JPH0758290B2 - 堅牢なカップリング化合物の中間体 - Google Patents

堅牢なカップリング化合物の中間体

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JPH0758290B2
JPH0758290B2 JP2035044A JP3504490A JPH0758290B2 JP H0758290 B2 JPH0758290 B2 JP H0758290B2 JP 2035044 A JP2035044 A JP 2035044A JP 3504490 A JP3504490 A JP 3504490A JP H0758290 B2 JPH0758290 B2 JP H0758290B2
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compound
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digoxin
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coupled
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スチーブン・ディー・アレン
マイケル・トンプソン
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ベクトン・ディッキンソン・アンド・カンパニー
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は有用なリガンド及び／又はマーカーを含むカッ
プリングした化合物を製造するために有用な中間体化合
物に関する。
カップリング試薬またはスペーサー化合物は、ある有機
物質を他にカップリングさせるために用いられる一般に
二官能性の化合物である。たとえばイムノアッセイなど
のアッセイにおいては、アッセイの成分の一方はリガン
ドからなるトレーサー；たとえば適切なマーカー（例え
ば蛍光色素のような色原体）にカップリングした抗原で
ある。この種のトレーサーを製造する際には、多くの場
合抗原を二官能性のカップリング剤またはスペーサーの
使用により蛍光色素にカップリングさせる。
同様に固体支持体を用いるイムノアッセイにおいては、
アッセイに用いられる物質（たとえば抗体）を固体支持
体（たとえばポリマー）にカップリングさせる必要があ
り、ある場合にはこれはカップリング剤の使用により達
成される。
当技術分野においては、ある物質をカップリング剤また
はスペーサー化合物を介して他にカップリングさせるた
めの改良された手段が求められている。
本発明の一観点によれば、ある物質を他にカップリング
させるための中間体が提供される。
より詳細には、本発明の一観点によればカップリングし
た化合物の製造に有用な中間体であって、下記の構造
式： （式中、Ｙは２価の芳香炭化水素残基であり;Rは蛍光色
素及び酵素から選ばれる検出可能なマーカー又は抗原、
ハプテン及び抗体からなる群から選ばれるリガンドであ
り、及びＡは−NO2、−NH2、−COOH、−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ、−
SH、−OH、−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ、 （式中、Ｒ″はアルキル基である）よりなる群から選ば
れる）を有する中間体が提供される。
本発明の中間体を用いると下記の 構造式II: よりなる群から選ばれ;Yは２価の芳香族炭化水素残基で
あり；及びＲ及びＢの一方は蛍光色素及び酵素から選ば
れる検出可能なマーカーであり、Ｒ及びＢの他方が抗
原、ハプテン及び抗体からなる群から選ばれるリガンド
である）を有する化合物を製造することができる。
本発明の特に好ましい実施態様によれば、前記の各構造
式においてＹは２価のベンゼン残基である。ただしＹは
２価のナフタリン残基または２価のジフエニル残基であ
りうるとも解すべきである。
中間体（１）は構造式（III）： Ｏ＝Ｃ＝Ｎ−Ｙ−Ｒ′ （III） （式中Ｒ′は−NO2；−COOR″； であり、 Ｒ″およびＹは定義されたものである） により表わされる化合物から製造できる。
Ｒ′は一般にパラ位またはメタ位にあり、好ましくはパ
ラ位にあり、Ｒ′は最も好ましくは−NO2である。
化合物IIIにおいてＲ′がNO2である場合、化合物IIIを
まずイソシアネート基と反応性である活性水素置換基を
有するマーカーまたはリガンドとカップリングさせて、
Ａが−NO2である式Ｉの化合物を製造する。次いでこの
−NO2基を選択的に還元してアミノ基となし（硫化され
た水素化ホウ素ナトリウムの使用）、他のマーカーまた
はリガンドにカップリングさせるための反応性基を与え
ることができる。あるいはアミノ基をイソシアネート基
（ホスゲンとの反応）またはイソチオシアネート基（チ
オホスゲンとの反応）に変えることができる。これらの
いずれも中間体１をマーカー又はリガンドにカップリン
