HU205148B - Process for producing amblyommin and process for producing pharmaceutical compositions comprising such compound as active ingredient - Google Patents
Process for producing amblyommin and process for producing pharmaceutical compositions comprising such compound as active ingredient Download PDFInfo
- Publication number
- HU205148B HU205148B HU892820A HU282089A HU205148B HU 205148 B HU205148 B HU 205148B HU 892820 A HU892820 A HU 892820A HU 282089 A HU282089 A HU 282089A HU 205148 B HU205148 B HU 205148B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- ser
- ile
- glu
- gly
- leu
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
- C07K14/43513—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from arachnidae
- C07K14/43527—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from arachnidae from ticks
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/56—Materials from animals other than mammals
- A61K35/63—Arthropods
- A61K35/646—Arachnids, e.g. spiders, scorpions, ticks or mites
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
- C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/855—Proteins from animals other than mammals or birds
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Insects & Arthropods (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Zoology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Description
A találmány az ambliommin nevű új hatóanyag előállítására vonatkozik, amely az antikoagulációs terápiában nyer alkalmazást.
Az antikoagulánsoknaknagy a jelentősége az orvosi gyakorlatban. Mint központi orvosi problémát nevezhetjük meg például a trombózisok megelőzését, az artériás reokkluziókprofüaxisát, trombózisokkezelését, a koagulopátiákat és az extrakorporális vérkeringést.
Az antikoagulációs terápiában jelenleg használatos gyógyszerek alkalmazása gyakran bizonyos nem-kívánatos hátrányokkal jár, például vérzések kockázatával, a trombocitákszámának csökkenésével, a központi idegrendszerre kifejtett hatással, intoleranciával vagy közvetett hatásokiad, mint amilyeneket például a heparinhatásávalkapcsolatbanfigyeltékmeg.
Walsmann és Markwardt/Die Pharmazie, 36,653 (1981)/ leírja a Hirudo medicinalis-há\ (orvosi pióca) kinyert hírűéin gyógyszerészeti jelentőségét. Ez egy 64-65 aminosavból álló polipeptid /Chan, EEBS, 164, 307 (1983); 4.668.662 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás/. Ez a peptid nagy specifitású trombin-gátló, amelynek úgy tűnik, nincs egyéb farmakológiai hatása. A vegyület hátránya a viszonylag rövid felezési idő és az, hogy csak parenterálisan lehet alkalmazni.
Szükség van tehát olyan antitrombotikus hatású vegyület előállítására, amely nem mutatja az említett hátrányokat. Ezért érdemes további antikoagulánsok után kutatni, amelyek optimálisan megfelelnek a fentebb tárgyalt orvosi problémáknak.
A pajzsos kullancsok, amelyek az Ixodidák családjához tartoznak, minden fejlődési stádiumukban átmeneti vérszívó ektoparazitái hüllőknek, madaraknak, emlősöknek és az embernek. A kifejlett nősténykullancsok általában több napon át a gazda-állaton maradnak és saját tömegük akár százszorosának megfelelő vérmennyiséget szívnak magukba. Ehhez a kullancsok szúró-szívó szájberendezéssel rendelkeznek, amely párosán elhelyezkedő chelicerákból és a hiposztómából áll. A chelicerák és a digitusok vágó-mechanizmusával a kullancsok sebet vágnak a felhámba és ebbe bevezetik a chelícérákat és a hiposztómát és ezáltal kialakul a szívó-csatorna. A kullancsfajták túlnyomó többségénél a nyálmirigyek egy fehérjét választanak ki, az úgynevezett cementet, amelyet beleeresztenek a sebbe, amelyben lehorgonyoznak a hiposztóma fogai és ami által a kullancsok szilárdan megtapadnak a gazdaállaton a táplálékfelvétel céljából.
A kullancsok továbbá váladékot bocsátanak ki a nyálmirigyekből, amely antikoaguláns anyagot tartalmaz.
A vérszívás céljából a kullancsok szájszervel nem hatolnak be közvetlenül a hajszál-vérerekbe, csak a szövetekbe. A nyálmlrigyek enzimjei segítségével ott feloldják a szöveteket és megsértik a legfinomabb kapillárisokat, amelyekből vér lép'ki. AnyálmirigyekváIadékának alvadásgátló hatása következtében a megsérültvéredények egy ideigvéreznek és egy szövet-vakuola keletkezik, amelyből a kullancsok a táplálékukat felveszik.
