PT90739B - Processo para a preparacao de uma proteina dotada de actividade de inibicao de trombina - Google Patents
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Description
A presente invenção refere-se a um processo para a preparação de uma nova substância activa, ambliomina, para a terapia anticoagulante.
Os anticoagulantes têm um grande interesse em medicina. Como problemas médicos fundamentais podem referir-se, por exemplo, a profilaxia da trombose, a profilaxia da reoclusão arterial, o tratamento de trombose, coagulopatias de consumo e a circulação extracorporal.
Os agentes utilizáveis até agora para a terapia anticoagulante apresentam frequentemente alguns inconvenientes indesejáveis, como por exemplo o risco de hemorragias, a redução de trombõcitos, a actividade sobre o SNC, a intolerância ou os efeitos secundários, como, por exemplo se observa no esquema de acção da heparina.
Walsman e Markwardt (Die Pharmazie Vol.
(1981) ρ. 653) descrevem ο significado da hirudina obtida a partir de Hirudo medicinalis. Esta substância é um polipeptideo de 64 a 65 ácidos aminos de dimensão (Chan, FEBS Vol. 164 (1983) p. 307; Patente dos Estados Unidos 4 668 662). 0 peptideo é um inibidor da trombina de alta especificidade que, para além disso, parece ter farmacologicamente inerte. Os inconvenientes des, te composto consistem no seu período de semivida relativamente curto e na forma de aplicação parenteral.
É desejável por conseguinte um composto dotado de actividade antitrombotica que não apresente os inconvenientes referidos.
Deste modo considerou-se útil investigar outros anticoagulantes que resolvessem os problemas médicos anteriormente mencionados de forma óptima.
Os carrapatos de carapaça da familia dos Ixodidae são em todos os estádios de desenvolvimento ectoparasitas temporários que se alimentam do sangue de répteis, de aves e de mamiferos incluindo o Homem. Os carrapatos fêmeas adul tos mantêm-se habitualmente vários dias agarrados aos hospedeiros e sugam até cem vezes o seu próprio peso em sangue. Para este fim os carrapatos possuem orgãos bucais que servem para se fixarem e para sugar o sangue constituídos por um par de queliceros e por um hipostomo. Com o mecanismo de corte dos queliceros, os dígitos, os carrapatos praticam um golpe na epiderme no qual introduzem os próprios queliferos e o hipostomo formando deste modo o canal de sucção. As glândulas salivares da maior parte das especies dos carrapatos produzem uma proteína, o chamado cimento, que ê introduzida na ferida e na qual os dentes do hipostomo ficam ancorados, fixando-se deste modo o carrapato ao hospedeiro para se alimentar.
Os carrapatos produzem ainda uma secreção das glândulas salivares que contém anticoagulantes.
Para sugar o sangue, os orgãos bucais dos carrapatos não penetram directamente nos capilares mas sim nos tecidos, Por meio das enzimas das glândulas salivares provo cam a lise dos tecidos e atingem os capilares adjacentes mais
finos provocando a saida do sangue. Por meio de actividade de inibição da coagulação da secreção das glândulas salivares os tecidos adjacentes sangram durante um período e criam assim um vacuolo nos tecidos, a partir do qual o carrapato toma o seu alimento.
A fim de se obterem substâncias com propriedades de inibição da coagulação do sangue investigaram-se, em consequência, as glândulas salivares do carrapato.
A presente invenção refere-se a uma proteína, ou a um seu sal farmaceuticamente aceitável, a qual é isolada a partir do carrapato de carapaça e que inibe a coagulação do sangue por meio da inactivação da trombina.
Se bem que esta proteína e a hirudina ataquem o mesmo substrato, as duas proteínas são de forma surprendente nitidamente diferentes. Este facto faz esperar que a proteína da presente invenção - designada por amblio mina - contenha um valor medicinal diferente da hirudina. A ambliomina ê uma nova proteína. É a primeira substância actiisolada a partir das glândulas salivares do carrapato multicolor sul-africano.