グさせるための反応性を有する。
化合物IIIにおいてＲ′が−COOR″、 である場合、化合物IIIをイソシアネート置換基を介し
てマーカーまたはリガンドにカップリングさせたのち、
置換基Ｒ′は加水分解して置換基Ａ（それぞれ−COOH、
−SHまたは−OHであり、これらはそれぞれ中間体１をマ
ーカーまたはリガンドにカップリングさせるための反応
性を有する）にすることができる。
従って明らかなとおり、化合物IIIはこれがそのイソシ
アネート基を介してカップリングすべきマーカーまたは
リガンドの活性水素置換基と反応性でない置換基Ｒ′を
含むべく選ばれる。次いでＲ′を、中間体１がそれとカ
ップリングしてカップリングした化合物IIを形成するマ
ーカーまたはリガンドの活性水素置換基と反応性である
置換基Ａに変える。
構造式Ｉで表わされる化合物は、構造式IIで表わされる
カップリングした化合物の製造に用いることができる。
構造式Ｉで表わされる化合物を使用する際には、Ａで表
わされる置換基は構造式Ｉにより表わされる化合物をカ
ップリングさせるべき化合物の活性水素置換基と反応し
うるものである。たとえばＡがアミノ基である場合、化
合物Ｉを当技術分野で一般に知られている方法により、
カルボキシル置換基を有するマーカーまたはリガンドと
カップリングさせることができる。同様にＡがカルボキ
シル基である場合、化合物Ｉを当技術分野で知られてい
る方法により、アミノ置換基またはイソシアネート置換
基を有する有機化合物とカップリングさせることができ
る。Ａがイソシアネート基である場合、化合物Ｉを活性
水素置換基（メルカプト（チオール）基、水酸基、カル
ボキシル基またはアミノ基である）を有するマーカーま
たはリガンドにカップリングさせることができる。Ａが
チオール基または水酸基である場合、化合物Ｉを活性水
素置換基（イソシアネート）を有するマーカーまたはリ
ガンドにカップリングさせることができる。Ａがイソチ
オシアネート基である場合、化合物Ｉをアミノ置換基を
有するマーカーまたはリガンドとカップリングさせるこ
とができる。この種のカップリングをこの種の官能基を
介して行う方法は、当技術分野で一般に知られている。
カップリング剤IIIは多種多様な有機物質を互いにカッ
プリングさせるために使用できる。たとえばトレーサー
が検出可能なマーカー；たとえばリガンド（ここで用い
られる“リガンド”という語はハプテン、抗原または抗
体を意味する）にカップリングした放射性マーカー、色
原体、酵素などからなるアッセイに使用すべきトレーサ
ーの製造にカップリング化合物IIIを用いることができ
る。この種の実施態様においてマーカーまたはリガンド
の一方には、イソシアネート基と反応しうる置換基が含
まれ、カップリング剤IIIの置換基Ｒ′はそのリガンド
またはマーカーの置換基と非反応性である。カップリン
グ剤IIIをリガンドまたはマーカーとカップリングさせ
たのち、置換基Ａが、最初にカップリングして中間体１
を生成したリガンドまたはマーカー上にある活性水素置
換基と非反応性である中間化合物Ｉが製造される。次い
で中間化合物Ｉをマーカーまたはリガンドの他方とカッ
プリングさせる。中間体Ｉの置換基Ａがリガンドまたは
マーカーの他方にある活性水素置換基と反応でない場合
は、置換基Ａを先に定義したようにリガンドまたはマー
カーの他方にある活性水素置換基と反応性である置換基
に選択的に変換する。次いでこの中間体１をリガンドま
たはマーカーの他方とカップリングさせてカップリング
した化合物IIを製造する。
たとえばアッセイに使用するトレーサーを製造する際
に、カップリング化合物IIにおいてＲおよびＢの一方が
マーカー、たとえば色原体、放射性置換基を含む有機化
合物または酵素であり、ＲおよびＢの他方がリガンドで
ある。たとえば蛍光トレーサーを製造する際にはＲおよ
びＢの一方がイソシアネート基または構造式Ｉ中のＡに
より表わされる反応性官能基の一つにカップリングしう
る置換基を有する蛍光色素から誘導され、ＲおよびＢの
他方がイソシアネート基または構造式ＩにおいてＡで表
わされる反応性置換基の他方にカップリングしうる置換
基を有するリガンドから誘導される。この種のトレーサ
ーを導入する際には、リガンドまたは蛍光色素をまずカ
ップリング試薬IIIのイソシアネート官能基にカップリ
ングさせる。
本発明者らは、式IIIで表わされるカップリング剤を使
用することは、カップリング剤が堅牢であり、このため
蛍光マーカーがリガンド上に“折り”返ることがなく、
従ってリガンドにより蛍光化合物が消光される可能性が
最小限に抑えられる点で、蛍光トレーサーの製造に特に
有利であることを見出した。
適切な色原体の代表例として、以下のものが挙げられ
る。アクリジン色素、アズレ（azure）色素、キノン色
素、ナイルブルー、クレジルバイオレット、フルオレセ
イン類、ローダミン類、クマリン類、アミノナフタリン
誘導体（ダンシル化合物）、カルボシアニン類、インド
ール類、ランタニドキレート類など。
たとえばT4トレーサーは、まずｐ−ニトロフエニルイソ
シアネートをT4のカルボキシル部分が適宜ブロックされ
