kestää kaikissa käytetyissä puskureissa. Jos eluaatti jäädytetään HPLC-puhdistuksen jälkeen lämpötilaan -80 °C, ei voida todeta aktiivisuuden vähenemistä. Yhdiste on lisäksi stabiili lämpötilassa 40 eC. Se on saostettavissa aseto-20 nilla pH-arvossa 1,8 (etikkahappo tai trikloorietikkahap-po) . Tällöin saostuman liuotuksen täysi teho havaitaan vielä ainakin 12 päivän kuluttua. Jos HPLC-analyysiin käytetään Waters 600 Multisolvent Delivery Systemiä ja Biorad . RP304 -erotuspylvästä ja gradienttia 80 %A-20%B

25 (jolloin A = 0,1 % TFA:a ja B = 0,1 % TFA:a 80-%:isessa asetonitriilin HPLC-vesiliuoksessa), jolloin 40 minuutin ajoajan kuluttua B:n osuus on 50 %, amblyommiinille mitataan viipymäaika 27 minuuttia. Suorittamalla geelisuodatus G75 superfine -materiaalilla proteiinille saadaan määrite-30 tyksi molekyylipaino 20 000 - 30 000 Daltonia. SDS-poly-akryyliamidigeelissä määritetään molekyylipaino 26 000 ± 2 000 Daltonia. Isoelektrisen pisteen määrityksestä saadaan arvo noin 5,35 ± 0,3. Lisäksi ilmoitettiin seuraavat osa-aminohapposekvenssit -Ile-Leu-Phe-Thr-Gln-Asn-X-Gly-35 Gln-Leu-Glu-Asn-X-Phe-Glu-, -Lys-Ile-Leu-Phe-X-Glu-Gly- ja 93697 ___ l 4 -Ala-Ser-Tyr-Ile-Val-X-Ser-Glu-Ser-Ile-Gln-Ile-Leu-X-Leu-Ser-Glu-Gly-Ile-, joissa kukin ryhmä X voi olla samanlainen tai erilainen ja se on kulloinkin jokin luonnossa e-siintyvä aminohappo kuten esim. Tyr, Ser, Thr, Glu, Asp, 5 Asn tai jokin translaation avulla modifioitu aminohappo kuten trimetyylilysiini tai V-karboksiglutamiinihappo.

Biologisena ominaisuutena trombiinin spesifinen esto on erinomainen. Keksinnön mukaisesti saatavalla proteiinilla on sen vuoksi lääketieteessä käyttöä trombiinia 10 estävänä aineena.

Esimerkki 1

Punkkien rauhasten eristäminen

Punkkien sylkirauhanen on parillinen elin ja se sijaitsee sagittaalileikkauksen suhteen ruumiin etupuolis-15 kon oikealla ja vasemmalla puolella. Aina toimintatilan mukaan sylkirauhanen on pieni nälkiintyneillä yksilöillä ja valtavan suuri imevillä punkeilla. Käytetyt punkit olivat eteläafrikkalaisen kirjopunkin sukulaisia, Amblvomma hebraeum ja Rhipicephalus evertsi. kaksi vuosien ajan la-20 boratoriossa tunnettuja menetelmiä käyttäen kasvatettua kantaa.

Isäntäeläimestä otettiin osittain imeneitä naaras-punkkeja, joiden paino oli alueella 150 - 400 mg, ja ne leikeltiin välittömästi tämän jälkeen stereomikroskoopin 25 alla, niin että punkit kiinnitettiin petrimaljaan selkä-puolelta kaksipuolisella liimanauhalla ja peitettiin PBS-puskurilla pH 7,2. Punkkien ympäri leikkausveitsellä suoritetun leikkauksen jälkeen ylä- ja alapuoli käännettiin erilleen ja sylkirauhaset otettiin pois ja jäädytettiin .· 3 0 typessä.

