DK161045B

DK161045B - Kemisk forbindelse, deres anvendelse ved en immunokemisk analysemetode, og forbindelse til fremstilling af den kemiske forbindelse

Info

Publication number: DK161045B
Application number: DK559984A
Authority: DK
Inventors: Stephen D Allen; Michael Thompson
Original assignee: Becton Dickinson Co
Priority date: 1984-01-06
Filing date: 1984-11-26
Publication date: 1991-05-21
Also published as: JPH0454904B2; NZ209819A; EP0153533A1; US4670406A; ZA847896B; JPH0758290B2; MY102211A; DK559984A; JPH02263161A; CA1249811A; DK161045C; DK559984D0; JPS60152497A; EP0153533B1; AU3403784A; AU569117B2; DE3469893D1

Description

i

DK 161045 B

Den foreliggende opfindelse angår kobling af ét organisk materiale til et andet, mellemprodukter, der er nyttige til fremstilling af koblede produkter og anvendelser af disse koblede produkter.

5

Koblingsmidler eller mellemrumsforbindelser er i almindelighed bifunktionelle forbindelser, der anvendes til at koble ét organisk materiale til et andet. For eksempel ved en analyse, såsom en immunobestemmelse, er en af komponenterne i bestemmelsen et sporstof, som omfatter en ligand, f.eks. et antigen, koblet til en egnet markør, f.eks. et chromogen, såsom et fluorescerende farvestof. Til fremstilling af et sådant sporstof bliver antigenet i mange tilfælde koblet til det fluorescerende farvestof ved anvendelse af et bifunktionelt koblingsmiddel eller en 15 mellemrumsforbindelse.

På lignende måde er der ved en immunobestemmelse, der anvender en fast bærer, et behov for at koble et materiale anvendt i bestemmelsen, såsom et antistof, til en fast bærer, såsom en 20 polymer, og i nogle tilfælde opnås dette ved anvendelse af et koblingsmiddel.

Eksempler på kendte kobl i ngsmidler findes f.eks. i følgende patentbeskrivelser: europæisk nr. 78952, tysk nr. 2722038, 25 2837087 og 2743446 og fransk nr. 2262670. Sammenlignet med de forbindelser, der kan fremstilles med disse kendte koblingsmidler, er de kemiske forbindelser ifølge opfindelsen fordelagtige ved, at liganddelen af sporstoffet kan være en hapten eller et antistof, og de andre substituentgrupper vil være en 30 påviselig markør.

Den kemiske forbindelse ifølge opfindelsen har den almene formel II

35 0 li

R-C-NH-Y-Z (II) I

i j i '1 :j j Ί

DK 161045B

2 hvor Y er et divalent aromatisk hydrocarbonradikal, R er et organisk radikal, afledt af en organisk forbindelse RH, hvor H er et aktivt hydrogen og Z er 5 -NH-CH-COB ; -NH-CO-OB; -NH-CO-SB ; -NH-CO-NHB; -NH-CS-NHB ; -CO-NHB; -S-CO-NHB eller -O-CO-NHB, 10 hvor B er et organisk radikal, og hvor en af R og B omfatter en påviselig markør og den anden omfatter et antigen, en hapten eller et antistof.

15 Opfindelsen angår endvidere anvendelse af en kemisk forbindelse som ovenfor defineret ved en immunokemisk analysemetode.

Opfindelsen angår endvidere en forbindelse til fremstilling af de ovenfor definerede kemiske forbindelser, hvilken forbin-20 delse har den almene formel: R-CO-NH-Y-A (I) hvor R er et organisk radikal afledt af en organisk forbin-25 delse RH, hvor R er en påviselig markør, et antistof, en hapten eller et antigen, og det viste H er et aktivt hydrogen, Y er som defineret i krav 1, og A er -N02, -NH2, -C00H, -C0C1, -C00R", -NCS, -SH, -OH, -NC0, -SCOR" eller -0C0R", hvor R" er al kyl.

30

Ifølge en særlig foretrukken udførelsesform ifølge opfindelsen er Y i de ovenfor beskrevne strukturformler et divalent benzenradikal, omend det også skal forstås, at Y kan være et divalent naphthalen- eller divalent diphenylradikal.

Mellemprodukterne I kan fremstilles af forbindelser repræsenteret ved strukturformlen 35 3

DK 161045B

0=C=N-Y-R1 (III)

O O

II Tf hvor R' er -N02, “COOR", -S-C-R" eller -O-C-R", hvor R og Y er som ovenfor defineret.

