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Neues Immunadsorbens, Verfahren zu seiner Herstellung
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und seine Verwendung Die Erfindung betrifft ein neues Immunadsorbens,
das auf einem Trägermaterial eine immobilisierte biologisch aktive Komponente A
bzw. B eines biologisch interaktierenden Substanzpaares A/B mit natürlicher reversibler
Bindungsaffinität zueinander enthält, Verfahren zur Herstellung dieses neuen Immunadsorbens
und seine Verwendung zur gezielten Isolierung der mit der immobilisierten biologisch
aktiven Komponente korrespondierenden Komponente A bzw. B aus ihren Mischungen mit
anderen Verbindungen.
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Es sind zahlreiche Methoden bekannt, die Bestandteile von Proteingemischen
mit Hilfe ihrer physiko-chemischen Eigenschaften voneinander zu trennen und möglichst
rein darzustellen. Die gegenwärtig bevorzugten Methoden zur Trennung von Proteingemischen
sind die Ionenaustauschchromatographie und die Gelfiltration.
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Diese und ältere Methoden zur Proteinisolierung sind aus immunologischer
Sicht unspezifisch, da sie nicht auf der immunologisch spezifischen Affinität zwischen
beispielsweise Antigenen und ihren entsprechenden Antikörpern beruhen. Es können
folglich z.-B. Immunglobuline nicht entsprechend ihrer Spezifität gegenüber ihren
Antigenen gereinigt werden.
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Die spezifischen biologischen Funktionen interaktierender Substanzpaare
mit natürlicher reversibler Bindungsaffinität zueinander - beispielsweise also des
Substanzpaares AntigenXbiologisch zugehöriger Antikörper -können zur spezifischen
Isolierung Jeweils einer Komponente eines solchen Substanzpaares aus ihren Gemischen
mit Begleitstoffen eingesetzt werden. Dieses als Immunadsorption bekannte Trennverfahren
arbeitet derart, daß zunächst die eine Komponente des zusammengehörigen Paares biologisch
interaktierender Substanzen - hier und im folgenden allgemein als "Substanzpaar
A/B" bezeichnet - immobilisiert wird. Dieses Material ist das Immunadsorbens.
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Das die korrelierende biologisch aktive Komponente A bzw B enthaltende
Stoffgemisch wird dann, zweckmäßig als Lösung, mit dem Immunadsorbens behandelt
Unter Ausbildung der biologisch spezifischen Adsorptionskomplexe wird dabei aus
der behandelten Stoffmischung nur die gesuchte Gegenkomponente am Immunadsorbens
gebunden. Nach Entfernung der nicht gebundenen Begleitstoffe, beispielsweise durch
Waschen, kann der gebildete reversible Adsorptionskomplex A/B in seiner Einzelkomponente
A und B getrennt werden. Dies gelingt beispielsweise durch pH-Verschiebung oder
durch Behandlung mit konzentrierten Elektrolytlösungen. Hiermit wird das Immunadsorbens
zurückgebildet, während die durch biologische Interaktion intermediär gebundene
Gegenkomponente zum immobilisierten Partner abgetrennt und in reiner Form isoliert
werden kann.
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Zur Ausbildung eines solchen Immunadsorbens ist es vorgeschlagen worden,
die eine Komponente eines Stoffpaares A/B auf einem Trägermaterial zu immobilisieren.
So wird nach der DT-OS 2 525 422 ein Verfahren zur Isolierung von biologisch aktiven
Verbindungen der hier geschilderten Art beschrieben , bei dem die eine Komponente
der biologisch aktiven Verbindungspaare durch kovalente Bindungskräfte an einen
festen Trager gebunden sein soll. Als Träger werden hydrophile makroporöse Copolymere
von hydrophilen Monomeren verwendet. Charakteristisch für die Konstitution der hier
geschilderten Immunadsorbentien ist, daß die zu immobilisierende Komponente A bzw.
B unmittelbar auf den Träger aufziehen und dort durch kovalente Bindungen festgehalten
werden soll. Vorgeschlagen wurde auch schon, bifunktionelle Reagentien, beispielsweise
Glutaraldehyd oder Bis-Diazobenzidin zur Vernetzung von Proteinen - beispielsweise
Antigenen -einzusetzen und auf diese Weise die eine Komponente des Substanzpaares
A/B zu immobilisieren. Bekannt sind auch verschiedene Methoden zur unspezifischen
Bindung von Antigenen auf Glas, Kaolin, Polyacrylamidgelen oder Aktivkohle. Vielfach
ergab sich, daß dabei Proteine unspezifisch gebunden werden oder gebundene Antigene
bei der Elution der Antikörper mit ausgewaschen werden.
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In neuerer Zeit sind Ionenaustauschharze als Trägersubstanzen vorgeschlagen
worden, und es wurde versucht, beispielsweise y-Globuline über ihre Histidyl- und
Tyrosylgruppen an diazotiertes Polyaminopolystyrol zu binden.
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Die unspezifische Affinität dieser Trägersubstanz erwies sich als
Nachteil. Andere Vorschläge aus dem Stand der Technik beschäftigen sich mit Trägermaterialien
auf der Basis von Zellulose, Maleinsäureanhydridcopolymerisaten, aktivierten Agaroseperlen
und weiteren Materialien.
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Versucht wurde schließlich auch, Proteine mit Glutaraldehyd an mit
Wasser gequollene Polyacrylamid-Gelperlen zu binden.
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Wenn auch insbesondere mit der zuletzt genannten Methode kurzfristig
recht befriedigende Ergebnisse bei der biologisch spezifischen Isolierung von Antikörpern
erhalten werden können, so hat sich doch gezeigt, daß die auf diese Weise gewonnenen
Immunadsorbentien nicht hinreichend lange gelagert werden können. Es tritt vielmehr
eine Dissoziation der Antigenbindung ein. Das Immunadsorbens wird damit unbrauchbar.
