JPS60152497A - トレーサー - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は壱慎物質をカップリング生成物の製造に有用な
他の中間体にカップリングさせること、およびこれらの
カシプリング生成物の用途に関する。

カップリング試薬またはス（−サー化合物Ｆ”ある有機
物質を他にカップリングさせるために用いられる一般に
二官能性の化合物である。たとえばイムノアッセイなど
のアッセイにおいては、アッセイの成分の一方はリガン
ドからなるトレーサー；たとえば適切なマーカー（例え
ば螢光色素のような色原体）にカンプリングした抗原で
ある。

この種のトレーサーを製造する除には、多くの場合抗原
を二官能性のカップリング剤またはスペーサーの使用に
よシ螢光色素にカップリングさせる。

同様に固体支持体を用いるイムノアッセイにおいては、
アッセイに用いられる物質（たとえば抗体）を固体支持
体（たとえばホＩＪマー）にカップリングさせる必資が
あり、ある場合にはこれはカップリング剤の使用によシ
達成される。

当技術分野においては、ある物質をカップリング剤また
はスペーサー化合物を介して他にカップリングさせるだ
めの改良された手段がめられている。

本発明の一観点によれば、ある物質を他にカップリング
させるだめの中間体が提供される。

本発明の他の観点によれば、カップリングした化合物ま
たは物質が提供される。

本発明の他の観点によれば、この棟のカップリング剤、
中間体およびカップリングした化合物の製法が提供され
る。

本発明のさらに他の観点によれは、カンプリング剤、中
間体およびカップリング生成物の使用法が提供される。

よシ詳細には、本発明の一観点によればカップリングし
た化合物の製造に有用な中間体であって、下記の構造式
： ％式％（） 〔式中Ｙは２価の芳香族炭化水素残基であシ；Ｒは少な
くとも１個の活性水素置換基（特にアミン、チオールま
たはヒトゝロキシ置侠基）を有する有慎残基であシ；そ
して Ｏ Ａは−Ｎｏ２；　ＮＨ２；−ＣＯＯＨ；−凸−Ｃ／；　
−６−ｏ−Ｒ〃；０ および−〇−Ｃ−Ｒ”　（これらにおいてＲ“はアルキ
ル基である） よりなる群から選ばれる〕 を有する中間体が提供される。

本発明の他の観点によれば、下記の構造式二〇 Ｒ−Ｃ−ＮＨ−Ｙ−Ｚ　（ＩＩ） 〔式中Ｚは よりなる群から選ばれ； Ｂは有機残基であシ； Ｒは少なくとも１個の活性水素置換基を有する有愼残基
であシ、ここでＲは該活性置換基（好ましくはアミン、
チオールまたはヒトゝロキシ置換基）を介してカップリ
ングしておシ；そしてＹは２価の芳香族炭化水素残基で
ある〕を有するカップリングした化合物が提供される。

本発明の特に好ましい実施態様によれば、前記の各構造
式においてＹは２価のベンゼン残基である。ただしＹは
２価のナフタリン残基捷たは２価のジフェニル残基であ
りうるとも解すべきである。

中間体（１）は構造式（匍： ０＝Ｃ＝Ｎ−Ｙ−）（’　（ｎｉ） （式中Ｒ′は−Ｎｏ２；　−ＣＯＯＲ”；−３−Ｃ−Ｈ
″；または−Ｏ−凸−Ｒ”であシ、 Ｒ“およびＹは定義されたものである）によシ表わされ
る化合物から製造できる。

Ｒ′は一般にパラ位またはメタ位にあり、好ましくけパ
ラ位にあり、Ｒ′は最も好ましくは−Ｎｏ□である。

化合物■においてＲ′がｌＮＯ２である場合、化合物■
をまずインシアネート基と反応性である活性　″水素置
換基を有する有機化合物とカップリングさせて、Ａが−
ＮＯ２である式】の化合物を製造する。

次いでこの−ＮＯ２基を選択的に還元してアミン基とな
しく硫化された水素化ホウ素ナトリウムの使用）、他の
有機化合物にカップリングさせるための反応性基を与え
ることができる。あるいはアミノ基をイソシアネート基
（ホスゲンとの反応）またけインチオシアネート基（チ
オホスゲンとの反応）に変えることができる。これらの
いずれも中間体１を有機化合物にカンプリングさせるた
めのまたは−ｏ−６−Ｒ“　である場合、化合物■をイ
ソシアネート置換基を介して有機化合物にカップリング
させたのち、置換基Ｒ′を加水分解して置換基Ａ（それ
ぞれ−〇ｏｏに−８）（または−ＯＨであシ、とれらは
それぞれ中間体１を有機化合物にカップリングさせるた
めの反応性を有する）にすることができる。

