JPH0967396A - 血液凝固阻害活性を持つタンパク質、その製造方法および血液凝固阻害剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 血液凝固カスケード因子に特異的にかつ効率
的に阻害する副作用の少ない血液凝固阻害物質、その製
造方法および血液凝固阻害剤を提供する。 【解決手段】 吸血性昆虫の唾液腺により単離された血
液凝固阻害活性を持つタンパク質Ａ。Ｎ末端から３６個
のアミノ酸が配列番号１で示されるアミノ酸配列を有す
る血液凝固阻害活性を持つタンパク質Ａ。配列番号１で
示されるアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを組込んだ
バキュロウィルスを感染させたカイコ又はカイコ培養細
胞を飼育または培養し、その飼育体または培養物から血
液凝固活性を有するタンパク質Ａを採取または回収する
ことを特徴とするタンパク質Ａの製造方法。前記タンパ
ク質Ａを有効成分として含有する血液凝固阻害剤。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、血液凝固阻害活性
を持つタンパク質、その製造方法および血液凝固阻害剤
に関する。

【０００２】

【従来の技術】日本人の４人に１人が老人となる超高齢
社会は既に目前に迫り我が国は高齢化社会へと進展して
いる。人口の老齢化につれて、老人病領域での疾患が増
えつつある。血液が血管を塞ぐことにより生ずる心筋硬
塞、狭心症等の心臓疾患ならびに脳血栓等の血栓症に起
因する死亡の増加が目立っている。血栓が原因で起こる
これらの疾患を予防したり治療するためには、血栓形成
が抑制でき、血管内で一旦形成した血栓を溶解する性能
を持ち、かつ副作用が無い血液凝固阻害剤の製造ならび
に開発に強い関心が寄せられている。

【０００３】哺乳動物等の血液を摂食するサシガメ類
は、その唾液腺から血液凝固阻害物質を分泌しながら吸
血する。唾液腺に含まれる血液凝固阻害物質は、宿主の
血液を凝固させないで吸血するのに都合の良い性質を持
っている。

【０００４】生体組織が傷を受け血管が損傷して出血す
ると、血液中の血小板が活性化してやがて血液は凝固
し、血栓を形成する。血液凝固系のバランスがくずれて
血栓ができ易くなっている病気が血栓症であり、血液凝
固を積極的に遅延させる血液凝固阻害剤は、血栓症等の
疾患の治療、予防に大変重要である。血液凝固阻害剤と
しては、動物の小腸から抽出されるヘパリンの他に、ク
エン酸ソーダあるいは４−ヒドロキシクマリン等が知ら
れている。これらの血液凝固阻害剤は血栓の発生の予防
あるいは進展の防止、さらには形成した血栓の溶解、除
去用等の臨床分野で利用されている。こうした従来の血
液凝固阻害剤で血液凝固を阻止させる上の問題点は、凝
固カスケード系での阻害の特異性が一般的には低い点に
ある。このような特異性の低い血液凝固阻害剤を用いて
血液凝固を阻害させる場合には多量の血液凝固阻害剤が
必要となり、これに伴い、例えば出血の危険、血小板の
減少、不耐性等の間接的な悪い副作用が起こる危険性が
あった。