Nachteilig ist auch die Säureempfindlichkeit dieser Immunadsorbentien, die insbesondere
bei der Trennung der Adsorptionskomplexe A/B zu Störungen - insbesondere zum Auswaschen
auch eines Teiles der immobilisierten Komponente - führt. Nachteile aller Gele ist,
daß ihre Konsistenz von der Hydratation abhängig ist und diese wiederum durch die
Molarität und den pH von Puffern beeinflußt wird.
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Die Erfindung geht von der Aufgabe aus, ein hochwirksames, allgemein
anwendbares hochstabiles Immunadsorbens zu schaffen, das auf der Basis einer polymeren
Trägersubstanz mittels einer mehrfunktionellen Kupplungskomponente die immobilisierte
biologisch aktive Komponente A bzw. B in fester und gebrauchs- und lagerstabiler
Anbindung enthält. Vorzugsweise soll dieses Immunadsorbens eine mehrfache Benutzung
derart ermöglichen, daß nach seiner Beladung mit biologisch selektiv gebundener
Gegenkomponente B bzw. A unter anschließendem Aufspalten dieses reversiblen Sorptionskomplexes
das Immunadsorbens zur unmittelbaren Wiederverwendung zurückgewonnen werden kann.
Das neue Immunadsorbens sollte darüberhinaus in einem einfachen Verfahren herstellbar
sein, und es sollte aufgrund seiner besonderen Beschaffenheit möglich sein, die
Trennung der bei der Adsorption gebildeten Sorptionskomplexe so rasch bewerkstelligen
zu können, daß keine oder praktisch keine Schädigung der biologisch aktiven Substanzen
eintritt.
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Die Erfindung hat sich in diesem Zusammenhang insbesondere die Aufgabe
gestellt, eine möglichst rasche Elution
der biologisch gebundenen
Gegenkomponente des Substanzpaares A/B zu ermöglichen, so daß hier mögliche Schäden,
beispielsweise durch pH-Verschiebung in den stärker sauren Bereich, weitgehend vermieden
werden. Selbstverständlich sollte das neue Immunadsorbens allgemeine Anforderungen,
beispielsweise leichte Handhabbarkeit, keine Toxizität und dgl. sicherstellen. Besonders
bedeutsam für die erfindungsgemäße Aufgabenstellung ist die hohe Beständigkeit des
den immobilisierten biologisch aktiven Reaktionspartner enthaltenden Adsorbensmaterials
unter üblichen Gebrauchs- und Lagerbedingungen für biologisch aktiven Substanzen
der hier betroffenen Art.
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Vorgeschlagen wird dementsprechend erfindungsgemäß ein Immunadsorbens
aus einem unlöslichen polymeren Träger und einer mittels einer mehrfunktionellen
Kupplungskomponente darauf fixierten biologisch aktiven Komponente A oder B eines
biologisch interaktierenden Substanzpaares A/B mit natürlicher reversibler Bindungsaffinität
zueinander, das dadurch gekennzeichnet ist, daß der polymere Träger mittels reaktiver
Gruppen chemisch und dabei säurestabil an die Kupplungskomponente gebunden ist,
die ihrerseits ebenfalls mittels säurestabiler chemischer Bindungen an die biologisch
aktive Komponente A bzw. B gebunden ist.
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-Der Begriff der Säurestabilität erfaßt dabei wenigstens etwa den
Bereich, in dem biologisch aktive Komponenten des interaktierenden Substanzpaares
A/B sauren, insbesondere sauren hydrolytischen Bedingungen, ausgesetzt werden können,
ohne ihre biologische Aktivität irreversibel zu zerstören.
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Für den Aufbau des neuen Immunadsorbens der Erfindung ist damit das
funktionelle Zusammenwirken von 5 Komponenten wesentlich. Die erste Komponente ist
der unlösliche
polymere Träger, der funktionelle Gruppen enthält,
die in der Lage sind, mit der polyfunktionellen Kupplungskomponente dauerhafte gebrauchs-
und lagerstabile chemische Bindungen auszubilden. Diese funktionellen Gruppen des
polymeren Trägermaterials reagieren Jedoch unter Arbeitsbedingungen nicht ihrerseits
mit dem biologisch aktiven Stoffpaar A/B. Der zweite wesentliche Bestandteil ist
die Kupplungskomponente, die mehrfunktionell ist und einerseits befähigt ist, mit-den
reaktiven Gruppen des polymeren Trägers die gewünschten stabilen chemischen Bindungen
auszubilden, andererseits aber ebenfalls in der Lage ist, mit der zu immobilisierenden
biologisch aktiven Substanz entsprechend stabile gebrauchs- und lagerbeständige
chemische Bindungen zu liefern. Diese Ausbildung chemischer Bindung - wenigstens
zwischen der Kupplungskomponente und der zu immobilisierenden biologisch aktiven
Komponente erfolgt dabei unter Bedingungen, die das biologisch aktive Material und
insbesondere die Fähigkeit zur selektiven Bildung der reversiblen Sorptionskomplexe
nicht schädigen. Mittels dieser Kupplungskomponente ist schließlich der eine Partner
des Substanzpaares A/B auf dem Trager fest verankert. Auch hier sind chemische Bindungen
ausgebildet, die diese Komponente fest an die Oberfläche des Trägers fixieren.
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In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die gewünschte
dauerhafte chemische Anbindung durch Auswahl eher bestimmten Kupplungskomponente
bewirkt. Diese Kupplungskomponente ist dabei eine polyfunktionelle aromatische Halogenverbindung,
die mehr als nur einen, vorzugsweise 2 Halogensubstituenten trägt und gleichzeitig
in o-Stellung zu den Halogenatomen mit Nitrogruppen substituiert ist. Geeignete
Halogene sind insbesondere Fluor und/oder Chlor, wobei dem in o-Stellung mit substituierenden
Nitrogruppen aktivierten Fluor besondere Bedeutung zukommt.