たチロキシン（T4）にカップリングさせることにより製
造できる。ニトロ基を還元してアミノ基（化合物１、Ｒ
はブロックされたT4残基であり、Ｙはベンゼン残基、Ａ
はアミノ基である）となし、化合物１のアミノ部分をた
とえばイソチオシアネート基を含む蛍光色素（特にフル
オレセインイソチオシアネート）にカップリングさせる
ことができる。
あるいは化合物１のアミノ基をチオホスゲンとの反応に
よりイソチオシアネート基に変え（化合物ＩにおいてＡ
がイソチオシアネート基）、次いで化合物Ｉをアミノ基
含有蛍光色素（特にフルオレセインアミン）と反応させ
ることができる。
同様にジゴキシントレーサーは、ジゴキシンをｐ−ニト
ロフエニルイソシアネートとカップリングさせたのちニ
トロ基を還元してアミノ基となし、そして蛍光色素、た
とえばフルオレセインイソチアシアネートと反応させる
ことにより製造できる。
本発明は前記のように蛍光トレーサーの製造に特に用い
られるが、本発明は他のトレーサー、たとえば放射性ト
レーサー、酵素トレーサーなどの製造にも用いられる。
放射性トレーサーを製造するための適切な放射性マーカ
ーの代表例としては、以下のものが挙げられる：ヒドロ
キシフエニル置換されたアミンまたはアミノ酸。これら
においてフエニル基には放射性置換基１個または２個以
上が含まれていてもよい。たとえば放射性ヨウ素化され
たチロシンまたはチラミン；イミダゾール基が放射性置
換基１個または２個以上により置換されたイミダゾール
置換アミノ酸またはアミン等。
適切な酵素マーカーの代表例としては以下のものが挙げ
られる：パーオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ア
セチルコリンエステラーゼ、グルコアミラーゼ、マレイ
ン酸デヒロドゲナーゼ、グルコース−６−リン酸デヒド
ロゲナーゼ、グルタルオキシダーゼ、アシドホスフアタ
ーゼなど。
当技術分野で知られるように、固体支持体はポリマーで
あってもよい。ただしそのようなボリマーにはイソシア
ネート官能基または中間体ＩのＡにより表わされる反応
性置換基の１つと反応しうる置換基が含まれる必要があ
る。たとえばポリアクリルアミド、ポリ（アミノスチレ
ン）など。
本発明により製造されるトレーサーおよび支持体上にリ
ガンドは、当技術分野で一般に知られている型の多種多
様な被分析体（“被分析体（analyte）”という語はハ
プテン、抗原または抗体を表わす）のアッセイに使用で
きる。たとえば本発明は治療薬およびいわゆる“麻薬
（drugs of abuse）”を含む薬剤；ステロイド、ビタミ
ン、糖、アミノ酸、ポリペプチド、蛋白質、各種ホルモ
ン、抗生物質、ウイルスなどのアッセイに使用できる。
本発明により製造されるトレーサーおよび支持体上のリ
ガンドはイムノアッセイ（“イムノアッセイ”という語
は総称的に用いられ、抗原または抗体の代わりに天然の
結合剤を使用し、時に競合蛋白質結合アッセイと呼ばれ
るアッセイを含む）に使用でき、当技術分野で知られる
ようにアッセイの成分の一つは結合剤である。被分析体
はハプテンまたは抗原である場合、結合剤は抗体、また
は被分析体に特異的な結合部位１個または２個以上をも
つ天然物質であり、被分析体が抗体である場合、結合剤
は抗体に対する抗原または被分析体に呼応して誘発され
た抗体であろう。適切な結合剤の選択は当業者がなしう
る範囲内にあると考えられ、本発明を十分に理解するた
めにこの点に関してこれ以上詳述する必要はないと思わ
れる。
アッセイに際して、アッセイに用いられるトレーサーの
リガンド部分は採用されるアッセイの型により定められ
る。たとえばアッセイが抗原またはハプテンである被分
析体に関するものである場合、トレーサーのリガンド部
分はアッセイすべき抗原もしくはハプテンまたはそれら
の適宜な同族体である（“適宜な同族体”という語はア
ッセイに用いられる結合剤に結合した被分析体の同族体
を意味する）。あるいはトレーサーのリガンド部分がア
ッセイすべきハプテンまたは抗原に対する結合剤であっ
てもよく、この場合アッセイはトレーサーがそのトレー
サーに特異的な結合部位に結合するのを被分析体が阻止
するように工夫される。
被分析体が抗体である場合、トレーサーのリガンド部分
は抗体またはその適宜な同族体であり、この場合抗体お
よびトレーサーの双方が被分析抗体およびトレーサーの
双方に対して特異的な限られた数の結合部位に関して競
合するであろう。あるいはトレーサーのリガンド部分
は、被分析抗体に対する抗原または被分析抗体に呼応し
て誘発された抗体であってもよい。この場合、被分析抗
体はトレーサーがそのトレーサーに対し特異的な結合部
位に結合するのを阻止する。
被分析体をいわゆる“サンドイッチ型”のアッセイによ
り決定する場合には、トレーサーのリガンド部分が被分
析体に特異的あ結合部位をもち、被分析体は複数の決定
部位をもつ。
トレーサーのリガンド部分として用いられる適切なリガ
ンドの選択は本明細書の教示から当業者がなしうる範囲
のものと考えられ、従って本発明を十分に理解するため