【０００５】また、血液凝固阻害剤の他の例としては、
ヒト血液由来のＡＴIII、大豆由来のクニッツ血栓凝固
抑制剤、ヒル（Ｈｉｒｕｄｏ ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉ
ｓ）から単離され、トロンビンと選択的に作用しかつ強
力なインヒビターであるヒルジン、血栓溶解剤のウロキ
ナーゼ、ＴＰＡなどが挙げられる。これらの血液凝固阻
害物質を用いる場合にあっても、副作用を伴うとか、血
液凝固カスケード因子に特異的には作用しない等の問題
点があった。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、血液凝固カ
スケード因子に特異的にかつ効率的に阻害する副作用の
少ない血液凝固阻害物質、その製造方法および血液凝固
阻害剤を提供することをその課題とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記課題
を解決すべく鋭意研究を重ね、吸血性昆虫の血液凝固阻
害因子が動物の血液の凝固を阻害することに着目した。
そこで、本発明者らは、その血液凝固阻害因子の阻害活
性の基質特性を解析し、当該因子の分子量、アミノ酸組
成、アミノ酸配列の構造を解明するとともに、その血液
凝固阻害因子のｍＲＮＡの抽出とｃＤＮＡクローニング
を進めて、ｃＤＮＡの塩基配列を解析し、バキュロウイ
ルス系で吸血性昆虫の唾液腺に含まれる血液凝固阻害因
子の機能を発現させて、優れた機能を持つ生理活性タン
パク質を得ることに成功した。すなわち、本発明によれ
ば、吸血性昆虫の唾液腺により単離された血液凝固阻害
活性を持つタンパク質Ａが提供される。また本発明によ
れば、Ｎ末端から３６個のアミノ酸が配列番号１で示さ
れるアミノ酸配列を有する血液凝固阻害活性を持つタン
パク質Ａが提供される。さらに本発明によれば、配列番
号１で示されるアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを組
込んだバキュロウィルスを感染させたカイコ又はカイコ
培養細胞を飼育または培養し、その飼育体または培養物
から血液凝固活性を有するタンパク質Ａを採取または回
収することを特徴とするタンパク質Ａの製造方法が提供
される。さらにまた、本発明によれば、前記タンパク質
Ａを有効成分として含有する血液凝固阻害剤が提供され
る。

【０００８】本発明の血液凝固阻害活性を持つ生理活性
タンパク質Ａは、吸血性昆虫の唾液線由来の血液凝固阻
害活性を示し、血液凝固カスケード系の血液凝固因子、
例えば、第８因子、第９因子、第８因子・第９因子・リ
ン脂質複合体等を阻害し、さらにそのリン脂質複合体の
形成を阻害し、血液の凝固を効果的に防止する。

【０００９】

【発明の実施の形態】本発明において、血液凝固阻害因
子を含む唾液腺内容物を抽出することができる吸血性昆
虫としては、オオサシガメ、ブラジルサシガメ、アカモ
ンサシガメ等のサシガメ類が例示できる。これらの吸血
性昆虫の中で、オオサシガメは、形が大きく、多量の唾
液腺内容物を取り出すのに適している。オオサシガメ
は、成長期間が約２．５ヶ月と他のサシガメよりも比較
的短く、実験室飼育が容易である。サシガメ飼育用の吸
血宿主としては、哺乳類一般が利用でき、ラット、モル
モット、イヌ、ウサギ等が例示できる。

【００１０】サシガメ類の唾液腺に含まれる血液凝固阻
害因子を単離するには、解剖して唾液腺を取り出し、唾
液腺の摩砕液から先ず粗血液凝固阻害因子を抽出する必
要がある。そのためにはウサギ等の吸血宿主に寄生さ
せ、唾液腺のできるだけ大きい時期、即ち成虫まで飼育
して用いることが望ましい。さらにサシガメを１週間以
上絶食させておくことにより唾液腺より凝血阻害因子を
多量に単離することができる。雄雌の区別なくサシガメ
成虫の唾液腺は抽出材料になる。摘出した唾液腺は生理
食塩水で再度注意深くリンスした後、氷冷下で貯蔵す
る。これを−８０℃の超低温フリーザーあるいは液体窒
素中に入れておくと長期に保存することができる。

【００１１】唾液腺は、０〜４℃の生理食塩水（０．９
％ ＮａＣｌ）を加えて、エッペンドルフチューブ内に
てガラス棒で押し潰すようにして摩砕する。摩砕液を４
℃、７，０００ｒｐｍの回転速度で１０分間遠心分離し
て得られる上清を採取する。収率を上げるためには、沈
殿部分に生理食塩水を加え同様にして抽出を合計３回以
上繰り返し、上清を一括して集める。得られた唾液腺粗
抽出液は場合により７０℃で１０分間熱処理することに
よって、本発明における目的以外のタンパク質を沈殿さ
せて除去することができ、かつ、目的の凝血阻害因子を
効率的に単離することができる。熱処理温度を７０℃以
上にすると唾液腺に含まれる坑凝血因子の活性が低下す
るので熱処理温度が７０℃をあまり越えないように留意
する必要がある。熱処理後の上清部分を併合し、さらに
食塩水を添加して唾液腺抽出液（ＳＧ Ｅｘｔｒａｃ
ｔ）を得、該抽出液を１００μｌづつ分注し、−８０℃
以下に凍結保存し、次の実験に用いる。