5 R^· er i almindelighed i enten para- eller metastilling, fortrinsvis para, idet R’ fortrinsvis er -Ν02· I det tilfælde, hvor R' i forbindelse III er N0o, kobles for-10 Å bindeisen III først til en organisk forbindelse, der har en substituerende gruppe med aktiv hydrogen, som er reaktionsdygtig med en isocyanatgruppe, til fremstilling af en forbindelse I, hvor A er -N02· Derefter kan -N02~gruppen selektivt reduceres til en aminogruppe (anvendelse af svovlbéhandlet natriumbo rhy dr id) for at tilvejebringe en reaktionsdygtig gruppe til kobling til en anden organisk forbindelse. Alternativt kan aminogruppen omdannes til et isocyanat (reaktion med phosgen) eller et isothiocyanat (reaktion med thiophosgen), der begge er reaktionsdygtige til kobling af mellemproduktet I til en 20 organisk forbindelse.

I det tilfælde, hvor R' i forbindelse III er -COOR",

0 O

2 S 11 11 -S-C-R" eller -O-C-R”, kan den substituerende gruppe R' efter kobling af forbindelsen III til en organisk forbindelse gennem en substituerende isocyanatgruppe hydrolyseres til at give en substituerende gruppe A, som er enten -COOH, -SH eller -OH, der hver især er reaktionsdygtig til kobling af mellemproduk-30 tet I til en organisk forbindelse.

Som det vil fremgå, vælges forbindelsen III derfor således, i at den indeholder en substituerende gruppe R', der ikke er reaktionsdygtig med den substituerende gruppe med aktiv hy-3 5

drogen i den organiske forbindelse, som forbindelsen III

i

• 4 . DK 161045 B

skal kobles med gennem sin isocyanatgruppe. Senere omdannes R' til en substituerende gruppe Af der er reaktionsdygtig med en substituerende gruppe med aktiv hydrogen i den organiske 5 forbindelse, som mellemproduktet I skal kobles med for at fremstille den koblede forbindelse II.

Forbindelsen repræsenteret ved strukturformlen I kan anvendes til fremstilling af koblede forbindelser, således som repræ--Q senteret ved strukturformlen II. Ved anvendelse af forbindel sen repræsenteret ved strukturformlen I er den substituerende gruppe repræsenteret ved A én, som er i stand til at reagere med en substituerende gruppe med aktiv hydrogen på forbindelsen, som forbindelsen repræsenteret ved strukturformlen I skal kob-les med. Når f.eks. A er en aminogruppe, kan forbindelsen I kobles til en organisk forbindelse, der har en substituerende carboxylgruppe, på i og for sig kendte måder. På lignende måde, når A er carboxyl, kan forbindelsen I kobles til en organisk forbindelse, der har enten en substituerende aminogruppe 20 eller en substituerende isocyanatgruppe, på i og for sig kend te måder. Når A er isocyanat, kan forbindelsen I kobles til til en organisk forbindelse, som har en substituerende gruppe med aktiv hydrogen, som er enten mercapto (thiol), hydroxy, carboxyl eller amino. Når A er thiol eller hydroxy, kan for-

*“* C

bindeisen I kobles til en organisk forbindelse, som har en substituerende gruppe med aktiv hydrogen, der er isocyanat. Når A er isothiocyanat, kan forbindelsen I kobles til en organisk forbindelse, der har en substituerende aminogruppe. Fremgangsmåder til at udføre en sådan kobling gennem disse funktionelle 3 0 grupper er velkendt. 1 5 5

DK 161045 B

Koblingsmidlerne III kan anvendes til at koble mange forskellige

organiske materialer til hinanden. Koblingsforbindelserne III

_ kan f.eks. anvendes til at fremstille sporstoffer/ der skal an-5 vendes ved en analyse, hvori dette sporstof omfatter en påviselig markør, f.eks. en radioaktiv markør, et chromogen, et enzym etc. koblet til en ligand (udtrykket "ligand" som anvendt heri refererer til en hapten, et antigen eller et antistof).

I denne udføreIsesform indbefatter markøren eller liganden en substituerende gruppe, der er i stand til at reagere med en isocyanatgruppe, og den substituerende gruppe R' i koblingsmidlet III er ikke-reaktionsdygtig med den substituerende gruppe på liganden eller markøren. Efter at koblingsmidlet III er ,_ koblet til liganden eller markøren, fremstilles en mellemliggen-

4. O

de forbindelse I, hvori den substituerende gruppe A ikke er reaktionsdygtig med gruppen indeholdende aktiv hydrogen, som er på liganden eller markøren, der først et blevet koblet til fremstilling af mellemproduktet I. Mellemproduktet I kobles så 20 til den anden af markøren eller liganden, og hvis den substituerende gruppe A i mellemproduktet I ikke er reaktionsdygtig med den substituerende gruppe med aktiv hydrogen på den anden af liganden eller markøren, omdannes den substituerende gruppe A selektivt til en substituerende gruppe, som defineret, der er I

0(. reaktionsdygtig med den substituerende gruppe med aktiv hydro- ! gen på den anden af liganden eller markøren. Mellemproduktet I ! kobles så til den anden af liganden eller markøren til frem- ! stilling af en koblet forbindelse II.