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Die erfindungsgemäß bevorzugte Kupplungskomponente ist das Difluordinitrobenzol,
und zwar hier insbesondere das l,5-Difluor-4,6-dinitrobenzol, im folgenden mit DF2NB
bezeichnet. DFDNB ist in der Lage, Uber seine beiden reaktiven Fluoratome mit beispielsweise
freien Amino-, Sulfhydryl-, phenolischen OH- oder Histid-ylgruppen zu reagieren.
Aufgrund seiner 2 reaktiven Fluoratome ist es bifunktionell. In wässrigen Lösungen
ist es unterhalb von pH 8,4 praktisch hydrolysenbeständig. Das DFDNB kann mono-
oder bifunktionell reagieren, je nachdem, ob ein Fluoratom oder beide in der Reaktion
eingehen. Eine monofunktionelle Reaktion findet hauptsächlich bei niedrigeren Reaktionstemperaturen
(beispielsweise bei ca. 100 C) und DFDNB-Uberschuß statt. Die Reaktion ist stark
bifunktionell bei Überschuß des bzw. der anderen Reaktionspartner und vergleichsweise
höheren Temperaturen, insbesondere im Temperaturbereich von ca. 40 bis 600 C.
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Eine Umsetzung von DFDNB mit den genannten funktionellen Gruppen kann
beispielsweise im pH-Bereich zwischen etwa 7,0 und 8,0 durchgeführt werden, wobei
zweckmäßigerweise in einem gepufferten Reaktionsgemisch gearbeitet wird.
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Am Beispiel der Umsetzung von DFDNB mit einer eine freie primäre Aminogruppe
enthaltenden Reaktionskomponente in einem Phosphatpuffer verläuft dann die Reaktion
beispielsweise gemäß der folgenden Gleichung: C6H2(No2)2F2+H2N-R + Na2HPO4
C6H2(N02)2F-NH-R + NaF + NaH2P04 Entsprechend verlaufen die Reaktionen, wenn statt
des Reaktionspartners H2N-R vergleichbare Verbindungen, wie HS-R, HO-R und dgl.
eingesetzt werden.
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Die Auswahl dieser besonders bevorzugten Kupplungsverbindung und die
mit ihr gegebene Reaktivität bestimmt weitgehend die erfindungsgemäß bevorzugte
Auswahl des polymeren Trägers. Er soll als Feststoffmatrix dem neuen Immunadsorbens
das physikalische Gepräge geben.
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Die bevorzugten Trägermaterialien der Erfindung sind unlösliche Feststoffe,
die wenigstene eine der zuvor geschilderten mit DFDNB reaktiven funktionellen Gruppen
enthalten. Bevorzugt sind dabei syntehtische harzartige Polymermaterialien, die
freie H2N-, HS-, phenolische HO- und/oder Histidylreste aufweisen. Im übrigen sind
diese Trägerharze zweckmäßigerweise gegenüber den biologisch aktiven Komponenten
A und B inert, so daß sie selber also unter den Arbeitsbedingungen keine chemische
Bindungen mit diesen biologisch aktiven Komponenten ausbilden. Die bevorzugten Trägerharze
der Erfindung sind in wässrigen Lösungen nicht quellbar und unterscheiden sich damit
von den nach den Angaben des Standes der Technik im Quellungszustand eingesetzten
Trägermaterialien.
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Besonders bevorzugt sind im Rahmen der Erfindung solche polymeren
Trägermaterialien, die freie primäre Aminogruppen enthalten. Die an der Oberfläche
des jeweiligen Formteils des Trägerharzes einer Reaktion zugänglichen H2N-Gruppen
setzen sich mit DFDNB unter Ausbildung einer dauerhaften chemischen Bindung um.
Zweckmäßig werden dabei solche Reaktionsbedingungen gewählt, daß das DFDNB dem Harz
gegenüber nur einfunktionell reagiert, d.h., daß damit die andere Funktionalität
dieser Kupplungskomponente der Umsetzung mit der zu immobilisierenden biologisch
aktiven Substanz zur Verfügung steht.
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Polymere Syntheseharze mit einem Gehalt an freien primären Aminogruppen
sind in hinreichender Zahl bekannt.
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Da für die Zwecke der Erfindung lediglich diese funktionelle Gruppe
wesentlich ist, im übrigen sich das
polymere Material aber inert
verhalten soll, ist seine Beschaffenheit im einzelnen unwesentlich, so lange diese
Voraussetzungen erfüllt sind. Eine besonders geeignete Klasse von Trägern wird durch
Polymerisation oder Copolymerisation von primäre Aminogruppen enthaitenden Estern
der Acrylsäure bzw. Methacrylsäure erhalten.
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So können Homo- und insbesondere Copolymerisate von Aminoalkylacrylaten
oder -methacrylaten bevorzugte Trägermaterialien im Sinne der Erfindung sein. Als
besonders geeignet erwiesen hat sich beispielsweise ein zur Unlöslichkeit vernetztes
Copolymerisat aus Acrylnitril und Methacrylsäure-B-Aminoäthylester.
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Reaktive Substanzpaare A/B im Sinne der Erfindung weisen in aller
Regel wenigstens eine der mit DFDNB reaktiven Gruppen -NH2-, -SH-, phenolisch-OH
oder Histidyl- auf.
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Das DFDNB ist daher in Verbindung mit den zuvor geschilderten entsprechend
substituierten Trägerharzen die ideale Kupplungskomponente zur Ausbildung dauerhafter
chemischer Bindungen zwischen dem polymeren Träger und der zu immobilisierenden
biologisch aktiven Komponente A bzw. B.