【００１２】本発明によれば、タンパク質Ａをコードす
るｃＤＮＡを組込んだ慣用のバキュロウィルス（学術
名：カイコ核多角体病ウィルス）を感染させたカイコ
（学術名：Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）又はカイコ培養細
胞を飼育または培養し、その飼育体または培養物からタ
ンパク質Ａを採取または回収することにより、工業的に
タンパク質Ａを生産することができる。タンパク質Ａを
コードするｃＤＮＡは、配列番号２の塩基配列を有す
る。このｃＤＮＡは、常法に従って、吸血性昆虫の唾液
腺から抽出したＲＮＡをｐｏｌｙＡ（＋）ＲＮＡとし、
更にｃＤＮＡとなし、λｇｔ１１に組み込んでライブラ
リーを作製した後、タンパク質Ａに対するポリクローナ
ル抗体を用いてスクリーニングし、タンパク質ＡｃＤＮ
Ａのクローン化を行うことにより得ることができる。

【００１３】

【実施例】次に本発明を実施例を挙げて具体的に説明す
るが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。

【００１４】実施例１ オオサシガメの唾液腺の単離 オオサシガメ（Ｒｈｏｄｎｉｕｓ ｐｒｏｌｉｘｕｓ）
はウサギを宿主として吸血させた。オオサシガメは成虫
を雌雄を区別せずに対象にし、２５℃長日（日長１６時
間）環境下で飼育した。オオサシガメは体長約２ｃｍ、
体幅６〜７ｍｍの吸血性昆虫である。ウサギ等の吸血宿
主から十分吸血した直後のオオサシガメの体重は、平均
０．７〜１．０ｇに達する。できるだけ唾液腺内容物が
多く取れるように吸血後１週間以上絶食させた後唾液腺
を採取した。接着テープでオオサシガメをぺトリ皿に固
定して、氷冷した０．９％の生理食塩水で覆い、立体顕
微鏡下に解剖した。詳細には、前胸と中胸間を切断し、
体内の唾液腺（長さ２ｍｍ、幅０．６ｍｍ）を取り出し
た。生理食塩水で唾液腺表面の体液を流し落とした後、
唾液腺内容物の活性が低下しないようにするために液体
窒素中に浸漬し実験するまでの間保存した。

【００１５】実施例２ オオサシガメ唾液腺からの活性物質の抽出 実施例１で述べたようにして液体窒素に保存した唾液腺
から次の方法で生理活性物質を抽出した。５００匹のオ
オサシガメ成虫から摘出した唾液腺の重量は湿潤状態で
約０．２ｇであった。解剖的に取り出した５００匹のオ
オサシガメの唾液腺に５℃の生理食塩水（０．９％Ｎａ
Ｃｌ）を３００μｌ加え、エッペンドルフチューブ内に
おいてガラス棒で唾液腺を潰すようにして摩砕した。遠
心分離中の試料温度は４℃、回転数は７、０００ｒｐ
ｍ、遠心分離時間は１０分とした。遠心分離後、約５０
０μ１の上清を採取した。遠心管底に付着した沈殿に３
００μｌの生理的食塩水を加えて上記の抽出操作を計３
回繰り返した。各遠心処理で得られた上清部分を合一し
て、これに生理食塩水を加えて合計量が１５００μｌに
なるように調整し、これを唾液腺抽出液（以下、単にＳ
ＧＥとも言う）として、下記以降の実施例で使用した。

【００１６】実施例３ 血液凝固阻害活性の測定（クエン酸血漿） 唾液腺抽出液（ＳＧＥ）の血液凝固活性は、次のように
して２５℃で評価した。生理食塩水に塩化カルシウムが
５０ｍＭになるように加えた液１０μｌを内径１ｃｍの
パイレックス製のガラス試験管に入れ、ＳＧＥを一定量
（０．２〜１０μｌ）加えた。これに採血したクエン酸
血漿を２００μｌ加えてよく混ぜてから試験管を２５℃
インキュベーター内に直立させ、１０秒毎に一回静かに
試験管を傾けて血液が凝固するのを目測して、凝固する
までに要した時間（凝固時間）を観察した。対照区とし
ては、ＳＧＥを含まない生理食塩水を用いた。クエン酸
血液またはクエン酸血漿は、プラスチック注射器でウサ
ギから採血し、これに直ちに３．８％クエン酸ソーダを
１／１０量加えて撹拌して調製し（クエン酸血液）、更
に５００ｒｐｍ、１５分遠心分離した上清（クエン酸血
漿）を取り、氷冷下に保存するか凍結保存して用いた。
得られた凝固実験の結果を表１に示す。