Ezért a vizsgálat tárgyává tettük kullancsok nyálmirigyét, hogy abból véralvadást gátló anyagokat nyerjünkki.
A találmány olyan proteinrevagy annakgyógyászati szempontból elfogadható sójára vonatkozik, amelyet pajzs-kullancsokból izláltunk, és amely a trombin ínaktiválásarévén gátolja avéralvadást
Bárezaproteinés ahirudinugyanaztaszubsztrátumot támdja meg, a két fehérje meglepő módon lényegesen különbözik egymástól. Ezért elvárható, hogy a találmány tárgyátképező fehérje - amelyet ambliomminnak nevezünk - a hirudintól eltérő orvosi értékelésben részesüljön. Az ambliommin új fehérje. Ez az első olyan hatóanyag, amelyet dél-afrikai tarka-kullancsoknyálmirigyéből izoláltak.
A találmány tárgya tehát eljárás trombingátló hatású fehérje - amelynek móltömege 20000-30000 és izoelektromos pontja 5,05 és 5,65 közötti - vagy e fehérje egy gyógyászatilag elfogadható sójának előállítására, azzal jellemezve, hogy pajzskullancsok nyálmirigyét homogenizáljuk és a fehérjét extrakciós és kromatográfiás eljárásokkal izoláljuk, majd kívánt esetben gyógyászatilag elfogadható sóvá alakítjuk.
Az ambliommint a következő fizikai tulajdonságok jellemzik. Viszonylag csekély affinitást mutat az ®Οοomassie Briliáns BlueR250 Bio-Rad-hoz. Liofilizálás után csak nehezen oldódik fel vízben. Ez a fehérje az összes alkalmazott pufferoldatban állandó. Ha HPLC (nagynyomású folyadékkromatográfla) után az eluátumot tisztított állapotban -80 °C-on megfagyasztjuk, nem észlelünk semmiféle aktivitás-csökkenést. A vegyület 40 °C-on is stabil. Acetonnal pH 1,8-nál (ecetsavval vagy triklór-ecetsawal beállítva) kicsapható. Emellett megfigyelhető, hogy a csapadékújra feloldása esetén legalább 12 napig a teljes aktivitás megmarad. Ha a HPLC-analízishez Waters 600 Multisolvant Delivery System-et és Biorad RP304 elválasztó oszlopot használunk és 80% A - 20% B gradienst alkalmazunk (ahol A = 0,1% trifluor-ecetsav (TFA) és B - 0,1 TFA-t tartalmazó 80%-os HPLC-vizes aeetonitril), úgy hogy 40 perces futtatási idő alatt a B 50%-os arányt ér el, akkor az amliommin retenciós ideje 27 percnek adódik. Superfine Matériái G 75-ön (Pharmacia) való gélszűrés szerint a fehérje molekulatömege 20000-30000; SDS-poli(akril-amid) gélben a móltömeg 2600 ± 2000, Az izoelektromos pont meghatározása körülbelül 5,35 ± 0,3 értéket szolgáltat. Végül a következő aminosav-rész-szekvenciákat határoztuk meg:
-Ile-Leu-Phe-Thr-GIn-Kly-Asn-X-Gly-Gln-Leu
-Asn-X-Phe-Glu-,
-Lys-Ile-Leu-Phe-X-Glu-Gly- és
-Ala-Ser-Tyr-Ile-Val-X-Ser-Glu-Ser-He-GIn-HeLeu-X-Leu-Ser-GIu-Gly-Heahol minden X-maradék azonos vagy különböző lehet és minden esetben valamilyen természetben általánosan előforduló aminosavat jelent, mint amilyen például a Tyr, Ser, GIu, Asp, Asn; vagy valamilyen transzláció által modifikált aminosavat, mint amilyen a trimetil-lizin vagy a y-karboxi-glutaminsav.
HU 205 148 Β
Mint biológiai tulajdonság kimagaslik a trombin specifikus gátlása, és ennek következtében a véralvadás gátlása. A találmány szerinti eljárással előállított 50 mg protein a 4. példa szerint véralvadási vizsgálatban 5 percnél hosszabbra növeli az alvadási időt (a mérést nem folytattuk 5 percnél hosszabb ideig), míg a kontroll (protein nélküli) kísérletben a plazma 17 másodperc alatt megalvadt. A találmány szerinti eljárással előállított protein mint antitromotikum nyer alkalmazást a gyógyászatban.