にこの点に関してこれ以上詳述する必要はないと思われ
る。
本発明のカップリング剤は治療薬を抗体（特にモノクロ
ーン抗体）にカップリングさせるためにも使用できる。
この場合、カップリングした化合物IIにおいてＲは治療
薬から誘導され、Ｂは抗体から誘導される。
従って上記の記述から明らかなように、カップリングし
た化合物IIは多種多様なマーカーまたはリガンドから製
造でき、化合物IIにおいてＲにり表わされる有機残基は
あるマーカーまたはリガンドから誘道され、カップリン
グした化合物IIにおいてＢにより表わされる有機残基は
他のマーカーまたはリガンドから誘導される。ただし各
マーカーまたはリガンドはガップリング剤III中の適宜
な置換基（イソシアネート）または構造式ＩにおいてＡ
により表わされる適宜な反応性置換基と反応するための
適宜な活性水素置換基を含む。たとえばカップリングし
た化合物IIにおいてＲはイソシアネート基と反応しうる
活性水素置換基を含むマーカーまたはリガンドから誘導
される有機残基であってもよく、そのマーカーは放射置
換基された有機化合物、色原体、好ましくは蛍光色素、
酵素であって良くまたはリガンドは特に非蛋白性抗原も
しくは非蛋白性ハプテン、固体支持体、たまたは治療薬
（特に医薬）であってもよい。同様にＢは中間体Ｉにお
いてＡにより表わされる反応性置換基の１つと反応しう
る活性水素置換基を含むマーカーまたはリガンドから誘
導される有機残基であってもよい。たとえばＢは蛋白
質、抗体、ハプテン、抗原、色原体（色素、好ましくは
蛍光色素）、酵素、放射性置換基を有する有機化合物ポ
リマーなどのマーカーまたはリガンドから誘導される有
機残基であってもよい。
本発明を以下の実施例に関連してさらに記述するが、こ
れにより本発明の範囲が限定されるべきではない。
実施例１ 塩化トリメチルシリル（TMS-Cl）2.1ミリモルをT4１ミ
リモルおよび再蒸留ピリジンに添加した。反応は約２時
間を要し、ほぼ定量的であった。反応後、ｐ−ニトロフ
エニルイソシアネート1.1モルを反応混合物に注入添加
し、混合物を磁気攪拌棒を用いて約48時間攪拌し、少量
の試料を薬４時間毎にTLC（薄層クロマトグラフィー）
による分析のため取出した。48時間後に生成物を未反応
イソシアネートの除去のためメタノールで十分に洗浄
し、次いでTLCもしくは高圧液体クロマトグラフィー（H
PLC）によりまたはカラムクロマトグラフィーにより生
成物を分離した。得られた生成物はT4のカルボキシル官
能基がトリメチルシラン（TMS）でブロックされたパラ
ーニトロフエニルイソシアネート−T4であった。
上記の反応は常温常圧（STP）で行われた。
硫化された水素化ホウ素ナトリウム0.55ミリモル（使用
したT4の濃度に対して過剰量を生成物0.5ミリモルに室
内の温度および圧力で添加することによりニトロ基を還
元した。反応は約３〜４時間混合して完了し、IRにより
ニトロからアミンへの変換を監視することにより行われ
た。得られた生成物はパラ−アミノフエニルイソシアナ
ト−T4であった。
上記生成物に１モル当量のイソチオシアナト−フルオレ
セインを添加したのち約48〜72時間攪拌し、TLCまたはH
PLCにより監視した。フルオレセイン色素をT4カップリ
ングした中間体にカップリングさせたのちブロック剤TM
Sを水性条件下で除去した。
得られた生成物はフルオレセインイソチオシアネートが
堅牢なカップリング剤を介してT4にカップリングした蛍
光トレーサーであり、このトレーサーはT4のアッセイに
使用できる。
実施例２ ジゴキシン蛍光トレーサーの製造 100ml容の丸底フラスコにジゴキシン１ミリモルおよび
攪拌棒を入れた。開口にゴム膜をはり、ガス抜き針を用
いて徐々に丸底フラスコを窒素で５分間パージした。長
い18ゲージのステンレス綱製の針を備えた50mlのガラス
製注射器に新たに蒸留したピリジン30mlを取り、ゴム膜
を介して丸底フラスコに最初は徐々に注入し、15〜20ml
が注入されたのち攪拌を加えた。残りの10〜15mlは丸底
フラスコの側面を洗い落としてジゴキシンを溶解するの
に使用した。再びガス抜き針を用いて容器を窒素で約５
分間パージした。ジゴキシンがすべて溶解して完全な溶
液になるまで攪拌混合を続けた。
別個の容器（好ましくは閉じた丸底フラスコ）にパラー
ニトロフエニルイソシアネート1.1ミリモル（あらかじ
め乾燥したもの）をとり、ピリジン15mlを注入により添
加し、前記のように閉鎖容器を窒素で混和パージし、す
べての物質が溶液となった時点で注射により取出し、攪
拌を続けながら徐々にジゴキシンを入れた100ml容丸底
フラスコに添加した。
注釈:1） 作業はすべて防護フード内で行うべきであ
る。
２） パラーニトーフエニルイソシアネートは使用前に
常にIRで検査すべきである。貯蔵期間および露光により
このイソシアネートが著しく影響を受ける可能性があ
る。ロット毎にイソシアネートの存在を調べるべきであ
る。
TLC用試料は注射器により取出すべきでありTLCによる監
視はパラ−ニトロフエニルイソシアネートを添加した２
時間後に開始すべきである。第１日目については２〜４