【００１７】

【表１】 唾液腺抽出液(SGE)，μｌ 血液凝固時間（分） ０ ４．７ ０．２ １２ ０．４ ２３ ０．６ ２５ ０．８ ２９ １ ３５ ２ ４０ ４ ∞（凝血せず） １０ ∞（ 〃 ）

【００１８】実施例４ 抗凝血因子の確認 クエン酸血液凝固アッセイ系に所定量のＳＧＥ（０．２
μｌから１０μｌ）を含むように調製して、実施例３に
おけると同様にして、２５℃でクエン酸血液の凝固時間
を観察した。ＳＧＥを全く含まず生理食塩水だけを含ん
だ対照区はわずか４．７分で血液が凝固したのに対し、
ＳＧＥを加えた系ではＳＧＥ量が多くなると血液の凝固
時間が長くなり、血液の凝固が阻害され、実施例３にお
けるとほぼ同様の結果が得られることが確認された。４
μｌ以上のＳＧＥを加えると凝固が完全に阻害された。
この凝固阻害は２４時間以上も継統した。ＳＧＥ３μｌ
は、オオサシガメ１匹の唾液腺内容物にあたり、およそ
この量が２００μｌの血液の凝固を阻止する計算にな
る。これは実施例３で述べたクエン酸血漿に関してもほ
ぼ同様であった。

【００１９】実施例５ 第８因子・第９因子・リン脂質複合体阻害活性の測定 活性化された第９因子（ＩＸａ）１ｎＭ溶液２０μｌに
ＳＧＥ（ＳＧＥ内容物を全く含まない実験区から種々の
希釈度のＳＧＥを加えた実験区まで）を加え、更に第１
０因子（２μＭ、２０μｌ）、リン脂質（１３μｇ／ｍ
ｌ、２０μｌ）、塩化カルシウム（５０ｍＭ、２０μ
ｌ）を加えよく撹拌する。次に活性化された第８因子
（VIIIａ）溶液（２５ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）を５μｌ加
え、３７℃で１０分間反応させ、生成するＸａの活性を
スウェーデン ＡＢ Ｋａｂｉ社製の合成基質Ｓ−２２
２２を用いて、遊離されるＰ−ニトロアニリン量を４０
５ｎｍの吸光度を定量することにより測定した。その結
果は、ＳＧＥを加えないときとの比較により、図１に示
す。図１において、縦軸は阻害率％を示し、横軸はＳＧ
Ｅ添加量を示す。この場合の添加量は、阻害率１００％
を与えるＳＧＥ量（一匹のオオサシガメより取出したＳ
ＧＥ量 ３μｌ）を１とする相対量で示した。一匹のオ
オサシガメより取り出したＳＧＥ量の１／９で６０％以
上、１／３で９０％以上、また一匹分のＳＧＥ全量で１
００％阻害した。この阻害はＳＧＥ量に依存しており、
ＳＧＥは第８因子・第９因子・リン脂質複合体阻害活性
をもつことが確認された。

【００２０】実施例６ 血液凝固阻害活性物質の分離 唾液腺抽出液をクロマトグラフィーにより分画した。ま
ず東ソ製のＴＳＫ Ｇ２０００ＳＷ カラム（３０ｃｍ
×０．５ｍｍφ）を用い、ＬＫＢ社製の高速液体クロマ
トグラフィー（ＨＰＬＣ）で分画した。Ｂｕｆｆｅｒに
は０．０１ＭＴｒｉｓ‐ＨＣｌ（ｐＨ８．０）−０．１
５Ｍ ＮａＣｌ系を用い、溶出速度を０．５ｍｌ／ｍに
設定した。分画は１ ｍｌずつ行った。このゲル濾過実
験で得られた各フラクションは、変性条件下でポリアク
リルアミドゲル電気泳動（以下ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ）でバ
ンドの確認を行うとともに、凝固時間を測定し、血液凝
固阻害活性を示す分画を探索したところ、フラクション
７（以下Ｆ７）が強い血液凝固阻害活性を示すことが確
認された。