従って明らかなとおシ、化合物■はこれがそのインシア
ネート基を介してカップリングすべき有機化合物の活性
水素置換基と反応性でない置換基Ｒ′を含むべく選ばれ
る。次いでＲ′を、中間体１がそれとカップリングして
カップリングした化合物■を形成する有機化合物の活性
水素置換基と反応性である置換基Ａに変える。

構造式ｌで表わされる化合物は、構造式■で表わされる
カップリングした化合物の製造に用いることができる。

構造式１で表わされる化合物を使用する隙には、Ａで衆
わされる置換基は構造式１にニジ表わされる化合物をカ
ップリングさせるべき化合物の活性水素置換基と反応し
うるものである。たとえばＡがアミノ基である場合、化
合物ｌを当技術分野で一般に知られている方法により、
カルボキシル置換基を有する有機化合物とカップリング
させることができる。同様にＡがカルボキシル基である
場合、化合物ｉ２当技術分野で知られている方法によシ
、アミン置換基またはインシアネート置換基を有する有
機化合物とカップリングさせることができる。Ａがイソ
シアネート基である場合、化合物１を活性水素置換基（
メルカプト（チオール）基、水酸基、カルボキシル基ま
たはアミン基である）を有する有機化合物にカップリン
グさせることができる。Ａがチオール基または水酸基で
ある場合、化合物Ｊを活性水素置換基（イノシアネ−１
・）ヲ有する４機化合物にカップリングさせることがで
きる。Ａがイソチオシアネート基である場合、化合物１
を、アミン置換基を廂する刹磯化合物とカップリングさ
せることができる。この棟のカップリングをこの棟の官
能基を介して行う方法は、当技術分野で一般に知られて
いる。

カッシリング剤■は多種多様な有機物質を互いにカップ
リングさせるために使用できる。たとえばトレーサーが
検出可能なマーカー：たとえばリガンド（ここで用いら
れる１リガントゝ”、という語はハプテン、抗原または
抗体を意味する）にカップリングした放射性マーカー、
色原体、酵素などからなるアッセイに使用すべきトレー
サーの製造にカップリング化合物■を用いることができ
゛る。

この種の実施態様においてマーカー捷だはりガント９の
一方には、インシアネート基と反応しうる置換基が含ま
れ、カップ１ソング剤Ｉｎの置換基Ｒ′はそのリガンド
またはマーカーの置換基と非反応性である。カップリン
グ剤■をリガンドまたはマーカーとカップリングさせた
のち、置換基Ａが、最初にカップリングして中間体１を
生成したりガント捷たはマーカー上にある活性水素置換
基と非反応性である中間化合物１が製造される。次いで
中間化合物Ｊをマーカーまたはりガントの・１ｍ方とカ
ッシリングさせる。中間体１の置換基Ａがリガントゝま
たはマーカーの他方にある活性水素置換基と反応性でな
い場合は、置換基Ａを先に定義したようにリガンドまた
はマーカーの他方にある活性水素置換基と反応性である
置換基に選択的に変換する。次いでこの中間体１をリガ
ント″またはマーカーの他方とカップリングさせてカッ
プリングした化合物■を製造する。

たとえばアッセイに使用するトレーザー′ｆＩ：製造す
る際に、カップリング化合物■においてＲおよびＢの一
方がマーカー、たとえば色原体、放射性置換基を含む有
機化合物または酵素であり、ＲおよびＢの他方がりガン
ビである。たとえば螢光トレーサーを製造する際にはＲ
およびＢの一方がイソシアネート基または構造式１中の
Ａによシ表わされる反応性１゛能基の一つにカップリン
グしうる置換基を有する螢光色素から誘導され、Ｒおよ
びＢの他方がインシアネート基または構造式ｌにおいて
Ａで表わされる反応性置換基の他方にカップリングしう
る置換基を有するリガンドから誘導される。この棟のト
レーサーを導入−する際には、リガンドまたは螢光色素
をまずカップリング試薬■のイソシアネート官能基にカ
ップリングさせる。

本発明者らは、式聞で表わされるカッシリング剤を１更
用することは、カップリング剤が堅牢であシ、このため
螢光マーカーがリガント９上に６折シ”返ることがなく
、従ってリガンドによシ螢光化合物が消光される可能性
が最小限に抑えられる点で、螢光トレーサーの製造に特
に肩オｉであることを見出した。