1. példa
Kullancs-mirigyek izolálása
A kullancsok nyálmirigye páros szerv és sagittális irányban helyezkedik el az elülső testfél jobb, illetve bal oldalán. Funkcionális állapotától függően a nyálmirigy az éhező példányoknál kicsi, és hatalmas a szívó állapotban levő kullancsoknál. A felhasznált kullancsok a dél-afrikai tarka-kullancsokhoz tartoznak, azAmblyomma hebraeum és Rhipicenhalus evertsi fajhoz, két olyan kolóniához, amelyet már évek óta, ismert módszerek alapján, laboratóriumban tenyésztenek.
Részlegesen teleszívott, 150-400 mg tömegű nőstényeket veszünk le a gazdaállatokról és azonnal felboncoljuk őket sztereomikroszkóp alatt, oly módon, hogy a kullancsokat Petri-csészékben mindkét oldalán ragadós papírhoz rögzítjük és pH 7,2-es foszfát-pufferoldattal megnedvesítjük azokat. Finom szikével végzett metszéssel a perifériák mentén feltárjuk a kullancsok felső és alsó oldalát, majd óvatosan kivesszük a nyálmirigyeket és nitrogénben mélyhűtjük.
2. példa
Hatóanyag kivonása a kullancsok mirigyeiből
AzAmblyomma hebraea fajhoz tartozó kullancsokból nyálmirigyeket izolálunk, majd nitrogén-atmoszférában, mozsárban finom porrá dörzsöljük. A homogenizátumot vízben oldjuk és liofilizáljuk. A száraz maradékot 40%-os acetonban 40 ’C-on, 30 percig erélyesen rázzuk, majd 15000 g-vel 10 percen át centrifugáljuk.Az üledéket a leírt módon ismét extraháljuk, a két extrakció felülúszóját egyesítjük, és 1 mól/1 koncentrációjú ecetsavoldat lassú hozzáadásával a pH-t 5-re állítjuk be.
A csapadékot lecentrifugáljuk és a tiszta felülúszót leszívjuk. A felülúszóhoz 10%-os, acetonban oldott triklór-ecetsavat adunk mindaddig, amíg a pH 1,81 lesz.
Ezután 10-szerestcrfogatú jéghideg acetont adunk hozzá, és 3,5 óráh át -20 ’C-on lecsapjuk az üledéket. A csapadékot 10 percen keresztül centrifugáljuk 6000 fordulat/perc-cel Sorvall hűtött centrifugában.
Az üledéket jéghideg acetonnal és éterrel mossuk, majd vízben újraszuszpendáljuk. A szuszpenziót -80 ’C-on megfagyasztjuk, majd rotációs vákuum elpárologtatóbandiofilizáljufe A száraz maradékot 0,4 mól/1 NáCb-of :ttetaltóaző/0;05 mól/1 koncentrációjú trietanol-amin-HCl pufferben felvesszük.
3. példa ,
Gélszürés
A 2. példában nyert fehérje-keveréket gélszűréssel tisztítjuk, Superfine Matériái G75-tel (Pharmacia) töltött,6cmátmérőjűés78,3 cm magas oszlopothasználva. Az áramlási sebesség 10 ml/óra. Az oszlopot a Pharmacia gél gélszűréses kalibráló készletével hitelesítjük (Art. No. 17;0442-01). Trombingátló aktivitást azokban a frakciókban találtunk, amelyek a 2000030000 molekulatömeg-tartományba esnek.
4. példa
Plazma-olvadás gátlása
A G75-ön való gélszűréssel nyert egyes frakciókból 50 μΐ-es alkivotokat összekeverünk 50 μ vízzel és 100 μΐ, citráttal kezelt kutyaplazmával, amely 3 egység/ml trombint tartalmaz és meghatározzuk a trombin-időt. A meghatározást Markwardt és munkatársai [Pharmazie 43, 202 (1988); Föl. Haematol, 115,70 (1988)] módszere szerint végezzük.
5. példa
Chromozym Th trombin által katalizált hasadásának gátlása
A meghatározott Griesbach és munkatársai [Thromb. Rés. 37, 347-350 (1985)] közleménye alapján végezzük. A módszert annyiban módosítottuk, hogy a reakciót mikrotitrátor-lemezen végezzük, mikőris a végső térfogat 0,2 ml. Az értékelés 405 nm-nél történik Elisa-leolvasó készülék segítségével.
