JPH0776236B2 - 蛋白質修飾物 - Google Patents
蛋白質修飾物Info
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- JPH0776236B2 JPH0776236B2 JP63088971A JP8897188A JPH0776236B2 JP H0776236 B2 JPH0776236 B2 JP H0776236B2 JP 63088971 A JP63088971 A JP 63088971A JP 8897188 A JP8897188 A JP 8897188A JP H0776236 B2 JPH0776236 B2 JP H0776236B2
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- hapten
- protein
- carrier
- amino group
- bsa
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はハプテン抗体作成に用いるハプテン（低分子量
抗原）の担体として、或いは種々の免疫分析に用いる多
価化したハプテン抗体作成用担体として用いられる蛋白
質修飾物に関するものである。
抗原）の担体として、或いは種々の免疫分析に用いる多
価化したハプテン抗体作成用担体として用いられる蛋白
質修飾物に関するものである。
（発明の背景） 薬剤などの低分子量化合物を抗原（Ag）とする抗体（A
b）の作成は、これら低分子量抗原（ハプテン）又はそ
の類縁体をBSA（牛血清アルブミン）などの蛋白質担体
に結合した複合体を免疫動物に免疫して行なっている。
担体蛋白質のハプテン結合部位には蛋白質に存在する官
能基のうちアミノ基またはカルボキシル基が考えられる
が、結合反応が容易なことから従来は主としてアミノ基
にハプテンを結合していた。
b）の作成は、これら低分子量抗原（ハプテン）又はそ
の類縁体をBSA（牛血清アルブミン）などの蛋白質担体
に結合した複合体を免疫動物に免疫して行なっている。
担体蛋白質のハプテン結合部位には蛋白質に存在する官
能基のうちアミノ基またはカルボキシル基が考えられる
が、結合反応が容易なことから従来は主としてアミノ基
にハプテンを結合していた。
しかし、ハプテンは蛋白質担体のアミノ基全てに結合す
るわけではなく、ハプテン未結合のアミノ基が多く存在
する領域は、蛋白質本来の立体構造を保持しているの
で、蛋白質本来の抗原決定基（Ag*）として働く。従っ
て、ハプテン担持蛋白質で免疫して得た血清中には担体
蛋白質自体に対応する抗体（Ab*）も作製されることに
なる。このため得られたハプテン抗血清（Ab）は、予め
担体蛋白質自体（Ag*）で吸収する必要がしばしばあっ
た。
るわけではなく、ハプテン未結合のアミノ基が多く存在
する領域は、蛋白質本来の立体構造を保持しているの
で、蛋白質本来の抗原決定基（Ag*）として働く。従っ
て、ハプテン担持蛋白質で免疫して得た血清中には担体
蛋白質自体に対応する抗体（Ab*）も作製されることに
なる。このため得られたハプテン抗血清（Ab）は、予め
担体蛋白質自体（Ag*）で吸収する必要がしばしばあっ
た。
又このような不都合はハプテン蛋白質複合体をいわゆる
受身凝集に用いた場合にも生じうる。受身凝集とは、モ
ノエピトープなハプテン（Ag）を複数個担体に担持させ
て、見かけ上多価の抗原として抗原・抗体結合をさせマ
トリックス凝集を起させるものである。すなわち、複数
のハプテン抗原（Ag）を担持する担体と、抗ハプテン抗
体（Ab）とを接触させ、抗原抗体マトリックスを形成さ
せる。その形成量は濁度変化から検出できる。このとき
１価の遊離ハプテン抗原が共存すると、マトリックス形
成は阻害され濁度低下が観察される。この濁度低下から
遊離ハプテン抗原即ち測定試料中の抗原量を定量するこ
とができる。この場合にも、ハプテン担持担体自体（Ag
*）の抗体（Ab*）が有れば、このAg*-Ab*を介したマト
リックス形成即ち凝集が生じる。従ってここで使用する
抗ハプテン抗体（Ab）は予めハプテン担持担体自体（Ag
*）で吸収するか、免疫時に使用したハプテン担持担体
（Ag*）とは別の担体にハプテン（Ag）を結合した複合
体を受身凝集反応系に供する必要がある。
受身凝集に用いた場合にも生じうる。受身凝集とは、モ
ノエピトープなハプテン（Ag）を複数個担体に担持させ
て、見かけ上多価の抗原として抗原・抗体結合をさせマ
トリックス凝集を起させるものである。すなわち、複数
のハプテン抗原（Ag）を担持する担体と、抗ハプテン抗
体（Ab）とを接触させ、抗原抗体マトリックスを形成さ
せる。その形成量は濁度変化から検出できる。このとき
１価の遊離ハプテン抗原が共存すると、マトリックス形
成は阻害され濁度低下が観察される。この濁度低下から