A ambliomina é caracterizada por meio das seguintes propriedades. Apresenta uma afinidade relativa reduzida para o Azul Brilhante de Coomassie R250 Bio-Rad. Após liofilização apenas se dissolvem em água dificilmen te. A proteína ê estável em todos os tampões usados. A congelação do eluido após purificação por HPLC a -809C não causa qualquer redução da actividade apreciável. 0 composto é ainda estável a 40<?C. Precipita por adição de acetona a pH 1,8 (ãcido acético ou ãcido tricloroacético). Neste caso observa-se uma actividade integral da solução do precipitado mesmo depois de 12 dias. Quando se utiliza para a análise por HPLC um sistema de fornecimento multissolventes Waters 600 e uma coluna de separação Biorad RP3O4 e por ajuste de um gradiente de 80% de A - 20% de B (sendo A = 0,1 % de ATFA e B = 0,1 % de ATFA em 80 % de acetonitrilo em âgua para HPLC), atingindo-se após um período de 40 minutos 50 % de Β, mede-se para a ambliomina um tempo de retenção de 20 minutos. Por filtração em gel atra3 vés de material superfino G 75 isola-se uma proteina com um pe so molecular de 20 000 a 30 000 Dalton. Num gel de SDS-poliacrilamida determina-se um peso molecular de 20 000 Dt- 2 000 Dt. A determinação do ponto isoleléctrico dá um valor de cerca de 5,35 + 0,3. Por fim foram determinadas as seguintes sequências parciais dos ácidos aminados -Ile-Leu--Phe-Thr-Gln-Gly-Asn-X-Gly-Gln-Leu-Glu-Asn-X-Phe-Glu-, -Lys-Ile-Leu-Phe-X-Gln-Gly- e
-Ala-Ser-Tyr-Ile-Val-X-Ser-Glu-Ser-Ile-Gln-Ile-Leu-X-Leu-Ser-Glu-Gly-Ileem que os residuos X podem ser iguais ou diferentes e cada um significa um ácido aminado de ocorrência natural como por exem pio Tyr, Ser, Thr, Gin, Asp, Asn ou qualquer ácido aminado modificado depois da tradução, como por exemplo trimetil-lisina ou ácido - Y-carboxiglutâmico.
De entre as propriedades biológicas salienta-se a inibição especifica da trombina. A proteina dã presente invenção pode por conseguinte ser utilizada em medicina como amtitrombotico.
Exemplo 1 Isolamento das glândulas dos carrapatos
As glândulas salivares dos carrapatos são orgãos que ocorrem aos pares e encontram-se situados na região sagital no lado direito e esquerdo da metade anterior do corpo. De acordo com o estado funcional as glândulas salivares de exemplares famintos são pequenas e as de carrapatos durante a alimentação são impressionantemente grandes. Os carrapatos utilizados pertenciam às espécies de carrapatos multicolores sul-africanos, Amblyomma hebraeum e Rhipicephalus ever tsi, duas colónias cultivadas em laboratório desde hã anos por meio de métodos conhecidos.
Tomaram-se fêmeas em meio do acto de sugar o sangue ao hospedeiro com um peso na gama de 150 a 400 mg e dissecaram-se sob um microscópio estereoscópico fixando os carrapatos numa cápsula de Petri com o dorso fixado em fita adesiva de dupla face e cobertos com tampão de PBS a pH 7,2. Após um corte por meio de um bisturi fino ao longo da periferia do carrapato separaram-se as partes superior e inferior e retiraram-se as glândulas salivares cuidadosamente, congelando-se em azoto.
Exemplo 2 Extracção da substância activa a partir de glândulas de carrapatos
Isolaram-se as glândulas salivares de carrapatos da espécie Amblyomma hebraeum e em seguida reduziram-se a põ fino sob atmosfera de azoto. Dissolveu-se a massa homogénea obtida em ãgua e liofilizou-se. Tomou-se o resíduo seco em acetona a 40 % e agitou-se vigorosamente a 409c durante 30 minutos. Em seguida centrifugou-se a 15 000 g durante 10 minutos. Extraiu-se de novo o sedimento conforme descrito, reuniu-se o sobrenadante com o primeiro extracto e tratou-se lentamente com ãcido acético 1 M até se atingir um pH de 5. Eliminou-se o precipitado que se formou por centrifugação e tomou-se o sobrenadante límpido. Tratou-se o sobrenadante com ãcido tricloroacêtico a 10 % em acetona até se atingir um pH de 1,81. Em seguida adicionou-se um volume de 10 vezes de acetona gelada e deixou-se formar um precipitado durante 3,5 horas a -209C. Separou-se o precipitado numa centrífuga refrigerada Sorvall a 6000 rpm durante 10 minutos. Lavou-se o sedimento com acetona gelada e éter e em seguida ressuspendeu-se em ãgua. Congelou-se a suspensão a -809C e em seguida liofilizouse num evaporador de vacuo rotativo. Retomou-se o residuo seco em tampão (trietanolamina.HCl 0,05 M; NaCl 0,4; pH 7,8).
