DE68922015T2

DE68922015T2 - Protein, das modifiziert ist, um ein Hapten tragen zu können.

Info

Publication number: DE68922015T2
Application number: DE1989622015
Authority: DE
Inventors: Nobuhito C O Fuji Photo Masuda
Original assignee: Fuji Photo Film Co Ltd
Current assignee: Fujifilm Corp
Priority date: 1988-04-13
Filing date: 1989-04-13
Publication date: 1995-09-28
Anticipated expiration: 2009-04-14
Also published as: DE68922015D1; EP0339377A2; EP0339377B1; EP0339377A3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft modifizierte Proteine oder modifizierte Polypeptide, die als Carrier bzw. Träger für das Tragen von Haptenen (Antigene mit niedrigem Molekulargewicht) für die Herstellung von Haptenantikörpern verwendet werden oder die als Carrier für die Herstellung von polyvalenten Haptenantigenen, die im Immunoassay verwendet werden, eingesetzt werden.
In der Vergangenheit wurden Antikörper (Ab) für Verbindungen mit niedrigem Molekulargewicht, die als Antigene wirken, wie Arzneimittel oder ähnliche Chemikalien, hergestellt, indem man immunologische Empfängertiere damit immunisiert, indem man sie mit Konjugaten inokuliert, die durch Xombinieren dieser Antigene mit niedrigem Molekulargewicht (Haptene) oder ihre Homologen mit Carrierprotein wie BSA (Rinderserumalbumin) hergestellt worden sind. Wenn das Carrierprotein funktionelle Gruppen wie Aminogruppen und Carboxylgruppen aufweist, wird angenommen, das die Haptenmoleküle sich mit dem Carrierprotein an der Stelle der Amino- oder Carboxylgruppen verbinden. Haptenmoleküle verbinden sich leichter mit Aminogruppen.
Jedoch nicht alle Aminogruppen eines Proteins werden vollständig mit Haptenmolekülen verknüpft, wodurch die inhärente sterische Struktur des Proteins in dem Bereich, wo eine Anzahl nicht verknüpfter Aminogruppen vorliegen, so beibehalten wird, daß die nicht verknüpften Aminogruppen als antigene Determinanten (Epitope; Ag*) für das ursprüngliche Protein wirken. Entsprechend wird ein Antikörper (Ab*), der dem Carrierprotein entspricht, in dem Serum produziert, das mit dem Protein, welches das Hapten trägt, immunisiert wurde. Um den Einfluß von Ab* zu eliminieren, muß das hergestellte Antihapten-Antiserum (Ab) vor der Verwendung durch den Carrier (Ag *) an sich absorbiert werden.
Eine ähnliche Schwierigkeit kann auftreten, wenn ein Haptenproteinkonjugat bei dem passiven Agglutinations-Immunoassay verwendet wird. Bei dem passiven Agglutinations-Immunoassay trägt ein Carrier mehrere Monoepitop-Haptene, die jeweils als monovalentes Antigen (Ag) wirken, so daß der Komplex aus Carrier und den mehreren von ihm getragenen Haptenen als polyvalentes Antigen wirken kann, was Matrixagglutination aufgrund der Antigenantikörperbindung bewirkt. Der mehrere Haptenantigene tragende Carrier (Ag) tritt mit Antihaptenantikörpern (Ab) in Kontakt, so daß eine Antigenantikörpermatrix gebildet wird. Die Menge an gebildeter Matrix wird durch die Bestimmung der Veränderung der Trübung detektiert. Wenn ein freies monovalentes Haptenantigen anwesend ist, wird die Bildung der Matrix inhibiert, was zu einer Verringerung der Trübung führt. Die Menge an freiem Haptenantigen, d.h. die Menge des in der Probe enthaltenen Antigens kann quantitativ durch die Analyse der Verringerung der Trübung bestimmt werden. Wenn ein Antikörper (Ab ) für den Carrier (Ag*) anwesend ist, tritt selbstverständlich die Bildung einer Matrix oder die Agglutination durch die Bildung eines Ag*-Ab*-Komplexes auf. Entsprechend ist es notwendig, den verwendeten Antihaptenantikörper (Ab) vorher durch den Carrier (Ag*) zu absorbieren oder bei dem passiven Agglutinations-Immunoassay einen Komplex zu verwenden, der durch Verknüpfen eines Haptens (Ag) mit einem Carrier, der sich von dem im Immunisierungsschritt verwendeten Carrier (Ag*) unterscheidet, gebildet worden ist.
Eine Gegenmaßnahme, um diese Schwierigkeit zu umgehen, ist es, alle Aminogruppen des Carrierproteins zu blockieren, so daß das Protein vollständig denaturiert ist. Die Realisierung dieser Gegenmaßnahme ist jedoch extrem schwierig und eine große Menge an Hapten wird benötigt, wenn eine solche Gegenmaßnahme gewählt wird. Entsprechend kann diese Gegenmaßnahme nicht gewählt werden, wenn die Menge an Hapten klein ist.
Wenn andererseits die Menge an Hapten sehr klein oder die Löslichkeit des Haptens in Lösungsmittels sehr gering ist, wodurch die Konzentration der zur Verfügung stehenden Haptenlösung verringert wird, wird es unmöglich, das Hapten ausreichend am Carrierprotein einzuführen, was zu einem unzureichenden Titer des resultierenden Antikörpers führt. Es wird daher angestrebt, die Stellen des Carriers, an denen Haptenmoleküle eingeführt werden, zu erhöhen, so daß ein Carrier erhalten wird, an dem das Hapten mit hoher Effizienz eingeführt werden kann.
Methods in Enzymology, 70 85-104 (1980) betrifft einen Überblick über die Herstellung antigener Hapten-Carrier-Konjugate.
Im Journal of Immunological Methods, 55 73-78 (1982) wird ein modifiziertes Protein als Hapten-Carrier beschrieben, wobei BSA mit Ethylendiamin modifiziert wurde und die zur Verfügung stehenden Aminogruppen des modifizierten BSA oder die extern eingeführten Aminogruppen mit einem Hapten wie Mycotoxinen vernetzt wurden.
Eine erste Aufgabe dieser Erfindung besteht darin, ein modifiziertes Protein für das Tragen eines Haptens bereitzustellen, wobei die Aminogruppen des Proteins im wesentlichen vollständig modifiziert oder denaturiert sind, um die Möglichkeit der Bildung eines Antikörpers gegen den Carrier in der folgenden Immunisierungsstufe zu eliminieren.
Das erfindungsgemäße modifizierte Protein kann im passiven Agglutinations-Immunoassay verwendet werden, ohne daß die Notwendigkeit besteht, den Antihaptenantikörper (Ab) durch den Hapten tragenden Carrier (Ag *) zu absorbieren.
Eine zweite wichtige Aufgabe dieser Erfindung besteht darin, ein modifiziertes Protein für das Tragen eines Haptens bereitzustellen, wobei die Effizienz für das Einführen des Haptens hoch ist, ohne daß die Bildung eines Antikörpers gegen den Carrier zu befürchten ist.
Die erste Aufgabe dieser Erfindung wird gelöst durch die Bereitstellung eines modifizierten Proteins für das Tragen eines Haptens, dadurch gekennzeichnet, daß das modifizierte Protein durch die folgende Formel wiedergegeben wird.
worin Pro für ein Protein oder ein Polypeptid steht; X eine nicht eliminierbare oder eliminierbare modifizierende Gruppe für die Aminogruppe bedeutet; L eine modifizierende Gruppe für die Carboxylgruppe mit zwei oder mehr Aminogruppen bedeutet, von denen eine über eine Amidbindung mit der Carboxylgruppe von Pro verbunden ist und die andere als die Stelle, an der das Haptenmolekül eingeführt wird, verwendet werden kann, r im wesentlichen die Zahl aller Aminogruppen, die das nicht modifizierte Pro enthält, angibt; und t für eine zahl von 1 bis zu der Zahl der Carboxylgruppen, die das nicht modifizierte Pro enthält, steht; wobei die Aminogruppen des nicht modifizierten Pro blockiert sind und die dreidimensionale Struktur des nicht modifizierten Pro dadurch denaturiert wird, wodurch die Bildung eines Antikörpers gegen das nicht modifizierte Pro verhindert wird, wenn das modifizierte Pro als Carrier für ein Hapten verwendet wird.
Die zweite Aufgabe dieser Erfindung wird gelöst durch die Bereitstellung eines modifizierten Proteins für das Tragen eines Haptens, dadurch gekennzeichnet, daß das modifizierte Protein durch die folgende Formel wiedergegeben wird:
worin Pro für ein Protein oder ein Polypeptid steht; X eine nicht eliminierbare oder eliminierbare modifizierende Gruppe für die Aminogruppe bedeutet; L eine modifizierende Gruppe für die Carboxylgruppe mit zwei oder mehr Aminogruppen bedeutet, von denen eine über eine Amidbindung mit der Carboxylgruppe von Pro verbunden ist und die andere als die Stelle, an der das Haptenmolekül eingeführt wird, verwendet werden kann, r im wesentlichen die Zahl aller Aminogruppen, die das nicht modifizierte Pro enthält, angibt; h für eine ganze Zahl von 1 bis zu der Zahl der Aminogruppen, die in dem nicht modifizierten Pro enthalten sind, steht; und t für eine ganze Zahl von 1 bis zu der Zahl der Carboxylgruppen, die das nicht modifizierte Pro enthält, steht; wobei die dreidimensionale Struktur des nicht modifizierten Pro nach der Eliminierung der modifizierenden Gruppen X von den Aminogruppen denaturiert bleibt, wodurch die Bildung eines Antikörpers gegen das nicht modifizierte Pro verhindert wird, wenn das modifizierte Pro als Carrier für ein Hapten verwendet wird.
Fig. 1 ist ein Flußdiagramm, welches das Herstellungverfahren für einen modifiziertes Carrierprotein zeigt und welches die Verwendungsmethode für das modifizierte Carrierprotein darstellt.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Carrierprotein oder -polypeptid, deren Aminogruppen durch Modifizieren blokkiert worden sind und deren Carboxylgruppen in die Amidform umgewandelt worden sind, um neue Aminogruppen einzuführen, mit denen die Haptenmoleküle verknüpft werden sollen.
Indem man die Aminogruppen mit eliminierbaren Gruppen modifiziert und dann die modifizierenden Gruppen eliminiert, um die Aminogruppen des ursprünglichen Proteins zu regenerieren kann die Effizienz bei der Hapteneinführung durch die Verwendung der regenerierten Aminogruppen und der eingeführten Aminogruppen verbessert werden.