遊離ハプテン抗原即ち測定試料中の抗原量を定量するこ
とができる。この場合にも、ハプテン担持担体自体（Ag
*）の抗体（Ab*）が有れば、このAg*-Ab*を介したマト
リックス形成即ち凝集が生じる。従ってここで使用する
抗ハプテン抗体（Ab）は予めハプテン担持担体自体（Ag
*）で吸収するか、免疫時に使用したハプテン担持担体
（Ag*）とは別の担体にハプテン（Ag）を結合した複合
体を受身凝集反応系に供する必要がある。
このような不都合をなくすため蛋白質担体のアミノ基を
全てハプテンでブロックし、蛋白質を事実上完全変性さ
せる方法も考えられるが、その実現はきわめて困難であ
るし、また実現できるとしても多量のハプテンが必要と
なり、ハプテンが微量しかない場合にはこのような方法
がとれないという不都合もあった。
全てハプテンでブロックし、蛋白質を事実上完全変性さ
せる方法も考えられるが、その実現はきわめて困難であ
るし、また実現できるとしても多量のハプテンが必要と
なり、ハプテンが微量しかない場合にはこのような方法
がとれないという不都合もあった。
（発明の目的） 本発明はこのような事情に鑑みなされたものであり、担
体自体のアミノ基をほぼ完全に修飾、変性し、微量のハ
プテンを結合させる場合でも、免疫時に担体自体の抗体
を生成することのない蛋白質修飾物を提供することを目
的とする。
体自体のアミノ基をほぼ完全に修飾、変性し、微量のハ
プテンを結合させる場合でも、免疫時に担体自体の抗体
を生成することのない蛋白質修飾物を提供することを目
的とする。
また本発明は受身凝集に用いる場合にも抗ハプテン抗体
（Ab）を予めハプテン担持担体自体（Ag*）で吸収する
ことなく免疫時と同じ担体でハプテンを担持できる蛋白
質修飾物を提供することも目的とする。
（Ab）を予めハプテン担持担体自体（Ag*）で吸収する
ことなく免疫時と同じ担体でハプテンを担持できる蛋白
質修飾物を提供することも目的とする。
（発明の構成） 本発明のこのような目的は、構造式 （但し式中、Ｐは蛋白質またはポリペプチド； ｍは０〜４、ｎは１〜８の整数であり、 ｐは非修飾状態のＰの有するアミノ基の数を上限とする
整数、 ｓは整数２から非修飾状態のＰの有するカルボキシル基
数を上限とする数の間の整数である） で表わされることを特徴とする蛋白質修飾物により達成
される。
整数、 ｓは整数２から非修飾状態のＰの有するカルボキシル基
数を上限とする数の間の整数である） で表わされることを特徴とする蛋白質修飾物により達成
される。
すなわち本発明は、蛋白質のアミノ基をアシル化してブ
ロックする一方、カルボキシル基をジアミンでアミド化
して新たなアミノ基を導入したもので、この導入アミノ
基にハプテンを結合させるようにしたものである。
ロックする一方、カルボキシル基をジアミンでアミド化
して新たなアミノ基を導入したもので、この導入アミノ
基にハプテンを結合させるようにしたものである。
蛋白質としては例えばBSA（牛血清アルブミン）、KLH
（キーホール・リンペッド・ヘモシアニン）、IgG、フ
ェリチンなどを用いることができ、また天然或いは合成
ポリペプチドなども担体として用いることができる。
（キーホール・リンペッド・ヘモシアニン）、IgG、フ
ェリチンなどを用いることができ、また天然或いは合成
ポリペプチドなども担体として用いることができる。
カルボキシル基をアミド化するジアミンは炭素数１〜８
のジアミンが好ましくこの範囲のジアミンを用いること
により、得られる蛋白質修飾物の水溶性を確保できる。
またジアミンの炭素数を選択して、担体とハプテンとの
間の長さ（スペーサ長）を調節することができる。
のジアミンが好ましくこの範囲のジアミンを用いること
により、得られる蛋白質修飾物の水溶性を確保できる。
またジアミンの炭素数を選択して、担体とハプテンとの
間の長さ（スペーサ長）を調節することができる。
担体蛋白質のアミノ基をブロックするアシル基の数ｐは
天然状態（すなわちアシル化する以前の状態）が蛋白質
Ｐの有するアミノ基の数ｐ′と同じか少ない整数である
が、ｐ′の少くとも90％以上、好ましくは99％以上の値
である。
天然状態（すなわちアシル化する以前の状態）が蛋白質
Ｐの有するアミノ基の数ｐ′と同じか少ない整数である
が、ｐ′の少くとも90％以上、好ましくは99％以上の値
である。
蛋白質にジアミンにより新たに導入されるアミノ基の数
ｓは少くとも２で、天然状態（すなわちアミド化する以
前の状態）の蛋白質Ｐの有するカルボキシル基数ｓ′を
最大とする。通常のハプテン蛋白質複合体の導入量が通
常10分子／担体以上好ましくは20分子／担体以上である
ことを考慮すれば、導入アミノ基数は通常10以上であ
り、好ましくは20以上である。
ｓは少くとも２で、天然状態（すなわちアミド化する以
前の状態）の蛋白質Ｐの有するカルボキシル基数ｓ′を