Exemplo 3 Filtração por gel
A mistura proteica obtida de acordo com o Exemplo 2 foi purificada por filtração por gel. Para esse fim encheu-se de uma coluna de 1,6 cm de diâmetro e 78,3 cm de altura com material G 75 superfino da firma Pharmacia. 0 cau dal foi de 10 ml/hora. A coluna foi calibrada com um conjunto de calibração de filtração em gel da firma Pharmacia (Art. No.
17-0442-01). Verificou-se a existência de actividade de inibição da trombina nas fracções correspondentes a uma gama de pesos moleculares de 20 000 a 30 000 Dt.
Exemplo 4 Inibição da coagulação do plasma
De cada uma das fracções de G 75 misturaram-se aliquotas de 50 #1 com 50 /il de t^O e 100 J/l de plasma de cão tratado com citrato que continha 3 U de trombina e determinou-se o tempo de trombina. 0 procedimento foi efectua do de acordo com Marckwardt et al. (Pharmazie 43 (1988) 202; Foi. Haematol. 115 (1988) 70).
Exemplo 5 Inibição da cisão da cromozina TH catalisada pela trombina
A determinação foi levada a efeito de acordo com a publicação de Griesbach et al. (Thromb. Res. 37 (1985), 347-50). Para a utilização o métodod foi modificado de modo a que a reacção pudesse ser levada a efeito em alvéolos de uma placa de microtitulação, sendo o volume final de 0,2 ml. A determinação foi efectuada a 405 nm com um aparelho de leitura 'Elisa'.
Exemplo 6 Purificação por meio de cromatografia de afinidade em coluna de trombina
Preparou-se Sepharose-trombina de acor do com método de Walsmann, P (Pharmazie 3(5 (1981) . As fracções de G-75 que apresentam actividade foram reunidas e liofilizadas e o liofilizado foi retomado em ãcido acético 0,1 M. As amostras foram desmineralizadas através de uma coluna G 25 arrefeciyda e ensaiou-se o eluído para determinação da actividade de acordo com o Exemplo 5. As fracções activas foram reunidas e liofilizadas. Retomou-se o resíduo seco em tris.HCl 0,05 M (ph 8) e fez-se passar através de uma coluna de trombina previamente preparada. Todas as operações foram levadas a efeito a 4?C. A coluna foi lavada 2 vezes com tampão de tris 0,05 M a pH 8 antes de ser eluída com cloreto de benzamidínio em tris .HC1 0,05 M (pH 8). Recolheram-se as fracções, tomaram-se aliquotas, reuniram-se e dialisaram-se contra H2O e experimentaram-se para verificar a capacidade de inibição de trombina. As fracções que apresentavam a actividade mais elevada foram dialisadas e liofilizadas. Analisou-se o liofilizado por meio de electroforese em gel de SDS-poliacrilamida com coloração final por prata usando um conjunto de colaração da
firma Bio-Rad. Na gama de P.M. de cerca de 25 000 Dt verificou se a ocorrência de uma banda proteica, que na eluição da coluna não é observada sem prévia carga das amostras provenientes dos carrapatos.
Exemplo 7 Criação dos carrapatos
A criação dos carrapatos trivalentes da espécie Rhipicephalus evertsi foi efectuada de acordo com Th. Hiepe (Lehrbuch der Parasitologie, Vol. 4, Gustav Fischer Verlag, Estugarda 1982, pag. 46 e segs.). A duração foi de cerca de 3 a 4 meses. Conservaram-se carrapatos fêmea a 289C e sob uma humidade do ar superior a 90 + atê postura dos ovos. Apôs a saida das larvas depositaram-se estas para a primeira refeição de sangue sobre coelhos. Após a refeição verificou-se a metamorfose em ninfas. Estas foram depositadas sobre coelhos para a segunda refeição de sangue. As ninfas alimentadas entraram então no estádio de diferenciação em adultos machos e fêmeas.
Os animais adultos foram utilizados apôs o fim da diferenciação.