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Je nach den gegebenen Reaktionsbedingungen bei der ein-oder mehrstufigen
Umsetzung von Träger, Kupplungskomponente und zu immobilisierender biologisch aktiver
Substanz kann dabei der Fall auftreten, daß nach der Reaktion dieser 5 Komponenten
noch überschüssige funktionelle Reaktivitäten der Kupplungskomponente vorhanden
sind, die damit die Möglichkeit einer weiterführenden Umsetzung mit Komponenten
schaffen, die beispielsweise eine der zuvor genannten reaktiven Gruppen enthalten.
Das könnte zu Störungen führen, beispielsweise zur unerwünschten Anbindung von 13
an das Immunadsorbens, das an sich die Komponente A als immobilisierten Bestandteil
enthält. In einer weiterhin bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind daher
solche eventuell ursprünglich noch vorliegenden freien Valenzen des DFDNB mit nicht
störenden
Maskierungsmitteln abgesättigt. Als Maskierungsmittel
eignen sich Verbindungen, die nicht selber biologisch aktiv im Sinne des Stoffpaares
A/B sind und insbesondere gewünschtenfalls auch leicht von diesen Komponenten abtrennbar
sind. Ein Beispiel für solche Maskierungsmittel sind einfache Aminosäuren, die dann
beispielsweise über ihre primäre Aminogruppe an die ursprünglich noch freien Valenzen
der Kupplungskomponente gebunden sind. In dieser bevorzugten Ausführungsform der
Erfindung ist also der polymere Träger über seine funktionellen Gruppen an die Kupplungskomponente
DFDNB gebunden, die ihrerseits die immobilisierte Komponente A oder B bindet, während
die restliche Funktionalität des DFDNB mit einer Aminosäure abgesättigt ist.
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Dieses Immunadsorbens besitzt damit keine unspezifische Affinität
zu Proteinen. Durch die Anbindung der biologisch aktiven Substanz hat keine Beeinträchtigung
der Affinität zum spezifischen Antikörper stattgefunden. Das Immunadsorbens ist
stabil gegenüber pH-Schwankungen in breitem Bereich, insbesondere, wenn diese nur
verhältnismäßig kurzfristig wirksam werden, gegenüber Schwankungen der Temperatur
und der Ionenstärke eingesetzter Lösungen.
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Es ist insbesondere zu wiederholtem Gebrauch geeignet.
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Als besonders zweckmäßig hat sich erwiesen, dem Immunadsorbens eine
pulverförmige bis körnige Struktur zu verleihen, so daß es in der Art von Ionenaustauschharzen
beispielsweise im Kolonnenbetrieb eingesetzt werden kann. Die Korngröße wird dabei
durch praktische Erwägungen bestimmt. Besonders geeignet haben sich Korngrößen bis
maximal ca. 5 mm Durchmesser, wobei eine Korngröße unter 1 mm bevorzugt sein kann.
Besonders geeignete Materialien können beispielsweise Korngrößen im Bereich von
0,1 mm bis 0,5 mm aufwelsen. Harzmassen dieser Art ermöglichen die Bindung hinreichender
Mengen der zu inmo-
bilisierenden Komponente und damit die hinreichende
Bildung der gei nschten Sorptionskomplexe, auf der anderen Seite gestatten sie die
Verarbeitung von biologischen Lösungen der hier betroffenen Art mit hohen Fließgeschwindigkeiten
im kontinuierlichen oder halbkontinuierlichen Verfahren. Wichtig ist das nicht nur
in der Stufe der Adsorption, bedeutungsvoll ist diese Fähigkeit insbesondere bei
der Desorption des aus einer Mischung mit anderen Komponenten isolierten Stoffes
unter Rückgewinnung des Immunadsorbens-. Die zur Spaltung der Sorptionskomplexe
in der Regel einzusetzenden stärker sauren Bedingungen können bei längerer Verweilzeit
eine Schädigung der biologisch aktiven Stubstanzen A und/oder B auslösen. Durch
die Möglichkeit, erfindungsgemäß mit hohen Fließgeschwindigkeiten arbeiten zu können,
wird der Zeitraum der Behandlung der biologisch aktiven Substanzen in bedenklichen
pH-Bereichen auf ein Minimum herabgesetzt.
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Die neuen Immunadsorbentien sind von bemerkenswerter Haltbarkeit und
Festigkeit, sie können bei +40 C, tief-0 gefroren (-15° C) oder lyophilisiert wochenlang
aufbewahrt werden, ohne daß eine nennenswerte Veränderung eintritt. Im Gegensatz
zu den eingangs geschilderten Immunadsorbentien des Standes der Technik ist das
erfindungsgemäße Immunadsorbens vom Hydratationszustand (Quellungszustand) des Trägers
unabhängig. Gele sind bekanntlich in ihrem Quellungszustand von der Temperatur,
von der Ionenstärke und vom pH-Wert des Puffers abhängig.
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Im Gegensatz dazu ist das den eingesetzten Flüssigphasen gegenUber
völlig inerte Trägermaterial der Erfindung bei der Affinitätschromatographie durch
Temperaturschwankungen, pH-Wert-Anderungen und änderungen der Ionenstärke kaum beeinflußt.
Es kann daher die Temperatur und die Zusamm nsetzung der Elutionspuffer relativ
frei gewählt werden, die Arbeitsbedingungen sind im einzelnen lediglich eingegrenzt
durch die Notwendig-
keit, die biologisch aktiven Substanzen nicht
irreversibel zu schädigen.
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Die Immobilisierung der biologisch aktiven Komponente A bzw. B mittels
der Kupplungskomponente auf dem Träger kann grundsätzlich einstufig oder mehrstufig
erfolgen. In mehrstufigen Herstellungsverfahren wird bevorzugt zunächst DFDNB mit
dem Träger verknüpft. Hierzu kann es zweckmäßig sein, bei niedrigen Reaktionstemperaturen,
z.B. im Temperaturbereich von ca. 5 bis 200 C, und mit einem Überschuß an DFDNB
zu arbeiten. Nach Isolierung des primären Reaktionsproduktes, insbesondere nach
Auswaschen des DFDNB-Überschusses wird dann in einer zweiten Verfahrensstufe die
Fixierung der biologisch aktiven Komponente über die noch freien Valenzen des einseitig
an den Träger gebundenen DFDNB vorgenommen.