Ved fremstilling af et sporstof til brug i en analyse er den 3 0 ene af R og B i de koblede forbindelser II således en markør, såsom et chromogen, en organisk forbindelse indeholdende en 35 | i 6

DK 161045B

radioaktiv substituerende gruppe eller et enzym, og den anden af R og B er en ligand. Ved fremstilling af et fluorescerende sporstof er f.eks. den ene af R og B afledt af et fluorescerende farvestof, der har en substituerende gruppe, der kan kobles til enten isocyanat eller en af de reaktionsdygtige funktionelle grupper repræsenteret ved A i strukturformlen I, og den anden af R og B er afledt af en ligand, der har en substituerende gruppe, der kan kobles til den anden af isocyanat-gruppen eller den reaktionsdygtige substituerende gruppe repræsenteret ved A i strukturformlen I. Ved fremstilling af et sådant sporstof kan enten liganden eller det fluorescerende farvestof først kobles til den funktionelle isocyanatgruppe i 1 5 koblingsmidlet III.

Det har ifølge opfindelsen vist sig, at anvendelse af et koblingsmiddel repræsenteret ved strukturformlen III er særligt ^ fordelagtig til fremstilling af fluorescerende sporstoffer, idet koblingsmidlet er stift, hvorved den fluorescerende markør ikke "folder" sig tilbage på liganden og derved formindsker muligheden for, at liganden "slukker" den fluorescerende forbindelse.

Λ g c 5

Som repræsentative eksempler på egnede chromogener kan nævnes: acridinfarvestoffer, azurfarvestoffer, quinonfarvestoffer,

Nile blue, cresyl-violet, fluoresceiner, rhodaminer, coumari- ner, aminonaphthalenderivater (dansylforbindelser), carbocya- niner, indoler, lanthanidchelater etc.

30

Et T^-sporstof kan f.eks. fremstilles ved først at koble p-nitrophenylisocyanat til thyroxin (T^), hvori carboxyIdelen i er passende blokeret. Nitrogruppen reduceres til amin 35 (forbindelse I, R er blokeret T^-radikal, Y er benzen, og A er 7

DK 161045 B

amin), og aminodelen af forbindelse I kan kobles til et fluore-5 scerende farvestof indeholdende f.eks. en isothiocyanatgruppe, især fluoresceinisothiocyanat.

Alternativt kan aminogruppen i forbindelse I omdannes til iso-thiocyanat ved reaktion med thiophosgen (i forbindelse I er A 1° isoothiocyanat), efterfulgt af reaktion af forbindelse I med et fluorescerende farvestof indeholdende en aminogruppe, især fluoresceinamin.

På lignende måde kan et digoxinsporstof fremstilles ved at kob-15 le digoxin til p-nitrophenylisocyanat, efterfulgt af reduktion af nitro til amin, og reaktion med et fluorescerende farvestof, såsom fluoresceinisothiocyanat.

Selv om den foreliggende opfindelse har særlig anvendelighed 20 til fremstilling af fluorescerende sporstoffer, som ovenfor nævnt, kan opfindelsen også anvendes til fremstilling af andre sporstoffer, såsom radioaktive sporstoffer, enzymsporstoffer etc. Som repræsentative eksempler på egnede radioaktive markører til fremstilling af radioaktive sporstoffer kan nævnes: 25 hydroxyphenyl-substituerede aminer eller aminosyrer, hvori phe- nylgruppen indeholder en eller flere radioaktive substituerende grupper, såsom radiojoderet tyrosin eller tyramin, imidazol-substituerede aminosyrer eller aminer, hvori imidazolgruppen 1 er substitueret med en eller flere radioaktive substituerende 30 grupper, og lignende.

Som repræsentative eksempler på egnede enzymmarkører kan nævnes: peroxidaser, β-galactosidaser, acetylcholinesterase, glucoamila-se, maleinsyredehydrogenase, glucose-6-phosphorsyredehydroge-35 nase, glutaroxidase, sur phosphatase etc.

Som velkendt kan den faste bærer være en polymer, forudsat at den polymere indeholder en substituerende gruppe, der er i stand til at reagere med enten isocyanatfunktionaliteten eller 8

DK 161045 B

en af de reaktionsdygtige substituenter repræsenteret ved A 5 i mellemproduktet I, f.eks. polyacrylamid, poly(aminostyren) etc.