Exemplo 8 Isolamento da ambliomina a partir de carrapatos adultos
Destroçaram-se carrapatos adultos em 1^0 num aparelho Ultra-Turrax da firma Janke und Kunkel. 0 produto homogênio proveniente dos carrapatos foi em seguida incubado durante 40 minutos a 409 c e em seguida foi centrifugado durante 30 minutos a 10 000 rpm e a 59c numa centrifuga Sorvall. Ressuspendeu-se o sedimento em í^O, incubou-se novamente a 409 C durante 30 minutos e em seguida centrifugou-se. Reuniram-se os sobrenadantes das duas operações de centri fugação e filtrou-se através de um filtro de banda azul. Liofilizou-se o sobrenadante limpido, retomou-se o resíduo em tris.HCl 20 mM (ph 7,5) e em seguida purificou-se por cromatografia Fast Flow através de Sepharose Q (gradiente de NaCl de 0 a 1 M em tris.HCl 20 mM. pH 7,5). Identificaram-se as fracções que continham a ambliomina de acordo com o Exemplo 5 liofilizaram-se e fizeram-se passar através de uma coluna de G 75, superfino de acordo com o Exemplo 3. As fracções dotadas de actividade antitrombõtica foram eluídas numa gama de pesos moleculares de 20 a 30 000 Dt. Estas fracções foram reunidas e purificadas por meio de HPLC de fase invertida através de uma coluna RP 304 da firma Bio-Rad. 0 aparelho usado foi um Waters 600 Multisolvent Delivery System. Utilizou-se o seguinte gradiente: inicio 80 % de A - 20 % de B (com A = ATFA a 0,1 % e B = ATFA 0,1 % em acetonitrilo a 80 %) até 100 % de B num período de 60 minutos. Reuniram-se as fracções que continham a actividade antitrombõtica, liofilizaram-se e purificaram-se de novo por HPLC de fase invertida. Estabeleceu-se o seguinte gradiente: inicio 80 % de A : 20 % de B ( A = ATFA a o,l % e B ATFA o,l % em acetonitrilo a 80 %. Após um período de 40 minutos atingiu-se 50 % de B.
Nestas condições verificou-se para as fracções de ambliomina um tempo de retenção de 27 minutos. Exemplo 9 Determinação do peso molecular de ambliomina
Analisou-se a fracção de HPLC com um tempo de retenção de 27 minutos por meio de um gel de SDS-poliacrilamida. Para marcador de peso molecular utilizou-se o Electrophoresis Calibration Kit da firma Pharmacia (Art.
No. 17-0446-01). A ambliomina migra a curta distância abaixo da Carbon-Anhydrase, a qual estã descrita como tendo um peso molecular de 30 000 Dt. Para a ambliomina encontrou-se um peso molecular de 26 000 - 2 000 Dt.
Exemplo 10 Determinação do ponto isoeléctrico
Submeteu-se ambliomina isolada de acordo com o Exemplo 8 a uma focagem em camada fina, conforme descrito por Dr. Schulte et al. da firma LKB Instrument GmbH.
t
Determinou-se um ponto isoelectrico de 5,35 - 0,3.
Exemplo 11 Analise da sequência proteica da ambliomina
Nas nossas experiências não foi pos sivel sequenciar a extremidade N-terminal da proteína autêntica isolada a partir de carrapatos adultos. 0 material disponível
foi por esta razão submetido a cisão por tripsina. A fim de se conseguir uma cisão por tripsina quantitativa, derivatizou-se em primeiro lugar a proteina por meio de uma reacção de carboximetilação. Para este fim dissolveu-se a proteina em 24 ./(1 de tampão (guanidinio.HCI 8 M, tris.HCl 10 mM, EDTA 1 mM) e adicionaram-se 51 mg de DTE em 4 Ji.1 de tampão bem como 4,52 mg de 2-mercaptoetanol em 5 /Ll· Incubou-se a mistura reacional durante 1 hora a 37 ÇC e em seguida tratou-se com 8, 3 JLl de uma solução de iodoacetamida (iodoacetamida 0,25 M a pH ajustado a 8,0 com KOH) e incubou-se durante 1 hora â temperatura ambiente. Em seguida adicionaram-se 59 J* 1 de H20 para diluição e após adição de 400 A 1 de C2H3OH com agitação vigorosa verificou-se a existência de um precipitado que se separou por centrifugação a 12 000 rpm.