【００２１】実施例７ 陰イオン交換クロマトグラフィーによる血液凝固阻害物
質の精製 ゲル濾過の分画のうち活性のあったＦ７をプールし、透
析後、ＭｏｎｏＱカラムに添加し、バッファー（０．０
１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０）にて洗浄した。
溶出は食塩の濃度勾配により行った。各分画の凝固時間
を測定した。広い範囲（Ｆ１５−１８）に抗血液凝固活
性物質が存在することが判明した。ＳＤＳ‐ＰＡＧＥに
よりモニターしながら分画Ｆ１５−１８をそれぞれ再度
ＭｏｎｏＱカラムによってより緩やかな食塩濃度勾配で
溶出を繰り返し、活性を持つ分画（以下、タンパク質Ａ
と称する）を得た。この分画は電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ）で単一なバンドとなっており、精製度が高く単一
な成分にまで精製されていることが確認された。分子量
マーカーのバンドの位置と比較することで、タンパク質
Ａの分子量は約２０ｋＤａと推定された。

【００２２】実施例８ 逆相クロマトグラフィーによる精製 次にＣｏｓｍｏｓｉｌ ₅Ｃ₄カラム（Ｎａｃａｌａｉ）
を用いた、日立製作所製の逆相クロマトグラフィーで、
０．１％トリフルオロ酢酸中でアセトニトリルの濃度勾
配（０−ｌ００％）によりタンパク質Ａを溶出した。こ
の分画は単一ピークとなっており、精製度の高いもので
あることが明かであった。

【００２３】実施例９ 実施例８で精製されたタンパク質Ａを用いて第８因子・
第９因子・リン脂質複合体阻害活性を実施例５における
と同様に測定したところ、強い阻害活性が認められた。
その結果を図２に示した。

【００２４】実施例１０ 等電点測定 実施例８で精製されたタンパク質Ａについて、アンフォ
ライン（ｐＨ３〜ｌ０）を用いて等電点電気泳動を行
い、ゲル断片のｐＨを測定することにより等電点（ｐ
Ｉ）を決定した。タンパク質Ａの等電点は６．０〜６．
２であった。

【００２５】実施例ｌｌ Ｎ末端のアミノ酸配列の決定 精製されたタンパク質ＡのＮ末端のアミノ酸配列の分析
を行った。すなわち、陰イオン交換クロマトグラフィー
により精製されたタンパク質Ａについて逆相クロマトグ
ラフィーにより更に精製して得られたピークについて、
ペプチドシーケンサー（Ｓｈｉｍａｄｚｕ、ＰＳＱ−
１）によりアミノ酸配列の分析を行った。得られた結果
を、配列番号１に示す。なお配列中のＸａａは確定に至
らなかったアミノ酸である。

【００２６】実施例１２ 分子量の測定 実施例８で精製されたタンパク質ＡをＳＤＳ−ＰＡＧＥ
により分離し、分子量マーカータンパク質バンドの泳動
位置から分子量測定を行ない２０ｋＤａと推定した。ま
た、正確な分子量を決定するためマススペクトロメータ
ー（質量分析計：Ｆｉｎｎｉｇａｎ ＭＡＴ、ＴＳＱ７
００）により分析した結果、タンパク質Ａの分子量は１
９９２０と決定できた。