Protein:

Typische Beispiele für die Proteine, die erfindungsgemäß verwendet werden können sind u.a. Rinderserumalbumin (BSA), Napfschneckenhämocyanin (KLH), IgG, Ferritin und Thyreoglobulin. Natürliche oder synthetische Polypeptide können als Ausgangsmaterialien für das modifizierte Protein für das Tragen eines Haptens gemäß dieser Erfindung verwendet werden.

Modifizierende Gruppe X für die Aminogruppe:

Beispiele für die modifizierende Gruppe für das Blockieren der Aminogruppen des Carrierproteins werden nachstehend angegeben. Eliminierbare modifizierende Gruppen werden durch die folgenden Formeln wiedergegeben:
In den vorstehend angegebenen Formeln bedeutet R eine substituierte oder unsubstituierte Alkyl-, Aryl- oder Aral- kylgruppe mit 2 bis 15 Kohlenstoffatomen; Y bedeutet eine substituierte oder unsubstituierte Methylengruppe und Z steht für ein Schwefel- oder Sauerstoffatom.
Die modifizierenden Gruppen werden eingehender erläutert.
-CO-O-R (modifizierende Gruppen vom Urethan-Typ für den Schutz von Aminogruppen):
Die modifizierenden Gruppen vom Urethan-Typ für den Schutz von Aminogruppen schließen Alkyloxycarbonylgruppen (Alkoxycarbonylgruppen), Aryloxycarbonylgruppen und Aralkyloxycarbonylgruppen ein, spezielle Beispiele sind t-Butoxycarbonyl (Boc), Isobutyloxycarbonyl, Benzyloxycarbonyl (Z), p-Methoxybenzyloxycarbonyl, t-Amyloxycarbonyl, d-Isobornyloxycarbonyl und Adamantyloxycarbonyl. Diese modifizierenden Gruppen können teilweise substituiert sein. Beispielsweise kann ein Halogenatom, eine Nitrogruppe oder eine Methoxygruppe in der Paraposition der Benzyloxycarbonylgruppe eingeführt worden sein.
Ein Beispiel für -SO&sub2;-R (modifizierende Gruppen vom Sulfonyltyp) ist die p-Toluolsulfonyl(tosyl)gruppe, dargestellt durch die Formel
Beispiele für durch -CO-S-R wiedergegebenen modifizierenden Gruppen sind die (Phenylthio)carbonylgruppe, (Benzylthio)carbonylgruppe und (Butylthio)carbonylgruppe.
Beispiele für durch -S-R (Thio-Typ) wiedergegebenen modifizierenden Gruppen sind die o-Nitrophenylthiogruppe und die o , p-Dinitrophenylthiogruppe.
Ein Beispiel für die durch
wiedergegebenen modifizierenden Gruppen ist die Diphenylphosphonylgruppe (Dpp), wiedergegeben durch . Ein Beispiel für die durch
wiedergegebenen modifizierenden Gruppen ist die Diphenylphosphinothioylgruppe (Ppt), wiedergegeben durch
Beispiele für die durch -CO-Y-Z-R (worin Y eine substituierte oder unsubstituierte Methylengruppe bedeutet und Z für ein Schwefel- oder Sauerstoffatom steht) wiedergegebenen modifizierenden Gruppen sind die o-Nitrophenoxyacetylgruppe, wiedergegeben durch -CO-CH&sub2;-O-C&sub6;H&sub5;-NO&sub2;, die o-Nitrophenoxyisopropylcarbonylgruppe, wiedergegeben durch
und eine Gruppe wiedergegeben durch
Weitere Beispiele für modifizierende Gruppen für die Blokkierung der Aminogruppe sind die Formylgruppe (-CHO), die Acetoacetylgruppe (-CO-CH&sub2;-COCH&sub3;), die Trifluoracetylgruppe (-CO-CF&sub3;), die Benzylgruppe (-CH&sub2;-C&sub6;H&sub5;), die Diphenylmethylgruppe (CH-(C&sub6;H&sub5;) &sub2;), die Triphenylmethyl (Trityl) -gruppe (-C-(C&sub6;H&sub5;)&sub3;) und durch worin R¹ und R² jeweils für eine Alkylgruppe stehen, wiedergegebene Gruppen.
Jede der vorstehend beschriebenen Modifizierungs- oder Schutzgruppen blockiert eine Aminogruppe des Proteins, wobei eine Einfachbindung mit dem Stickstoffatom der Aminogruppe gebildet wird. Die Aminogruppe (-NH&sub2;) kann jedoch ebenfalls in -N=CH-R umgewandelt werden, so daß eine Doppelbindung mit dem Stickstoffatom der Aminogruppe gebildet wird, um die Aminogruppe zu blockieren.
Die Einführung und Eliminierung der Schutzgruppe können nach bekannten Verfahren erreicht werden. Beispielsweise kann eine Schutzgruppe vom Urethantyp durch das Isocyanatverfahren, das Azidformiatverfahren, das Verfahren der gemischten Carbonate oder das Halogenformiatverfahren eingeführt werden. Die Schutzgruppe kann beispielsweise durch katalytische Hydrierung, durch Behandlung mit Na-NH&sub3;, durch Behandlung mit einer Säure (z.B. Bromwasserstoff, Trifluoressigsäure und Fluorwasserstoff), durch Behandlung mit einem Alkali oder mittels Elektrolyse oder Photolyse eliminiert werden.
Details zu den modifizierenden Gruppen für den Schutz der Aminogruppe und zu den Verfahren für die Einführung und Eliminierung der Schutzgruppen sind in den folgenden Publikationen aus dem Stand der Technik beschrieben, auf die expressis verbis Bezug genommen wird.
Izumiya et al., "Peptide synthesis", Maruzen (1975); lzumiya et al., "Principle and Experiment of Peptide Synthesis", Maruzen (1985);
Herausgegeben von der Biochemical Society of Japan, "Biochemical Experiment Course 1, Chemistry of Protein IV", Tokyo Kagaku Dojin (1977);
J. P. Greenstein und M. Winitz, "Chemistry of Amino Acids", John Wiley & Sons, New York, Band II (1961); E. Schröder, K. Lübke, "The Peptides", Academic Press, New York, Bände I & II (1965);
M. Bodanszky und M. A. Ondetti, "Peptide synthesis", John Wiley & Sons, New York (1966 & 1976);
"Peptide Chemistry" Series, Proceedings of the Japan symposium on Peptide Chemistry, 1976 - 1987, Peptide Institute, Protein Research Foundation, Osaka, Japan.