時間毎にスポットを検査し、一夜置いた場合はTLCをま
ず朝一番に行うべきである。
反応は終了するまで約72時間かかった。（48時間後に主
生成物は実質的に形成されていたが−75％終了）。これ
よりも長時間置くと目的生成物の増加は認められるが、
これは付加的な副生物が匹敵するかまたはより大きな割
合で生じるという犠牲においてなされる。可能な限り最
良の結果が得られたことを確認するため、目的生成物の
精製（および単離）をここで行うべきである。
この生成物の精製は調製用TLCにより行われ、１日で行
うことができるが、プレートに過剰負荷しないように注
意しなければならない。さもなければバンドが重複する
おそれがある。シリカゲルからメタノール：クロロホル
ムを用いて抽出する際、溶液を0.22μのフィルターを介
して回転蒸発用の丸底フラスコ中へ濾過するとよい。濾
過はジゴキシンに対するイソシアネート（結合）形成を
破壊する可能性がある痕跡量のシリカゲルを除去するた
めに重要である。（シリカゲル−メタノール：クロロホ
ルムを濾過の前に遠心分離することにより大部分の粒子
を除去することができ、濾過工程が促進される。） この時点で生成物およびその相対濃度を確認する最も迅
速な試験はジゴキシンに対するRIAによるものである。
濾過した生成物を回転蒸発させ（×４）、生成物を少量
のメタノールに取り入れることにより稀釈液を調製し、
置換イゴキシンの免疫反応性につき容易に試験された。
これが確認され、相対純度が求められると（TLCによ
る）、次の工程はニトロを硫化した水素化ホウ素ナトリ
ウムの使用によりアミンに還元することであった。
生成物はＹがベンゼン残基、ＡがNO2、Ｒが15′−ジゴ
キシン残基である化合物Ｉであった。
操作を続行する前に、カップリングしたジゴキシンを回
転蒸発により乾燥させ、反応器にパラ−ニトロフエニル
イソシアナト−ジゴキシンを入れる前にテトラヒドロフ
ラン（THF）で１回洗浄すべきである。
NaBH2S3との反応はジオキサンまたはTHF中で行うことが
できるが、置換されたジゴキシンの溶解性の点でTHFが
好ましい。窒素雰囲気を維持することは決定的ではない
が、前記のようにNaBH2S3を添加する前に容器をパージ
すべきである。
100ml容の丸底フラスコに上記ジゴキシン（置換パラ−
ニトロフエニルイソシアナト−ジゴキシン）おおび攪拌
棒を一定容積のTHFに入れた（この場合もTHFの容積を最
小限にすべきである）。ガス抜き針を用いてゴム膜を介
して５分間窒素でパージした。
別個の容器にて乾燥後、さらに乾燥剤で乾燥させたNaBH
2S3を入れ、THF20mlを添加し、完全に溶解させ、ゴム膜
を介して窒素でパージした。
50mlのガラス製注射器を用いて溶液を取出し、連続的に
攪拌しながらジゴキシンに徐々に添加した。反応速度は
IRにより追跡することができ（NO2→NH2への変換）、反
応はジゴキシンの濃度に応じてわずか数時間後に終了す
べきである。進行速度を増すために熱を用いることもで
きるが、わずか37℃までであり、きわめて綿密に監視す
べきである。25℃（室温）では反応はこれよりも若干緩
慢に進行するが、より制御しやすい。
この生成物はシリカゲルTLC（調製用）またはシリカゲ
ルカラムにより単離および精製し、メタノールで十分に
洗浄し、濾過し、保存のため乾燥させておくことができ
る。あるいは後続の反応にはニトロ基は全く関与しない
と思われるので、これをそれ以上精製することなくその
まま使用し、後続の最終精製をこれらの生成物の精製に
利用することもできる。
ジゴキシンの相対濃度が確認されると（この場合もRIA
により）、後続のパラ−アミノフエニルイソアナト−ジ
ゴキシンとの反応は、たとえばフルオレセインイソチオ
シアネートの使用により直接行うことができる。
置換ジゴキシン100μモルを清浄な乾燥した25ml容丸底
フラスコに入れ、攪拌棒を入れた。注射器によりピリジ
ン10mlを添加し、ゴム膜で閉じ前記のように窒素でパー
ジし、生成物が完全に溶解するまで攪拌した。
第２の丸底フラスコにフルオレセインイソチオシアネー
ト100μモルを添加し、ピリジン10〜15mlに溶解した。
ゴム膜で閉じ、N2でパージし、ガラス製注射器で取出
し、連続的に混合しながらジゴキシンに徐々に添加し
た。（フルオレセインイソチオシアネートの性質のため
これは丸底フラスコおよび注射器に付着するので、必ず
しもすべての物質が移されるわけではないであろう。し
かし必要ならばのちに上記と同じ方法で追加することが
できる。） この反応は終了するのに約72時間かかるであろう。これ
は分析用TLCを採用すると新たな蛍光種が出現すること
により監視できる。
生成物の精製はその後の分析作業前に行わなければなら
ない。RIA、および蛍光を検出するように考案された他
の試験法はいずれも最終生成物の免疫反応性を証明する
であろう。
最終生成物が単離されると、これをメタノールで十分に
洗浄し、数回濾過し（0.22μ）、乾燥剤により乾燥さ
せ、−30℃で乾燥剤下に保存した（冷凍）。