適切な色原体の代表例として、以下のものが挙げられる
。アクリジン色素、アズレ（ａＺｕｒｅ　）色素、キノ
ン色素、ナイルブルー、クレジルバイオレット、フルオ
レセイン類、ローダミン類、クマリン類、アミンナフタ
リン誘導体（ダンシル化合物）、カルボシアニン類、イ
ンドール類、ランタニド９キレート類など。

たとえばＴ４トレーサーは、まずｐ−ニトロフェニルイ
ノシアネートヲ′１゛４　のカルボキシ部分が適宜ブロ
ックされたチロキシン（Ｔ４）にカップリングさせるこ
とによシ製造できる。ニトロ基を還元してアミン基（化
合物＋、ＲはブロックされたＴ４残基であシ、Ｙはベン
ゼン残基、Ａはアミン基である）となし、化合物Ｉのア
ミン部分をたとえばインチオシアネート基を含む螢光色
素（特にフルオレセインインチオシア床−））にカップ
リングさせることができる。

あるいは化合物ｌのアミノ基をチオホスゲンとの反応に
よジイソチオシアネート基に変え（化合物ＪにおいてＡ
がインチオシアネート基）、次いで化合物ｊをアミノ基
含有螢光色素（特にフルオレセインアミン）と反応させ
ることができる。

同様にジゴギシントレーサーは、ジゴキシンをｐ−ニト
ロフェニルイソシアネートとカップリングさせたのちニ
トロ基を還元してアミン基となし、そして螢光色素、た
とえばフルオレセインイソチオ／アネートと反応させる
ことによシ製造できる。

本発明は前記のように螢光トレーサーの製造に特に用い
られるが、本発明は他のトレーサー、たとえば放射性ト
レーサー、酵素ｌ・レーサーなどの製造にも用いられる
。放射性トレーサーを製造するだめの適切な放射性マー
カーの代表例としては、以下のものが挙げられる：ヒト
゛ロキシフェニル置換されたアミンまたはアミノ酸。こ
れらにおいてフェニル基には放射性置換基１個または２
個以上が含まれていてもよい。たとえば放射性ヨウ累化
されたチロシンまたはチラミン；イミダゾール基が放射
性置換基１個または２個以上によシ置換されたイミダゾ
ール置換アミノ酸またはアミン等。

適切な酵素マーカーの代表例としては以下への゛ものが
挙げられる：パーオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ
、アセチルコリンエステラーゼ、グルコアミラーゼ、マ
レイン−デヒドロゲナーゼ、グルコース−６−リン酸テ
ヒドロゲナーゼ、グルタルオキシグーゼ、アシドゝホス
ノアターゼアよど。

当技術分野で知られるように、固体支持体はポリマーで
あってもよい。ただしそのようなポリマーにはインシア
ネート官能基または中間体１のＡにより衆わされる反応
性置換基の１つと反応しうる置換基が含まれる必要があ
る。たとえば・式リアクリルアミド、汁こり（アミノス
チレン）など。

本発明によシ製造されるトレーサーおよび支持体上のり
ガントゝは、当技術分野で一般に知られている型の多棟
多様な被分析体じ被分析体（ａｎａ、：］、ｙｔθ）”
という語はハプテン、抗原または抗体を戎ゎす）のアッ
セイに使用できる。たとえば本発明は治療薬およびいわ
ゆる一肝薬（ａｒｕ％。ｆ　ａｂｕｓθ）″　を含む薬
剤；ステロイド、ビタミン、糖、アミノ酸、ポリーＥ’
プチド、蛋白質、各種ホルモン、抗生物質、ウィルスな
どのアッセイに使用できる。

本発明により製造されるトレーサーおよび支持体」二の
りが７１・゛はイムノアッセイ（”イムノアッセイ゛と
いう語は総称的に用いられ、抗原または抗体の代わりに
天然の結合剤を使用し、時拠競合蛋白質結合アッセイと
呼ばれるアッセイを含む）に使用でき、当技術分野で知
られるようにアッセイの成分の一つは結合剤である。被
分析体がノ・ブテン−！たけ抗原である場合、結合剤は
抗体、または被分析体に特異的な結合部位１個または２
個以上をもつ天然物質であシ、被分析体が抗体である場
合、結合剤は抗体に対する抗原または被分析体に呼応し
て誘発された抗体であろう。適切な結合剤の選択は当業
−者がなしうる馳囲内にあると考えられ、本発明を十分
に理解するためにこの点に関してこれ以上詳述する必要
はないと思われる。