Beispiele für nicht eliminierbare modifizierende Gruppen sind Acylgruppen, wiedergegeben durch
worin m eine ganze Zahl von 0 bis 4 bedeutet. Um sicherzustellen, daß das resultierende Carrierprotein in Wasser löslich ist, sollte m nicht mehr als 4 betragen. Die Acylgruppe kann nach einer bekannten Technik eingeführt werden, die in den Publikationen des Standes der Technik beschrieben ist.
Die Anzahl r der modifizierenden Gruppen X, die die Aminogruppe schützen, sollte nicht größer sein als die Zahl p der in dem nicht modifizierten Protein Pro enthaltenen Aminogruppen. Modifizierende Gruppe L für die Carboxylgruppe: Es ist anzustreben, daß das Diamin oder Polyamin für die Umwandlung der Carboxylgruppe des Carrierproteins 1 bis 8 Kohlenstoffatome aufweist, um sicherzustellen, daß das resultierende modifizierte Carrierprotein in Wasser löslich ist. Die Raumlänge, d.h. die Länge zwischen der Oberfläche des Carriers und dem Haptenmolekül, kann durch die Wahl der geeigneten Kohlenstoffzahl bei dem für die Modifizierung verwendeten Diamin oder Polyamin eingestellt werden. Bevorzugte Diamine sind beispielsweise Methylendiamin, Ethylendiamin und Triethylendiamin.
Die in dem Polyamin enthaltenen Aminogruppen bedeuten nicht nur Aminogruppen, die primären Aminen (-NH&sub2;) entsprechen, sondern auch Aminogruppen, die sekundären Aminen ( NH) entsprechen, die allgemein als Iminogruppen bezeichnet werden. Entsprechend steht der hier verwendete Terminus "Polyamin" für ein Konzept, das Polyimine mit Iminogruppen einschließt. Die Aminogruppe der modifizierenden Gruppe L zum Modifizieren der Carboxylgruppe des Carrierproteins kann entweder eine primäre oder eine sekundäre Aminogruppe sein, die mit der Carboxylgruppe des Proteins über eine Amidbindung verknüpft wird, und die in der Lage ist, mit dem Protein verknüpft zu werden.
Beispiele für bevorzugte Polyamine sind nachfolgend angegeben:
Diethylentriamin H&sub2;N-CH&sub2;CH&sub2;-NH-CH&sub2;CH&sub2;-NH&sub2;
Triethylentetramin H&sub2;N-(CH&sub2;CH&sub2;-NH)&sub2;-CH&sub2;CH&sub2;-NH&sub2;
Tetraethylenpentamin H&sub2;N-(CH&sub2;CH&sub2;-NH)&sub3;-CH&sub2;CH&sub2;-NH&sub2;
Pentaethylenhexamin H&sub2;N-(CH&sub2;CH2&sub2;NH)&sub4;-CH&sub2;CH&sub2;-NH&sub2;
Polyethylenpolyamin H&sub2;N- (CH&sub2;CH&sub2;-NH) n-CH&sub2;CH&sub2;-NH&sub2;
Dipropylentriamin H&sub2;N-CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;-NH-CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;-NH&sub2;
1, 4-Bis(aminopropyl)piperazin H&sub2;N-CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;-N N -CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;-NH&sub2;
Bishexamethylentriamin H&sub2;N- (CH&sub2;) &sub6;-NH- (CH&sub2;) &sub6;-NH&sub2;
Die Carboxylgruppe des Carrierproteins kann in die Amidform umgewandelt werden, indem man ein Aminosäurepolymer (Polyaminosäure) mit drei oder mehr Aminogruppen verwendet. Beispiele für die Polyaminosäuren, die für diesen Zweck verwendet werden können, sind u.a. Polymere der Dimere und Trimere von Ornithin mit α-Amino- und δ-Aminogruppen, Lysin oder Oxylysin mit α-Amino- und &epsi;-Aminogruppen. Bevorzugte Polyaminosäuren sind Lysyllysin, das Dimer von Lysin, Lysyllysyllysin, das Trimer von Lysin, und Ornithylornithin, das Dimer von Ornithin. Die Anzahl t der Aminogruppen des Carrierproteins, die durch das Diamin, Polyamin oder die Polyaminsäure eingeführt werden, liegt im Bereich von mindestens einer bis zu der Multiplikation der Anzahl Carboxylgruppen s des ursprünglichen Proteins Pro. Im Hinblick auf die Tatsache, daß die Anzahl Haptene in dem Hapten-Protein-Konjugat normalerweise mehr als 10 Moleküle pro Carrier, vorzugsweise mehr als 20 Moleküle pro Carrier beträgt, ist es anzustreben, daß die Anzahl eingeführter Aminogruppen generell mehr als 10, vorzugsweise mehr als 20 beträgt.
Indem man im wesentlichen alle modifizierenden Gruppen X, die an die ursprünglichen Aminogruppen gebunden sind, eliminiert, wird die Anzahl der in dem modifizierten Carrierprotein enthaltenen Aminogruppen im Vergleich zu denen im ursprünglichen Protein um 10 oder mehr, vorzugsweise 20 oder mehr erhöht, so daß die Effizienz für die Einführung des Haptens entsprechend erhöht wird.
Wenn die Carboxylgruppe des ursprünglichen Proteins unter Verwendung eines Polyamins oder einer Polyaminosäure in eine Amidgruppe umgewandelt wird, weist die modifizierende Gruppe 2 oder mehr Aminogruppen auf, so daß die Effizienz für die Einführung des Haptens weiter verbessert wird, da zusätzliche Haptenmoleküle an den von diesen eingeführten Aminogruppen zur Verfügung gestellten Stellen eingeführt werden können.
Wenn die dreidimensionale Struktur eines Moleküls mit hohem Molekulargewicht, wie eines Proteins oder eines Polypeptids, einmal durch Einführung modifizierender Gruppen zum Schutz der Aminogruppen verändert worden ist, kehrt die Struktur nicht zu ihrer ursprünglichen Struktur zurück, selbst wenn die modifizierenden Gruppen eliminiert werden. Entsprechend stellt ein Protein, bei dem eine oder mehrere Aminogruppen einmal blockiert sind, keine Ursache für die Bildung eines Antikörpers gegen das ursprüngliche Protein dar, selbst nachdem die blockierenden Aminogruppen entfernt worden sind.