【００２７】実施例１３ タンパク質ＡのｃＤＮＡのクロニーング オオサシガメの唾腺からＲＮＡを抽出し、ｐｏｌｙ Ａ
（＋）ＲＮＡとし、次いでそのｃＤＮＡを合成しλｇｔ
ｌｌに組み込んでライブラリーを作製した。大腸菌に感
染させてできたプラークに対し、タンパク質Ａに対する
ポリクローナル抗体を用いてスクリーニングし、タンパ
ク質ＡｃＤＮＡのクローン化を行った。得られたタンパ
ク質ＡのｃＤＮＡの塩基配列を決定し、配列表の配列番
号２に示す。この塩基配列から考えられるアミノ酸配列
の三文字記号を下に示した。下線部が配列番号１で示し
たＮ末端のアミノ酸配列と一致し、タンパク質ＡのｃＤ
ＮＡであることが確認された。そのｃＤＮＡ構造から得
られたアミノ酸配列よりアミノ酸組成を表示したものが
表２である。全アミノ酸数は１７９のぺプチドであるこ
とが確認された。また分子量を計算したところ、マスス
ペクトロメーターによる測定結果と一致した。

【００２８】

【表２】

【００２９】実施例１４ 実施例１３の方法で調製したｃＤＮＡをバキュロウイル
スに組み込んで組換えウィルスを得た。このものをカイ
コ培養細胞ＢｍＮ₄に感染させて形質転換細胞となし、
このものをグレース培地で培養してタンパク質Ａを発現
させ、細胞培養物中にタンパク質Ａが蓄積されているこ
とを確認した。即ち、組換えウイルスに感染した細胞培
養物抽出液を抗タンパク質Ａ血清によりウエスターン
ブロット分析したところ、タンパク質Ａに相当するバン
ドが確認された。さらに、前記組換えウイルスをカイコ
に感染させ、感染カイコを飼育してその体液を取り、タ
ンパク質Ａの存在を上記と同様の方法により確認した。
培養細胞抽出液及びカイコ体液からそれぞれＨＰＬＣを
用いてタンパク質Ａを精製した。この精製タンパク質Ａ
に第８因子・第９因子・リン脂質複合体形成阻害活性が
認められた。

【００３０】

【発明の効果】本発明による血液凝固阻害物質タンパク
質Ａは、血液凝固カスケード系の第８因子、第９因子、
第８因子・第９因子・リン脂質複合体、第８因子・第９
因子・リン脂質複合体の形成に対して特異的に阻害する
機能を持つ血液凝固阻害剤であるため、副作用の少ない
効率的な血液凝固阻害作用を持つ新しい抗血栓剤として
有望である 本発明の血液凝固阻害性タンパク質Ａは、バキュロウイ
ルスベクターを介して遺伝子工学的な手法で多量に製造
できる。生体組織が有する血液凝固阻害因子を分離して
得ている従来の血液凝固阻害剤系薬剤に比べて容易に製
造でき、工業的価値が高い。

【００３１】

【配列表】

【００３２】配列番号：１ 配列の長さ：３６ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：Ｎ末端フラグメント 起源：オオカシガメ（Ｒｈｏｎｄｎｉｕｓ ｐｒｏｌｉ
ｘｕｓ）唾液腺 配列の特徴： 配列： Asp Xaa Ser Thr Asn Ile Ser Pro Lys Gln Gly Leu Asp Lys Ala Lys 1 5 10 15 Tyr Phe Ser Gly Lys Trp Tyr Val Thr His Phe Leu Asp Lys Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Val Thr Asp 35

