JPH02263161A - 堅牢なカップリング化合物の中間体 - Google Patents
堅牢なカップリング化合物の中間体Info
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-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
-
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- G01N33/94—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving narcotics or drugs or pharmaceuticals, neurotransmitters or associated receptors
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は有用なりガント及び/又はマーカーを含むカッ
プリングした化合物を製造するために有用な中間体化合
物に関する。
プリングした化合物を製造するために有用な中間体化合
物に関する。
カップリング試薬またはスペーザー化合物は、ある有機
物質を他にカップリングさせるために用いられる一般に
二官能性の化合物である。たとえばイムノアッセイなど
のアッセイにおいては、アッセイの成分の一方はリガン
ドからなるトレーサー;たとえば適切なマーカー(例え
ば蛍光色素のような色原体)にカップリングした抗原で
ある。
物質を他にカップリングさせるために用いられる一般に
二官能性の化合物である。たとえばイムノアッセイなど
のアッセイにおいては、アッセイの成分の一方はリガン
ドからなるトレーサー;たとえば適切なマーカー(例え
ば蛍光色素のような色原体)にカップリングした抗原で
ある。
この種のトレーサーを製造する際には、多くの場合抗原
を二官能性のカップリング剤またはスペーサーの使用に
より蛍光色素にカップリングさせる。
を二官能性のカップリング剤またはスペーサーの使用に
より蛍光色素にカップリングさせる。
同様に固体支持体を用いるイムノアッセイにおいては、
アッセイに用いられる物質(たとえば抗体)を固体支持
体(たとえばポリマー)にカップリングさせる必要があ
り、ある場合にはこれはカップリング剤の使用により達
成される。
アッセイに用いられる物質(たとえば抗体)を固体支持
体(たとえばポリマー)にカップリングさせる必要があ
り、ある場合にはこれはカップリング剤の使用により達
成される。
当技術分野においては、ある物質をカップリング剤また
はスペーサー化合物を介して他にカップリングさせるた
めの改良された手段が求められている。
はスペーサー化合物を介して他にカップリングさせるた
めの改良された手段が求められている。
本発明の一観点によれば、ある物質を他にカップリング
させるための中間体が提供される。
させるための中間体が提供される。
より詳細には、本発明の一観点によればカンプリングし
た化合物の製造に有用な中間体であって、下記の構造式
: 0 (I) 11−C−Nil−Y −八 (式中、yは2価の芳香炭化水素残基であり;Rは蛍光
色素及び酵素から選ばれる検出可能なマーカー又は抗原
、ハプテン及び抗体からなる群から選ばれるリガンドで
あり、及びAは−No2、−N11□、C00II、−
N=C=S、−3H,−叶、−N=C=0.C−(J!
、 −C−0−’1″、 −3−C−17” 及び
0−C−R″(式中、pl+はアルキル基である)より
なる群から選ばれる)を有する中間体が提供される。
た化合物の製造に有用な中間体であって、下記の構造式
: 0 (I) 11−C−Nil−Y −八 (式中、yは2価の芳香炭化水素残基であり;Rは蛍光
色素及び酵素から選ばれる検出可能なマーカー又は抗原
、ハプテン及び抗体からなる群から選ばれるリガンドで
あり、及びAは−No2、−N11□、C00II、−
N=C=S、−3H,−叶、−N=C=0.C−(J!
、 −C−0−’1″、 −3−C−17” 及び
0−C−R″(式中、pl+はアルキル基である)より
なる群から選ばれる)を有する中間体が提供される。
本発明の中間体を用いると下記の
構造式■:
(式中、Zは 0
Nll−C−B 。
O
N+1−C−0−B 、 −NH−C−5−B
。
。
Nil−C−Nll−B 、 −C−Nll−B
。
。
S −C−Nll−B 及び −0−C−Nll−B
よりなる群から選ばれ;Yは2価の芳香族炭化水素残基
であり;及びR及びBの一方は蛍光色素及び酵素から選
ばれる検出可能なマーカーであり、R及びBの他方が抗
原、ハブテン及び抗体からなる群から選ばれるリガンド
である)を有する化合物を製造することができる。
よりなる群から選ばれ;Yは2価の芳香族炭化水素残基
であり;及びR及びBの一方は蛍光色素及び酵素から選
ばれる検出可能なマーカーであり、R及びBの他方が抗
原、ハブテン及び抗体からなる群から選ばれるリガンド
である)を有する化合物を製造することができる。
本発明の特に好ましい実施態様によれば、前記の各構造
式においてYは2価のヘンゼン残基である。ただしYは
2価のナフタリン残基または2価のジフェニル残基であ
りうるとも解すべきである。
式においてYは2価のヘンゼン残基である。ただしYは
2価のナフタリン残基または2価のジフェニル残基であ
りうるとも解すべきである。
中間体(1)は構造式(■):
0=C=N−Y−R’ (]I[
)(式中R′は−NO2; C0OR″; S
CR”;またI は−0−C−R“であり、 RrrおよびYは定義されたものである)により表わさ
れる化合物から製造できる。
)(式中R′は−NO2; C0OR″; S
CR”;またI は−0−C−R“であり、 RrrおよびYは定義されたものである)により表わさ
れる化合物から製造できる。
R′は一般にパラ位またはメタ位にあり、好ましくはパ
ラ位にあり、R′は最も好ましくは−NO2である。
ラ位にあり、R′は最も好ましくは−NO2である。
化合物■においてR′がNo2である場合、化合物■を
まずイソシアネート基と反応性である活性水素置換基を
有するマーカーまたはリガンドとカップリングさせて、
八が−NO□である式■の化合物を製造する。次いでこ
の−NO2基を選択的に還元してアミノ基となしく硫化
された水素化ホウ素ナトリウムの使用)、他のマーカー
またはりガントにカップリングさせるための反応性基を
与えることができる。あるいはアミン基をイソシアネー
ト基(ホスゲンとの反応)またはイソチオシアネート基
(チオホスゲンとの反応)に変えることができる。これ
らのいずれも中間体1をマーカー又はリガンドにカップ
リングさせるための反応性を有または−0−C−R“で
ある場合、化合物■をイソシアネート置換基を介してマ
ーカーまたはりガントにカップリングさせたのち、置換
基R′を加水分解して置換基A(それぞれ−COO11
、−5HまたはOHであり、これらはそれぞれ中間体1