得られた生成物はＲが15′−ジゴキシン残基、 Ｚが がフルオレセイン残基そしてＹが２価のベンゼン残基で
ある化合物IIであった。
実施例３ 25ml容の丸底フラスコに15′−ｐ−アミノフエニルイソ
シアナト−ジゴキシン（ジゴキシン）（実施例２で製造
したもの）100ミリモルを添加し、新たに蒸留したピリ
ジン５〜7mlを添加し、完全に溶解するまで攪拌により
溶解および混和した。丸底フラスコにゴム膜で蓋をし、
N2で５分間パージした。
十分に換気された防護フード内でガラス製注射器（洗浄
でかつ十分に乾燥したもの）によりこのホスゲン液100
μｌを取出し、注射器から空気をすべて除去し、このチ
オホスゲンを連続的に攪拌されているジゴキシン溶液に
３〜４分間にわたって徐々に添加した。反応器は直射光
を遮断しなければならず（金属箔または箱）、少量を注
射器により取出すことによって監視すべきである。IRは
2250cm-1にイソチオシアネートの生成を示すはずであ
る。生成は急速に進行し、通常は数時間内に終了する
が、所望により一夜放置することもできる。
メタノールの添加により反応を停止し、メタノールで数
回洗浄し、回転蒸発により乾燥させた。
単離および精製はTLCによりメタノール：クロロホルム
（50:50）を用いて行うことができ、抽出によりパラ−
イソチオシアナト−フエニルイソシアナト−ジゴキシン
を取出すことについては先に述べた（調製用シリカゲ
ル、MeOH中への抽出、および0.22μのフィルターによる
濾過、乾燥、洗浄（３×）および保存のための乾燥）。
得られた生成物はＹが２価のベンゼン残基;Rが15′−ジ
ゴキシン残基、そしてＡが−Ｎ＝Ｃ＝Ｓである化合物Ｉ
であった。
この化合物は単離および精製されるとさらに精製する必
要なしに数か月にわたって安定である。保存条件を維持
しなければならない（即ちこれらを乾燥させ、−30℃で
乾燥条件下に保存する）。
実施例４ 15′−パラ−イソチオシアナト−フエニルイソシアナト
−ジゴキシンと酵素（アシドホスフアターゼ）との反応 反応容積を最小限に保ちながら、解放（または閉鎖）容
器に適量の酵素を入れ、乾燥させ、第１または第２アミ
ンを含まない塩基性の低分子緩衝液（たとえばpH9.5、
0.5Mのホウ酸塩緩衝液が適切である）を最少容積添加し
た。４℃で攪拌混和した。
希望する置換の程度（ジゴキシン：酵素）を計算し、こ
の量になるまで、酵素溶液の全容積の10％以上ではない
ジメチルホルムアミド（DMF）またはジメチルスルホキ
シド（DMSO）を添加した。溶解するまで混和した。
ピペットまたはこれに類する移しかえ用器具によりDMF
またはDMSO中のジゴキシンを取出し、酵素を含むpH9.5
の溶液にきわめて徐々に添加した。（10分程度かけるべ
きであり、受器は４℃に保存するかまたは氷上で保存し
て低温に保持して使用すべきである）。ジゴキシン−酵
素（複合体）を形成する反応は比較的速やかであり、通
常は24時間以内に終了する。生成物はＲがジゴキシン残
基、Ｙが２価のベンゼン残基、Ｚが そしてＢが酵素アシドホスフアクターゼ残基である化合
物IIであった。
結合したジゴキシン−アシドホスフアターゼの精製は多
数の分離法のうちのいずれか（たとえばセフアデック
ス、バイオゲルなど）を用いることにより行われる。
上記の方法は一例であり、有機化合物が必要な活性水素
置換基をもつ限り多種多様な有機化合物を互いにカップ
リングさせるために同様に使用できる。たとえば上記の
方法はジゴキシンまたはT4以外のリガンドをフルオレセ
イン色素および／または酵素以外の有機化合物にカップ
リングさせるのに使用できる。
本発明は、化合物IIIの使用によりある有機化合物と他
のものが堅牢にカップリングしたカップリング生成物II
を製造しうるという点で特に有利である。これは、蛍光
トレーサーを製造するに際し、カップリングが堅牢であ
るためリガンドによる蛍光化合物の消光が少なくなると
いう点で有利である。たとえば蛍光物質を、消光させる
可能性のある重い原子（たとえばT3および／またはT4の
ヨウ素基）が蛍光色素に与える影響が少なくなりおよび
／または除かれる。従って本発明は特に甲状腺ホルモン
（T3又はT4）が蛍光化合物に結合した甲状腺ホルモント
レーサーの製造に用いられる。
以上の教示を考慮して本発明を種々に修正および変更す
ることができ、従って特許請求の範囲の記述の範囲内に
おいて本発明を以上に詳述した以外の様式で実施するこ
とができる。

Claims (9)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】構造式I: （式中、Ｙは２価の芳香族炭化水素残基であり;Rは少な
    くとも１個の活性水素置換基を有する有機残基であり、
    かつ、蛍光色素及び酵素から選ばれる検出可能なマーカ
    ー又は抗原、ハプテン及び抗体からなる群から選ばれる
    リガンドであり；そしてＡは−NO2、−NH2、−COOH、−
    Ｎ＝Ｃ＝Ｓ、−SH、−OH、−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ、 （式中、Ｒ″はアルキル基である）よりなる群から選ば