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DFDNB ist in Wasser kaum löslich, jedoch in organischen Lösungsmitteln,
wie Aceton, Äthanol, Methanol, Dimethylsulf oxyd, u.a. gut löslich. Es wird erfindungsgemäß
bevorzugt, das im Reinzustand kristalline Material in gelöster Form der Umsetzung
zuzuführen. In der hier geschilderten ersten Verfahrensstufe kann beispielsweise
der auf die gewünschte Teilchengröße zerkleinerte Träger als solcher oder in Wasser
und/oder Lösungsmitteln suspendiert mit einer Lösung des DFDNB zusammengebracht
werden. In der nachfolgenden Verfahrensstufe der Immobilisierung der biologisch
aktiven Substanz A bzw. B wird zweckmäßigerweise unter an sich bekannten physiologisch
tolerierbaren Bedingungen gearbeitet. Insbesondere bedeutet das das Arbeiten mit
wässrigen Lösungs-bzw. Suspensionsmitteln mit pH-Werten im mittleren Bereich (etwa
pH 5 bis 8), bei nicht oder nur mäßig erhöhten Temperaturen und Elektrolytkonzentrationen
im physiologisch tolerierbaren Bereich. Die Verfahrensbedingungen
im
einzelnen werden durch die Sensitivität der zu fixierenden biologisch aktiven Komponente
bestimmt und lassen sich von Fall zu Fall den entsprechenden Angaben des Standes
der Technik entnehmen.
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Nach der Immobilisierung der biologisch aktiven Komponente wird das
Immunadsorbens erneut gewaschen. Dann werden gegebenenfalls noch vorliegende freie
Valenzen der Kupplungskomponente mit einer biologisch inerten Komponente, beispielsweise
mit einer Aminocarbonsäure, maskiert. Hier und bei allen folgenden Arbeiten mit
dem neuen Immunadsorbens ist darauf zu achten, daß Verfahrensbedingungen gewählt
werden, die zu keiner oder keiner wesentlichen Schädigung der auf dem Träger immobilisierten
biologisch aktiven Verbindung führen. Wird kurzfristig die Wahl von Verfahrensbedingungen
- beispielsweise stärker saure pH-Werte - notwendig, die zu einer Schädigung der
biologisch aktiven Komponente führen können, so wird zweckmäßigerweise die Zeitdauer
der Einwirkung solcher Verfahrensbedingungen so kurz wie möglich gehalten.
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In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird
die Reaktion zwischen Träger, Kupplungskomponente und der zu immobilisierenden biologisch
aktiven Komponente einstufig vorgenommen. Hierbei wird zweckmäßig bei Temperaturen
von etwa 40 bis 600 C, einem pH-Wert unter 8,0, jedoch im physiologisch akzeptablen
Bereich, insbesondere im Bereich von etwa 6,5 bis 8,0, mit einem Unterschuß an DFDNB
in einer Pufferlösung, beispielsweise einem Phosphatpuffer, gearbeitet.
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Im einzelnen wird dabei eine Suspension von Trägermaterial und zu
immobilisierender Komponente in der Pufferlösung mit vorbestimmtem pH-Wert-auf die
erforderliche Reaktionstemperatur gebracht. Dann wird eine DFDNB-Lösung im Unterschußzigetropft.
Nach Abschluß
der Reaktion werden die nicht an den Träger gebundenen
Proteine und die Pufferlösung einschließlich der bei der Reaktion gebildeten Salze
ausgewaschen. Zweckmäßig ist es hier, wie auch bei dem zuvor erwähnten mehrstufigen
Verfahren, eine Trennung zwischen gebundenen und löslichen Proteinen durch mehrmalige
Zentrifugierung (z.B. bei 600 x g) vorzunehmen. Jetzt noch vorliegende restliche
freie Valenzen der Kupplungskomponente, die nicht mit der biologisch aktiven Verbindtmg
reagiert haben, werden durch Reaktion mit einer Aminocarbonsäure, z.B. durch Reaktion
mit L-Lysin, abgesättigt.
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Die neuen Immunadsorbentien sind so in einem verkürzten Verfahren
herstellbar. Diese Herstellungsmethode eignet sich besonders für suche Fälle, bei
denen die zu immobilisierenden biologisch aktiven Komponenten in hinreichend großen
Mengen zur Verfügung stehen.
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Die Erfindung betrifft in einer weiteren Ausführungsform die Anwendung
der neuen Immunadsorbentien zur spezifischen Isolierung der biologisch aktiven Komponenten
A oder B entsprechender Substanzpaare A/B. Als solche Komponenten kommen ganz allgemein
Vertreter der folgenden Substanzpaare in betracht: Antigene/Antikörper; Enzyme/
Enzyminhibitoren; Hormone/hormontransportierenue Proteine bzw. Hormone/Antihormone;
Vitamine/vitaminbindende Proteine; Zellen und Zellenmembranen/antizelluläre Antikörper;
Bakterien sowie Teile von Bakterien (Membranen, Geißeln) und antibakterielle Antikörper;
Viren und antivirale Antikörper. Der Anwendungsbereich der neuen Immunadsorbentien
erfaßt dabei auch das Gebiet der Pflanzenproteine und der zugehörigen Antikörper.
Im breiten Gebiet der Reaktantenpaare Antigene/Antikörper ist das erfindungsgemäße
Immunadsorbens mit immobilisierten Antigenen insbesondere zur spezifischen Isolierung
präzi-
pitierender, agglutinierender und cytotoxischer Antikörper
geeignet. Es können spezifische Antikörper isoliert werden, die durch Immunisation
in xenogenen (heterologen) Systemen hergestellt worden sind. Das neue Immunadsorbens
eignet sich infolge seiner physiko-chemischen Beschaffenheit besonders auch zur
Bindung von Zellen und Zellmembranen und anderen korpuskulären biologischen Elementen.