最大とする。通常のハプテン蛋白質複合体の導入量が通
常10分子／担体以上好ましくは20分子／担体以上である
ことを考慮すれば、導入アミノ基数は通常10以上であ
り、好ましくは20以上である。
次に本発明の蛋白質修飾物の製造方法について説明す
る。
る。
第１図のフローチャート図に示すように、まず蛋白質の
アミノ基を無水酢酸（この場合はｍ＝０となる）などの
酸無水物或いはハロゲン化アシルなどでアシル化する
（ステップ１）。通常弱アルカリ性下でアミノ基に対し
数倍モル量のアシル化剤を使用することにより、アミノ
基をほぼ完全にブロックすることができる。
アミノ基を無水酢酸（この場合はｍ＝０となる）などの
酸無水物或いはハロゲン化アシルなどでアシル化する
（ステップ１）。通常弱アルカリ性下でアミノ基に対し
数倍モル量のアシル化剤を使用することにより、アミノ
基をほぼ完全にブロックすることができる。
次にカルボキシル基をジアミンでアミド化する（ステッ
プ２）。ジアミンはｎの数に応じてメチレンジアミン、
エチレンジアミン、トリメチレンジアミン等を用いる。
反応に際しては蛋白質のカルボキシル基を予めカルボジ
イミドを活性化して、これを過剰量のジアミンに添加し
て行なう。
プ２）。ジアミンはｎの数に応じてメチレンジアミン、
エチレンジアミン、トリメチレンジアミン等を用いる。
反応に際しては蛋白質のカルボキシル基を予めカルボジ
イミドを活性化して、これを過剰量のジアミンに添加し
て行なう。
こうして得られた蛋白質修飾物では、蛋白質由来のアミ
ノ基の殆どがブロックされており、新たに導入されたジ
アミン由来のアミノ基だけが蛋白質に存在する。このア
ミノ基に対しハプテンをそのカルボキシル基を介して結
合させれば、ハプテン担持担体が得られ、免疫動物への
免疫に用いることができる（ステップ３）。このとき、
必ずしも導入アミノ基の全てにハプテンが結合するわけ
ではないので、ハプテン導入数ｒは導入アミノ基数ｓよ
り少ない。但し通常は約10以上である。ハプテン未結合
の導入アミノ基数は第１図に示すようにｓ−ｒとなる。
ノ基の殆どがブロックされており、新たに導入されたジ
アミン由来のアミノ基だけが蛋白質に存在する。このア
ミノ基に対しハプテンをそのカルボキシル基を介して結
合させれば、ハプテン担持担体が得られ、免疫動物への
免疫に用いることができる（ステップ３）。このとき、
必ずしも導入アミノ基の全てにハプテンが結合するわけ
ではないので、ハプテン導入数ｒは導入アミノ基数ｓよ
り少ない。但し通常は約10以上である。ハプテン未結合
の導入アミノ基数は第１図に示すようにｓ−ｒとなる。
また本発明による蛋白質修飾物を受身凝集による複数の
ハプテン抗原（Ag）を担持する担体として用いれば、蛋
白質が充分変性し抗原性を失っているため、複数の抗ハ
プテン抗体（Ab）を担持する担体と接触させても、その
抗体（Ab）はハプテン抗原担持担体自体（Ag*）とは結
合しない。従って用いる抗血清（Ab）を予めハプテン抗
原担持担体自体（Ag*）で吸収する必要もなく、また免
疫時に用いたハプテン抗原担持担体以外の担体を用いる
必要もない。
ハプテン抗原（Ag）を担持する担体として用いれば、蛋
白質が充分変性し抗原性を失っているため、複数の抗ハ
プテン抗体（Ab）を担持する担体と接触させても、その
抗体（Ab）はハプテン抗原担持担体自体（Ag*）とは結
合しない。従って用いる抗血清（Ab）を予めハプテン抗
原担持担体自体（Ag*）で吸収する必要もなく、また免
疫時に用いたハプテン抗原担持担体以外の担体を用いる
必要もない。
（発明の効果） 以上のように本発明は、蛋白質のアミノ基をアシル化し
てブロックする一方、カルボキシル基をジアミンでアミ
ド化して新たなアミノ基を導入した。このため、担体蛋
白質由来のアミノ基を消失或いは少なくして蛋白質の変
性度を高めることができ、担体蛋白質自体の抗体（A
b*）を生成することがない。従って微量のハプテンでも
効率的に抗体（Ab）を作製することができる。
てブロックする一方、カルボキシル基をジアミンでアミ
ド化して新たなアミノ基を導入した。このため、担体蛋
白質由来のアミノ基を消失或いは少なくして蛋白質の変
性度を高めることができ、担体蛋白質自体の抗体（A
b*）を生成することがない。従って微量のハプテンでも
効率的に抗体（Ab）を作製することができる。
また受身凝集に用いる場合にも抗ハプテン抗体（Ab）を
予めハプテン担持担体自体（Ag*）で吸収する必要がな
い。また免疫時と同じ担体で多価ハプテン抗原複合体を
作成できる。
予めハプテン担持担体自体（Ag*）で吸収する必要がな
い。また免疫時と同じ担体で多価ハプテン抗原複合体を
作成できる。
（実施例） 以下実施例により説明する。
実施例1;アセチル化BSAの調製 BSA（シグマ社製）1gを、100mlの50mM燐酸緩衝液（pH
9）に溶かし、これに氷冷下で0.5mlの無水酢酸を滴下し