Em seguida agitou-se o sedimento com 100 /Cl de CHCl^, tratou-se com 300 /<1 de H20 e centrifugou-se novamente. Misturou-se a fase superior com 300 // 1 de C2H3OH. Centrifugou-se a mistura e dissolveu-se o sedimento para cisão por tripsina em 66/^1 de N-metilmorfolina 0,2 M (pH ajustado a 8,5 com ácido acético) . Em seguida adicionam-se 5>W1 de solução de tripsina (3,3 mg de tripsina em tampão de N-metilmorfolina) e incubou-se a mistura durante 2 horas à temperatura ambiente. Separaram-se em seguida os fragmentos da mistura por meio de uma fase de HPLC com uma coluna de microporos de fase invertida (coluna de microporos: 1 mm x 25 cm, fornecedor: Braun-Lee).
Para este fim estabeleceu-se um graduente linear de 10% de A - 60 % de B (A = 10 % de acetonitrilo em ãgua para HPLC + 0,1 % de ATFA; B = 10 % de H20 em acetonitrilo + 0,1 % de ATFA).
Isolaram-se facilmente três fracções correspondentes a três picos. Secaram-se estas fracções, uma de cada vez, no filtro de fibra de vidro do sequenciador de fase gasosa e submeteram-se a análise de sequência. Para este fim utilizou-se o Gas-Phase-Protein-Sequencer 470 A da firma Applied Biosystems com um sistema de identificação de PTH 'online'.
- 9- - ,.
Identificou-se a seguinte sequência par ciai de ácidos aminados, na qual X representa um lugar para um ãcido aminado de ocorrência natural.
a) Ile-Leu-Phe-Thr-Gln-Gly-Asn-X-Gly-Gln-Leu-Glu-Asn-X-Phe-Glu
b) Lys-Ile-Leu-Phe-X-Gln-Gly
c) Ala-Ser-Tyr-Ile-Val-X-Ser-Glu-Ser-Ile-Gln-Ile-Leu-X-Leu-Ser-Glu-Gly-Ile
Claims (1)
- REIVINDICAÇÕESProcesso para a preparação de uma pro teina dotada de actividade de inibição da trombina ou de um seu sal farmaceuticamente aceitavel caracterizado por se isolar a proteina a partir de carrapatos de carapaça e eventualmente transformã-la num sal farmaceuticamente aceitável.- 2aProcesso de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por a proteina referida apresentar um peso molecular de 20 000 a 30 000 Dalton, um ponto isoeléctrico entre 5,05 e 5,65 e a sequência parcial de ácidos aminados- Ile-Leu-Phe-Thr-Gln-Gly-Asn- X-Gly-Gln-Leu-Glu-Asn-X-Phe-Glu-Lys-Ile-Leu-Phe-X-Gln- e-Ala-Ser-Tyr-Ile-Val-X-Ser-Glu-Ser-Ile-Gln-Ile-Leu-X-Leu-Ser-Glu-Gly-Ileem que os resíduos X podem ser iguais ou diferentes e cada um representa um ãcido aminado de ocorrência natural.- 3aProcesso de acordo com qualquer das reivindicações 1 ou 2 caracterizado por a proteína referida apresentar um peso molecular de 26 000 + 2 000 DaltonProcesso de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3 caracterizado por a proteína referida apresentar um ponto isoeléctrico de 5,35.- 5aProcesso de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4 caracterizado por a proteína referida apresentar uma sequência parcial de ácidos aminados-Ile-Leu-Phe-Thr-Gln-Gly-Asn-X-Gly-Gln-Leu-Glu~Asn-X-Phe-Glu-Lys-Ile-Leu-Phe-X-Gln-Gly- e-Ala-Ser-Tyr-Ile-Val-X-Ser-Glu-Ser-Ile-Gln-Ile-Leu-X-Leu-Ser-Glu-Gly-Ileem que os residuos X podem ser iguais ou diferentes e cada um representar Tyr, Ser, Thr, Gin, Asp, Asn ou qualquer ácido ami nado modificado depois da tradução, como por exemplo trimetil-lisina ou ãcido carboxiglutânico.- 6aProcesso de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5 caracterizado por a proteína referida ser isolada a partir de Rhipicephalus evertsi.- 7aProcesso de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3caracterizado por a proteína referida ser isolada a partir de Amblyomma hebraeum,- 8aProcesso de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 6 ou 1, 3e7 caracterizado por o isolamento ser levado a efeito por meio de uma combinação de métodos de extracção e cromatogrâficos, abrangendo caso necessário a cisão enzimática da proteína e caso necessário a transformação da proteina obtida num seu sal fisiologicamente tolerável,
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