アッセイに際して、アッセイに用いられるトに一す−の
リガント″部分は採用されるアッセイの型により定めら
れる。たとえばアッセイが抗原またはハプテンである被
分析体に関するものである場合、トレーサーのりガン１
−゛部分はアッセイすべき抗原もしくはハプテンまたは
それらの適宜な同族体である（゛°適宜な同族体”とい
う刑はアッセイに用いられる結合剤に結合した被分析体
の同族体を意味する）。あるいはトレーサーのりガント
゛部分がアッセイすべきハプテン捷たは抗原に対する結
合剤であってもよく、この場合アッセイはトレーサーが
そのトレーサーに特異的な結合部位に結合するのを被分
析体が阻止するように工夫される。

被分析体が抗体である場合、トレーサーのりガント部分
は抗体またはその適宜な同族体であり、この場合抗体お
よびトレーサーの双方が被分析抗体およびトレーサーの
双方に対して特異的な限られた数の結合部位に関して競
合するであろう。あるいはトレーサーのりガント部分は
、被分析抗体に対する抗原葦たは被分析抗体に呼応して
誘発された抗体であってもよい。この場合、被分析抗体
はトレーサーがそのトレーサーに対し特異的な結合部位
に結合するのを阻止する。

被分析体をいわゆる６サント９インチ型”のアソセイに
よシ決定する場合には、トレーサーのりガント部分が被
分析体に特異的な結合部位をもち、被分析′ドは複数の
決定部位をもつ。

トレーサーのリガント９部分として用いられる適切なり
ガントの選択は本明細書の教示から当業者がなしうる範
囲のものと考えられ、従って本発明を十分に理解するた
めにこの点に関してこれ以上詳述する必要はないと思わ
れる。

本発明のカップリング剤は治療薬を抗体（特にモノクロ
ーン抗体）にカンプリングさせるためにも使用できる。

この場合、カップリングした化合物■においてＲは治療
薬から誘導され、Ｂは抗体から誘導される。

従って上記の記述から明らかなように、カップリングし
た化合物■は多棟多様な有機化合物から製造でき、化合
物■においてＲによシ表わされる肩壁残基はある有機化
合物から誘導され、カップリングした化合物■において
Ｂによシ表わされる１機残基は他の有機化合物から誘導
される。ただし各有機化合物はカップリング剤■中の適
宜な置換基（インシアネート）または構造式１に計いて
Ａにより表わされる適宜な反応性置換基と反応するため
の適宜な活性水素置換基を含む。たとえばカップリング
した化合物■においてＲはイソシアネート基と反応しう
る活性水素置換基を含む有機化合物から誘導される有機
残基であってもよく、その有機化合物はマーカー（放射
性置換された有機化合物、色原体、好捷しくは螢光色素
、酵素）、またはりガント、特に非蛋白性抗原もしくは
非蛋白性・・ブテン、固体支持体、または治療薬（特に
医薬）であってもよい。同様にＢは中間体１においてＡ
により＆わされる反応性置換基の１つと反応しうる活性
水素置換基を含む有機化合物から誘導される有慎残基で
あってもよい。たとえばＢは蛋白質、抗体、ハプテン、
抗原、色原体（色素、好ましくは螢光色素）、酵素、放
射性置換基を１する有機化合物、ミリマーなどの有慎化
合物から誘導される有＋Ｍ残基であってもよい。

本発明を以下の実施例に関連してさらに記述するが、こ
れによシ本発明の範囲が限定されるべきではない。

実施例１ 塩化トリメチルシリル（ＴＭＳ−（Ｊ）２．１ミリモル
ｉＴ４１ミリモルおよび再蒸留ピリジンに添加した。反
応は約２時間を要し、はぼ定量的であった。反応後、ｐ
−ニトロフェニルイソシアネート１１モルを反応混合物
に注入添加し、混合物を磁気撹拌棒を用いて約４８時間
撹拌し、少量の試料を約４時間毎にＴＬＣ（４層クロマ
トグラフィー）による分析のため取出した。４８時間後
に生成物を未反応インシアネートの除去のためメタノー
ルで十分に洗浄し、次いでＴＬＣもしくは高圧液体クロ
マトグラフィー（ＨＰＬＣ）　によシまたはカラムクロ
マトグラフィーによシ生成物を分離した。得られた生成
物はＴ４のカルボキシル官能基がトリメチルシラン（Ｔ
ＭＳ）でブロックされたパラーニトロフェニルイソシア
ナ）−Ｔ４であった。