をマーカーまたはリガンドにカップリングさせるための
反応性を有する)にすることができる。
まずイソシアネート基と反応性である活性水素置換基を
有するマーカーまたはリガンドとカップリングさせて、
八が−NO□である式■の化合物を製造する。次いでこ
の−NO2基を選択的に還元してアミノ基となしく硫化
された水素化ホウ素ナトリウムの使用)、他のマーカー
またはりガントにカップリングさせるための反応性基を
与えることができる。あるいはアミン基をイソシアネー
ト基(ホスゲンとの反応)またはイソチオシアネート基
(チオホスゲンとの反応)に変えることができる。これ
らのいずれも中間体1をマーカー又はリガンドにカップ
リングさせるための反応性を有または−0−C−R“で
ある場合、化合物■をイソシアネート置換基を介してマ
ーカーまたはりガントにカップリングさせたのち、置換
基R′を加水分解して置換基A(それぞれ−COO11
、−5HまたはOHであり、これらはそれぞれ中間体1
をマーカーまたはリガンドにカップリングさせるための
反応性を有する)にすることができる。
従って明らかなとおり、化合物■はこれがそのイソシナ
ネート基を介してカンプリングすべきマーカーまたはり
ガントの活性水素置換基と反応性でない置換基R′を含
むべく選ばれる。次いでR′を、中間体Iがそれとカッ
プリングしてカンプリングした化合物■を形成するマー
カーまたはりガントの活性水素置換基と反応性である置
換基へに変える。
ネート基を介してカンプリングすべきマーカーまたはり
ガントの活性水素置換基と反応性でない置換基R′を含
むべく選ばれる。次いでR′を、中間体Iがそれとカッ
プリングしてカンプリングした化合物■を形成するマー
カーまたはりガントの活性水素置換基と反応性である置
換基へに変える。
構造式Iで表わされる化合物は、構造式■で表わされる
カップリングした化合物の製造に用いることができる。
カップリングした化合物の製造に用いることができる。
構造式■で表わされる化合物を使用する際には、八で表
わされる置換基Gノ構造式■により表わされる化合物を
カップリングさせるべき化合物の活性水素置換基と反応
しうるものである。たとえば八がアミノ基である場合、
化合物Iを当技術分野で一般に知られている方法により
、カルボキシル置換基を有するマーカーまたはりガント
とカップリングさせることができる。同様に八がカルボ
キシル基である場合、化合物Iを当技術分野で知られて
いる方法により、アミノ置換基またはイソシアネート置
換基を有する有機化合物とカップリングさせることがで
きる。八がイソシアネート基些である場合、化合物Iを
・活性水素置換基(メルカプト(チオール)基、水酸基
、カルボキシル基またはアミノ基である)を有するマー
カーまたはりガントにカップリングさせることができる
。八がチオール基または水酸基である場合、化合物1を
活性水素置換基(イソシアネー1−)を有するマーカー
またはリガンドにカップリングさせることができる。八
がイソチオシアネート基である場合、化合物■をアミノ
置換基を有するマーカーまたばリガンドとカップリング
させることができる。この種のカップリングをこの種の
官能基を介して行う方法は、当技術分野で一般に知られ
ている。
わされる置換基Gノ構造式■により表わされる化合物を
カップリングさせるべき化合物の活性水素置換基と反応
しうるものである。たとえば八がアミノ基である場合、
化合物Iを当技術分野で一般に知られている方法により
、カルボキシル置換基を有するマーカーまたはりガント
とカップリングさせることができる。同様に八がカルボ
キシル基である場合、化合物Iを当技術分野で知られて
いる方法により、アミノ置換基またはイソシアネート置
換基を有する有機化合物とカップリングさせることがで
きる。八がイソシアネート基些である場合、化合物Iを
・活性水素置換基(メルカプト(チオール)基、水酸基
、カルボキシル基またはアミノ基である)を有するマー
カーまたはりガントにカップリングさせることができる
。八がチオール基または水酸基である場合、化合物1を
活性水素置換基(イソシアネー1−)を有するマーカー
またはリガンドにカップリングさせることができる。八
がイソチオシアネート基である場合、化合物■をアミノ
置換基を有するマーカーまたばリガンドとカップリング
させることができる。この種のカップリングをこの種の
官能基を介して行う方法は、当技術分野で一般に知られ
ている。
カップリング剤■は多種多様な有機物質を互いにカップ
リングさせるために使用できる。たとえばトレーサーが
検出可能なマーカーtたとえばリガンド(ここで用いら
れる“リガンド゛という語はハプテン、抗原または抗体
を意味する)にカップリングした放射性マーカー、色原
体、酵素などからなるアッセイに使用すべきトレーサー
の製造にカップリング化合物■を用いることができる。
リングさせるために使用できる。たとえばトレーサーが
検出可能なマーカーtたとえばリガンド(ここで用いら
れる“リガンド゛という語はハプテン、抗原または抗体
を意味する)にカップリングした放射性マーカー、色原
体、酵素などからなるアッセイに使用すべきトレーサー
の製造にカップリング化合物■を用いることができる。
この種の実施態様においてマーカーまたはりガントの一
方には、イソシアネート基と反応しうる置換基が含まれ
、カップリング剤■の置換基R′ばそのリガンドまたは
マーカーの置換基と非反応性である。カップリング剤■
をリガンドまたはマーカーとカップリングさせたのち、
置換基へが、最初にカップリングして中間体1を生成し
たリガンドまたはマーカー上にある活性水素置換基と非
反応性である中間化合物Iが製造される。次いで中間化
合物■をマーカーまたはリガンドの他方とカップリング
させる。中間体1の置換基へがリガンドまたはマーカー
の他方にある活性水素置換基と反応でない場合は、置換
基へを先に定義したようにリガンドまたはマーカーの他
方にある活性水素置換基と反応性である置換基に選択的
に変換する。
方には、イソシアネート基と反応しうる置換基が含まれ
、カップリング剤■の置換基R′ばそのリガンドまたは
マーカーの置換基と非反応性である。カップリング剤■
をリガンドまたはマーカーとカップリングさせたのち、
置換基へが、最初にカップリングして中間体1を生成し
たリガンドまたはマーカー上にある活性水素置換基と非
反応性である中間化合物Iが製造される。次いで中間化
合物■をマーカーまたはリガンドの他方とカップリング
させる。中間体1の置換基へがリガンドまたはマーカー
の他方にある活性水素置換基と反応でない場合は、置換
基へを先に定義したようにリガンドまたはマーカーの他
方にある活性水素置換基と反応性である置換基に選択的
に変換する。
次いでこの中間体1をリガンドまたはマーカーの他方と
カップリングさせてカップリングした化合物■を製造す
る。
カップリングさせてカップリングした化合物■を製造す
る。
たとえばアッセイに使用するトレーサーを製造する際に