Sporstofferne og de understøttede ligander fremstillet ifølge den foreliggende opfindelse anvendes i en analyse for mange 10 forskellige analyter -(udtrykket "analyter" refererer til en hapten, et antigen eller et antistof) af en type, der er velkendt inden for faget. Den foreliggende opfindelse er f.eks. anvendelig til bestemmelse af lægemidler, herunder terapeutiske lægemidler og såkaldte "misbrugs-lægemidler", steroider, 15 vitaminer, sukkerarter, aminosyrer, polypeptider, proteiner, forskellige hormoner, antibiotika, virus etc.

Sporstofferne og de understøttede ligander fremstillet ifølge opfindelsen kan anvendes i en immunobestemmeIse (udtrykket A Λ "immunobestemmelse" anvendes i generel betydning og indbefatter bestemmelser, der udnytter naturligt forekommende bindemidler i stedet for et antigen eller antistof, og som sommetider omtales som kompetitive proteinbindingsbestemmelser), og som bekendt er en af komponenterne i bestemmelsen et bindemiddel.

25 I det tilfælde, hvor analyten er en hapten eller et antigen, kan bindemidlet være et antistof eller et naturligt forekommende stof, som har et eller flere bindingssteder specifikke for analyten, og i et tilfælde, hvor analyten er et antistof, kan bindemidlet være et antigen til antistoffet eller et anti-30 stof, der udløses som reaktion på analyten. Udvælgelsen af et egnet bindemiddel anses for at ligge inden for en fagmands kunnen, og nærmere enkeltheder i denne henseende anses for unødvendige for en fuldstændig forståelse af opfindelsen.

35 Ved analysen bestemmes liganddelen af sporstoffet, som anvendes til analysen, af den type analyse, som skal benyttes. Hvis f.eks. analysen gælder en analyt, som er enten et antigen eller en hapten, er liganddelen af sporstoffet enten antigenet eller

9 DK 161045 B

5 haptenen, der skal bestemmes, eller en passende analog deraf (udtrykket "passende analog" betyder en analog af analyten, som bindes af bindemidlet anvendt ved analysen). Alternativt kan liganddelen af sporstoffet være et bindemiddel for haptenen eller antigenet, der skal bestemmes, i hvilket tilfælde analysen udformes således, at analyten hæmmer binding af sporstoffet til bindingsstederne, der er specifikke for sporstoffet.

I det tilfælde, hvor analyten er et antistof, kan liganddelen af sporstoffet være antistoffet eller en passende analog der- 1 ζ af, i hvilket tilfælde både antistoffet og sporstoffet vil konkurrere om et begrænset antal bindingssteder specifikke for både antistofanalyten og sporstoffet. Alternativt kan liganddelen i sporstoffet være et antigen til antistofanalyten eller antistof udløst som reaktion på antistofanalyten, i hvilket 2 0 tilfælde antistofanalyten hæmmer binding af sporstoffet til bindingssteder specifikke for sporstoffet.

I nogle tilfælde, hvor analyten skal bestemmes ved en såkaldt "sandwich-type"-bestemmelse, har liganddelen af sporstoffet * bindingssteder specifikke for analyten, hvilken analyt har fle re determinantsteder.

Udvælgelsen af en egnet ligand til brug som liganddel i sporstoffet anses for at ligge inden for en fagmands kunnen, og 30 nærmere enkeltheder i denne henseende anses derfor for unødvendige for en fuldstændig forståelse af den foreliggende opfin- . delse.

35 10

DK 161045 B

Som det vil fremgå af det ovenstående, kan den koblede forbin-5

delse II saledes fremstilles af mange forskellige organiske forbindelser yidet det organiske radikal repræsenteret ved R i forbindelsen II er afledt af én organisk forbindelse, og det organiske radikal repræsenteret ved B i den koblede forbindelse II

er afledt af en anden organisk forbindelse, forudsat at de re- 1 o spektive organiske forbindelser indeholder passende substituerende grupper med aktiv hydrogen til reaktion med den ønskede substituerende gruppe i koblingsmidlet III (isocyanat), eller den ønskede reaktionsdygtige substituerende gruppe repræsenteret ved A i strukturformlen I. I den koblede forbindelse 15 o II kan R således være et organisk radikal afledt af en organisk for-forbindelse,, som indeholder en gruppe med aktiv hydrogen, som er i stand til at reagere med en isocyanatgruppe, hvilken organiske forbindelse kan være en markør (radioaktiv substitueret organisk forbindelse, et chromogen, fortrinsvis et fluo- 2 υ rescerende farvestof, et enzym) eller en ligand, og især et antigen, som ikke er et protein, en hapten, som ikke er et protein, en fast bærer eller et terapeutisk middel (især et lægemiddel). På lignende måde kan B være et organisk radikal afledt af en organisk forbindelse, som indeholder en substitu- 9 5 erende gruppe med aktiv hydrogen, der er i stand til at reagere med en af de reaktionsdygtige substituerende grupper repræsenteret ved A i mellemproduktet I. B kan således være et organisk radikal afledt af en organisk forbindelse, som kan være et protein, et antistof, en hapten, et antigen, et chromogen