た。滴下中はpHをモニターし、１規定NaOH溶液でpH9に
保った。滴下終了後、室温下攪拌しながら30分間反応さ
せた。反応液を１％酢酸で平衡化したセファデックスG-
10（ファルマシア社製）カラムにかけてゲル濾過・脱塩
しアセチル化BSAを分取した。凍結乾燥後の収量は1.05g
であった。反応後の残存アミノ基の数をフルオレサミン
（fluorescamine;F・ホフマン・ラ・ロシュ社製）で定
量したところ、反応前BSAの0.1％程度であった。
9）に溶かし、これに氷冷下で0.5mlの無水酢酸を滴下し
た。滴下中はpHをモニターし、１規定NaOH溶液でpH9に
保った。滴下終了後、室温下攪拌しながら30分間反応さ
せた。反応液を１％酢酸で平衡化したセファデックスG-
10（ファルマシア社製）カラムにかけてゲル濾過・脱塩
しアセチル化BSAを分取した。凍結乾燥後の収量は1.05g
であった。反応後の残存アミノ基の数をフルオレサミン
（fluorescamine;F・ホフマン・ラ・ロシュ社製）で定
量したところ、反応前BSAの0.1％程度であった。
実施例2:アセチル化BSAへのアミノ基導入 アセチル化BSAのカルボキシル基とエチレンジアミンと
を縮合させて新たなアミノ基を導入した。
を縮合させて新たなアミノ基を導入した。
実施例１で調製したアセチル化BSA1gを50mlの50mM燐酸
緩衝液（pH8）に溶かし、これに水溶性カルボジイミド
（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−
カルボジイミド）の５％水溶液5mlを氷冷下、滴下混合
して、アセチル化BSAのカルボキシル基を活性化した。
本液を、50mlの50mMエチレンジアミン水溶液（pH8）に
氷冷下攪拌しながら滴下・混合し反応させた。室温に戻
して１時間反応させた後、実施例１と同様にセファデッ
クスG-10カラムでゲル濾過・脱塩し、分取物を凍結乾燥
した。得られた標品の導入アミノ基の量をフルオレサミ
ンで定量したところ、BSA1分子当り約60分子の新しいア
ミノ基（エチレンジアミン由来）が導入されたことが分
かった。
緩衝液（pH8）に溶かし、これに水溶性カルボジイミド
（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−
カルボジイミド）の５％水溶液5mlを氷冷下、滴下混合
して、アセチル化BSAのカルボキシル基を活性化した。
本液を、50mlの50mMエチレンジアミン水溶液（pH8）に
氷冷下攪拌しながら滴下・混合し反応させた。室温に戻
して１時間反応させた後、実施例１と同様にセファデッ
クスG-10カラムでゲル濾過・脱塩し、分取物を凍結乾燥
した。得られた標品の導入アミノ基の量をフルオレサミ
ンで定量したところ、BSA1分子当り約60分子の新しいア
ミノ基（エチレンジアミン由来）が導入されたことが分
かった。
実施例3:BSA修飾物へのハプテン結合及び抗体作製 １−カルボキシブチル−フェノバルビタールをハプテン
としてBSA修飾物に結合させた。
としてBSA修飾物に結合させた。
実施例２で得たBSA修飾物100mgを10mlの50mMトリス塩酸
緩衝液（pH9）に溶解した。一方、１−カルボキシブチ
ル−フェノバルビタール100mgをジメチルスルホキシド5
mlに溶かし、これに1.1倍当量のトリエチルアミン及び
1.1倍当量のイソブチルクロロ蟻酸を加え混合酸無水物
を形成して活性化した。この混合酸無水物溶液を上記BS
A修飾物溶液に添加し反応させた。４℃で30分、さらに
室温下で１時間反応させた後、反応液を流水に対し透析
して脱塩した。凍結乾燥後の標品について、フェノバル
ビタール導入量を紫外吸収スペクトル（280nmおよび300
nmの２波長で測定）より定量した。導入量はBSA1分子当
り45モルという高値であった。
緩衝液（pH9）に溶解した。一方、１−カルボキシブチ
ル−フェノバルビタール100mgをジメチルスルホキシド5
mlに溶かし、これに1.1倍当量のトリエチルアミン及び
1.1倍当量のイソブチルクロロ蟻酸を加え混合酸無水物
を形成して活性化した。この混合酸無水物溶液を上記BS
A修飾物溶液に添加し反応させた。４℃で30分、さらに
室温下で１時間反応させた後、反応液を流水に対し透析
して脱塩した。凍結乾燥後の標品について、フェノバル
ビタール導入量を紫外吸収スペクトル（280nmおよび300
nmの２波長で測定）より定量した。導入量はBSA1分子当
り45モルという高値であった。
得られたハプテン担持BSAを常法に従い家兎に免疫した
ところ、高力価の抗フェノバルビタール血清が得られ
た。
ところ、高力価の抗フェノバルビタール血清が得られ
た。
また得られた抗フェノバルビタール抗血清は実施例２の
BSA修飾物自体で吸収しなくても受身凝集に供すること
ができた。