、カップリング化合物■においてRおよびBの一方がマ
ーカー、たとえば色原体、放射性置換基を含む有機化合
物または酵素であり、RおよびBの他方がリガントであ
る。たとえば蛍光1・レーサーを製造する際にはRおよ
びBの一方がイソシアネート基または構造式I中の八に
より表わされる反応性官能基の一つにカップリングしう
る置換基を有する蛍光色素から誘導され、RおよびBの
他方がイソシアネート基または構造式Iにおいて八で表
わされる反応性置換基の他方にカップリンタしうる置換
基を有するリガンドから誘導される。この種のトレーサ
ーを導入する際には、リガントまたは蛍光色素をまずカ
ップリング試薬■のイソシアネート官能基にカップリン
グさせる。
、カップリング化合物■においてRおよびBの一方がマ
ーカー、たとえば色原体、放射性置換基を含む有機化合
物または酵素であり、RおよびBの他方がリガントであ
る。たとえば蛍光1・レーサーを製造する際にはRおよ
びBの一方がイソシアネート基または構造式I中の八に
より表わされる反応性官能基の一つにカップリングしう
る置換基を有する蛍光色素から誘導され、RおよびBの
他方がイソシアネート基または構造式Iにおいて八で表
わされる反応性置換基の他方にカップリンタしうる置換
基を有するリガンドから誘導される。この種のトレーサ
ーを導入する際には、リガントまたは蛍光色素をまずカ
ップリング試薬■のイソシアネート官能基にカップリン
グさせる。
本発明者らは、弐■で表わされるカップリング剤を使用
することは、カップリング剤が堅牢であり、このため蛍
光マーカーがリガンド上に°°折り返ることがなく、従
ってリガンドにより蛍光化合物が消光される可能性が最
小限に抑えられる点で、蛍光トレーサーの製造に特に有
利であることを見出した。
することは、カップリング剤が堅牢であり、このため蛍
光マーカーがリガンド上に°°折り返ることがなく、従
ってリガンドにより蛍光化合物が消光される可能性が最
小限に抑えられる点で、蛍光トレーサーの製造に特に有
利であることを見出した。
適切な色原体の代表例として、以下のものが挙げられる
。アクリジン色素、アズレ(azure)色素、キノン
色素、ナイルブルー、タレジルバイオレット、フルオレ
セイン類、ローダミン類、クマリン類、アミノナフタリ
ン誘導体(ダンシル化合物)、カルボシアニン類、イン
ドール類、ランタニドキレ−1・類など。
。アクリジン色素、アズレ(azure)色素、キノン
色素、ナイルブルー、タレジルバイオレット、フルオレ
セイン類、ローダミン類、クマリン類、アミノナフタリ
ン誘導体(ダンシル化合物)、カルボシアニン類、イン
ドール類、ランタニドキレ−1・類など。
たとえばT4)レーサーは、まずp−ニトロフェニルイ
ソシアネートをT、のカルボキシ部分が適宜ブロックさ
れたチロキシン(T4)にカップリングさせることによ
り製造できる。ニトロ基を還元してアミノ基(化合物1
、PはブロックされたT4残基であり、■はベンゼン残
基、Aはアミノ基である)となし、化合物1のアミノ部
分をたとえばイソチオシアネート基を含む蛍光色素(特
にフルオレセインイソチオシアネート)にカップリング
させることができる。
ソシアネートをT、のカルボキシ部分が適宜ブロックさ
れたチロキシン(T4)にカップリングさせることによ
り製造できる。ニトロ基を還元してアミノ基(化合物1
、PはブロックされたT4残基であり、■はベンゼン残
基、Aはアミノ基である)となし、化合物1のアミノ部
分をたとえばイソチオシアネート基を含む蛍光色素(特
にフルオレセインイソチオシアネート)にカップリング
させることができる。
あるいは化合物1のアミノ基をチオホスゲンとの反応に
よりイソチオシナネート基に変え(化合物IにおいてA
がイソチオシアネート基)、次いで化合物Iをアミノ基
含有蛍光色素(特にフルオレセインアミン)と反応させ
ることができる。
よりイソチオシナネート基に変え(化合物IにおいてA
がイソチオシアネート基)、次いで化合物Iをアミノ基
含有蛍光色素(特にフルオレセインアミン)と反応させ
ることができる。
同様にジゴキシントレーサーは、ジゴキシンをp−ニト
ロフェニルイソシアネートとカップリングさせたのちニ
トロ基を還元してアミノ基となし、そして蛍光色素、た
とえばフルオレセインイソチオシアネートと反応させる
ことにより製造できる。
ロフェニルイソシアネートとカップリングさせたのちニ
トロ基を還元してアミノ基となし、そして蛍光色素、た
とえばフルオレセインイソチオシアネートと反応させる
ことにより製造できる。
本発明は前記のように蛍光トレーサーの製造に特に用い
られるが、本発明は他のトレーサー、たとえば放射性ト
レーサー、酵素トレーサーなどの製造にも用いられる。
られるが、本発明は他のトレーサー、たとえば放射性ト
レーサー、酵素トレーサーなどの製造にも用いられる。
放射性1−レーサーを製造するだめの適切な放射性マー
カーの代表例としては、以下のものが挙げられる:ヒド
ロキシフェニル置換されたアミンまたはアミノ酸。これ
らにおいてフェニル基には放射性置換基1個または2個
以上が含まれていてもよい。たとえば放射性ヨウ素化さ
れたチロシンまたはチラミン;イミダゾール基が放射性
置換基1個または2個以上により置換されたイミダゾー
ル置換アミノ酸またはアミン等。
カーの代表例としては、以下のものが挙げられる:ヒド
ロキシフェニル置換されたアミンまたはアミノ酸。これ
らにおいてフェニル基には放射性置換基1個または2個
以上が含まれていてもよい。たとえば放射性ヨウ素化さ
れたチロシンまたはチラミン;イミダゾール基が放射性
置換基1個または2個以上により置換されたイミダゾー
ル置換アミノ酸またはアミン等。
適切な酵素マーカーの代表例としては以下のものが挙げ
られる:バーオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ア
セチルコリンエステラーゼ、グルコアミラーゼ、マレイ
ン酸デヒロトゲナーゼ、グルコース−6−リン酸デヒド
ロゲナーゼ、グルクルオキシダーゼ、アシドホスファタ
ーゼなど。
られる:バーオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ア
セチルコリンエステラーゼ、グルコアミラーゼ、マレイ
ン酸デヒロトゲナーゼ、グルコース−6−リン酸デヒド
ロゲナーゼ、グルクルオキシダーゼ、アシドホスファタ
ーゼなど。
当技術分野で知られるように、固体支持体はポリマーで
あってもよい。ただしそのようなポリマーにはイソシア
ネート官能基または中間体Iの八により表わされる反応
性置換基の1つと反応しうる置換基が含まれる必要があ
る。たとえばポリアクリルアミド、ポリ(アミノスチレ
ン)など。
あってもよい。ただしそのようなポリマーにはイソシア
ネート官能基または中間体Iの八により表わされる反応
性置換基の1つと反応しうる置換基が含まれる必要があ
る。たとえばポリアクリルアミド、ポリ(アミノスチレ
ン)など。