    れる）を有する化合物。
  2. 【請求項２】Ｙが２価のベンゼン残基である、特許請求
    の範囲第１項記載の化合物。
  3. 【請求項３】Ａが−NO2である、特許請求の範囲第１項
    または第２項記載の化合物。
  4. 【請求項４】Ａが−NH2である、特許請求の範囲第１項
    または第２項記載の化合物。
  5. 【請求項５】Ａが−Ｎ＝Ｃ＝Ｓである、特許請求の範囲
    第１項または第２項記載の化合物。
  6. 【請求項６】Ａが−Ｎ＝Ｃ＝Ｏである、特許請求の範囲
    第１項または第２項記載の化合物。
  7. 【請求項７】Ｒがジゴキシン残基である、特許請求の範
    囲第１項ないし第６項のいずれか１項に記載の化合物。
  8. 【請求項８】ＲがT4である、特許請求の範囲第１項ない
    し第６項のいずれか１項に記載の化合物。
  9. 【請求項９】Ｒが検出可能なマーカーである、特許請求
    の範囲第１項ないし第６項のいずれか１項に記載の化合
    物。
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Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5622871A (en) 1987-04-27 1997-04-22 Unilever Patent Holdings B.V. Capillary immunoassay and device therefor comprising mobilizable particulate labelled reagents
US4698315A (en) * 1985-04-22 1987-10-06 Hoffmann-La Roche Inc. Method and kit for determining total digoxin levels involving agent to dissociate digoxin-protein complex
US4680338A (en) * 1985-10-17 1987-07-14 Immunomedics, Inc. Bifunctional linker
EP1248112A3 (en) 1987-04-27 2004-08-25 Inverness Medical Switzerland GmbH Immunochromatographic specific binding assay device
JPH0776236B2 (ja) * 1988-04-13 1995-08-16 富士写真フイルム株式会社 蛋白質修飾物
JPH0776237B2 (ja) * 1988-09-13 1995-08-16 富士写真フイルム株式会社 蛋白質修飾物
US6352862B1 (en) 1989-02-17 2002-03-05 Unilever Patent Holdings B.V. Analytical test device for imuno assays and methods of using same
US5661040A (en) * 1993-07-13 1997-08-26 Abbott Laboratories Fluorescent polymer labeled conjugates and intermediates
DE4438660A1 (de) * 1994-10-28 1996-05-02 Boehringer Mannheim Gmbh Biolumineszenzmarkierte Hapten-Konjugate für den Einsatz in kompetitiven Immunoassays

Family Cites Families (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE899192C (de) * 1944-02-15 1953-12-10 Bayer Ag Verfahren zur Herstellung von ungesaettigten Isocyanten
US3081310A (en) * 1956-12-24 1963-03-12 Searle & Co Bis(aminoalkylcarbamates)
US3036112A (en) * 1959-09-15 1962-05-22 Union Carbide Corp Bis(cyanoalkyl) phenylenedicarbamates
CH436207A (de) * 1965-03-02 1967-11-15 Ciba Geigy Verfahren zum antimikrobiellen Ausrüsten und Schützen von Textilien gegen schädliche Mikroorganismen
GB1179231A (en) * 1966-02-05 1970-01-28 Honeywill Atlas Ltd Surface Active Urethanes