BSA修飾物自体で吸収しなくても受身凝集に供すること
ができた。
第１図は本発明による蛋白質修飾物の製造方法及び使用
方法を説明するフローチャート図である。
方法を説明するフローチャート図である。
Claims (1)
- 【請求項１】構造式； （但し式中、Ｐは蛋白質またはポリペプチド； ｍは０〜４、ｎは１〜８の整数であり、 ｐは非修飾状態のＰの有するアミノ基の数を上限とする
整数、 ｓは整数２から非修飾状態のＰの有するカルボキシル基
数を上限とする数の間の整数である） で表わされることを特徴とする蛋白質修飾物。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63088971A JPH0776236B2 (ja) | 1988-04-13 | 1988-04-13 | 蛋白質修飾物 |
| EP89106552A EP0339377B1 (en) | 1988-04-13 | 1989-04-13 | Modified protein for carrying hapten |
| DE1989622015 DE68922015T2 (de) | 1988-04-13 | 1989-04-13 | Protein, das modifiziert ist, um ein Hapten tragen zu können. |
| US07/880,292 US5180815A (en) | 1988-04-13 | 1992-05-05 | Modified protein for carrying hapten |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63088971A JPH0776236B2 (ja) | 1988-04-13 | 1988-04-13 | 蛋白質修飾物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01261400A JPH01261400A (ja) | 1989-10-18 |
| JPH0776236B2 true JPH0776236B2 (ja) | 1995-08-16 |
Family
ID=13957698
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63088971A Expired - Lifetime JPH0776236B2 (ja) | 1988-04-13 | 1988-04-13 | 蛋白質修飾物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0776236B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB0700136D0 (en) * | 2007-01-04 | 2007-02-14 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Process for manufacturing vaccines |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2557458B1 (fr) * | 1983-12-30 | 1987-09-04 | Centre Nat Rech Scient | Nouveaux anticorps capables de reconnaitre specifiquement des groupements hapteniques, leur preparation et leur application, et nouveaux antigenes permettant de les preparer |
| US4670406A (en) * | 1984-01-06 | 1987-06-02 | Becton Dickinson And Company | Tracers for use in assays |
| GB8728560D0 (en) * | 1987-12-07 | 1988-01-13 | Glaxo Group Ltd | Chemical compounds |
-
1988
- 1988-04-13 JP JP63088971A patent/JPH0776236B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 泉屋信夫他「ペプチド合成の基礎と実験」（昭６２−４−２０）丸善Ｐ．１４６ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH01261400A (ja) | 1989-10-18 |
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