本発明により製造されるトレーサーおよび支持体上にリ
ガンドは、当技術分野で一般に知られている型の多種多
様な被分析体じ被分析体(anajyte)“′という
語はハプテン、抗原または抗体を表わす)のアッセイに
使用できる。たとえば本発明は治療薬およびいわゆる“
麻薬(drugs of abuse)”を含む薬剤;
ステロイド、ビタミン、糖、アミノ酸、ポリペプチド、
蛋白質、各種ホルモン、抗生物質、ウィルスなどのアッ
セイに使用できる。
ガンドは、当技術分野で一般に知られている型の多種多
様な被分析体じ被分析体(anajyte)“′という
語はハプテン、抗原または抗体を表わす)のアッセイに
使用できる。たとえば本発明は治療薬およびいわゆる“
麻薬(drugs of abuse)”を含む薬剤;
ステロイド、ビタミン、糖、アミノ酸、ポリペプチド、
蛋白質、各種ホルモン、抗生物質、ウィルスなどのアッ
セイに使用できる。
本発明により製造されるトレーサーおよび支持体上のり
ガントはイムノアッセイ (“°イムノア・ンセイ゛と
いう語は総称的に用いられ、抗原または抗体の代わりに
天然の結合剤を使用し、時に競合帯白質結合アッセイと
呼ばれるアッセイを含む)に使用でき、当技術分野で知
られるようにアッセイの成分の一つは結合剤である。被
分析体がハプテンまたは抗原である場合、結合剤は抗体
、または被分析体に特異的な結合部位1個または2個以
上をもつ天然物質であり、被分析体が抗体である場合、
結合剤は抗体に対する抗原または被分析体に呼応して誘
発された抗体であろう。適切な結合剤の選択は当業者が
なしうる範囲内にあると考えられ、本発明を十分に理解
するためにこの点に関してこれ以上詳述する必要はない
と思われる。
ガントはイムノアッセイ (“°イムノア・ンセイ゛と
いう語は総称的に用いられ、抗原または抗体の代わりに
天然の結合剤を使用し、時に競合帯白質結合アッセイと
呼ばれるアッセイを含む)に使用でき、当技術分野で知
られるようにアッセイの成分の一つは結合剤である。被
分析体がハプテンまたは抗原である場合、結合剤は抗体
、または被分析体に特異的な結合部位1個または2個以
上をもつ天然物質であり、被分析体が抗体である場合、
結合剤は抗体に対する抗原または被分析体に呼応して誘
発された抗体であろう。適切な結合剤の選択は当業者が
なしうる範囲内にあると考えられ、本発明を十分に理解
するためにこの点に関してこれ以上詳述する必要はない
と思われる。
アッセイに際して、アッセイに用いられるトレーサーの
りガント部分は採用されるアッセイの型により定められ
る。たとえばアッセイが抗原またはハプテンである被分
析体に関するものである場合、トレーナ−のりガント部
分はアッセイすべき抗原もしくはハプテンまたはそれら
の適宜な同族体である(“適宜な同族体°゛という語は
アッセイに用いられる結合剤に結合した被分析体の同族
体を意味する)。あるいはl−レーサーのりガント部分
がアッセイすべきハプテンまたは抗原に対する結合剤で
あってもよく、この場合アッセイはトレーサーがそのト
レーサーに特異的な結合部位に結合するのを被分析体が
阻止するように工夫される。
りガント部分は採用されるアッセイの型により定められ
る。たとえばアッセイが抗原またはハプテンである被分
析体に関するものである場合、トレーナ−のりガント部
分はアッセイすべき抗原もしくはハプテンまたはそれら
の適宜な同族体である(“適宜な同族体°゛という語は
アッセイに用いられる結合剤に結合した被分析体の同族
体を意味する)。あるいはl−レーサーのりガント部分
がアッセイすべきハプテンまたは抗原に対する結合剤で
あってもよく、この場合アッセイはトレーサーがそのト
レーサーに特異的な結合部位に結合するのを被分析体が
阻止するように工夫される。
被分析体が抗体である場合、トレー・す−のりガント部
分は抗体またはその適宜な同族体であり、この場合抗体
およびトレーザーの双方が被分析抗体およびトレーサー
の双方に対して特異的な限られた数の結合部位に関して
競合するであろう。あるいはトレーサーのりガント部分
は、被分析抗体に対する抗原または被分析抗体に呼応し
て誘発された抗体であってもよい。この場合、被分析抗
体はトレーサーがそのトレーザーに対し特異的な結合部
位に結合するのを阻止する。
分は抗体またはその適宜な同族体であり、この場合抗体
およびトレーザーの双方が被分析抗体およびトレーサー
の双方に対して特異的な限られた数の結合部位に関して
競合するであろう。あるいはトレーサーのりガント部分
は、被分析抗体に対する抗原または被分析抗体に呼応し
て誘発された抗体であってもよい。この場合、被分析抗
体はトレーサーがそのトレーザーに対し特異的な結合部
位に結合するのを阻止する。
被分析体をいわゆる“ザンドイッチ型°゛のアッセイに
より決定する場合には、1−レーザーのりガント部分が
被分析体に特異的あ結合部位をもち、被分析体は複数の
決定部位をもつ。
より決定する場合には、1−レーザーのりガント部分が
被分析体に特異的あ結合部位をもち、被分析体は複数の
決定部位をもつ。
トレーサーのりガント部分として用いられる適切なリガ
ンドの選択は本明細書の教示から当業者がなしうる範囲
のものと考えられ、従って本発明を十分に理解するため
にこの点に関してこれ以上詳述する必要はないと思われ
る。
ンドの選択は本明細書の教示から当業者がなしうる範囲
のものと考えられ、従って本発明を十分に理解するため
にこの点に関してこれ以上詳述する必要はないと思われ
る。
本発明のカップリング剤は治療薬を抗体(特にモノクロ
ーン抗体)にカップリングさせるためにも使用できる。
ーン抗体)にカップリングさせるためにも使用できる。
この場合、カップリングした化合物■においてRは治療
薬から誘導され、Bは抗体から誘導される。
薬から誘導され、Bは抗体から誘導される。
従って上記の記述から明らかなように、カップリングし
た化合物■は多種多様なマーカーまたはリガンドから製
造でき、化合物HにおいてRにより表わされる有機残基
はあるマーカーまたはりガントから誘導され、カップリ
ングした化合物HにおいてBにより表わされる有機残基
は他のマーカーまたはりガントから誘導される。ただし
各マーカーまたはりガントはガラプリング剤■中の適宜
な置換基(イソシアネート)または構造式Iにおいて八
により表わされる適宜な反応性置換基と反応するだめの
適宜な活性水素置換基を含む。たとえばカップリングし
た化合物■においてRはイソシアネート基と反応しうる
活性水素置換基を含むマーカーまたはりガントから誘導
される有機残基であってもよく、そのマーカーは放射置
換基された有機化合物、色原体、好ましくは蛍光色素、
酵素であって良くまたはりガントは特に非蛋白性抗原も
しくは非蛋白性ハプテン、固体支持体、または治療薬(
特に医薬)であってもよい。同様にBは中間体Iにおい
て八により表わされる反応性置換基の1つと反応しうる
活性水素置換基を含むマーカーまたはりガントから誘導
される有機残基であってもよい。たとえばBは蛋白質、