Esimerkki 2

Vaikuttavan aineen uutto sylkirauhasista

Lajia Amblvomma hebraeum olevien punkkien sylkirauhaset eristetään ja hienonnetaan sen jälkeen typessä hie-35 noksi jauheeksi. Homogenisaatti liuotetaan veteen ja lyö- 5 93697 filisoidaan. Kuivattua jäännöstä ravistellaan voimakkaasti 40-%isessa asetonissa lämpötilassa 40 °C 30 minuutin ajan. Sen jälkeen sentrifugoidaan 10 min (15 000 g). Sedimenttiä uutetaan edellä kuvatulla tavalla uudelleen ja päällä ole-5 va neste yhdistetään ensimmäisen uutteen kanssa ja sekoitetaan hitaasti 1 M etikkahapon kanssa, kunnes on saavutettu pH-arvo 5. Syntyvä saostuma poistetaan sentrifugoi-malla ja päällä oleva kirkas neste otetaan talteen. Nesteeseen sekoitetaan 10-%:ista trikloorietikkahapon aseto-10 niliuosta, kunnes on saavutettu pH-arvo 1,81. Sen jälkeen lisätään 10-kertainen tilavuus jääkylmää asetonia ja annetaan saostua 3,5 tunnin ajan lämpötilassa -20 °C. Saostuma poistetaan sentrifugoimalla 10 min Sorvall-kylmäsent-rifugissa (6 000 kierrosta/min). Sedimentti pestään jää-15 kylmällä asetonilla ja eetterillä ja sen jälkeen suspen-doidaan uudelleen veteen. Suspensio jäädytetään lämpötilassa -80 °C ja sen jälkeen lyofilisoidaan kiertovakuumi-haihduttimessa. Kuivattu jäännös siirretään puskuriin (0,05 M trietanoliamiini-HCl, 0,4 M NaCl pH 7,8).

20 Esimerkki 3

Gee1isuodatus

Esimerkissä 2 saatu proteiiniseos puhdistetaan gee-lisuodatusta käyttäen. Sitä varten täytetään pylväs, jonka halkaisija on 1,6 cm ja korkeus 78,3 cm, G 75 superfine 25 -massalla (valmistaja Pharmazia). Virtausnopeus on 10 ml/ tunti. Pylväs kalibroitiin käyttäen geelisuodatuskali-brointipakkausta (tuotenumero 17-0442-01, valmistaja Pharmazia) . Trombiinia estävä vaikutus havaitaan fraktioissa, jotka voidaan osoittaa molekyylipainoalueella 20 000 -30 30 000 dt.

Esimerkki 4

Plasman hyytymisen estäminen

Yksittäisistä G 75 -fraktioista sekoitetaan 50 μ1:η eriä 50 μ1:η kanssa vettä ja 100 μ1:η kanssa sitraatilla 35 käsiteltyä koiran plasmaa, joka sisältää 3 yksikköä trom- 6 93697 biinia millilitrassa, ja määritetään trombiiniaika. Määrityksessä käytetään Markwardtin et ai. menetelmää [Pharma-zie 43 (1988) 202; Fol. Haematol. 115 (1988) 70]. Esimerkki 5 5 Kromotsyymi TH:n trombiinikatalysoidun lohkeamisen estäminen Määritys suoritetaan Griesbachin julkaisun (Thromb. Res. 37 (1985) 347-350] mukaan. Menetelmää muutetaan tällöin niin, että reaktio suoritetaan mikrotitrauskuoppale-10 vyissä, jolloin lopputilavuus on 0,2 ml. Analysointi suoritetaan Elisa-lukulaitteella käyttäen arvoa 405 nM. Esimerkki 6