Herstellung des modifizierten Carrierproteins

Das Verfahren zur Herstellung des modifizierten Carrierproteins gemäß dieser Erfindung wird nun mit Bezug auf die beigefügte Zeichnung beschrieben.
Mit Bezug auf das Flußdiagramm von Fig. 1 wird die Aminogruppe des ursprünglichen Proteins durch eine eliminierbare modifizierende Gruppe unter milden Bedingungen blokkiert (Stufe 1). Wenn eine modifizierenden Gruppe vom Urethantyp verwendet wird, können die Aminogruppen im wesentlichen vollständig unter schwach alkalischen Bedingungen blockiert werden, wobei ein Mehrfaches des molaren Äquivalents des Modifizierungsreagens verwendet wird.
Die Carboxylgruppe des ursprünglichen Proteins wird dann unter Verwendung eines Diamins oder Polyamins in die Amidgruppe umgewandelt (Stufe 2). Methylendiamin, Ethylendiamin oder Trimethylendiamin oder andere geeignete Diamine können als Diaminreagens für die Modifizierung verwendet werden und Diethylentriamin oder Triethylentetramin oder andere geeignete Polyamine können als Polyaminreagens für die Modifizierung verwendet werden. Die Carboxylgruppe des ursprünglichen Proteins wird vor der Reaktion durch Carbodiimid aktiviert und ein großer Überschuß an Diamin oder Polyamin wird zugesetzt, wobei die Menge des zugesetzten Diamins oder Polyamins so angepaßt wird, daß intramolekulare und intermolekulare Vernetzung im wesentlichen vermieden wird.
Da die Aminogruppe des ursprünglichen Proteins im wesentlichen vollständig in Stufe 1 blockiert worden ist, finden während der Aktivierung der Carboxylgruppe in Stufe 2 keine intramolekularen oder intermolekularen Vernetzungsreaktionen statt. Wenn Stufe 2 durchgeführt wird, ohne Stufe 1 durchzuführen, würde das Carrierprotein durch intramolekulare Vernetzungsreaktionen polymerisiert werden, wodurch ein inhomogenes Proteingemisch entstehen würde. Die Löslichkeit des resultierenden Produkts in Wasser wird durch solche intramolekularen oder intermolekularen Vernetzungen erheblich verringert, hierdurch wird es schwierig, den folgenden Vorgang der Einführung der Haptenmoleküle durchzuführen. Erfindungsgemäß wird das nachteilige intramolekulare und intermolekulare Vernetzen verhindert, wodurch ein homogenes modifiziertes Carrierprotein hergestellt wird, das zufriedenstellende Löslichkeit in Wasser aufweist.
In dem resultierenden modifizierten Carrierprotein sind fast alle Aminogruppen des ursprünglichen Proteins blokkiert und das Carrierprotein besitzt daher Aminogruppen, die aus dem eingeführten Diamin oder Polyamin stammen.
Die Carboxylgruppen der Haptenmoleküle werden mit den eingeführten Aminogruppen verknüpft, wodurch Hapten-Carrier-Konjugate erhalten werden (Stufe 4) und die so erhaltenen Hapten-Carrier-Konjugate können verwendet werden, um ein immunologisches Empfängertier zu immunisieren. Nicht alle der eingeführten Aminogruppen werden mit den Haptenmolekülen verknüpft, so daß die Zahl i der eingeführten Haptene kleiner ist als die Zahl t der eingeführten Aminogruppen und generell in einem Bereich nicht unter etwa 10 liegt.
Wenn die modifizierenden Gruppen X unter milden Bedingungen eliminiert werden (Stufe 3), besitzt das resultierende modifizierte Carrierprotein die regenerierten Aminogruppen und die in Stufe 2 eingeführten Aminogruppen. Falls der Schutz der Aminogruppen in Stufe 1 und die Eliminierung der Aminogruppen in Stufe 2 im wesentlichen in idealer Weise erreicht worden sind, ist die Zahl h der regenerierten Aminogruppen im wesentlichen gleich der Zahl p der in dem ursprünglichen Protein enthaltenen Aminogruppen, so daß das modifizierte Carrierprotein Aminogruppen aufweist, die um die Anzahl t der Aminogruppen, die an der Carboxylgruppe eingeführt wurden, wenn ein Diamin eingesetzt worden ist, vermehrt worden sind, oder die um eine Zahl vermehrt worden sind, die die Multiplikation der Zahl, erhalten, indem man 1 von der Zahl der Aminogruppen des verwendeten Polyamins abzieht, ist. Als Ergebnis werden die Stellen, an denen das Hapten eingeführt werden kann, in maximalem Maße erhöht, so daß das Hapten mit höherer Effizienz eingeführt werden kann. Daher kann ein Hapten-Carrier-Konjugat hergestellt werden, das sich für die Bildung eines Antihaptenantikörpers eignet, und einen hohen Titer aufweist (Stufe 5).
In diesem Fall sind nicht alle Aminogruppen des Carriers mit Haptenmolekülen verknüpft, die Zahl j der Haptenmoleküle, die mit den regenerierten Aminogruppen verknüpft sind, und die Zahl k der Haptenmoleküle, die mit den eingeführten Aminogruppen verknüpft sind, sind kleiner als die Zahl h der regenerierten Aminogruppen und die Zahl t der eingeführten Aminogruppen. Die Zahl der Haptenmoleküle
(h + t) ist jedoch größer als die der in das ursprüngliche, nicht modifizierte Protein eingeführten und ebenfalls größer als die der in das modifizierte Protein eingeführten, das in Stufe 2 hergestellt worden ist, in der die Aminogruppen des ursprünglichen Proteins blockiert blieben. Entsprechend wird die Effizienz der Einführung von Haptenmolekülen verbessert. Die Zahl der für die Immunisierung notwendigen Haptenmoleküle beträgt generell mehr als etwa 10 Moleküle pro Carrier und dieses Erfordernis wird leicht durch die Verwendung eines modifizierten Carrierproteins erfüllt, indem die Stellen für die Hapteneinführung in maximalem Maße vermehrt wurden.
Das erfindungsgemäße modifizierte Carrierprotein kann bequem als Carrier für das Tragen mehrerer Haptenantigene (Ag) im pPassiven Agglutinations-Immunoassay verwendet werden, da die Charakteristika des ursprünglichen Proteins durch die Modifizierungsreaktion in die Stufe 1 denaturiert werden, wodurch es die antigene Wirkung des ursprünglichen Proteins verliert. Selbst wenn man es mit einem Carrier, der mehrere Antihapten-Antikörper (Ab) trägt, in Kontakt kommen läßt, binden die Antikörper (Ab) daher nicht an den Carrier (Ag*) an sich. Entsprechend ist es daher nicht notwendig, das Antiserum (Ab) vorher durch den Carrier (Ag *) zu absorbieren oder einen anderen Carrier zu verwenden.
Dasselbe kann gesagt werden, wenn die Aminogruppen in Stufe 3 regeneriert werden. Die Struktur eines Peptids mit niedrigem Molekulargewicht kann durch Eliminierung der modifizierenden Gruppen zu der ursprünglichen Struktur zurückkehren. Die Strukturen von Molekülen mit hohem Molekulargewicht, wie Proteinen oder Polypeptiden, kehren jedoch nicht vollständig in die ursprüngliche Form zurück, wenn sie einmal modifiziert waren, selbst wenn die modifizierenden Gruppen eliminiert werden. Die dreidimensionalen Strukturen solcher Proteine und Polypeptide mit hohem Molekulargewicht werden durch die Modifizierungsreaktion denaturiert. Folglich wird, selbst wenn die regenerierten Aminogruppen als Stellen für die Einführung der Haptenmoleküle verwendet werden, ein Antikörper gegen den Carrier an sich nicht gebildet, im Unterschied zu dem Fall, wenn ein nicht modifiziertes Protein als Carrier verwendet wird.
Gemäß einem ersten Aspekt dieser Erfindung werden die Aminogruppen eines Proteins durch eliminierbare oder nicht eliminierbare modifizierende Gruppen blockiert und die Carboxylgruppen des ursprünglichen Proteins werden in die Amidform umgewandelt, indem man ein Diamin, Polyamin oder eine Polyaminosäure verwendet, um zusätzliche Aminogruppen einzuführen. Als Ergebnis sind die Aminogruppen des ursprünglichen Proteins vollständig blockiert oder vermindert, wodurch das Protein in hohem Maße modifiziert wird, so daß die Bildung des Antikörpers (Ab*) gegen das Carrierprotein an sich im wesentlichen eliminiert wird.
Wenn ein Polyamin für die Blockierung der Carboxylgruppe des ursprünglichen Proteins verwendet wird, werden zwei oder mehr Aminogruppen eingeführt, um die Stellen zu vermehren, an denen Haptenmoleküle eingeführt werden, wodurch die Effizienz der Einführung des Haptens verbessert wird.
Durch die Verwendung des erfindungsgemäßen modifizierten Carrierproteins kann ein Antihapten-Antikörper (Ab) effizient hergestellt werden, selbst wenn die verfügbare Menge an Hapten klein ist.
Das erfindungsgemäße modifizierte Carrierprotein kann ebenfalls im passiven Agglutinations-Immunoassay verwendet werden, wobei es nicht notwendig ist, einen Antihapten-Antikörper (Ab) vorher durch den Carrier (Ag*) an sich zu absorbieren. Ein polyvalentes Hapten-Antigen-Konjugat kann hergestellt werden, indem man denselben Carrier verwendet, der bei dem Immunisierungsvorgang verwendet worden ist.
Gemäß einem zweiten Aspekt der Erfindung werden die blokkierenden Gruppen von den einmal blockierten Aminogruppen entfernt, so daß Haptenmoleküle mit den regenerierten Aminogruppen verknüpft werden können und ebenfalls mit den eingeführten Aminogruppen verknüpft werden können. Die Anzahl an Stellen, an denen Haptenmoleküle eingeführt werden, wird im Vergleich zu dem nicht modifizierten Protein und auch im Vergleich zu dem modifizierten Protein mit blockierten Aminogruppen erhöht. Das modifizierte Carrierprotein hat bezüglich der Einführung von Haptenen eine hohe Effizienz und kann zur Herstellung eines Antikörpers (Ab) verwendet werden, selbst wenn die zur Verfügung stehende Menge an Hapten sehr klein ist. Das erfindungsgemäße modifizierte Carrierprotein weist einen hohen Grad an Nodifizierung auf, da seine Aminogruppen einmal modifiziert worden sind, um sie zu schützen, so daß es nicht die Bildung eines Antikörpers (Ab*) gegen den Carrier verursacht.