抗体、ハプテン、抗原、色原体(色素、好ましくは蛍光
色素)、酵素、放射性置換基を有する有機化合物ポリマ
ーなどのマーカーまたはりガントから誘導される有機残
基であってもよい。
た化合物■は多種多様なマーカーまたはリガンドから製
造でき、化合物HにおいてRにより表わされる有機残基
はあるマーカーまたはりガントから誘導され、カップリ
ングした化合物HにおいてBにより表わされる有機残基
は他のマーカーまたはりガントから誘導される。ただし
各マーカーまたはりガントはガラプリング剤■中の適宜
な置換基(イソシアネート)または構造式Iにおいて八
により表わされる適宜な反応性置換基と反応するだめの
適宜な活性水素置換基を含む。たとえばカップリングし
た化合物■においてRはイソシアネート基と反応しうる
活性水素置換基を含むマーカーまたはりガントから誘導
される有機残基であってもよく、そのマーカーは放射置
換基された有機化合物、色原体、好ましくは蛍光色素、
酵素であって良くまたはりガントは特に非蛋白性抗原も
しくは非蛋白性ハプテン、固体支持体、または治療薬(
特に医薬)であってもよい。同様にBは中間体Iにおい
て八により表わされる反応性置換基の1つと反応しうる
活性水素置換基を含むマーカーまたはりガントから誘導
される有機残基であってもよい。たとえばBは蛋白質、
抗体、ハプテン、抗原、色原体(色素、好ましくは蛍光
色素)、酵素、放射性置換基を有する有機化合物ポリマ
ーなどのマーカーまたはりガントから誘導される有機残
基であってもよい。
本発明を以下の実施例に関連してさらに記述するが、こ
れにより本発明の範囲が限定されるべきではない。
れにより本発明の範囲が限定されるべきではない。
実施例 1
塩化トリメチルシリル(TMS−Cffi)2.1ミリ
モルをT、1ミリモルおよび再蒸留ピリジンに添加した
。
モルをT、1ミリモルおよび再蒸留ピリジンに添加した
。
反応は約2時間を要し、はぼ定量的であった。反応後、
p−ニトロフェニルイソシアネート1.1モルを反応混
合物に注入添加し、混合物を磁気撹拌棒を用いて約48
時間攪拌し、少量の試料を薬4時間毎にTLC(F4I
層クロマトグラフィー)による分析のため取出した。4
8時間後に生成物を未反応イソシアネートの除去のため
メタノールで十分に洗浄し、次いでTLCもしくは高圧
液体クロマトグラフィー (IIPLc)によりまたは
カラムクロマトグラフィーにより生成物を分離した。得
られた生成物はT4のカルボキシル官能基がトリメチル
シラン(TMS)でブロックされたパラ−ニトロフェニ
ルイソシアナイト−T4であった。
p−ニトロフェニルイソシアネート1.1モルを反応混
合物に注入添加し、混合物を磁気撹拌棒を用いて約48
時間攪拌し、少量の試料を薬4時間毎にTLC(F4I
層クロマトグラフィー)による分析のため取出した。4
8時間後に生成物を未反応イソシアネートの除去のため
メタノールで十分に洗浄し、次いでTLCもしくは高圧
液体クロマトグラフィー (IIPLc)によりまたは
カラムクロマトグラフィーにより生成物を分離した。得
られた生成物はT4のカルボキシル官能基がトリメチル
シラン(TMS)でブロックされたパラ−ニトロフェニ
ルイソシアナイト−T4であった。
上記の反応は常温常圧(STP)で行われた。
硫化された水素化ホウ素ナトリウム0.55ミリモル(
使用したT4の濃度に対して過剰量を生成物0.5ミリ
モルに室内の温度および圧力で添加することによりニト
ロ基を還元した。反応は約3〜4時間混合して完了し、
IRによりニトロからアミンへの変換を監視することに
より行われた。得られた生成物はパラ−アミノフェニル
イソシアナトT4であった。
使用したT4の濃度に対して過剰量を生成物0.5ミリ
モルに室内の温度および圧力で添加することによりニト
ロ基を還元した。反応は約3〜4時間混合して完了し、
IRによりニトロからアミンへの変換を監視することに
より行われた。得られた生成物はパラ−アミノフェニル
イソシアナトT4であった。
上記生成物に1モル当量のイソチオシアナ1〜フルオレ
セインを添加したのち約48〜72時間攪拌し、TLC
またはHPLCにより監視した。フルオレセイン色素を
T4カップリングした中間体にカップリングさせたのち
ブロック剤TMSを水性条件下で除去した。
セインを添加したのち約48〜72時間攪拌し、TLC
またはHPLCにより監視した。フルオレセイン色素を
T4カップリングした中間体にカップリングさせたのち
ブロック剤TMSを水性条件下で除去した。
得られた生成物はフルオレセインイソチオシアネートが
堅牢なカップリング剤を介してT4にカップリングした
蛍光トレーサーであり、このトレーサーはT4のアッセ
イに使用できる。
堅牢なカップリング剤を介してT4にカップリングした
蛍光トレーサーであり、このトレーサーはT4のアッセ
イに使用できる。
実施例 2
ジゴキシン蛍光トレーサーの製造
10h+R容の丸底フラスコにジゴキシン1ミリモルお
よび攪拌棒を入れた。開口にゴム膜をはり、ガス抜き針
を用いて徐々に丸底フラスコを窒素で5分間パージした
。長い18ゲージのステンレス網製の針を備えた50雌
のガラス製注射器に新たに蒸留したピリジン30mRを
取り、ゴム膜を介して丸底フラスコに最初は徐々に注入
し、15〜20m1が注入されたのち攪拌を加えた。残
りの10〜15雌は丸底フラスコの側面を洗い落として
ジゴキシンを溶解するのに使用した。再びガス抜き針を
用いて容器を窒素で約5分間パージした。ジゴキシンが
すべて熔解して完全な溶液になるまで攪拌混合を続りた
。
よび攪拌棒を入れた。開口にゴム膜をはり、ガス抜き針
を用いて徐々に丸底フラスコを窒素で5分間パージした
。長い18ゲージのステンレス網製の針を備えた50雌
のガラス製注射器に新たに蒸留したピリジン30mRを
取り、ゴム膜を介して丸底フラスコに最初は徐々に注入
し、15〜20m1が注入されたのち攪拌を加えた。残
りの10〜15雌は丸底フラスコの側面を洗い落として
ジゴキシンを溶解するのに使用した。再びガス抜き針を
用いて容器を窒素で約5分間パージした。ジゴキシンが
すべて熔解して完全な溶液になるまで攪拌混合を続りた
。
別個の容器(好ましくは閉じた丸底フラスコ)にパラ−
ニトロフェニルイソシアネート1.1 ミリモル(あら
かじめ乾燥したもの)をとり、ピリジン15m2を注入
により添加し、前記のように閉鎖容器を窒素で混和パー
ジし、すべての物質が溶液となった時点で注射により取
出し、攪拌を続けながら徐々にジゴキシンを入れた10
0mj!容丸底フラスコに添加した。
ニトロフェニルイソシアネート1.1 ミリモル(あら
かじめ乾燥したもの)をとり、ピリジン15m2を注入
により添加し、前記のように閉鎖容器を窒素で混和パー
ジし、すべての物質が溶液となった時点で注射により取
出し、攪拌を続けながら徐々にジゴキシンを入れた10
0mj!容丸底フラスコに添加した。
注釈=1)作業はすべて防護フード内で行うべきである
。
。