6. példa
Tisztás trombinoszlopon affinitási kromatográfiás eljárással
A trombin-sepharose-t Walsmann P. módszere szerint állítjuk elő |Pharmazie 36,860-861 (1981)].
Az aktivitást mutató G75-frakciókat egyesítjük, líofilizáljuk és a liofilizátumot 0,1 mól/1 koncentrációjú ecetsavban oldjuk. A mintákat hűtött G25 oszlopon sótalanítjuk és az eluátum aktivitását az 5, példa szerinti módon vizsgáljuk. Az aktív frakciókat egyesítjük és liofilizáljuk. A szárított maradékot 0,05 mól/1 koncentrációjú Tris-HCl-ben oldjuk (pH 8) és a fentiek szerint előkészített trombin-oszlopra visszük fel. Valamennyi lépést 4 °C-on végezzük.
Az oszlopot kétszer átmossuk 0,05 mól/1 koncentrációjú Tris-pufferrel (pH 8), majd 5 mól/1 benzamidinium-kloridot tartalmazó 0,05 mól/1 koncentrációjú Tris-HCl pufferrel (pH 8) eluáljuk. A frakciókat felfogjuk, alikvotokat veszünk ki, egyesítjük és vízzel szemben dializáljuk, majd megvizsgáljuk trombingátlásukat. A legnagyobb aktivitást mutató frakciókat dializáljuk és liofilizáljuk.
A liofilizátumot SDS-poli(akril-amid) gélen elektroforézissel és rákövetkező ezüst-festéssel analizáljuk, a Bio-Rad cég által gyártott megfestő-készlet alkalmazásával. A körülbelül 25000 középértékű móltömeg-tartományban egy protein-sávot találunk, amelyet az oszlop eluálásakor, a kullancspróba felvitele nélkül nem észlelünk.
HU 205148 Β
7. példa
Kullancsok tenyésztése
A Rhipicephalus evertsi fajhoz tartozó három fejlődési szakaszos (lárva, báb, felnőtt), kullancsok tenyésztését Th. Hiepe módszerével végezzük (Lehrbuch dér Parasitologíe, 4. kötet, Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1982,46. oldaltól). Atenyésztés 3-4 hónapotveszígénybe.
Anőstény-kullancsokat 28 “C-on és 90%-ot meghaladó levegőnedvesség mellett tartjuk peterakásig. Amikor a lárvák nyüzsögni kezdenek, ezeket házinyulakra helyezzük első táplálkozás céljából. A jóllakás után történik a bábbá válás. Ezeket házinyulakra rakjuk a második vérszívás biztosítása végett. A bábok miután teleszívták magukat - a differenciálódás stádiumába lépnek és kifejlett hímekké és nőstényekké válnak.
A differenciálódás lefolyása után a kifejlett állatokathasználjukfel.
8. példa
Amliommin izolálása kifejlett kullancsokból
A kifejlett kullancsokat vízben, Ultra-Turrax-készülékben (amelyet a Janke és Kunkel céggyárt) felaprítjuk. A homogenizált kullancsokat ezután 40 percen át 40 “C-on inkubáljuk, majd 30 percen keresztül 10000 fordulat/perc sebességgel, 5 °C-on, Sorvallcentrifugában centrifugáljuk. Az üledéket vízben újraszuszpendáljuk és ismét inkubáljuk 40 °C-on 30 percen keresztül, majd centriguáljuk. A két centrifugálás felülúszóját egyesítjük és kékszalagos szűrőn szűrjük. A tiszta szűrletet liofilizáljuk, a maradékot 20 mmól/I koncentrációjú Tris-HCl-ban (pH 7,5) felvesszük, majd Q-Sepharose-on gyorskromatográfiás eljárással [Gradiens: 0-1 mól/I NaCl 20 mmól/1 koncentrációjú Tris-HCl-ban (pH 7,5)] tisztítjuk. Az ambliommintartalmú frakciókat az 5. példában leírtak szerint azonosítjuk, liofilizáljuk és G75 oszlopon kezeljük a 3. példában megadottak szerint. Az antitrombin-hatású frakciók a 20000-30000 móltömeg-tartományban eluálódnak. Ezeket egyesítjük és fordított fázisú HPLC eljárással Βΐο-Rad RP 304 oszlopon tisztítjuk. Ehhez Waters 600 Multisolvent Delivery System készüléket használunk és a következő gráf ienst alkalmazzuk:
kiindulási 80% A - 20% B (ahol A=0,1%-os TFA és B= 0,1% TFA 80%-os vizes acetonitrilben) és B arányát 100%-ig növeljük 60 perc futtatási idő alatt. Az antitrombin-hatású frakciókat egyesítjük, lioflizáljuk és fordított fázisú HPLC eljárással ismételten tisztítjuk a következő gradiens alkalmazásával: kiindulásnál 80% A - 20% B (A = 0,1%-os TFA, B = 0,1% TFA 80%-os vizes acetonitrilben), és B arányát 50%-ig növeljük 40 percen futtatási idő alatt.