BEISPIEL:

Die vorliegende Erfindung wird mit Bezug auf einige Beispiele genauer beschrieben.

Beispiel 1-1: Herstellung von acetyliertem BSA

Ein Gramm BSA (hergestellt von Sigma Chemical Co.) wurde in 100 ml einer 50 mM Phosphat-Pufferlösung (pH 9) gelöst und 0,5 ml Acetanhydrid wurden tropfenweise zu der Lösung zugegeben, wobei die Lösung in einem Eisbad gekühlt wurde. Der pH-Wert der Lösung wurde während der tropfenweisen Zugabe verfolgt und durch Zugabe einer 1 N NaOH-Lösung bei pH 9 gehalten. Nach dem Ende der tropfenweisen Zugabe wurde die Reaktion unter Durchbewegen 30 Minuten bei Raumtemperatur fortgesetzt. Die Reaktionslösung wurde der Gelfiltration und dem Entsalzen unterworfen, indem man sie durch eine Sephadex-G-10-Säule (hergestellt von Pharmacia Finechemicals Co., Ltd.), eguilibriert mit einer l%-igen Essigsäurelösung, fließen ließ, um das acetylierte BSA abzutrennen. Die Ausbeute an lyophilisiertem Produkt betrug 1,05 g. Die Anzahl verbleibender Aminogruppen nach der Acetylierungsreaktion wurde durch Verwendung von Fluorescamin (hergestellt von F. Hoffman la Roche) bestimmt und es wurde gefunden, daß die Anzahl der verbleibenden Aminogruppen etwa 0,1% derjenigen des BSA vor der Acetylierungsreaktion betrug.