Ein weiteres Anwendungsgebiet der neuen Immunadsorbentien liegt in der Reinigung
von Antikörpern, die im allogenen Immunisationssystem hergestellt sind. Hier können
Antikörper mit hoher Reinheit in hohen Ausbeuten erhalten werden. Diese Allo-Antiseren
spielen bei der Erforschung eines besonderen Mechanismus zur biologischen Suppression
der Immunantwort eine Rolle.
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Die Anwendung der neuen Immunadsorbentien sei im folgenden anhand
des Substanzpaares Antigen/Antikörper geschildert, ist aber natürlich in entsprechender
Weise auch auf alle anderen hier aufgezählten biologisch aktiven Substanzpaare anwendbar.
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Zur Reindarstellung von Antikörpern mit Hilfe von Immunadsorbentien
mit immobilisierten Antigenen kann grundsätzlich nach 2 Arbeitsverfahren vorgegangen
werden: Bei der sogenannten batch-Methode werden zunächst die Antikörper spezifisch
aus ihren Gemischen mit anderen Proteinen an das Immunadsorbens gebunden. Das dabei
anfallende Material mit gebundenen Antikörpern wird durch wiederholte Zentrifugation
und Resuspension gewaschen.
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Jetzt wird in an sich bekannter Weise, insbesonder also durch Erhöhung
der H+ -lonenkonzentration auf Werte zwischen 4,5 und 2,4 oder durch Behandlung
mit konzentrierten Elektrolytlösungen, der reversible Sorptionskomplex gelöst. Die
freigesetzten Antikörper werden dann wiederum durch wiederholte Zentrifugation mit
zwischengeschalteten Suspensions-Waschstufen gewonnen.
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Nachteile dieses Verfahrens sind, daß die Zentrifugierung zeitraubend
ist, und daß die Verweildauer der biologisch aktiven Komponenten im Puffer mit hoher
H+ -lonenkonzentration relativ lang ist, so daß also Schädigungen der biologisch
aktiven Komponenten zu befürchten sind.
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Bei dera nach der Art der Säulenchromatographie durchgeführten zweiten
Verfahrenstyp werden die reaktionsbereiten Immunadsorbentien in eine Säule geschichtet
und nach der Inkubation mit dem Proteingemisch, das die Antikörper enthält, mit
Wasch-Pufferlösungen so lange durchgespült, bis sich im Eluat keine Proteine mehr
nachweisen lassen. Aur die gleiche Weise werden Jetzt die spezifischen Antikörper
mit Hilfe von - z.B. stärker sauer eingestellten - Elutionspuffern ausgewaschen.
Die mehrmalige Zentrifugierung entfällt. Die aus der Säule austretende, Antikörper
enthaltende Waschlösung kann sofort wieder auf physiologisch akzeptable pH-Werte
neutralisiert werden. Insgesamt sind hier gegenüber der batch-Methode die Waschphase
und insbesondere die Trennungsphase schonender und damit wirkungsvoller.
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Von Vorteil ist in diesem Zusammenhang, daß die Einstellbarkeit der
physiko-chemischen Beschaffenheit der erfindungsgemäßen Immunadsorbentien - beispielsweise
durch Wahl der Korngröße des Trägerharzes - hohe Durchflußgeschwindigkeiten der
jeweiligen Lösungen gewählt werden können, die beispielsweise im Bereich von 50
ml/Min. liegen. Auf diese Weise sind nicht nur Antikörper den erniedrigten pH-Werten
nur kurze Zeit ausgesetzt, es werden auch unspezifische Adsorptionen von anderen
Serumproteinen, die nicht den spezifischen Antikörpern zugehören, vermieden.
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Da die Trennung der Sorptionskomplexe aus Antigenen/ Antikörpern in
der Regel eine Behandlung in starker saurem Gebiet (pH 2,5 bis 4) fordert, kann
es zweckmäßig sein, das Immunadsorbens vor seinem Einsatz zur spezifischen Isolierung
von Antikörpern einer Waschbehandlung zu unterwerfen, die in ihren Bedingungen der
reversiblen Trennung der Sorptionskomplexe und Elution der Antikörper entspricht.
Auf diese Weise ist sichergestellt, daß bei der späteren Elution von spezifischen
Antikörpern unter den gleichen Bedingungen eine eventuelle Elution von Antigenen
vermieden wirdf In dieser Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verwendung der neuen
Immunadsorbentien wird also beispielsweise das fertige Immunadsorbens vor seinem
Einsatz mit einer stärker sauren (z.B. pH 2,8) eingestellten Pufferlösung gewaschen.
Diese Pufferlösung wird dann mit einem Standardpuffer wieder ausgewaschen. Insbesondere
wird der pH-Wert wieder auf den Bereich eingestellt, in dem die gewünschte Bildung
der Sorptionskomplexe stattfindet.
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Jetzt ist das Material zur Verwendung als Immunadsorbens einsatzbereit.
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Zur Ausbildung der Sorptionskomplexe, zu ihrer Wiederauflösung und
zur Elution der spezifisch adsorbierten Komponente gelten im übrigen die jeweiligen
Angaben des Standes der Technik. So ist es beispielsweise bekannt, daß Glycin eine
stabilisierende Wirkung auf Immunglobuline ausübt, so daß die Auflösung der Sorptionskomplexe
und die Elution der wieder frei gewordenen Antikörper beispielsweise mit einem Glycin-HCl-Puffer
erfolgen kann.
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In einer besonders wichtigen weiteren Ausführungsform der Erfindung
kann das neue Immunadsorbens als spezifischer Feststoffkatalysator in solchen Reaktionen
eingesetzt werden, in denen biologisch aktive Komponenten bzw. Komponentenpaare
für den Ablauf chemischer Reaktionen z.B.