^ A

(et farvestof, fortrinsvis et fluorescerende farvestof), et enzym, en organisk forbindelse, der har en radioaktiv substituerende gruppe, en polymer etc.

Opfindelsen illustreres nærmere af følgende eksempler.

35

DK 161045 B

11 EKSEMPEL 1.

5 2,1 mmol trimethylsilylchlorid (TMS-C1) sættes til 1 mmol thy roxin (T4) og redestilleret pyridin. Reaktionen kræver ca. 2 timer og er næsten kvantitativ. Efter reaktionen sættes 1,1 mol p-nitrophenylisocyanat til den reagerede blanding ved injektion, og blandingen omrøres under anvendelse af en magne-tisk omrøringsstang i ca. 48 timer, idet små prøver udtages ca. hver fjerde time til analyse ved TLC (tyndt 1 agskromato-grafi). Efter 48 timer vaskes produktet grundigt med methanol til fjernelse af ureageret isocyanat, efterfulgt af adskillelse af produkterne ved TLC eller højtryks-væskekromatografi 15 (HPLC) eller ved søjlekromatografi. Det fremkomne produkt er para-nitrophenylisocyanato-T4, hvori den funktionelle carbo-xylgruppe i T4 er blokeret med trimethylsilan.

De ovenstående reaktioner udføres ved stuetemperatur (STP).

20

Nitrogruppen reduceres til amin ved tilsætning af 0,55 mmol (overskud over den anvendte koncentration af T^) svovlbehandlet natrium-borhydrid til 0,5 mmol af produktet ved stuetemperatur og tryk. Reaktionen opnås ved blanding i ca. 3-4 timer og overvågning af omdannelsen af nitro til amin ved IR. Det fremkomne produkt er para-aminophenylisocyanato-T^.

i'

Til ovennævnte produkt sættes et molært ækvivalent af iso- thiocyanato-fluorescein, efterfulgt af omrøring i ca. 48 - 72 3 0 timer og overvågning ved TLC eller HPLC. TMS-blokerings-midlet fjernes under vandige betingelser efter kobling af fluorescein-farvestoffet til det T4~koblede mellemprodukt.

Det fremkomne produkt er et fluorescerende farvestof, hvori fluoresceinisothiocyanat er koblet til T^ gennem et stift koblingmiddel, og dette sporstof kan anvendes til en analyse for 12

DK 161045 B

S

EKSEMPEL 2.

Fremstilling af digoxin-fluorescerende sporstof: 10

Til en 100 ml rundbundet kolbe sættes 1 mmol digoxin og en omrøringsstang. En gummiskillevæg fastgøres til åbningen, og den rundbundede kolbe skylles langsomt med nitrogen i 5 minutter under anvendelse af en udluftningsnål. Under anvendelse 1 c, af en 50 ml glas-injektionssprøjte med en lang nr. 18 rustfri stålnål udtages 30 ml frisk destilleret pyridin, som injiceres gennem gummiskillevæggen i den rundbundede kolbe, langsomt til at begynde med og under omrøring, efter at 15 - 20 ml er blevet indsprøjtet. De resterende 10 - 15 ml skal anvendes til 20 at vaske siderne af den rundbundede kolbe for at få digoxinet i opløsning. Under anvendelse af udluftningsnålen skylles beholderen igen med nitrogen i 5 minutter. Blandingen (under omrøring) fortsættes, indtil alt digoxinet er blevet opløst og er fuldstændigt i opløsning.

25 ' I en beholder for sig, fortrinsvis en lukket rundbundet kolbe, indføres 1,1 mmol (forud tørret) para-nitrophenylisocyanat, og ved indsprøjtning tilsættes 15 ml pyridin, og den lukkede beholder blandes og skylles med EL, som beskrevet, og når alt 3 0 Δ materialet er i opløsning, udtages det med injektionssprøjte og tilsættes langsomt under stadig blanding til de 100 ml i den rundbundede kolbe indeholdende digoxinet.