2)パラ−ニド−フェニルイソシアネートは使用前に常
にIRで検査すべきで ある。貯蔵期間および露光によりこ のイソシアネ−1・が著しく影響を受 ける可能性がある。ロフト毎にイソ シアネートの存在を調べるべきであ る。
にIRで検査すべきで ある。貯蔵期間および露光によりこ のイソシアネ−1・が著しく影響を受 ける可能性がある。ロフト毎にイソ シアネートの存在を調べるべきであ る。
TLC用試料は注射器により取出すべきでありTI、C
による監視はパラ−ニトロフェニルイソシアネートを添
加した2時間後に開始すべきである。
による監視はパラ−ニトロフェニルイソシアネートを添
加した2時間後に開始すべきである。
第1日日については2〜4時間毎にスポットを検査し、
−夜間いた場合は且Cをまず朝一番に行うべきである。
−夜間いた場合は且Cをまず朝一番に行うべきである。
反応は終了するまで約72時間かかった。(48時間後
に主生成物は実質的に形成されていたが一75%終了)
。これよりも長時間置くと目的生成物の増加は認められ
るが、これは付加的な副生物が匹敵するかまたはより大
きな割合で生じるという犠牲においてなされる。可能な
限り最良の結果が得られたことを確認するため、目的生
成物の精製(および単離)をここで行うべきである。
に主生成物は実質的に形成されていたが一75%終了)
。これよりも長時間置くと目的生成物の増加は認められ
るが、これは付加的な副生物が匹敵するかまたはより大
きな割合で生じるという犠牲においてなされる。可能な
限り最良の結果が得られたことを確認するため、目的生
成物の精製(および単離)をここで行うべきである。
この生成物の精製は調製用TLCにより行われ、1日で
行うことができるが、プレートに過剰負荷しないように
注意しなければならない。さもなければバンドが重複す
るおそれがある。シリカゲルからメタノール:クロロホ
ルムを用いて抽出する際、溶液を0.22μのフィルタ
ーを介して回転蒸発用の丸底フラスコ中へ濾過するとよ
い。濾過はジゴキシンに対するイソシアネート(結合)
形成を破壊する可能性がある痕跡量のシリカゲルを除去
するために重要である。(シリカゲル−メタノール:ク
ロロホルムを濾過の前に遠心分離することにより大部分
の粒子を除去することができ、濾過工程が促進される。
行うことができるが、プレートに過剰負荷しないように
注意しなければならない。さもなければバンドが重複す
るおそれがある。シリカゲルからメタノール:クロロホ
ルムを用いて抽出する際、溶液を0.22μのフィルタ
ーを介して回転蒸発用の丸底フラスコ中へ濾過するとよ
い。濾過はジゴキシンに対するイソシアネート(結合)
形成を破壊する可能性がある痕跡量のシリカゲルを除去
するために重要である。(シリカゲル−メタノール:ク
ロロホルムを濾過の前に遠心分離することにより大部分
の粒子を除去することができ、濾過工程が促進される。
)
この時点で生成物およびその相対濃度を確認する最も迅
速な試験はジゴキシンに対するRIAによるものである
。濾過した生成物を回転蒸発させ(×4)、生成物を少
量のメタノールに取り入れることにより希釈液を調製し
、置換ジゴキシンの免疫反応性につき容易に試験された
。これが確認され、相対純度が求められると(TLCに
よる)、次の工程はニトロを硫化した水素化ボウ素すl
・リウムの使用によりアミンに還元することであった。
速な試験はジゴキシンに対するRIAによるものである
。濾過した生成物を回転蒸発させ(×4)、生成物を少
量のメタノールに取り入れることにより希釈液を調製し
、置換ジゴキシンの免疫反応性につき容易に試験された
。これが確認され、相対純度が求められると(TLCに
よる)、次の工程はニトロを硫化した水素化ボウ素すl
・リウムの使用によりアミンに還元することであった。
生成物はYがベンゼン残基、AがNO2、Rが15′ジ
ゴキシン残基である化合物Iであった。
ゴキシン残基である化合物Iであった。
操作を続行する前に、カップリングしたジゴキシンを回
転蒸発により乾燥させ、反応器にバラニ1−ロフェニル
イソシアナ1ヘ−ジゴキシンを入れる前にテトラヒドロ
フラン(THF)で1回洗浄すべきである。
転蒸発により乾燥させ、反応器にバラニ1−ロフェニル
イソシアナ1ヘ−ジゴキシンを入れる前にテトラヒドロ
フラン(THF)で1回洗浄すべきである。
NaB11゜S3 との反応はジオキサンまたはTHF
中で行うことができるが、置換されたジゴキシンの溶解
性の点でTIIFが好ましい。窒素雰囲気を維持するこ
とは決定的ではないが、前記のようにNaBII□S3
を添加する前に容器をパージすべきである。
中で行うことができるが、置換されたジゴキシンの溶解
性の点でTIIFが好ましい。窒素雰囲気を維持するこ
とは決定的ではないが、前記のようにNaBII□S3
を添加する前に容器をパージすべきである。
100mff1容の丸底フラスコに上記ジゴキシン(置
換パラ−ニトロフェニルイソシアナト−ジゴキシン)お
よび撹拌棒を一定容積のTI(Fに入れた(この場合も
T肝の容積を最小限にすべきである)。
換パラ−ニトロフェニルイソシアナト−ジゴキシン)お
よび撹拌棒を一定容積のTI(Fに入れた(この場合も
T肝の容積を最小限にすべきである)。
ガス抜き針を用いてゴム膜を介して5分間窒素でパージ
した。
した。
別個の容器にて乾燥後、さらに乾燥剤で乾燥させたNa
BIIzS3を入れ、TIIF 20mRを添加し、完
全に溶解させ、ゴム膜を介して窒素でパージした。
BIIzS3を入れ、TIIF 20mRを添加し、完
全に溶解させ、ゴム膜を介して窒素でパージした。
50m1のガラス製注射器を用いて溶液を取出し、連続
的に攪拌しながらジゴキシンに徐々に添加した。反応速
度はIRにより追跡することができ(No。
的に攪拌しながらジゴキシンに徐々に添加した。反応速
度はIRにより追跡することができ(No。
→N11□への変換)、反応はジゴキシンの濃度に応じ
てわずか数時間後に終了すべきである。進行速度を増す
ために熱を用いることもできるが、わずか37°Cまで
であり、きわめて綿密に監視すべきである。25°C(
室温)では反応はこれよりも若干緩慢に進行するが、よ
り制御しやすい。
てわずか数時間後に終了すべきである。進行速度を増す
ために熱を用いることもできるが、わずか37°Cまで
であり、きわめて綿密に監視すべきである。25°C(
室温)では反応はこれよりも若干緩慢に進行するが、よ
り制御しやすい。
この生成物はシリカケル且C(all製用)またはシリ
カゲルカラムにより単離および精製し、メタノールで十
分に洗浄し、濾過し、保存のため乾燥させておくことが
できる。あるいは後続の反応にはニトロ基は全く関与し
ないと思われるので、これをそれ以上精製することなく
そのまま使用し、後続の最終精製をこれらの生成物の精
製に利用することもできる。
カゲルカラムにより単離および精製し、メタノールで十
分に洗浄し、濾過し、保存のため乾燥させておくことが
できる。あるいは後続の反応にはニトロ基は全く関与し