Bespiel 1-2: Einführung von Aminogruppen in das acetylierte BSA

Aminogruppen wurden in das acetylierte BSA durch Kondensationsreaktion zwischen den Carboxylgruppen des acetylierten BSA und Ethylendiamin eingeführt.
Ein Gramm des acetylierten BSA, hergestellt nach Beispiel 1-1, wurde in 50 ml einer 50 mM Phosphat-Pufferlösung (pH 8) gelöst und 5 ml einer 5%-igen wäßrigen Lösung eines wasserlöslichen Carbodiimids (1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl)carbodiimid) wurden tropfenweise der Lösung Zugemischt, wobei die Lösung in einem Eisbad gekühlt wurde; hierdurch wurden die Carboxylgruppen des acetylierten BSA aktiviert. Das Gemisch wurde tropfenweise zu 50 ml einer 50 mM wäßrigen Lösung von Ethylendiamin (pH 8) gegeben, und zwar unter Rühren und Kühlen der Lösung mit Eis. Nachdem die Reaktion eine Stunde lang bei Raumtemperatur fortgesetzt wurde, wurde das Reaktionsgemisch der Gelfiltration und Entsalzung unterworfen, wobei eine Sephadex-G-10- Säule in gleicher Weise wie in Beispiel 1-1 verwendet wurde, um das Reaktionsprodukt abzutrennen. Dieses wurde dann lyophilisiert, um eine Probe des Produkts zu erhalten. Die Anzahl eingeführter Aminogruppen der Produktprobe wurde unter Verwendung von Fluorescamin bestimmt, wobei gefunden wurde, daß die Anzahl an eingeführten Aminogruppen etwa 60/ein Molekül BSA betrug. Diese Aminogruppen stammten aus dem Ethylendiamin, das an den Carboxylgruppen eingeführt worden war.

Beispiel 1-3: Kupplung des Haptens an das modifizierte BSA und Antikörper-Herstellung

1-Carboxybutylphenobarbital wurde als Hapten verwendet und wurde an das modifizierte BSA gekuppelt.
100 mg des modifizierten BSA, hergestellt in Beispiel 1-2, wurden in 10 ml einer 50 mM Tris-HCl-Pufferlösung (pH 9) gelöst. Davon getrennt wurden 100 mg 1-Carboxybutylphenobarbital in 5 ml Dimethylsulfoxid gelöst und es wurden 1,1 Äquivalente Triethylamin und 1,1 Äquivalente Isobutylchloroformiat zugesetzt, um ein gemischtes Säureanhydrid zu bilden. Die Lösung des gemischten Säureanhydrids wurde zu der Lösung des modifizierten BSA gegeben, um das modifizierte BSA zu aktivieren. Nach 30 minütiger Reaktion bei 4ºC und einstündiger Reaktion bei Raumtemperatur wurde die Reaktionslösung gegen fließendes Wasser dialysiert, um sie zu entsalzen. Die Menge an eingeführtem Phenobarbital der lyophilisierten Probe wurde durch Ultraviolett-Absorptionsspektroskopie bestimmt (die Messungen wurden bei den Wellenlängen 280 nm und 300 nm durchgeführt). Die Menge an eingeführtem Phenobarbital war so groß wie 45 Mol/BSA-Molekül.
Mit dem so hergestellten modifiziertes BSA tragenden Hapten wurde ein Kaninchen geimpft, um das Kaninchen nach dem herkömmlichen Verfahren zu immunisieren, um Anti-Phenobarbital-Seren mit hohem Titer zu erhalten.
Das so erhaltene Anti-Phenobarbital-Serum konnte für den passiven Agglutinations-Immunoassay verwendet werden, ohne daß es notwendig war, das modifizierte BSA, das in Beispiel 1-2 beschrieben wurde, zu absorbieren.

Beispiel 2-1: Herstellung von mit Boc modifiziertem BSA

Die Aminogruppen von BSA wurden blockiert, indem man BSA mit t-Butoxycarbonyl (Boc) nach dem Verfahren der gemischten Carbonate modifizierte. Ein Gramm BSA (hergestellt von Sigma Chemical Co.) wurde in 100 ml einer 50 mM Phosphat-Pufferlösung (pH 9) gelöst, es wurden 0,6 ml Triethylamin zugesetzt und weiterhin wurden tropfenweise 50 ml einer 2%-igen Lösung von t-Butyl (4, 6-dimethylpyrimidyl-2-thiol) -carbonat (hergestellt von Aldrich Corp.) in Dioxan zugesetzt. Nach dem Umsetzen über Nacht bei Raumtemperatur unter Rühren, wurde die Reaktion durch Zugabe von 100 ml Wasser abgebrochen. Das nicht umgesetzte Carbonat wurde durch Extraktion mit Ethylacetat entfernt und dann wurde die wäßrige Phase gegen fließendes Wasser dialysiert, um sie zu entsalzen. Die Ausbeute an lyophilisiertem BSA, das mit Boc blockiert war, betrug 1,08 g. Die Anzahl verbleibender Aminogruppen wurde unter Verwendung von Fluoscamin bestimmt, wodurch gefunden wurde, daß die Anzahl verbleibender Aminogruppen weniger als 0,1% derjenigen des nicht blockierten BSA betrug.

Beispiel 2-2: Einführung von Aminogruppen in das mit Boc blockierte BSA

Aminogruppen wurden durch Kondensationsreaktion zwischen den Carboxylgruppen des blockierten BSA und Ethylendiamin in das durch Boc blockierte BSA eingeführt.
Ein Gramm des mit Boc blockierten BSA, wie in Beispiel 2-1 hergestellt, wurde in 50 ml einer 50 mM Phosphat-Pufferlösung (pH 8) gelöst und es wurden tropfenweise 5 ml einer 5%-igen wäßrigen Lösung eines wasserlöslichen Carbodiimids (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimid) zugegeben, wobei in einem Eisbad gekühlt wurde. Hierdurch wurden die Carboxylgruppen des durch Boc blockierten BSA aktiviert. Die Lösung wurde dann unter Kühlung mit einem Eisbad tropfenweise zu 50 ml einer 1 M wäßrigen Ethylendiaminlösung (pH 8) gegeben, um erstere mit der letzteren zu mischen und umzusetzen. Nach einstündigem Umsetzen bei Raumtemperatur wurde die Reaktionslösung gegen fließendes Wasser dialysiert, um sie zu entsalzen und anschließend wurde das Reaktionsprodukt lyophilisiert. Die Anzahl an eingeführten Aminogruppen in der Produktprobe wurde unter Verwendung von Fluorescamin bestimmt, wodurch gefunden wurde, daß die Anzahl an eingeführten Aminogruppen (aus Ethylendiamin stammend) etwa 60 pro ein BSA-Molekül betrug.

Beispiel 2-3: Kupplung des Haptens an das modifizierte BSA und Antikörper-Herstellung

1-Carboxybutylphenobarbital wurde als Hapten verwendet, das an das modifizierte mit Boc blockierte BSA gekuppelt wurde.
Indem man generell das Verfahren, wie in Beispiel 1-3 beschrieben, verwendete, wurde 1-Carboxybutylphenobarbital an 100 mg des modifizierten BSA, hergestellt in Beispiel 2-2, gekuppelt. Die Menge an eingeführtem Phenobarbital war so hoch wie 43 Mol pro ein Molekül des modifizierten BSA.
Mit dem so hergestellten modifiziertes BSA tragenden Hapten wurde ein Kaninchen geimpft, um das Kaninchen nach dem herkömmlichen Verfahren zu immunisieren, wodurch Anti-Phenobarbital-Seren mit hohem Titer erhalten wurden.