Ilyen feltételek mellett az ambliommin-frakció retenciós ideje 27 perc.
9. példa
Ambliommin molekulatömegének meghatározása
A27 perces retenciós időnekmegfeleló'HPLCfrakciót 17,5%-os SDS-poli(akril-amid) gélen analizáljuk.
„Molekulatömeg-marker”-ként a Pharmacia cég elektroforézis kalibrációs készletét (Elekfrophoresis CalibrationKit, Art. No. 17-0446-01) használjuk. Ebben arendszerben az ambliommin valamivel a karbon5 anhidráz alattvándorol, amelynek ismert molekulatömege 30000. Az ambliommin molekulatömege 26000 ± 2000-nek adódik.
10. példa
Izoelektromos pont meghatározása
A 8. példa szerint izolált ambliommint ultravékonyrétegű fókuszálásnak vetjük alá Dr. Schulte és munkatársai javaslata szerint (LKB Instrument GmbH). Az izoelektromos pontot 5,35 + 0,3-nak találjuk.
11. példa
Ambliommin protein-szekvencia-analÍzise Az autentikus, kifejlett kullancsokból izolált proteint nem sikerült N-terminális szekvenálással analizál20 ni. Ezért a rendelkezésre álló anyagot tripszinnel hasítottuk. Ahhoz, hogy lehetővé tegyük a tripszinnel való kvantitatívhasítást, előbb a fehérjéből annak karboximetilezett származékát kell előállítani. Ehhez a proteint feloldjuk 24 μΐ pufferben (8 mól/1 guanidín-HCl,
10 mmól/1 Tris, 1 mmól/I EDTA) és hozzáadunk 51 pg DTE-t 4 μΐ pufferben, valamint 4,52 pg 2-merkaptoetanolt5 pl-ben.
Areakcióelegyet 1 óra hosszat inkubáljuk 37 °C-on, majd 8,3 μΐ jód-acetamid-oldatot adunk hozzá (0,25 mól/I jód-acetamid, pH 8,0 KOH-dal beállítva) és 1 óra hosszat inkubáljuk szobahőmérsékleten. Ezután 59 pl vízzel hígítjuk és 400 pl etanol hozzáadása és erőteljes rázás után a csapadékot 12000 fordulat/perccel lecentrifugáljuk.
Ezután a csapadékot 100 pl kloroformmal rázzuk össze, és 300 pl vizet adunk hozzá, majd ismét centrifugáljuk az anyagot. A felső fázishoz 300 pl etanolt adunk és összekeverjük. A keveréket lecentrifugáljuk és az üledéket 66 pl 0,2 mől/l koncentrációjú N-metil40 morfolinban (pH 8,5 ecetsavval beállítva) oldjuk a tripszinnel való hasításhoz. Ezután 5 pl tripszinoldatot (3,3 pg tripszin N-metil-morfolin-pufferben) adunk hozzá és az elegyet 2 órán át inkubáljuk szobahőmérsékleten.
A fragmentumok keverékét ezután szétválasztjuk Mikro-Bore-oszIopon fordított fázisú HPLC eljárás. sál (Mikro-Bore oszlop: 1 mm x 25 cm, előállító: Braun-Leecég).
Ehhez lineáris gradienst állítunk be 10% A - 60%
B-ből (A = 10% acetonitril HPLC-vízben+0,1% TFA; B = 10% H2O acetonitrilben+0,1% IFA).