Noter: 1) Alt arbejde skal udføres i stinkskab.

3 5 2) p-mtrophenylisocyanatet skal kontrolleres ved IR før brugen. Alder og eksponering kan i høj grad påvirke isocyanatet, og partier skal vindersøges for tilstedeværelse af isocyanat.

13

DK 161045 B

Prøver til TLC skal udtages med injektionssprøjte, og overvåg-5 ning ved TLC skal begynde 2 timer efter tilsætning af p-nitro-phenylisocyanatet. Den første dag skal der udføres pletkontroller hver anden eller fjerde time, og efter henstand natten over skal TLC udføres straks om morgenen.

10

Reaktionen varer ca. 72 timer, før den er fuldendt (omend hovedproduktet i det væsentlige er dannet efter 48 timer - 75% fuldendt) . Hvis det henstilles længere, iagttages stigninger i det ønskede produkt, men det er på bekostning af yderligere bi-^ produkt i relativ eller større mængde. For at sikre de bedst mulige resultater skal rensning (og isolering) af det foretrukne produkt udføres her.

Rensning af dette produkt er ved præparativ TLC og kan udføres inden for én dag, men der må drages omsorg for ikke at overbelaste pladerne, hvorved bindingerne vil løbe sammen. Efter ekstraktion fra silicagel under anvendelse af methanol :chlo:-form skal opløsningen filtreres gennem et 0,22 μ. filter i en rundbundet kolbe til rotationsinddampning. Filtreringen er vigtig for at fjerne spor af silicagelen, som kunne nedbryde 2 5 dannelsen af isocyanat-bindingen til digoxinet. (Centrifugering af silicagelen, methanol:chloroform, før filtrering hjælper til fjernelse af størstedelen af de partikelformede stoffer og fremskynder filtreringsprocessen).

30 På dette punkt er den hurtigste prøve til sikring af produktet og dets relative koncentration ved RIA for digoxin. Efter rotationsinddampning af det filtrerede produkt (4 x) og optagelse af produktet i et lille rumfang methanol kan der let fremstilles fortyndinger og afprøves for immunoreaktionsdygtighed af 3 5 det substituerede digoxin. Når først dette er konstateret (samt den relative renhed (ved TLC)),er næste trin at reducere nitro til amin ved anvendelse af svovlbehandlet natriumbcrhydrid.

14

DK 161045 B

t-

Produktet er forbindelse I, hvori Y er et benzenradikal, A er 5 NC>2 / og R er et 15 1 -digoxinradikal.

Før der gås videre, skal det koblede digoxin tørres ved rota-tionsinddampning og vaskes én gang med tetrahydrofuran (THF), før p-nitrophenylisocyanato-digoxinet anbringes i reaktions-beholderen.

Reaktionen med NaBH^S^ kan udføres i dioxan eller THF, idet THF foretrækkes på grund af opløseligheden af det substituerede digoxin i dette opløsningsmiddel. Selv om det ikke er afgøren-15 de at opretholde en atmosfære af nitrogen, skal beholderen skylles, som beskrevet, før tilsætningen af NaB^Sg.

Til en 100 ml rundbundet kolbe sættes digoxinet (substitueret p-nitrophenylisocyanato-digoxin) og en omrøringsstang i et 20 rumfang THF. (Igen gøres rumfanget af THF mindst muligt).

Der skylles med nitrogen under anvendelse af en udluftnihgsnål gennem en gummiskillevæg i 5 minutter.

I en særskilt beholder anbringes det tørrede NaB^Sg, og der 25 tilsættes 20 ml THF og opløses fuldstændigt, skylles med nitro gen gennem en gummiskillevæg.

Med en 50 ml glas-injektionssprøjte udtages opløsningen og sættes langsomt til digoxinet under stadig omrøring. Reaktions-20 graden kan følges ved IR (omdannelse af NOg —> N^)' rea^" tionen skulle være fuldstændig efter kun nogle timer, afhængende af koncentrationen af digoxinet. Varme kan anvendes for at fremskynde reaktionen, men kun op til 37°C, og den skal overvåges meget nøje. Ved 25°C (R.T.) forløber reaktionen noget ό Γ langsommere, men mere kontrollerbart.

Dette produkt kan isoleres og renses med silicagel-TLC (præparativ) eller med søjle-silicagel og vaskes omfattende med metha- 15

DK 161045 B

nol, filtreres og tørres til lagring, eller det kan anvendes 5 direkte uden yderligere rensning, da de følgende reaktioner ikke indebærer nitrogruppen på nogen måde, og endelig kan anvendes en påfølgende rensning for at rense disse produkter.