上らピの反応は常温常圧（ＳＴＰ）で行われた。

硫化された水素化ホウ素ナトリウム０５５ミリモル（使
用したＴ４　の濃度に対して過剰量を生成物０．５　ミ
ＩＪモルに室内の温度および圧力で添加することによジ
ニトロ基を還元した。反応は約３〜４時間混合して完了
し、ＩＲによジニトロからアミンへの変換を監視するこ
とによシ行われた。得られた生成物はパラ−アミノフェ
ニルイソシアナト−Ｔ４であった。

上記生成物に１モル当量のイノチオシアナト−フルオレ
セインを添加したのち約４８〜７２時間撹拌し、ＴＬＣ
またはＨＰＬＣによシ監視した。フルオレセイン色素ヲ
Ｔ４　カップリングした中間体にカップリングさせたの
ちブロック剤ＴＭＳを水性条件下で除去した。

得られた生成物はフルオレセインイノチオシアネートが
堅牢なカップリング剤を介してＴ４にカップリングした
螢光トレーサーでアリ、このトレーサーはＴ４のアッセ
イに使用できる。

実施例２ ジゴキシン螢光トレーサーの製造 １００ｍＡ！容の丸底フラスコにジゴキシンｌミリモル
および撹拌棒を入れた。開口にゴム膜をはシ、ガス抜き
針を用いて徐々に丸底フラスコを窒素で５分間パージし
た。長い１８ゲージのステンレス鋼製の針を備えた５０
　ｍｌのガラス製注射器に新たに蒸留したぎりジン３０
ｍ１を取シ、ゴム膜を介して丸底フラスコに最初は徐々
に注入し、１５〜２０　ｍｌが注入されたり・・ち撹拌
金部えた。残りの１０〜１５ｍ６は丸底フラスコの側面
を洗い洛としてジゴキシンを溶解するのに使用した。再
びガス抜き針を用いて容器を窒素で約５分間パージした
。ジゴキシンがすべて溶解して完全な溶液になるまで撹
拌混合を続けた。

別個の容器（好ましくは閉じた丸底フラスコ）にパラ−
ニトロフェニルイソシアネート１１ミリモル（あらかじ
め乾燥したもの）をとシ、ピリジン１５ｍ１を注入によ
シ添加し、前記のように閉鎖容器を窒素で混和パージし
、すべての物質が溶液となった時点で注射によシ取出し
、撹拌を続けながら徐々にジゴキシンを入れた１００ｍ
Ｊ芥丸底フラスコに添加した。

注釈＝１）作業はすべて防護フード内で行うべきである
。

２）パラ−ニトロフェニルイソ７アネートは使用前に常
に工Ｒで検査すべき である。貯蔵期間および露光によシ このインシアネートが著しく影響を 受ける可能性がある。ロット毎にイ ソシアネートの存在を調べるべきで ある。

ＴＬＣ用試料は注射器により取出すべきであシＴＬＣに
よる監視はパラ−ニトロフェニルイソシアネートを添加
した２時間後に開始すべきである。

第１日月については２〜４時間毎にスポットを検査し、
−装置いた場合はＴＬＣをまず朝一番に行うべきである
。

反応は終了するまで約７２時間かかった。（４８時間後
に主生成物は実質的に形成されていたが一７５チ終了）
。これよシも長時間置くと目的生成物の増加は認められ
るが、これは付加的な副生物が匹敵するかまたはよシ大
きな割合で生じるという犠牲においてなされる。可能な
限、り最良の結果が得られたことを確認するため、目的
生成物の精製（および単離）をここで行うべきである。

この生成物の精製は調製用ＴＬＣによシ行われ、１日で
行うことができるが、プレートに過剰負荷しないように
注意しなければならない。さもなければバンドがＭ４Ｊ
ｉするおそれがある。シリカゲルからメタノール：クロ
ロホルムを用いて抽出する際、溶液’１０．２２μのフ
ィルターを介して回転蒸発用の丸底フラスコ中へ濾過す
るとよい。濾過はジゴキシンに対するインシアネート（
結合）形成を破壊する可能性がある痕跡量のシリカゲル
を除去するために重要でおる。（シリカゲル−メタノー
ル：クロロホルムを濾過の前に遠心分離することにより
大部分の粒子を除去することができ、濾過工程が促進さ
れる。） この時点で生成物およびその相対濃度を確認する最も迅
速な試験はジゴキシンに対するＲＩＡによるものである
。濾過した生成物を回転蒸発させ（×４）、生成物を少
量のメタノールに取シ入れることにより希釈液を調製し
、置換ジゴキシンの免疫反応性につき容易に試験された
。これが確認され、相対純度がめられると（、ｊＬＣに
よる）、次の工程はニトロを硫化した水素化ホウ素ナト
リウムの使用によシアミンに還元することであった。