Három csúcs-frakciót jól el lehet különíteni. Ezeket a gázfázisú szekvenátor üvegszálszűrőjén külön-külön beszárítjuk és szekvencia-analízisnek vetjük alá. Eh55 hez az Applied Biosystems cég OnlinePIH-azonosítórendszerrel ellátott 470 A Gas Phase Protein Sequencer-ét használjuk.
A következő részleges aminosav-szekveuciákat azonosítjuk, ahol X egy természetben előforduló ami50 nosavhelyét jelzi.
i
HU
a) Ile-Leu-Phe-Thr-Gln-Gly-Asn-X-Gly-Gln-Leu
-Glu-Asn-X-Phe-Glu,
b) Lys-Ile-Leu-Phe-X-Glu-Gly,
c) Ala-Ser-Tyr-IIe-Val-X-Ser-Glu-Ser-Ile-Gln-IleGln-He-Leu-X-Leu-Ser-Glu-Gly-He.
Claims (8)
1. Eljárás trombingátló hatású fehérje - amelynek móltömege 20000-30000 és izoelektromos pontja 5,05 és 5,65 közötti - vagy e fehérje egy gyógyászatilag elfogadható sójának előállítására, azzal jellemezve, hogy pajzskullancsok nyálmirigyét homogenizáljuk és a fehérjét extrakciós és kromatográfiás eljárásokkal izoláljuk, majd kívánt esetben gyógyászatilag elfogadható sóvá alakítjuk.
2. Azl. igénypont szerinti eljárás olyan fehérje előállítására, amely a következő részleges aminosav-szekveneiákkal rendelkezik:
-Ile-Leu-Phe-Thr-Gln-Gly-Asn-X-Gly-Glu-LeuAsn-X-Phe-Glu-, és
-Lys-Ile-Leu-Phe-X-Gln-Gly- és
-Ala-Ser-Tyr-Ile-Val-X-Ser-Glu-Ser-Ile-Gln-IleLeu-X-Leu-Ser-Glu-Gly-Ileahol X azonos vagy különböző lehet és minden esetben valamely természetben előforduló aminosavat jelent, azzal jellemezve, hogy a megfelelő izolálási eljárásokat alkalmazzuk,
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás olyan fehérje előállítására, amelynek molekulatömege 26000 ± 2000, azzal jellemezve, hogy a megfelelő izolálási eljárásokat alkalmazzuk.
205 148 B 2
4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás olyan fehérje előállítására, amelynek izoelektromos pontja 5,35, azzal jellemezve, hogy a megfelelő izolálási eljárásokat alkalmazzuk.
5 5. Az 1-4, igénypontok bármelyike szerinti eljárás olyan fehérje előállítására, amely a következő aminosav-szekvenciákat tartalmazza:
-Ile-Leu-Phe-Thr-Gln-Gly-Asn-X-Gly-Glu-LeuAsn-X-Phe-Glu-,
10 -Lys-Ile-Leu-Phe-X-Gln-Gly- és
-Ala-Ser-Tyr-Ile-Val-X-Ser-Glu-Ser-Ile-Gln-IleLeu-X-Leu-Ser-Glu-Gly-Ileahol X azonos vagy különböző és Tyr-t, Ser-t, Thr-t,
Gln-t, Asp-t, Asn-t vagy valamely transzláció által mó15 dosított aminosavat - például trimetil-lizint vagy karboxi-glutaminsavat - jelent, azzal jellemezve, hogy a megfelelő izolálási eljárásokat alkalmazzuk.
6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy
20 pajzskulíancsként Rhipicephalus evertsi-t alkalmazunk.
7. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy pajzskullancsként Amblyomma hebraeum-ot alkal25 mázunk.