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im Sinne der Biosynthese verantwortlich bzw. mitverantwortlich sind.
In erster Linie kommt hier das Gebiet der
biologischen bzw. biologisch-analogen Reaktionen
in Betracht, die unter dem Einfluß von beispielsweise Enzymen und/oder Fermenten
ablaufen. So sind beispielsweise heute zahlreiche Pflanzen-biologische Aufbaureaktionen
aufgeklärt, die biosynthetisch unter dem Einfluß von Enzymen bzw.
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Enzymsystemen ablaufen. Eine Schwierigkeit für die Nachahmung solcher
Reaktionen in vitro liegt darin, daß die als echte Katalysatoren wirkenden Enzyme
bzw. Fermente mit in das Reaktionsprodukt übergehen und daraus nicht oder nur mit
Schwierigkeiten isoliert werden können.
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Das neue Immunadsorbens der Erfindung schafft hier die einleuchtende
Möglichkeit, die biologisch spezifisch-aktive Katalysatorkomponente zu immobilisieren
und auf diesem Wege die leichte Abtrennbarkeit des Katalysators -und damit seine
Wiederverwendung in anschließenden Verfahrensstufen - zu ermöglichen. Auch hier
wird also die Handhabung der Umsetzung reaktiver Substanzpaare im Sinne der Erfindung
dadurch vereinfacht, daß eine - oder mehrere - biologisch spezifisch aktive Komponenten
auf einem unlöslichen polymeren Träger fixiert werden und der gewünschte Reaktionsablauf
dann in Gegenwart der derart fixierten Komponenten vorgenommen wird. Letztendlich
gelingt auch hier die Wiedergewinnung der immobilisierten biologisch aktiven Komponenten
- vorzugsweise zur Wiederverwendung in weiteren Verfahrensstufen - in vereinfachter
Weise.
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Bei den nachstehend geschilderten experimentellen Arbeiten wurden
die im folgenden geschilderten Materialien eingesetzt.
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Wasserunlöslicher polymerer Träger: Vernetztes basisches Copolymerisat
aus Acrylnitril und Methacrylsäure-ß-Aminoäthylester mit einem Gehalt an freien
Aminogruppen von etwa 1,5 Val/kg. Das unlösliche Harz wird durch Zerkleinerung in
einem görser und anschließendes Sieben auf eine Teilchengröße im Bereich von 0,1
bis 0,5 mm eingestellt.
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l,3-Difluor-4,6-dinitrobenzol: Analysenreine kristalline Substanz
Arbeitslösungen: 1) 0,15 M NaCl-Lösung 2) Phosphatpuffer: Stammlösungen von Na2IIP04
und NaH2P04 mit den molaren Konzentrationen der herzustellenden Puffer wurden gemischt
und auf den gewünschten pH-Wert eingestellt.
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3) Phosphatgepufferte NaCl-Lösung (PBS): 0,15 M Stammlösung von K2HP04
und KH2P04 wurden gemischt, der geforderte pH wurde eingestellt und dieser Puffer
mit 0,15 M NaCl-Lösung im Verhältnis 1:1 aufgefüllt.
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Die Lösung wurde bei +40 C aufbewahrt.
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4) 0,5 M Na2HP04-Lösung (89,0 g ad 1000 ml Aqua dest.) 5) 0,15 M Glycin-HCl
Puffer vom pH 2,8 und pH ),0: 11,26 g Glycin wurden in ca. 900 ml Aqua dest. gelöst
und mit 1 N HC1 auf pH 2,8 bzw. pH ),0 eingestellt. Anschließend wurde mit Aqua
dest. auf 1000 ml aufgefüllt.
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Zu immobilisierende Antigene: Isoliertes Rinderalbumin bzw. isolierte
Schaflymphozyten.
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Beispiel 1 Herstellung des Immunadsorbens aus Trägerharz, DFDNB und
Rinderalbumin.
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500 mg Rinderalbumin werden in 250 ml Phosphatpuffer (o,15 M, pH 8,0)
gelöst und auf 45° C erwärmt. 11 g des Trägers werden dazugegeben und unter ständigem
Rühren mit einem Magnetrührer in Suspension gehalten. Dann werden 15 mMol DFDNB
(ca. 3,06 g) gelöst in 20 ml Athanol-Aceton-Lösung (4 + 1, V/V) langsam dazugetropft.
Als Reaktionsgefäß dient ein Dreihalskolben mit aufgesetztem Rückf-lußkühler in
einem Wasserbad, das konstant auf 45° C gehalten wird.
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Die Reaktion wird unter laufender pH- und Temperaturkontrolle 3 Stunden
belassen. Bei Absinken des pH erfolgt eine Korrektur mit 0,5 M Na2HP04-Lösung. Anschliessend
werden die Granula so oft in Phosphatpuffer (0,15 M, pH 8,0) suspendiert und wieder
abzentrifugiert, bis das nicht gebundene Rinderalbumin entfernt ist. Die Extinktion
des Überstandes wird im Spektralphotometer bei 280 nm gemessen; sie soll weniger
als 0,05 betragen.
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Dann werden die Granula in 250 ml Phosphatpuffer (0,15 M, pH 8,0)
zusammen mit 2,75 g (15 mM) L-Lysin resuspendiert, und unter den oben beschribenen
Bedingungen und leichtem Rühren wieder 3 Stunden belassen, um die restlichen Fluor-dinitro-phenylgruppen,
die nicht mit dem Rinderalbumin reagiert haben, abzusättigen.
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Danach werden die Granula in einem Filter nach Bücher (Fritte) mit
0,15 M NaCl-Lösung und Aqua dest. sorgfältig gewaschen, um die gelösten Fluoride
zu entfernen. Wenn die Waschflüssigkeit nicht mehr gelb gefärbt ist, wird das Immunadsorbens
in 0,15 M NaGl-Lösung suspendiert und bei +40 C aufbewahrt.