生成物はＹがベンゼン残基、ＡがＮｏ２．Ｒが１５′　
−ジゴキシン残基である化合物ｌであった。

操作を続行する前に、カップリングしたジゴキシンを回
転蒸発によシ乾燥させ、反応器にパラ−ニトロフェニル
イソシアナト−ジゴキシンを入れる前にテトラヒト９０
フラン（Ｔ）（Ｆ’　）で１回洗浄ス−さきである。

ＮａＢＨ２Ｓ３　との反応はジオキサンまたはＴＨＦ中
で行うことができるが、置換されたジゴキシンの溶解性
の点でＴ）（Ｆ’が好ましい。窒素葵囲気を、■持する
ことは決定的ではないが、前記のようにＮａＢＨ２Ｓ　
３　を添加する前に容器をパージすべきである。

１００ｍＡ’容の丸底フラスコに上記ジゴキシン（ｌ１
ｍパラ−ニトロフェニルイソシアナト−ジゴキシン）お
よび撹拌棒を一定容積のＴＨＦに入れた（この場合もＴ
　ＨＥ”の容積を最小限にすべきである）。ガス抜き針
を用いてゴム膜を介して５分間窒素でパージした。

別個の容器にて乾燥後、さらに乾燥剤で乾燥させたＮａ
ＢＨ２Ｓ３を入れ、ＴＨＥ″２Ｏｖｔｌを添加し、完全
に浴ノｑイさぜ、ゴム膜を介して窒素でパージした。

５０ｍ１のガラス製注射器を用いて溶液を取出し、連＾
ンｄ的に撹拌しながらジゴキシンに徐々に添加し度に応
じてわずか数時間後に終了すべきである。

進１イ速度を増すために熱を用いることもできるが、わ
ずか３７°Ｃまでであシ、きわめて綿密に監視すべきで
ある。２５℃（室温）では反応はこれよシも若干緩慢に
進行するが、よシ制御しやすい。

この生成物はシリカゲルＴＬＣ（潤製用）またはシリカ
ゲルカラムによシ単離および精製し、メタノールで十分
に洗浄し、濾過し、保存のため乾燥させておくことがで
きる。あるいは後続の反応にはニトロ基は全く関与しな
いと思われるので、これをそれ以上精製することなくそ
のまま使１用し、後続の最終精製をこれらの生成物の精
製に利用することもできる。

ジゴキシンの相対濃度が確認されると（この場合もＲＩ
Ａによシ）、後続のパラーアミノフェニルインシアナト
ージコ゛キシンとの反応（ｒｉ、たとえばフルオレセイ
ンイノチオシアネ−１・の１史用により直接行うことが
できる。

置換ジコ゛キシン１００μモルを清浄な乾燥しまた２５
ｍ１答丸底フラスコに入れ、撹拌棒を入れた。注射器に
よりピリジン１０ｍｅを添加し、コ゛ム膜で１イ１じ０
１」記のように窒素でパージし、生成物が完全に溶解す
るまで撹拌した。

第２の丸底フラスコにフルオレセインインチオシアネ−
１−１（ｌ　Ｏμモルを添加し、ピリジン１０〜１５１
ｒＬｌＫ溶解した。ゴム膜で閉じ、Ｎ２　で・ξ−ジし
、ガラス製注射器で取出し、連続的に混合しながらジゴ
キシンに徐々に添加した。（フルオレセインインチオシ
アネートの性質のためこれは丸底フラスコおよび注射器
に付着するので、必ずしもすべての物質が移されるわけ
ではないであろう。しかし必要ならばのちに上記と同じ
方法で追加するととができる。） この反応は終了するのに約７２時間かかるであるう。こ
れは分析用ＴＬＣを採用すると新たな螢光種が出現する
ことによシ監視できる。

生成物の精製はその後の分析作業前に行わなければなら
ない。ＲＩＡ、および螢光を検出するように考案された
他の試験法はいずれも最終生成物の兎投反応性を証明す
るであろう。