【００３３】配列番号：２ 配列の長さ：９１６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍ−ＲＮＡ） 起源 生物名：オオサシガメ Ｒｈｏｄｎｉｕｓ ｐｒｏｌｉ
ｘｕｓ 組織の種類：成虫唾液腺 配列： T CTC GTC AAT ATG GAA CTG TAC ACA GCG TTG TTG GCC GTG ACC AT 45 Met Glu Leu Tyr Thr Ala Leu Leu Ala Val Thr Ile T CTC TGT CTA ACT TCA ACA ATG GGA GTC AGT GGA GAC TGT AGT AC 90 Leu Cys Leu Thr Ser Thr Met Gly Val Ser Gly Asp Cys Ser Thr 1 A AAT ATA AGT CCT AAA CAA GGA TTA GAT AAA GCA AAG TAT TTC AG 135 Asn Ile Ser Pro Lys Gln Gly Leu Asp Lys Ala Lys Tyr Phe Ser 5 10 15 C GGT AAA TGG TAT GTG ACT CAT TTT CTA GAC AAG GAT CCT CAG GT 180 Gly Lys Trp Thr Val Thr His Phe Leu Asp Lys Asp Pro Gln Val 20 25 30 T ACA GAT CAA TAC TGC TCT AGT TTT ACA CCA AGA GAA TCT GAT GG 225 Thr Asp Gln Tyr Cys Ser Ser Phe Thr Pro Arg Glu Ser Asp Gly 35 40 45 T ACA GTA AAA GAG GCA TTG TAT CAC TAC AAC GCA AAT AAA AAA AC 270 Thr Val Lys Glu Ala Leu Tyr His Tyr Asn Ala Asn Lys Lys Thr 50 55 60 A TCT TTT TAC AAT ATA GGT GAA GGT AAA TTG GAA TCG TCT GGT TT 315 Ser Phe Tyr Asn Ile Gly Glu Gly Lys Leu Gln Ser Ser Gly Leu 65 70 75 A CAG TAC ACT GCA AAA TAT AAA ACT GTT GAT AAA AAA AAA GCT GT 360 Gln Tyr Thr Ala Lys Tyr Lys Thr Val Asp Lys Lys Lys Ala Val 80 85 90 G TTA AAA GAA GCA GAT GAG AAA AAC TCA TAT ACA CTT ACC GTT TT 405 Leu Lys Glu Ala Asp Glu Lys Asn Ser Tyr Thr Leu Thr Val Leu 95 100 105 G GAA GCT GAC GAT TCG TCC GCT CTG GTC CAC ATA TGT TTG CGG GA 450 Glu Ala Asp Asp Ser Ser Ala Leu Val His Ile Cys Leu Arg Glu 110 115 120 A GGA TCA AAA GAT CTT GGA GAT CTC TAC ACT GTT TTA ACT CAC CA 495 Gly Ser Lys Asp Leu Gly Asp Leu Tyr Thr Val Leu Thr His Gln 125 130 135 A AAA GAT GCG GAA CCC AGT GCA AAA GTT AAA AGC GCC GTG ACT CA 540 Lys Asp Ala Glu Pro Ser Ala Lys Val Lys Ser Ala Val Thr Gln 140 145 150 G GCT GGT TTA CAG TTA AGT CAG TTC GTT GGC ACC AAA GAT CTT GG 585 Ala Gly Leu Gln Leu Ser Gln Phe Val Gly Thr Lys Asp Leu Gly 155 160 165 G TGC CAG TAC GAT GAT CAA TTC ACT TCT TTG TAG CAA AAA TAA CG 630 Cys Gln Tyr Asp Asp Gln Phe Thr Ser Leu 170 175 179 CGT ACA GAA TGA TTT TCA ATG GAA CTT AAA ACC CTA ATA AAA TAA 675 TTG CAA ATT GGT GGA GGT TTT CAT GTA TAA ATA AAC TCA TTA AAA 720 ATC AAT ATC AGA TTT ATT AAA CGT TAG CAA GGA TGT AAT AAG GAA 765 AGA AAC AGT TGA TAT TCA CCT GGA AAG TCA GAA AGT AAT CTG TTA 810 AAA ATA TTA AAT AAA TGT GTG TTC ACC ATT TTA AAA AAA AAA AAA 855 AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA 900 AAA AAA AAA AAA AAAA 916

【図面の簡単な説明】

【図１】ＳＧＥ添加量と第８因子・第９因子・リン脂質
複合体阻害率％との関係を示すグラフである。

【図２】精製タンパク質Ａ量と第８因子・第９因子・リ
ン脂質複合体阻害率％との関係を示すグラフである。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 吸血性昆虫の唾液腺により単離された血
   液凝固阻害活性を持つタンパク質Ａ。
2. 【請求項２】 Ｎ末端から３６個のアミノ酸が配列番号
   １で示されるアミノ酸配列を有する血液凝固阻害活性を
   持つタンパク質Ａ。
3. 【請求項３】 配列番号１で示されるアミノ酸配列をコ
   ードするｃＤＮＡを組込んだバキュロウィルスを感染さ
   せたカイコ又はカイコ培養細胞を飼育または培養し、そ
   の飼育体または培養物から血液凝固活性を有するタンパ
   ク質Ａを採取または回収することを特徴とするタンパク
   質Ａの製造方法。
4. 【請求項４】 請求項１又は２のタンパク質Ａを有効成
   分として含有する血液凝固阻害剤。