Puhdistus käyttäen trombiinipylväsaffiniteettikro-matografiaa 15 Trombiini-Sepharose valmistetaan käyttäen P. Wals- mannin esittämää menetelmää [Pharmazie 36 (1981) 860-861]. G-75 -fraktiot, joilla on aktiivisuutta, yhdistetään, lyo-filisoidaan ja lyofilisoitu tuote siirretään 0,1 M etik-kahappoon. Näytteistä poistetaan suolat käyttäen G 25 20 -pylvästä ja eluaatin aktiivisuus testataan esimerkin 5 mukaisesti. Aktiiviset fraktiot yhdistetään ja lyofilisoi-daan. Kuivattu jäännös siirretään 0,05 M Tris-HCl-liuok-seen (pH 8) ja kaadetaan esikäsiteltyyn trombiinipylvää-seen. Kaikki vaiheet suoritetaan lämpötilassa 4 °C. Pylväs 25 pestään kahdesti 0,05 M Tris-puskurilla pH 8, ennen kuin sitä eluoidaan 5 M bentsamidiinikloridin Tris-HCl -liuoksella (0,05 M, pH 8). Fraktiot otetaan talteen, yhtä suuret näyte-erät otetaan pois, yhdistetään ja dialysoidaan vedellä ja testataan trombiiniaktiivisuus. Fraktiot, joil-.· 30 la on suurin aktiivisuus, dialysoidaan ja lyofilisoidaan.

Lyofilisoitu tuote analysoidaan SDS-polyakryyliamidielek-troforeesin ja sen jälkeen hopeavärjäyksen avulla käyttäen värjäyssarjaa (valmistaja Bio-Rad). Molekyylipainoalueella n. 25 000 dt havaitaan proteiinivyö, jota ei havaittu elu-35 oltaessa pylvästä, johon ei ollut etukäteen laitettu punk-kinäytettä.

il 7 93697

Esimerkki 7

Punkkien kasvatus

Lajiin Rhipicephalus evertsi kuuluvien punkkien, joilla on kolme kehitysvaihetta, kasvatus tapahtuu Th.

5 Hiepen (Lehrbuch der Parasitologie, osa 4, Gustav Fischer Verlag, Stuttgart 1982, alkaen sivulta 46) mukaan. Kesto on noin 3-4 kuukautta. Naaraspunkkeja pidetään lämpötilassa 28 °c ja ilmankosteudessa yli 90 % munien säilymisen vuoksi. Toukkien kuoriutumisen jälkeen ne laitetaan kanii-10 neihin imemään ensimmäistä veriateriaa. Aterioinnin jälkeen tapahtuu nahanluonti nymfeiksi välittömästi. Nämä laitetaan kaniineihin toista veriateriaa varten. Täysin ravitut nymfit tulevat nyt erilaistumisvaiheeseen muuttuakseen täysikasvuisiksi uroksiksi ja naaraiksi. Erilais-15 tumisen jälkeen täysikasvuiset eläimet otetaan käyttöön.

Esimerkki 8

Amblyommiinin eristys täysikasvuisista punkeista Täysikasvuiset punkit hienonnetaan vedessä Ultra-Turrax-laitteella (valmistaja Janke ja Kunkel). Punkkiho-20 mogenisaattia inkuboidaan sen jälkeen 40 minuuttia lämpötilassa 40 °C ja sen jälkeen sentrifugoidaan lämpötilassa 5 °C 30 minuuttia Sorvall-sentrifuugilla (10 000 kierros-ta/min). Sedimentti suspendoidaan uudelleen veteen ja sitä , inkuboidaan uudelleen lämpötilassa 40 °C 30 minuutin ajan

25 ja sen jälkeen sentrifugoidaan. Kummankin sentrifugointi-vaiheen nestemäiset kerrokset yhdistetään ja suodatetaan sininauhasuodattimella. Kirkas nestemäinen osa lyofilisoi-daan ja jäännös siirretään 20 mM Tris-HCl-liuokseen (pH

7,5) ja sen jälkeen puhdistetaan käyttäen Q-Sepharose Fast 30 Flow -kromatografiaa (gradientti 0 - 1 M NaCl 20 mM Tris-HCl-liuoksessa, pH 7,5). Amblyommiinia sisältävät jakeet tunnistetaan esimerkin 5 mukaisesti, lyofilisoidaan ja kaadetaan G 75 superfine -pylvääseen esimerkin 3 mukaisesti. Trombiinia estävät fraktiot eluoituvat molekyylipaino-35 alueella 20 - 30 000 dt. Ne yhdistetään ja puhdistetaan käyttäen käänteisfaasi-HPLC:a (Bio-Rad RP 304 -pylväs).