Beispiel 3-1: Eliminierung der Schutzgruppen, welche die Aminogruppen des modifizierten BSA blockieren

500 mg des modifizierten BSA, hergestellt in Beispiel 2-2, wurden in 50 ml eines Gemischs aus Bromwasserstoff und Eisessig gelöst und bei Raumtemperatur 20 Minuten lang umgesetzt. Nach dem Reaktionsende wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abdestilliert. Nach Zugabe von 100 ml Wasser wurde die Lösung des Reaktionsgemisches gegen fließendes Wasser dialysiert, um sie zu entsalzen, dann wurde das Reaktionsprodukt lyophilisiert. Die Ausbeute an Produkt betrug etwa 440 mg. Die Anzahl Aminogruppen wurde unter Verwendung von Fluorescamin bestimmt, es wurde gefunden, daß etwa 120 Aminogruppen pro ein BSA-Molekül eingeführt worden waren. Da die Anzahl der Aminogruppen des blockierten BSA, hergestellt in Beispiel 2-2, etwa 60 pro ein BSA-Molekül betrug, wurde festgestellt, daß 60 (20 bis 60 Aminogruppen pro ein BSA-Molekül) regeneriert worden waren.

Beispiel 3-2: Kupplung des Haptens an das modifizierte BSA mit regenerierten Aminogruppen und Antikörper-Herstellung

In gleicher Weise wie in Beispiel 2-3 wurde 1-Carboxybutylphenobarbital an 100 mg des modifizierten BSA mit regenerierten Aminogruppen, hergestellt in Beispiel 3-1, gekuppelt. 65 Mol Phenobarbital wurden pro ein BSA-Molekül eingeführt. Dieses Ergebnis war höher als die Menge an eingeführtem Phenobarbital (43 Mol/ein BSA Molekül wie in Beispiel 2-3 beschrieben) bei der Kupplung an das modifizierte BSA, welches nicht der Stufe des Abspaltens der blockierenden Gruppen unterworfen worden war. Mit dem so hergestellten modifiziertes BSA tragenden Hapten wurde ein Kaninchen geimpft, um das Kaninchen nach dem herkömmlichen Verfahren zu immunisieren, wodurch Anti-Phenobarbital-Seren mit hohem Titer erhalten wurden.

Beispiel 4-1: Einführung von Aminogruppen bei acetyliertem BSA

Aminogruppen wurden durch Kondensationsreaktion zwischen den Carboxylgruppen des acetylierten BSA und Etylendiamin in das acetylierte BSA eingeführt.
Ein Gramm des acetylierten BSA, hergestellt in Beispiel 1- 1, wurde in 50 ml einer 50 mM Phosphat-Pufferlösung (pH 8) gelöst und 5 ml einer 5%-igen wäßrigen Lösung eines wasserlöslichen Carbodiimids (1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl)carbodiimid) wurden tropfenweise der Lösung unter Kühlen der Lösung in einem Eisbad zugemischt, wodurch die Carboxylgruppen des acetylierten BSA aktiviert wurden. Das Gemisch wurde tropfenweise unter Rühren und Kühlen der Lösung mit Eis zu 50 ml einer 50 mM wäßrigen Ethylendiaminlösung (pH 8) gegeben. Nachdem die Reaktion bei Raumtemperatur eine Stunde lang fortgesetzt worden war, wurde das Reaktionsgemisch unter Verwendung von fließendem Wasser der Dialyse und dem Entsalzen unterworfen, anschließend wurde lyophilisiert. Die Anzahl an eingeführten Aminogruppen der Produktprobe wurde unter Verwendung von Fluorescamin bestimmt, wodurch gefunden wurde, daß die Anzahl an eingeführten Aminogruppen etwa 50 pro ein BSA-Molekül betrug.

Beispiel 4-2: Kupplung des Haptens an das modifizierte BSA und Antikörper-Herstellung

1-Carboxybutylphenobarbital wurde als Hapten verwendet, das an das modifizierte BSA gekuppelt wurde.
Indem man generell dem Verfahren wie in Beispiel 1-3 beschrieben, folgte, wurde 1-Carboxybutylphenobarbital an 100 mg des modifizierten BSA, hergestellt in Beispiel 2-2, gekuppelt. Die Menge an eingeführtem Phenobarbital war so hoch wie 67 Mol pro ein Molekül modifiziertes BSA.
Mit dem so hergestellten modifiziertes bSA tragenden Hapten wurde ein Kaninchen geimpft, um das Kaninchen nach dem herkömmlichen Verfahren zu immunisieren, wodurch Anti-Phenobarbital-Seren mit hohem Titer erhalten wurden.

Beispiel 5-1: Einführung von Aminogruppen in BSA, blokkiert mit Boc

Aminogruppen wurden in das mit Boc blockierte BSA durch Kondensationsreaktion zwischen den Carboxylgruppen des blockierten BSA und Ethylendiamin eingeführt.
Ein Gramm des mit Boc blockierten BSA, wie in Beispiel 2-1 hergestellt, wurde in 50 ml einer 50 mM Phosphat-Pufferlösung (pH 8) gelöst, und tropfenweise mit 5 ml einer 5 %igen wäßrigen Lösung eines wasserlöslichen Carbodiimids (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimid) unter Kühlen in einem Eisbad versetzt, wodurch die Carboxylgruppen des mit Boc blockierten BSA aktiviert wurden. Die Lösung wurde dann unter Kühlung in einem Eisbad tropfenweise zu 50 ml einer 1 M wäßrigen Ethylendiamin-Lösung (pH 8) zugegeben, um erstere mit der letzteren zu mischen und umzusetzen. Nach einstündiger Reaktion bei Raumtemperatur wurde die Reaktionslösung gegen fließendes Wasser dialysiert, um sie zu entsalzen und dann wurde das Reaktionsprodukt lyophilisiert. Die Anzahl an eingeführten Aminogruppen in der Produktprobe wurde unter Verwendung von Fluorescamin bestimmt; es wurde gefunden, daß die Anzahl an eingeführten Aminogruppen (aus Ethylendiamin stammend) etwa 55 pro ein BSA-Molekül betrug.

Beispiel 5-2: Kupplung des Haptens an das modifizierte BSA und Antikörper-Herstellung

1-Carboxybutylphenobarbital wurde als Hapten verwendet, das an das modifizierte BSA gekuppelt wurde.
Indem man generell dem Verfahren wie in Beispiel 1-3 beschrieben, folgte, wurde 1-Carboxybutylphenobarbital an 100 mg des modifizierten BSA, hergestellt in Beispiel 5-1, gekuppelt. Die Menge an eingeführtem Phenobarbital war so hoch wie 65 Mol pro ein Molekül modifiziertes BSA.
Mit dem so hergestellten modifiziertes BSA tragenden Hapten wurde ein Kaninchen geimpft, um das Kaninchen nach dem herkömmlichen Verfahren zu immunisieren, wodurch Anti- Phenobarbital-Seren mit hohem Titer erhalten wurden.