ないと思われるので、これをそれ以上精製することなく
そのまま使用し、後続の最終精製をこれらの生成物の精
製に利用することもできる。
ジゴキシンの相対濃度が確認されると(この場合モRI
Aにより)、後続のパラ−アミノフェニルイソシアナト
−ジゴキシンとの反応は、たとえばフルオレセインイソ
チオシアネーI・の使用により直接行うことができる。
Aにより)、後続のパラ−アミノフェニルイソシアナト
−ジゴキシンとの反応は、たとえばフルオレセインイソ
チオシアネーI・の使用により直接行うことができる。
置換ジゴキシン100μモルを清浄な乾燥した25mf
l容丸底フラスコに入れ、撹拌棒を入れた。注射器によ
りピリジン10mffを添加し、ゴム膜で閉じ前記のよ
うに窒素でパージし、生成物が完全に溶解するまで攪拌
した。
l容丸底フラスコに入れ、撹拌棒を入れた。注射器によ
りピリジン10mffを添加し、ゴム膜で閉じ前記のよ
うに窒素でパージし、生成物が完全に溶解するまで攪拌
した。
第2の丸底フラスコにフルオレナインイソチオシアネー
ト100μモルを添加し、ピリジン10〜15m1に溶
解した。ゴム膜で閉じ、N2でパージし、ガラス製注射
器で取出し、連続的に混合しながらジゴキシンに徐々に
添加した。(フルオレセインイソチオシアネートの性質
のためこれは丸底フラスコおよび注射器に付着するので
、必ずしもすべての物質が移されるわけではないであろ
う。しかし必要ならばのちに上記と同じ方法で追加する
ことができる。) この反応は終了するのに約72時間かがるであろう。こ
れは分析用TLCを採用すると新たな蛍光種が出現する
ことにより監視テきる。
ト100μモルを添加し、ピリジン10〜15m1に溶
解した。ゴム膜で閉じ、N2でパージし、ガラス製注射
器で取出し、連続的に混合しながらジゴキシンに徐々に
添加した。(フルオレセインイソチオシアネートの性質
のためこれは丸底フラスコおよび注射器に付着するので
、必ずしもすべての物質が移されるわけではないであろ
う。しかし必要ならばのちに上記と同じ方法で追加する
ことができる。) この反応は終了するのに約72時間かがるであろう。こ
れは分析用TLCを採用すると新たな蛍光種が出現する
ことにより監視テきる。
生成物の精製はその後の分析作業前に行わなければなら
ない。RIM、および蛍光を検出するように考案された
他の試験法はいずれも最終生成物の免疫反応性を証明す
るであろう。
ない。RIM、および蛍光を検出するように考案された
他の試験法はいずれも最終生成物の免疫反応性を証明す
るであろう。
最終生成物が単離されると、これをメタノールで十分に
洗浄し、数回濾過しく0.22μ)、乾燥剤により乾燥
させ、−30’Cで乾燥剤下に保存した(冷凍)。
洗浄し、数回濾過しく0.22μ)、乾燥剤により乾燥
させ、−30’Cで乾燥剤下に保存した(冷凍)。
得られた生成物はRが15′−ジゴキシン残基、Zが−
N−C−N−B 、Bがフルオレセイン残基そしてVが
2価のベンゼン残基である化合物■であった。
N−C−N−B 、Bがフルオレセイン残基そしてVが
2価のベンゼン残基である化合物■であった。
実施例 3
25mfl容の丸底フラスコに15’−p−アミノフェ
ニルイソシアナト−ジゴキシン(ジゴキシン)(実施例
2で製造したもの) 100ミリモルを添加し、新たに
蒸留したピリジン5〜7 mlを添加し、完全に溶解す
るまで攪拌により溶解および混和した。
ニルイソシアナト−ジゴキシン(ジゴキシン)(実施例
2で製造したもの) 100ミリモルを添加し、新たに
蒸留したピリジン5〜7 mlを添加し、完全に溶解す
るまで攪拌により溶解および混和した。
丸底フラスコにゴム膜で蓋をし、N2て5分間パージし
た。
た。
十分に換気された防護フード内でガラス製注射器(洗浄
でかつ十分に乾燥したもの)によりこのホスゲン液10
0μlを取出し、注射器から空気をすべて除去し、この
チオホスゲンを連続的に攪拌されているジゴキシン溶液
に3〜4分間にわたって徐々に添加した。反応器は直射
光を遮断しなレノればならず(金属箔または箱)、少量
を注射器により取出すことによって監視すべきである。
でかつ十分に乾燥したもの)によりこのホスゲン液10
0μlを取出し、注射器から空気をすべて除去し、この
チオホスゲンを連続的に攪拌されているジゴキシン溶液
に3〜4分間にわたって徐々に添加した。反応器は直射
光を遮断しなレノればならず(金属箔または箱)、少量
を注射器により取出すことによって監視すべきである。
IRは2250cm−’にイソチオシアネートの生成を
示すはずである。生成は象、速に進行し、通常は数時間
内に終了するが、所望により一夜放置することもできる
。
示すはずである。生成は象、速に進行し、通常は数時間
内に終了するが、所望により一夜放置することもできる
。
メタノールの添加により反応を停止し、メタノールで数
回洗浄し、回転蒸発により乾燥させた。
回洗浄し、回転蒸発により乾燥させた。
単離および精製はTLCによりメタノール;クロロホル
ム(50:50)を用いて行うことができ、抽出により
パラ−イソチオシアナト−フェニルイソシアナト−ジゴ
キシンを取出すことについては先に述べた(調製用シリ
カゲル、MeOH中への抽出、および0.22μのフィ
ルターによる濾過、乾燥、洗浄(3×)および保存のた
めの乾燥)。
ム(50:50)を用いて行うことができ、抽出により
パラ−イソチオシアナト−フェニルイソシアナト−ジゴ
キシンを取出すことについては先に述べた(調製用シリ
カゲル、MeOH中への抽出、および0.22μのフィ
ルターによる濾過、乾燥、洗浄(3×)および保存のた
めの乾燥)。
得られた生成物はYが2価のベンゼン残基;Rが15′
−ジゴキシン残基、そしてAが−N=C=Sである化合
物Iであった。
−ジゴキシン残基、そしてAが−N=C=Sである化合
物Iであった。
この化合物は単離および精製されるとさらに精製する必
要なしに数か月にわたって安定である。
要なしに数か月にわたって安定である。
保存条件を維持しなければならない(即ちこれらを乾燥
させ、−30°Cで乾燥条件下に保存する)。
させ、−30°Cで乾燥条件下に保存する)。
実施例 4
15′−バラ−イソチオシアナト−フェニルイソシアナ
ト−ジゴキシンと酵素(アシドホスファターゼ)との反
応 反応容積を最小限に保ちながら、解放(または閉鎖)容
器に適量の酵素を入れ、乾燥させ、第1または第2アミ
ンを含まない塩基性の低分子緩衝液(たとえばpl+
9.5.0.5Mのホウ酸塩緩衝液が適切である)を最
少容積添加した。4°Cで攪拌混和した。
ト−ジゴキシンと酵素(アシドホスファターゼ)との反
応 反応容積を最小限に保ちながら、解放(または閉鎖)容
器に適量の酵素を入れ、乾燥させ、第1または第2アミ
ンを含まない塩基性の低分子緩衝液(たとえばpl+
9.5.0.5Mのホウ酸塩緩衝液が適切である)を最
少容積添加した。4°Cで攪拌混和した。
希望する置換の程度(ジゴキシン:酵素)を計算し、こ