Når først den relative koncentration af digoxin er blevet kon-stateret (igen ved RIA), kan påfølgende reaktioner med p-amino-phenylisocyanato-digoxin forløbe gennem anvendelse af f.eks. fluoresceinisothiocyanat direkte.

100 Minol substitueret digoxin anbringes i en klar, tør 25 ml 15 rundbundet kolbe, hvortil der er sat en omrøringsstang. Med injektionssprøjte tilsættes 10 ml pyridin, der lukkes med en gummiskillevæg og skylles med nitrogen, som beskrevet, og omrøres, indtil produktet er fuldstændigt opløst.

20 Til en anden rundbundet kolbe sættes 100 /miol fluoresceiniso thiocyanat og opløses i pyridin (10 - 15 ml). Der lukkes med en gummiskillevæg,skylles med M2, udtages med glas-injektions-sprøjte og sættes langsomt til digoxinet under anvendelse af kontinuerlig blanding. På grund af karakteren af fluorescein-25 isothiocyanat vil ikke alt materiale blive overført, da det vil klæbe til den rundbundede kolbe og sprøjten. Hvis det er nødvendigt, kan der dog tilsættes mere på et senere tidspunkt på samme måde som den beskrevne.

30 Denne reaktion vil vare ca. 72 timer for at fuldendes og kan overvåges ved forekomsten af et nyt fluorescerende stof, hvis der anvendes analytisk TLC.

Rensning af produktet skal gøres før yderligere analytisk op-3 5 arbejdning, og analyse ved RIA vil vise immunoreaktionsdygtig- . heden af slutproduktet og alle yderligere prøver beregnet til påvisning af fluorescens.

DK 161045B

16 Når først slutproduktet er isoleret, skal det vaskes omfattende 5 med methanol og filtreres (0,22 /i) flere gange, tørres med ekssikkator og lagres under . ekssikkator-betingelser ved 30°C (frosset) .

' Det fremkomne produkt er en forbindelse II, hvori R er et 15'- digoxinradikal, Z er -N-C-N-B, hvor B er et fluorescein-

II

O

radikal, og Y er et divalent benzenradikal.

EKSEMPEL 3. x 5

Til en 25 ml rundbundet kolbe sættes 100 mmol 151-p-aminophenyl-isocyanato-digoxin (digoxin) (som fremstillet i eksempel 2), 2C og der tilsættes 5 - 7 ml frisk destilleret pyridin, opløses og blandes, indtil der er sket fuldstændig opløsning ved omrøring. Den rundbundede kolbe overdækkes med en gummiskillevæg og skylles med ^ i 5 minutter.

2f. Med en glas-injektionssprøjte (ren og meget tør) udtages

100 /imol af denne phosgenvæske i et godt ventileret stinkskab, og alt luft uddrives af sprøjten, og thiophosgenet sættes langsomt til den kontinuerligt omrørte digoxinopløsning i løbet af 3 - 4 minutter. Reaktionsbeholderen skal holdes uden for direkte lys (metalfolie eller kasse), og overvågningen skal udføres ved udtagelse med en sprøjte af små mængder, og IR

*Cj|i skal vise dannelsen af isothiocyanat ved 2250 . Dannelsen forløber hurtigt og er i reglen fuldstændig på nogle timer, men kan henstilles natten over, hvis det ønskes.

35

Reaktionen standses ved tilsætning af methanol og skal vaskes flere gange med methanol og tørres ved roterende inddampning.

Isolering og rensning kan udføres ved TLC under anvendelse af 17

DK 161045 B

methanol:chloroform (50:50). Fjernelse af para-isothiocyanat-- phenylisocyanato-digoxinet ved ekstraktion er blevet beskrevet tidligere (præparativ silicagel, ekstraktion i MeOH og filtrering med 0,22 μ filtre, tørring, vask (3 x) og tørring til lagring) .

Det fremkomne produkt er forbindelse I, hvori Y er et divalent benzenradikal, R er 15'-digoxinradikal, og A er -N=C=S.

Når først denne forbindelse er isoleret og renset, vil den være stabil i flere måneder, før den kræver yderligere rens-ning. Lagringsbetingelserne skal opretholdes (de er tørre i ekssikkator ved -30°C).

EKSEMPEL 4.

20

Reaktion af 15'-p-isothiocyanatophenyl-isocyanatodigoxin med et enzym (sur phosphatase):

Idet reaktionsrumfangene holdes på et minimum, anbringes i en 25 åben (eller lukket) beholder en passende mængde enzym, tørres, og der tilsættes et minimalt rumfang af en basisk, lavmolær stødpude, som ikke indeholder primære eller sekundære aminer. For eksempel vil en boratstødpude, pH 9,5 - 0,5 M, være passende. Der omrøres ved 4°C.