8. Eljárás gyógyászati készítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1-6. igénypontok bármelyike, vagy 13, és 7. igénypontok bármelyike szerinti eljárással előállított fehérjét a gyógyszerkészítésben szo30 kásosan használt hordozó- és/vagy egyéb segédanyagokkal összekeverjük és gyógyászati készítménnyé alakítjuk.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3819078A DE3819078A1 (de) | 1988-06-04 | 1988-06-04 | Amblyommin, ein neuer wirkstoff fuer die antikoagulationstherapie |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUT52117A HUT52117A (en) | 1990-06-28 |
| HU205148B true HU205148B (en) | 1992-03-30 |
Family
ID=6355878
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU892820A HU205148B (en) | 1988-06-04 | 1989-06-02 | Process for producing amblyommin and process for producing pharmaceutical compositions comprising such compound as active ingredient |
| HU94P/P00042P HU210528A9 (en) | 1988-06-04 | 1994-11-09 | Tick-derived amblyommin and method of antithrombin therapy |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU94P/P00042P HU210528A9 (en) | 1988-06-04 | 1994-11-09 | Tick-derived amblyommin and method of antithrombin therapy |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5093322A (hu) |
| EP (1) | EP0345614B1 (hu) |
| JP (1) | JP2703993B2 (hu) |
| KR (1) | KR0138531B1 (hu) |
| AT (1) | ATE107666T1 (hu) |
| AU (1) | AU618364B2 (hu) |
| CA (1) | CA1339189C (hu) |
| DE (2) | DE3819078A1 (hu) |
| DK (1) | DK270489A (hu) |
| ES (1) | ES2056149T3 (hu) |
| FI (1) | FI93697C (hu) |
| HU (2) | HU205148B (hu) |
| IE (1) | IE64674B1 (hu) |
| IL (1) | IL90508A (hu) |
| NO (1) | NO175900C (hu) |
| NZ (1) | NZ229401A (hu) |
| PT (1) | PT90739B (hu) |
| ZA (1) | ZA894181B (hu) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5385885A (en) * | 1988-01-15 | 1995-01-31 | Gasic; Gregory P. | Inhibition of smooth muscle cell proliferation by antistasin and tick anticoagulant peptide |
| DE3931839A1 (de) * | 1989-09-23 | 1991-04-04 | Basf Ag | Neue proteine und ihre herstellung |
| DE4136513A1 (de) * | 1991-11-06 | 1993-05-13 | Basf Ag | Neues thrombininhibitorisches protein aus raubwanzen |
| US5321010A (en) * | 1991-12-10 | 1994-06-14 | Merck & Co., Inc. | Proteins for inhibiting adhesion of platelets to collagen |
| CA2150909A1 (en) * | 1992-12-04 | 1994-06-23 | Christiane Noeske-Jungblut | Clotting inhibitor made from protostomia saliva |
| GB2304048A (en) * | 1995-08-12 | 1997-03-12 | John William Carson | Medicament containing saliva extract |
| US20050033022A1 (en) * | 1997-09-26 | 2005-02-10 | Smithkline Beecham Biologicals Sa | Fusion proteins comprising HIV-1 Tat and/or Nef proteins |
| BRPI0406057B1 (pt) * | 2004-09-15 | 2021-10-26 | União Química Farmacêutica Nacional S/A | Sequência nucleotídica de um inibidor de proteases do tipo kunitz obtida a partir de uma biblioteca de cdna de glândulas salivarares de carrapatos amblyomma cajennese uso da proteína recombinante |
| KR102429287B1 (ko) | 2015-12-10 | 2022-08-05 | 가부시끼가이샤 메니콘 | 펩티드 조성물 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3438296A1 (de) * | 1984-04-18 | 1985-11-07 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Neue polypeptide mit blutgerinnungshemmender wirkung, verfahren zu deren herstellung bzw. gewinnung, deren verwendung und diese enthaltende mittel |
| NO170430C (no) * | 1986-09-18 | 1992-10-14 | Pennsylvania Hospital | Fremgangsmaate for fremstilling av et protein som har antikoagulerende og anti-metastatiske egenskaper |
| US4832849A (en) * | 1988-06-16 | 1989-05-23 | Merrell Dow Pharmaceuticals Inc. | Extraction and purification of an anticoagulant principle from the south american leech, haementeria ghilianii |
| CA2024697A1 (en) * | 1989-09-07 | 1991-03-08 | George P. Vlasuk | Protein having anticoagulant properties |
-
1988
- 1988-06-04 DE DE3819078A patent/DE3819078A1/de not_active Withdrawn
-
1989
- 1989-05-30 DE DE58907930T patent/DE58907930D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1989-05-30 AT AT89109770T patent/ATE107666T1/de not_active IP Right Cessation