最終生成物が単離されると、これをメタノールで十分に
抗浄し、数回ｐ過しく０２２μ）、乾燥剤によシ乾燥さ
せ、−３０°Ｃで乾燥剤下に保存した（冷凍）。

得られた生成物はＲが１５７−ジゴキシン残基、Ｚが−
Ｎ−Ｃ−Ｎ−Ｂ　；　Ｂがフルオレセイン残基そしてＹ
が２１１１Ｉ］のベンゼン残基である化合物■であった
。

実施例３ ２５ｍＪ容の丸底フラスコに１５’＝ｐ−アミノフェニ
ルイソシアナトージゴギノン（ジゴキシン）（実施例２
で製造したもの）　１００　ミｌ）モルを添加し、新た
に蒸留したピリジン５〜７ｍｌを添加し、完全に溶解す
るまで撹拌により溶）９年および混和した。丸底フラス
コにゴム膜で蓋をし、Ｎ２　で５分間パージした。

十分に換気された防護フード内でガラス製、−射器（清
浄でかつ十分に乾燥したもの）によシこのホスゲンａ　
１．　ｏ　ｏμｌを取出し、注射器から空気をすべて除
去し、このチオホスゲンｆ：ｍ　ｉＵ的に撹拌されてい
るジゴキシン溶液に３〜４分間にわたって徐々に添加し
た。反応器は直射光を遮断しなければならず（金属箔ま
たは＠）、少量を注射器によ、！ｌｌｌ取出すことによ
って監視すべきである。　ＩＲは２２５０ｃｍ−”にイ
ノチオシアネートの生成を示す・はずである。生成は誦
、速に進行し、通常は数時間内に終了するが、所望によ
勺−夜装置することもできる。

メタノールの添加によシ反応を停止し、メタノールで数
回洗浄し、回転蒸発によシ乾燥させた。

単離および精製はＴＬＣＫよジメタツール：クロロホル
ム（５０：　５０　）を用いて行うことができ、抽出に
よりパラ−イソチオシアナト−フェニルイノシアナト−
ジゴキシンを取出すことについては先きに述べた（調製
用シリカゲル、ＭｅＯＨ中への抽出、および０．２２μ
のフィルターによる沖過、乾燥、洸伊（３Ｘ　）および
保存のだめの乾燥）。

得られた生成物はＹが２１ｉ１［ｉのベンゼン残基；Ｒ
が１５’−ジコ゛キシン残基、そしてＡが−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ
である化合物１であった。

この化合物は単離および精製されるとさらに精製する必
要なしに数か月にわたって安定である。

保存条件を維持しなければならない（即ちこれらを乾燥
させ、−３０°Ｃで乾燥条件下に保存する）。

実施例４ １ｓ’−ハラ−イソチオ−シアナト−フェニルイソシア
ナト−ジゴキシンとＩ８１り素（アシド９ホズフアター
ゼ）との反応 反応容積を最小限に保ちながら、開放（または閉鎖）容
器に適量の酵素を入れ、乾燥させ、第１または第２アミ
ンを含まない塩基性の低分子緩衝液（たとえばｐＨ９，
５，０，５Ｍのホウ酸塩緩衝液が適切である）を最少容
積添加した。４℃で撹拌混和した。

希望する置換の程度（ジコ゛キシン：酵素）を割算し、
この量になるまで、酵素溶液の全容積の１０係以上では
ないジメチルホルムアミピ（ＤＭＦ）−４たはジメチル
スルホキシ）’（ＤＭＳＯ）を添加した。

溶解するまで混和した。

ピはットまたはこれに類する移しかえ用器具によシＤＭ
Ｆ’またはＤＭＳＯ中のジゴキシンを取出し、酵素を含
むｐＨ９，５の溶液にきわめて徐々に添加した。（１０
分程度かけるべきでりシ、受話は４°Ｃに保存するかま
たは氷上で保存して低温に保持して使用すべきである）
。ジゴキシン−酵素（破合体）を形成する反応は比軟重
速やかであり、通常は２４時間以内に終了する。生成物
は１（がジコ゛ギシン残基、Ｙが２価のベンゼン残基、
ＺｄＥ１ ＮＨ−Ｃ−ＮＨ−Ｂ　、そしてＢが酵素アシドホズフア
ターゼ残基である化合物りであった。

結合したジゴキシン−アシド９ホズフアターゼの精製は
多数の分離法のうちのいずれか（たとえばセファデック
ス、バイオゲルなと）を用いることによシ行われる。

上記の方法は一例であり、有機化合物が必要な活性水素
置換基をもつ限シ多種多様な有機化合物を互いにカップ
リングさせるために同様に使用できる。たとえば上記の
方法はジゴキシンまたはＴ４以外のリガンドをフルオレ
セイン色素および／または酵素以外の１機化合物にカン
プリングさせるのに使用できる。