30

Den ønskede substitutionsgrad beregnes (digoxin:enzym), og hertil sættes enten dimethylformamid eller dimethylsulfoxid ækvivalent med ikke mere end 10% af det samlede rumfang af enzymopløsningen. Der blandes, indtil der er sket opløsning.

35

Med en pipette eller lignende overføringsorgan udtages digoxin i DMF eller DMSO og sættes meget langsomt til pH 9,5-opløsnin-gen indeholdende enzymet. (Skal vare 10 minutter, og den modtagende beholder skal holdes kold, enten lagret ved 4°C eller 18

DK 161045 B

på is). Reaktionen til dannelse af digoxin-enzymkomplekset 5 er forholdsvis hurtig og er i reglen fuldstændig i løbet af 24 timer. Produktet er forbindelse II, hvori R er et digoxin-radikal, Y er et divalent benzenradikal, Z er NH-C-NH-B, og

II

S

B er et surt phosphatase-enzymradikal.

1°

Rensning af den konjugerede digoxin-sur phosphatase sker ved anvendelse af enhver af flere forskellige adskillelser, såsom "Sephadex", "Bio-gel" etc.

-5 De ovenstående fremgangsmåder er illustrerende og kan anvendes på lignende måde til kobling af mange forskellige organiske forbindelser til hinanden, forudsat at de organiske forbindelser har de nødvendige substituerede grupper med aktiv hydrogen. De ovenfor beskrevne fremgangsmåder er således anvendelige 2° til kobling af andre ligander end digoxin eller til andre organiske forbindelser end fluorescein-farvestoffer og/eller -enzymer,

Den foreliggende opfindelse er særligt fordelagtig, fordi ved 25 anvendelse af forbindelse III er det muligt at fremstille kob lede produkter II, hvori der er en stiv kobling af én organisk forbindelse til en anden. Dette er en fordel ved fremstilling af fluorescerende sporstoffer derved, at stivheden af koblingen reducerer ligandens "slukning" af den fluorescerende for-,>0 bindelse. Tungatomvirkningen på et fluorescerende materiale (f.eks. jodgrupperne i og/eller T^), der kan "slukke" et fluorescerende materiale, bliver således reduceret og/eller elimineret. Opfindelsen har således særlig anvendelse til fremstilling af et thyroidhormon-sporstof, hvori et thyroid-35 hormon (T^ eller T^) kobles til en fluorescerende forbindelse.

Claims

1. En kemisk forbindelse med den almene formel II 0 )l R-C-NH-Y-Z (II) 10 hvor Y er et divalent aromatisk hydrocarbonradikal, R er et organisk radikal, afledt af en organisk forbindelse RH, hvor H er et aktivt hydrogen og Z er -NH-CH-COB ; -NH-CO-OB;

15 -NH-CO-SB ; -NH-CO-NHB; -NH-CS-NHB ; -CO-NHB; -S-CO-NHB eller -O-CO-NHB, hvor B er et organisk radikal, og hver en af R og B omfatter 20 en påviselig markør og den anden omfatter et antigen, en hapten eller et antistof.

2. Forbindelse ifølge krav 1, kendetegnet ved, at Y er et divalent benzenradikal. 25

3. Forbindelse ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at R er en hapten eller et antigen.

4. Forbindelse ifølge krav 3, kendetegnet ved, at 30 RH er digoxin.

5. Forbindelse ifølge krav 3, kendetegnet ved, at RH er T4.

6. Forbindelse ifølge krav 1, kendetegnet ved, at R omfatter den påviselige markør. DK 16 1045 B

7. Forbindelse ifølge krav 1, kendetegnet ved, at B omfatter den påviselige markør. . · i

8. Forbindelse ifølge et af de foregående krav, kende tegnet ved, at den påviselige markør er et fluorescerende farvestof, fortrinsvis fluorescein.

9. Anvendelse af en kemisk forbindelse ifølge krav 1-8 ved en 10 immunokemisk analysemetode.

10. Forbindelse med den almene formel I til fremstil ling af en kemisk forbindelse ifølge krav 1-8

15 R-CO-NH-Y-A (I) hvor R er et organisk radikal afledt af en organisk forbindelse RH, hvor R er en påviselig markør, et antistof, en hapten eller et antigen, og det viste H er et aktivt hydrogen, Y 20 er som defineret i krav 1, og A er -N02, -NH2, -C00H, -COC1, -C00R", -NCS, -SH, -OH, -NCO, -SCOR" eller -0C0R", hvor R" er al kyl. 2 c-30 1 5