- 1989-05-30 EP EP89109770A patent/EP0345614B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1989-05-30 ES ES89109770T patent/ES2056149T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1989-06-01 AU AU35954/89A patent/AU618364B2/en not_active Ceased
- 1989-06-01 FI FI892690A patent/FI93697C/fi not_active IP Right Cessation
- 1989-06-02 KR KR1019890007559A patent/KR0138531B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1989-06-02 NZ NZ229401A patent/NZ229401A/xx unknown
- 1989-06-02 PT PT90739A patent/PT90739B/pt not_active IP Right Cessation
- 1989-06-02 CA CA000601594A patent/CA1339189C/en not_active Expired - Fee Related
- 1989-06-02 NO NO892266A patent/NO175900C/no unknown
- 1989-06-02 US US07/360,573 patent/US5093322A/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-06-02 IL IL9050889A patent/IL90508A/en not_active IP Right Cessation
- 1989-06-02 JP JP1139377A patent/JP2703993B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1989-06-02 ZA ZA894181A patent/ZA894181B/xx unknown
- 1989-06-02 DK DK270489A patent/DK270489A/da not_active Application Discontinuation
- 1989-06-02 HU HU892820A patent/HU205148B/hu not_active IP Right Cessation
- 1989-06-12 IE IE181489A patent/IE64674B1/en not_active IP Right Cessation
-
1994
- 1994-11-09 HU HU94P/P00042P patent/HU210528A9/hu unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NO175900C (no) | 1994-12-28 |
| EP0345614A2 (de) | 1989-12-13 |
| CA1339189C (en) | 1997-07-29 |
| FI93697C (fi) | 1995-05-26 |
| IE64674B1 (en) | 1995-08-23 |
| NZ229401A (en) | 1991-10-25 |
| AU618364B2 (en) | 1991-12-19 |
| DE3819078A1 (de) | 1989-12-07 |
| EP0345614B1 (de) | 1994-06-22 |
| FI892690A0 (fi) | 1989-06-01 |
| EP0345614A3 (en) | 1990-10-10 |
| DK270489A (da) | 1989-12-05 |
| JP2703993B2 (ja) | 1998-01-26 |
| HUT52117A (en) | 1990-06-28 |
| FI93697B (fi) | 1995-02-15 |
| DE58907930D1 (de) | 1994-07-28 |
| JPH0232100A (ja) | 1990-02-01 |
| PT90739B (pt) | 1994-10-31 |
| NO892266L (no) | 1989-12-05 |
| HU210528A9 (en) | 1995-04-28 |
| KR0138531B1 (ko) | 1998-04-30 |
| ATE107666T1 (de) | 1994-07-15 |
| NO892266D0 (no) | 1989-06-02 |
| IL90508A0 (en) | 1990-01-18 |
| FI892690A (fi) | 1989-12-05 |
| IL90508A (en) | 1994-12-29 |
| NO175900B (no) | 1994-09-19 |
| DK270489D0 (da) | 1989-06-02 |
| ES2056149T3 (es) | 1994-10-01 |
| IE891814L (en) | 1989-12-04 |
| AU3595489A (en) | 1989-12-07 |
| US5093322A (en) | 1992-03-03 |
| ZA894181B (en) | 1990-02-28 |
| PT90739A (pt) | 1989-12-29 |
| KR910001040A (ko) | 1991-01-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6121435A (en) | Nematode-extracted serine protease inhibitors and anticoagulant proteins | |
| EP0317053B1 (en) | Trigramin- a platelet aggregation inhibiting polypeptide | |
| US5066592A (en) | Trigramin - a platelet aggregation inhibiting polypeptide | |
| US5472942A (en) | Anti-thrombins | |
| HU205148B (en) | Process for producing amblyommin and process for producing pharmaceutical compositions comprising such compound as active ingredient | |
| JP3537437B2 (ja) | トロンビンインヒビター | |
| CA2203827A1 (en) | Novel family of protease inhibitors, and other biologic active substances | |
| de León et al. | Anticoagulant Activity in Salivary Glands of the Insect VectorCulicoides variipennis sonorensisby an Inhibitor of Factor Xa | |
| WO1994025000A1 (en) | Hookworm anticoagulant | |
| EP0239644A1 (en) | Novel physiologically active substance having blood coagulation controlling activity | |
| KR100261657B1 (ko) | 룸부로키나제의 제조방법 | |
| US5981469A (en) | 78 residue polypeptide (NK-lysine) and its use | |
| Wang et al. | A 40-kilodalton protein with growth inhibitory activity against the adzuki bean weevil in seeds of Vigna mungo | |
| IL93915A (en) | Peptides from hirudinaria manillensis having anti-thrombin activity and their use. |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HMM4 | Cancellation of final prot. due to non-payment of fee |