8 93697

Laitteena käytetään Waters Multisolvent Delivery Systemiä. Ajetaan seuraava gradientti: lähtö 80%A-20%B (jossa A on 0,1-% TFA ja B on 0,1-% TFA 80-%:isessa asetonitrii-lissä), lopussa B on 100 %, ajoaika 60 minuuttia. Trombii-5 nia estävät fraktiot lyofilisoidaan yhdistämisen jälkeen ja puhdistetaan uudelleen käänteisfaasi-HPLC:n avulla. Käytetään seuraavaa gradienttia: alku 80 % A : 20 % B (A on 0,1-% TFA; B on 0,1-% TFA 80-%:isessa asetonitriilis-sä). 40 min:n ajoajan jälkeen B on saavuttanut arvon 50 %. 10 Näissä olosuhteissa amblyommiinifraktiolle saadaan viipy-mäaika 27 minuuttia.

Esimerkki 9

Amblyommiinin molekyylipainon määritys

Viipymäajan 27 minuuttia omaava HPLC-fraktio analy-15 soidaan käyttäen 17,5-% SDS-polyakryyliamidigeeliä. Mole-kyylipainomerkkiaineena käytetään elektroforeesin kali-brointipakkausta (tuotenumero 17-0446-01, valmistaja Pharmacia). Tässä systeemissä amblyommiini menee tuskin "Carbon-Anhydrasen" alapuolelle, jolle on ilmoitettu mole-20 kyylipaino 30 000 dt. Amblyomiinille saadaan molekyylipai-no 26 000 ± 2000 dt.

Esimerkki 10

Isoelektrisen pisteen määritys

Esimerkin 8 mukaan eristetty amblyommiini saatetaan 25 ultraohutkalvofokusointiin, jonka ovat esittäneet tohtori Schulte et ai. yhtiöstä LKB Instrument GmbH. Isoelektri-seksi pisteeksi saadaan 5,35 ± 0,3.

Esimerkki 11

Amblyommiinin proteiinisekvenssianalyysi 30 Autenttisen täysikasvuisista punkeista eristetyn proteiinin N-terminaalinen sekvensointi ei ole hallinnassa. Käsillä olevalle materiaalille suoritettiin sen vuoksi trypsiinilohkaisu. Jotta kvantitatiivinen trypsiinilohkai-su olisi mahdollinen, proteiini derivatisoidaan ensin kar-35 boksimetylointireaktiossa. Tämän takia se liuotetaan

24 μ1:η puskuria (8 M guanidiini-HCl, 10 mM Tris, 1 mM

9 93697 EDTA) ja lisätään 51 μς DTE:ä 4 niissä puskuria ja 4,52 μg 2-merkaptoetanolia 5 Mlrssa. Reaktioseosta inkuboidaan tunnin ajan lämpötilassa 37 °C ja sen jälkeen sekoitetaan 8,3 μ1:η kanssa jodiasetamidiliuosta (0,25 M jodiasetami-5 di, pH säädetty arvoon 8,0 KOH:lla) ja inkuboidaan tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Sen jälkeen lisätään laimenti-meksi 59 μΐ vettä, ja etanolin (400 μΐ) lisäyksen ja voimakkaan ravistelun jälkeen tapahtuu saostuminen, minkä jälkeen suoritetaan sentrifugointi nopeudella (12 000 kilo errosta/min). Sen jälkeen sedimenttiä ravistellaan 100 μ1:η kanssa CHCl3:a ja sekoitetaan 300 μΐ^η vettä ja sentrifugoidaan uudelleen. Ylempi faasi sekoitetaan 300 niiaan etanolia. Seos sentrifugoidaan ja sedimentti liuotetaan trypsiinilohkaisua varten 66 niiaan 0,2 M N-me-15 tyylimorfoliinia (pH säädetty arvoon 8,5 etikkahapon avulla) . Sen jälkeen lisätään 5 μΐ trypsiiniliuosta (3,3 μg trypsiiniä N-metyylimorfoliinipuskurissa) ja seosta inkuboidaan 2 tuntia huoneenlämpötilassa. Fragmenttiseos erotetaan nyt Mikro-Bore-käänteisfaasi-HPLC:11a. (Mikro-Bore-20 pylväs: 1 mm x 25 cm, valmistaja Braun-Lee) . Tätä varten tarvitaan lineaarinen gradientti 10 % A - 60 % B (A on 10 % asetonitriilin HPLC-vesiliuos + 0,1 % TFA; B on 10 % veden asetonitriililiuos +0,1 % TFA). Kolme piikkifrak-tiota voidaan eristää hyvin. Ne kuivataan yksitellen kaa-' 25 sufaasisekventoijan lasikuitusuodattimella ja niille suo ritetaan sekvenssianalyysi. Tähän tarkoitukseen käytetään 470 A -kaasufaasiproteiinisekventoijaa (valmistaja Applied Biosystems), jossa online-PTH-tunnistussysteemi.