Beispiel 6-1: Eliminierung der Schutzgruppen, welche die Aminogruppen des modifizierten BSA blockieren

500 mg des modifizierten BSA, hergestellt in Beispiel 5-1, wurden in 50 ml eines Gemischs aus Bromwasserstoff und Eisessig gelöst und bei Raumtemperatur 20 Minuten lang umgesetzt. Nach dem Reaktionsende wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abdestilliert. Nach Zugabe von 100 ml Wasser wurde die Lösung des Reaktionsgemisches gegen fließendes Wasser dialysiert, um sie zu entsalzen, dann wurde das Reaktionsprodukt lyophilisiert. Die Ausbeute an Produkt betrug etwa 440 mg. Die Anzahl Aminogruppen wurde unter Verwendung von Fluorescamin bestimmt, es wurde gefunden, daß etwa 115 Aminogruppen pro ein BSA-Molekül eingeführt worden waren. Da die Anzahl der Aminogruppen des blockierten BSA, hergestellt in Beispiel 5-1, etwa 55 pro ein Molekül betrug, wurde festgestellt, daß 60 (115 - 55 Aminogruppen pro ein BSA-Molekül) regeneriert worden waren.

Beispiel 6-2: Kupplung des Haptens an das modifizierte BSA mit regenerierten Aminogruppen und Antikörper-Herstellung

In gleicher Weise wie in Beispiel 1-3 wurde 1-Carboxybutylphenobarbital an 100 mg des modifizierten BSA mit regenerierten Aminogruppen, hergestellt in Beispiel 6-1, gekuppelt. 83 Mol Phenobarbital wurden pro ein BSA-Molekül eingeführt. Dieses Ergebnis war höher als die Menge an eingeführtem Phenobarbital (65 Mol/ein BSA Molekül wie in Beispiel 5-2 beschrieben) bei der Kupplung an das modifizierte BSA, das nicht der Stufe der Eliminierung der Gruppen, die die Aminogruppen des ursprünglichen Proteins blockieren, unterworfen worden ist.
Mit dem so hergestellten modifiziertes BSA tragenden Hapten wurde ein Kaninchen geimpft, um das Kaninchen nach dem herkömmlichen Verfahren zu immunisieren, um Anti-Phenobarbital-Seren mit hohem Titer zu erhalten.

Claims

1.Modifiziertes Protein für das Tragen eines Haptens, dadurch gekennzeichnet, daß das modifizierte Protein durch die folgende Formel wiedergegeben wird:

worin Pro für ein Protein oder ein Polypeptid steht; X eine nicht eliminierbare oder eliminierbare modifizierende Gruppe für die Aminogruppe bedeutet; L eine modifizierende Gruppe für die Carboxylgruppe mit zwei oder mehr Aminogruppen bedeutet, von denen eine über eine Amidbindung mit der Carboxylgruppe von Pro verbunden ist und die andere als die Stelle, an der das Haptenmolekül eingeführt wird, verwendet werden kann, r im wesentlichen die Zahl aller Aminogruppen, die das nicht modifizierte Pro enthält, angibt; und t für eine ganze Zahl von 1 bis zu der Zahl der Carboxylgruppen, die das nicht modifizierte Pro enthält, steht; wobei die Aminogruppen des nicht modifizierten Pro blockiert sind und die dreidimensionale Struktur des nicht modifizierten Pro dadurch denaturiert wird, wodurch die Bildung eines Antikörpers gegen das nicht modifizierte Pro verhindert wird, wenn das modifizierte Pro als Träger für ein Hapten verwendet wird.

2. Modifiziertes Protein für das Tragen eines Haptens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die modifizierende Gruppe X durch die folgende Formel wiedergegeben wird:

worin m für eine ganze Zahl von 0 bis 4 steht.

3. Modifiziertes Protein für das Tragen eines Haptens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die modifizierende Gruppe X aus den nachstehend angegebenen Gruppen ausgewählt ist:

worin R eine substituierte oder unsubstituierte Alkyl-, Aryl- oder Aralkylgruppe mit 2 bis 15 Kohlenstoffatomen bedeutet.

4. Modifiziertes Protein für das Tragen eines Haptens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die modifizierende Gruppe X durch die folgende Formel wiedergegeben wird:

-CO-Y-Z-R

worin Y eine substituierte oder unsubstituierte Methylengruppe bedeutet; Z ein Schwefel- oder Sauerstoffatom bedeutet; und R für eine substituierte oder unsubstituierte Alkyl-, Aryl- oder Aralkylgruppe mit 2 bis 15 Kohlenstoffatomen steht.

5. Modifiziertes Protein für das Tragen eines Haptens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die modifizierende Gruppe L eine substituierte oder unsubstituierte Alkylgruppe mit drei oder mehr Aminogruppen und mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen bedeutet.

6. Modifiziertes Protein für das Tragen eines Haptens nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die modifizierende Gruppe L eine polymerisierte Aminosäure mit zwei oder mehr Aminogruppen ist.

7. Modifiziertes Protein für das Tragen eines Haptens nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die modifizierende Gruppe L durch die folgende Formel wiedergegeben wird: -NH- ( CH&sub2; ) n-NH&sub2;

worin n für eine ganze zahl von 1 bis 8 steht.

8. Modifiziertes Protein für das Tragen eines Haptens, dadurch gekennzeichnet, daß das modifizierte Protein durch die folgende Formel wiedergegeben wird:

worin Pro für ein Protein oder ein Polypeptid steht; X eine nicht eliminierbare oder eliminierbare modifizierende Gruppe für die Aminogruppe bedeutet; L eine modifizierende Gruppe für die Carboxylgruppe mit zwei oder mehr Aminogruppen bedeutet, von denen eine über eine Amidbindung mit der Carboxylgruppe von Pro verbunden ist und die andere als die Stelle, an der das Haptenmolekül eingeführt wird, verwendet werden kann, r im wesentlichen die Zahl aller Aminogruppen, die das nicht modifizierte Pro enthält, angibt; h für eine ganze Zahl von 1 bis zu der Zahl der Aminogruppen, die in dem nicht modifizierten Pro enthalten sind, steht; und t für eine ganze Zahl von 1 bis zu der Zahl der Carboxylgruppen, die das nicht modifizierte Pro enthält, steht; wobei die dreidimensionale Struktur des nicht modifizierten Pro nach der Eliminierung der modifizierenden Gruppen X von den Aminogruppen denaturiert bleibt, wodurch die Bildung eines Antikörpers gegen das nicht modifizierte Pro verhindert wird, wenn das modifizierte Pro als Träger für ein Hapten verwendet wird.

9. Modifiziertes Protein für das Tragen eines Haptens nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die modifizierende Gruppe X aus den nachstehend angegebenen Gruppen ausgewählt ist:

worin R für eine substituierte oder nicht substituierte Alkyl-, Aryl- oder Aralkylgruppe mit 2 bis 15 Kohlenstoffatomen steht.

10. Modifiziertes protein für das Tragen eines Haptens nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet , daß die modifizierende Gruppe X durch die folgende Formel wiedergegeben wird:

-CO-Y- Z -R

worin Y für eine substituierte oder unsubstituierte Nethylengruppe steht; Z für ein Schwefel- oder Sauerstoffatom steht; und R eine substituierte oder unsub-

stituierte Alkyl-, Aryl- oder Aralkylgruppe mit 2 bis 15 Kohlenstoffatomen bedeutet.

11. Modifiziertes protein für das Tragen eines Haptens nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die modifizierende Gruppe L für eine substituierte oder unsubstituierte Alkylgruppe mit drei oder mehr Aminogruppen und mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen steht.

12. Modifiziertes Protein für das Tragen eines Haptens nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekenn -zeichnet, daß die modifizierende Gruppe L eine polymerisierte Aminosäure mit zwei oder mehr Aminogruppen ist.