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Beispiel 2 Herstellung des Immunadsorbens aus Trägerharz, DFDNB und
Schaf lymphozyten 11 g des Trägerharzes werden in Phosphatpuffer (0,15 M, pH 7,4)
zusammen mit 6 bis 8 ml dichter Lymphozytensuspension (1,2 x 108 Zellen/ml) unter
Rühren auf 410 C erwärmt. 3,06 g DFDNB (15 mMol) werden in 24 ml Athanol-Acetongemisch
(4+1 V/V) tropfenweise zugegeben, Die Reaktion wird in einem Drei hals kolben mit
aufgesetztem Rückflußkilhler und Thermometer im Wasserbad bei 410 C durchgeführt.
Bei ständiger Kontrolle des pH und leichtem Rühren wird die Reaktion für 3 Stunden
belassen. Anschliessend werden die Reaktionsprodukte bei 400 x g 5 Minunten lange
abzentrifugiert und der Überstand dekantiert.
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Das Immunadsorbens wird dann in 0,15 M NaCl-Lösung so lange gewaschen,
bis die Extinktion des Überstandes ( 0,05 ist.
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Um noch vornandene freie 1>initro-fluor-benzolgruppen abzusättigen,
wird das Produkt in 100 ml Phosphatpuffer (0,15 M, pH 7,4) mit 15 mMol L-Lysin (2,75
g) bei 410 C unter gleichen Bedingungen 5 Stunden lang reinkubiert. Danach wird
das Immuadsorbens so lange in 0,15 M NaCl gewaschen, bis die Extinktion des Überstandes(0,05
ist.
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Ein Teil des Immunadsorbens wird in phosphatgepufferter NaCl-Lösung
(pH 7,4) bei +40 C bis zur Verwendung aufbewahrt, ein anderer Teil wird lyophilisiert
und ebenfalls bei +40 C gelagert.
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Beispiel 5 Isolierung spezifischer Antikörper (allgemeine Angaben)
diene Säule mit Kühlmantel (25 cm Länge, 2 cm Durchmesser) wird mit 50 g Immunadsorbens,
das in O,l5.M'NaCl-Lösung suspendiert ist, gepackt. Die fertige Säule wird mit Glycin-HC1-Puffer
(ca. 500 ml, pH 2,8) gewaschen, um bei der späteren Elution von spezifischen Antikörpern
mit diesem Puffer eine eventuell. gleichzeitige Elution von Antigenen zu vermeiden.
Der Puffer wird dann mit PBS (0,15 M, pH 7,4) wieder ausgewaschen.
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Anschließend werden 20 bis 25 ml Antiserum eingefüllt; die Säule wird
1 1/2 Stunden bei Raumtemperatur belassen und 1/2 Stunde über den Kühlmantel auf
+40 C gekühlt.
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Die nächsten Arbeitsgänge werden bei +40 C mit gekühlter Säule und
gekühlten Lösungen durchgeführt: Die Säule wird mit 0,15 M NaCl-Lösung so lange
gewaschen bis die nicht gebundenen Serumproteine vollständig entfernt sind. Die
Extinktion der Waschflüssigkeit soll bei Messung im Spektralphotometer bei 280 nn<O,05
sein.
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Die gebundenen Antikörper werden dann mit 200 ml Glycin-HCl-Puffer
vom pH ),0 und 200 ml Glycin-HCl-Puffer vom pH 2,8 dissoziiert und ausgewaschen.
Die Durchflußgeschwindigkeit wird auf 50 ml/Min. eingestellt. Das Eluat muß sofort
aut pH 7,4 mit 0,5 M Na2HPO4-Lösung zurücktitriert werden. Die eluierten spezifischen
Antikörper werden in einer "AMICON"-Filterkammer (AMICON BV, Oosterhout N.B. Holland)
mit dem Filter IM 10 ankonzentriert und anschließend gegen 0,15 M NaCl-Lösung dialysiert.
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Nach Bestimmung der Eiweißkonzentration mit der Biuret-Methode wird
gegebenenfalls in einer "MINICON B 15"-Kammer (AMICON BV, Oosterhout, N.B., Holland)
weiter ankonzentriert.
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Die Antikörper werden in an sich bekannter Weise konserviert, z.B.
in Lösung bei -150 C eingefroren oder lyophilisiert.
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Isolierung spezifischer Antikörper (spezielle Angaben) Durch Immunisierung
von Kaninchen mit reinstem Rinderalbumin wurde ein Hyperimmunserum gegen Rinderalbumin
hergestellt. Dieses Serum wird mit dem nach Beispiel 1 hergestellten Immunadsorbens
unter den zuvor angegebenen Verfahrensbedingungen behandelt. Die das Immunadsorbens
enthaltende Säule wird dabei in einer aufeinanderfolgenden Versuchsreihe mehrfach
wieder verwendet. Es werden diefolgenden Ausbeuten an Antikörper ermittelt: 1. Versuch:
1,57 mg Antikörper/ml Antiserum 2. Versuch: 1,42 mg Antikörper/ml Antiserum 3. Versuch:
1,1) mg Antikörper/ml Antiserum In entsprechender Weise wird mit dem gemäß Beispiel
2 hergestellten Immunadsorbens ein Immunserum von Ratten gegen Schaflymphozyten
aufgearbeitet, das durch Immunisierung von Ratten mit Lymphozyten aus Schafsmilzen
hergestellt worden war. Auch hierbei wurde in aufeinanderfolgenden Versuchen das
Immunadsorbens wiederholt verwendet. Die isolierten Ausbeuten an Antikörper sind
die folgenden: 1. Versuch: 0,22 mg Antikörper/ml Antiserum 2. Versuch: 0,16 mg Antikörper/ml
Antiserum 5. Versuch: 0,11 mg Antikörper/ml Antiserum