本発明は、化合物■の使用によりある有機化合物と他の
ものが堅牢にカップリングしたカップリング生成物１を
製造しうるという点で特に有利である。これは、螢光ト
レーブーを製造するに際し、カップリングが堅牢である
ためリガンドに、よる、螢光化合物の消光が少なくなる
という点で有利である。たとえば螢光物質を、消光させ
る可能性のある重い原子（たとえばＴ３および／または
Ｔ４のヨウ素基）が螢光色素に与える影響が少なくなり
および／または除かれる。従って本発明は特に甲状腺ホ
ルモン（Ｔ３又はＴ４）が螢光化合物に結合した甲状腺
ホルモントレーサーの製造に用いられる。

以上の教示を考慮して本発明を種々に修正および変更す
ることができ、従って特許請求の範囲の記述の範囲内に
おいて本発明を以上に詳述した以外の様式で実施するこ
とができる。

特許出願人　ベクトン・デイツキンノン・アントゝカン
パニー （外５名）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）構造式１： ％式％（］） 〔式中Ｙは２価の芳香族炭化水素残基であシ；Ｒは少な
   くとも１個の活性水素置換基ｆ：有する有機残基であり
   、ここでＲは活性水素置換基を介してカップリングして
   おシ；そして −Ｎ＝Ｃ＝Ｓ；　−８Ｈ；　−ＯＨ；　−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ；
   　−８−６−Ｒ１１；および−〇−凸−Ｒ”　（これら
   においてＲ″はアルキル基である） よりなる群から選ばれる〕 を有する複合化合物。 （２１Ｍ　カ２　価のベンゼン残基である、特許請求の
   範囲第１項記載の化合物。 （３）Ｒがハプテンおよび抗原よシなる群から選ばれる
   リガントゝである、特許請求の範囲第１項または２項記
   載の化合物。 （４）Ａが−ＮＯ□である、特許請求の範囲第１項ない
   し３項のいずれかに記載の化合物。 （５）Ａが−ＮＨ２である、特許請求の範囲第１ホない
   し３項のいずれかに記載の化合物。 （６）Ａが−Ｎ＝Ｃ＝Ｓである、特許請求の範囲第１項
   ないし３項のいずれかに記載の化合物。 （７）Ａが−Ｎ＝Ｃ＝Ｏである、特許請求の範囲第１項
   ないし３項のいずれかに記載の化合物。 （８）Ｒがジゴキシン残基である、特許請求の範囲第１
   項ないし７項のいずれかに記載の化合物。 （９）ＲがＴ４　残基である、特許請求の範囲第１項な
   いし７項のいずれかに記載の化合物。 ００）Ｒが検出可能なマーカーである、特許請求の範［
   ｍ１項ないし７項のいずれかに記載の化合物。 ０υ　特許請求の範囲第１ないし１０項のいずれかに記
   載した式１の化合物を次式： Ｂ−Ｙｌｌ （式中、Ｙ“は水酸基、カルボキシル基、メルカプト基
   またはアミン基であり１Ｂは下記式■で与Ｒ−Ｃ−ＮＨ
   −Ｙ−Ｚ　（ｌ］） 〔式中Ｚは よりなる群から選ばれ； Ｂは壱１幾残基であシ； Ｒは少なくとも１個の活性水素置単基ヲ有する有１幾残
   基であり、ここでＲは該活性置換基を介してカップリン
   グしておシ；そして Ｙは２価の芳香族炭化水素残基である〕を有する化合物
   。 α２）ＲおよびＢの一方が検出可能なマーカーであり、
   ＲおよびＢの他方が抗原、ハプテンおよび抗体よシなる
   群から選ばれるリガントゝである、特許請求の範囲第１
   １項記載の化合物。 ０３）Ｂが検出可能なマーカーである、特許請求の範囲
   第１１項記載の化合物。 ０（イ）マーカーが螢光色素である、特許請求の範囲第
   １２項記載の化合物。 （１５）　マーカーがフルオレセイン色素である、特許
   請求の範囲第１２項記載の化合物。 α６）トレーサーを使用する被分析体のアッセイにおい
   て、トレーサーとして特許請求の範囲第１２項ないし１
   ５項のいずれかに記載の化合物を使用することを特徴と
   するアッセイ方法。