の量になるまで、酵素溶液の全容積の10%以上ではな
いジメチルホルムアミド(DMF)またはジメチルスル
ホキシド(DMSO)を添加した。溶解するまで混和し
た。
の量になるまで、酵素溶液の全容積の10%以上ではな
いジメチルホルムアミド(DMF)またはジメチルスル
ホキシド(DMSO)を添加した。溶解するまで混和し
た。
ピペットまたはこれに類する移しかえ用器具によりD肝
またはDMSO中のジゴキシンを取出し、酵素を含むp
H9,5の溶液にきわめて徐々に添加した。
またはDMSO中のジゴキシンを取出し、酵素を含むp
H9,5の溶液にきわめて徐々に添加した。
(10分程度かけるべきであり、受器は4°Cに保存す
るかまたは氷上で保存して低温に保持して使用ずべきで
ある)。ジゴキシン−酵素(複合体)を形成する反応は
比較的速やかであり、通常は24時間以内に終了する。
るかまたは氷上で保存して低温に保持して使用ずべきで
ある)。ジゴキシン−酵素(複合体)を形成する反応は
比較的速やかであり、通常は24時間以内に終了する。
生成物はRがジゴキシン残基、■が2価のベンゼン残基
、Zが N11−C−N11−B 、そしてBが酵素アシドホス
ファターゼ残基である化合物■であった。
、Zが N11−C−N11−B 、そしてBが酵素アシドホス
ファターゼ残基である化合物■であった。
結合したジゴキシン−アシドホスファターゼの精製は多
数の分離法のうぢのいずれか(たとえばセファデックス
、バイオゲルなど)を用いることにより行われる。
数の分離法のうぢのいずれか(たとえばセファデックス
、バイオゲルなど)を用いることにより行われる。
上記の方法は一例であり、有機化合物が必要な活性水素
置換基をもつ限り多種多様な有機化合物を互いにカップ
リングさせるために同様に使用できる。たとえば上記の
方法はジゴキシンまたはT4以外のリガンドをフルオレ
セイン色素および/または酵素以外の有機化合物にカッ
プリングさせるのに使用できる。
置換基をもつ限り多種多様な有機化合物を互いにカップ
リングさせるために同様に使用できる。たとえば上記の
方法はジゴキシンまたはT4以外のリガンドをフルオレ
セイン色素および/または酵素以外の有機化合物にカッ
プリングさせるのに使用できる。
本発明は、化合物■の使用によりある有機化合物と他の
ものが堅牢にカップリングしたカップリング生成物■を
製造しうるという点で特に有利である。これは、蛍光ト
レーサーを製造するに際し、カップリングが堅牢である
ためリガンドによる蛍光化合物の消光が少なくなるとい
う点で有利である。たとえば蛍光物質を、消光させる可
能性のある重い原子(たとえばT3および/またはT4
のヨウ素基)が蛍光色素に与える影響が少なくなりおよ
び/または除かれる。従って本発明は特に甲状腺ホルモ
ン(T3又はT4)が蛍光化合物に結合した甲状腺ホル
モントレーサーの製造に用いられる。
ものが堅牢にカップリングしたカップリング生成物■を
製造しうるという点で特に有利である。これは、蛍光ト
レーサーを製造するに際し、カップリングが堅牢である
ためリガンドによる蛍光化合物の消光が少なくなるとい
う点で有利である。たとえば蛍光物質を、消光させる可
能性のある重い原子(たとえばT3および/またはT4
のヨウ素基)が蛍光色素に与える影響が少なくなりおよ
び/または除かれる。従って本発明は特に甲状腺ホルモ
ン(T3又はT4)が蛍光化合物に結合した甲状腺ホル
モントレーサーの製造に用いられる。
以上の教示を考慮して本発明を種々に修正および変更す
ることができ、従って特許請求の範囲の記述の範囲内に
おいて本発明を以」−に詳述した以外の様式で実施する
ことができる。
ることができ、従って特許請求の範囲の記述の範囲内に
おいて本発明を以」−に詳述した以外の様式で実施する
ことができる。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、構造式 I : ▲数式、化学式、表等があります▼( I ) (式中、Yは2価の芳香族炭化水素残基であり;Rは蛍
光色素及び酵素から選ばれる検出可能なマーカー又は抗
原、ハプテン及び抗体からなる群から選ばれるリガンド
であり、及びAは−NO_2、−NH_2、−COOH
、−N=C=S、−SH、−OH、−N=C=O、▲数
式、化学式、表等があります▼、▲数式、化学式、表等
があります▼、▲数式、化学式、表等があります▼及び ▲数式、化学式、表等があります▼(式中、R″はアル
キル基である)よりなる群から選ばれる)を有する化合
物。 2、Yが2価のベンゼン残基である、特許請求の範囲第
1項記載の化合物。 3、Aが−NO_2である、特許請求の範囲第1項また
は2項記載の化合物。 4、Aが−NH_2である、特許請求の範囲第1項また
は2項記載の化合物。 5、Aが−N=C=Sである、特許請求の範囲第1項ま
たは2項記載の化合物。 6、Aが−N=C=Oである、特許請求の範囲第1項ま
たは2項記載の化合物。 7、Rがジゴキシン残基である、特許請求の範囲第1項
ないし6項のいずれか1項に記載の化合物。 8、RがT_4である、特許請求の範囲第1項ないし6
項のいずれか1項に記載の化合物。 9、Rが検出可能なマーカーである、特許請求の範囲第
1項ないし6項のいずれか1項に記載の化合物。
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US568482 | 1984-01-06 | ||
US06/568,482 US4670406A (en) | 1984-01-06 | 1984-01-06 | Tracers for use in assays |
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-
1984
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- 1984-10-03 CA CA000464595A patent/CA1249811A/en not_active Expired
- 1984-10-09 NZ NZ209819A patent/NZ209819A/en unknown
- 1984-10-09 AU AU34037/84A patent/AU569117B2/en not_active Ceased
- 1984-10-09 ZA ZA847896A patent/ZA847896B/xx unknown
- 1984-11-26 DK DK559984A patent/DK161045C/da not_active IP Right Cessation
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-
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-
1990
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