Tunnistettiin seuraavat osa-aminohapposekvenssit, • 30 jolloin X tarkoittaa jotain luonnossa esiintyvää aminohap poa.

a) Ile-Leu-Phe-Thr-Gln-Gly-Asn-X-Gly-Gln-Leu-Glu-Asn-X-Phe-Glu b) Lys-Ile-Leu-Phe-X-Glu-Gly 35 c) Ala-Ser-Tyr-Ile-Val-X-Ser-Glu-Ser-Ile-Gln-Ile- .. Leu-X-Leu-Ser-Glu-Gly-Ile.

Claims (7)

1. Menetelmä trombiinia inhiboivan vaikutuksen omaavan proteiinin tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävän 5 suolan eristämiseksi, jonka proteiinin molekyylipaino on 20 000 - 30 000 Daltonia ja isoelektrinen piste on 5,05 - 5,65 ja joka sisältää aminohappo-osasekvenssit -Ile-Leu-Phe-Thr-Gln-Gly-Asn-X-Gly-Glu-Leu-Glu-Asn-X-Phe-Glu-, -Lys-Ile-Leu-Phe-X-Gln-Gly- ja -Ala-Ser-Tyr-Ile-Val-X-Ser-10 Glu-Ser-Ile-Gln-Ile-Leu-X-Leu-Ser-Glu-Gly-Ile-, joissa ku kin ryhmä X voi olla samanlainen tai erilainen ja on jokin luonnossa esiintyvä aminohappo tai mikä tahansa translaation jälkeen modifioitu aminohappo, kuten trimetyylilysii-ni tai karboksiglutamiinihappo, tunnettu siitä, 15 että proteiini uutetaan kuoripunkeista ja puhdistetaan geelifiltraatiolla.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että proteiinin molekyylipaino on 26 000 ± 2 000 Daltonia.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että proteiinin isoelektrinen piste on 5,35.

4. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että proteiini sisältää * 25 aminohappo-osasekvenssit -Ile-Leu-Phe-Thr-Gln-Gly-Asn-X- Gly-Glu-Leu-Glu-Asn-X-Phe-Glu-, -Lys-Ile-Leu-Phe-X-Gln-Gly- ja -Ala-Ser-Tyr-Ile-Val-X-Ser-Glu-Ser-Ile-Gln-Ile-Leu-X-Leu-Ser-Glu-Gly-Ile-, joissa kukin ryhmä X voi olla samanlainen tai erilainen ja voi olla kulloinkin Tyr, Ser, . 30 Thr, Gin, Asp, Asn tai mikä tahansa translaation jälkeen • · ·· modifioitu aminohappo, kuten trimetyylilysiini tai karbok siglutamiinihappo.

5. Jonkin patenttivaatimuksista 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että proteiini eriste- 35 tään Rhipicephalus evertsistä. 93697

6. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että proteiini eristetään Amblvom-ma hebraeumista.

7. Jonkin patenttivaatimuksista 1-6 mukainen me-5 netelmä, tunnettu siitä, että eristys suoritetaan käyttäen uuttomenetelmien ja kromatografisten menetelmien yhdistelmää, jolloin mukana on tarvittaessa proteiinin entsymaattinen lohkaisu ja tarvittaessa syntyvän proteiinin muuttaminen fysiologisesti siedettäviksi suoloikseen. 93697