BE756287A (fr) * 1969-09-17 1971-03-17 Hoechst Ag Produits de polyaddition d'ethylene-imines utilisables pour l'appretagede textiles
US3783151A (en) * 1971-03-23 1974-01-01 Sun Chemical Corp Isocyanate-modified esters
GB1315871A (en) * 1971-05-19 1973-05-02 Mon Anto Co Carbanilates thio-carbanilates and compositions containing them
US3979426A (en) * 1971-08-12 1976-09-07 Ppg Industries, Inc. Radiation-sensitive diacrylates
GB1417618A (en) * 1973-04-03 1975-12-10 Ici Ltd Surface active urethanes
US3925355A (en) * 1974-03-01 1975-12-09 Corning Glass Works Labelled digoxin derivatives for radioimmunoassay
GB1471755A (en) * 1974-06-20 1977-04-27 Radiochemical Centre Ltd Derivatives of digoxin and digotoxin
US4007089A (en) * 1975-04-30 1977-02-08 Nelson Research & Development Company Method for binding biologically active compounds
CA1083508A (fr) * 1975-11-13 1980-08-12 Jacques Grange Supports porteurs de chaines laterales, procedes d'obtention de ces supports, procedes de fixation de composes organiques comportant un residu glucidique sur lesdits supports, produits et reactifs resultant de ladite fixation chimique
DE2609614A1 (de) * 1976-03-09 1977-09-15 Hermann Guenther Neues immunadsorbens, verfahren zu seiner herstellung und seine verwendung
US4115539A (en) * 1976-05-17 1978-09-19 Union Carbide Corporation Analytical or clinical derivatives, tagged derivatives and methods of analysis using such derivatives
JPS53119873A (en) * 1977-03-28 1978-10-19 Rohm & Haas Digoxigenin derivative
US4152411A (en) * 1977-07-27 1979-05-01 Akzona Incorporated High specific activity labeled substances
CA1119163A (en) * 1977-09-01 1982-03-02 Ravi K. Varma Digoxigenin derivatives
US4286964A (en) * 1979-10-12 1981-09-01 Seed Brian S Polyfunctional epoxides and halohydrins used as bridging groups to bind aromatic amine group-containing alcohols and thiols to hydroxyl bearing substrates
FI71845C (fi) * 1979-12-18 1987-02-09 Vickers Ltd Foerbaettringar angaoende straolningskaensliga material.
DE3110573A1 (de) * 1981-03-18 1982-10-21 Bayer Ag, 5090 Leverkusen Verfahren zur herstellung von n- und o-substituierten di- und/oder polyurethanen
US4358604A (en) * 1981-11-04 1982-11-09 Miles Laboratories, Inc. N-Aminoalkyl iodothyronine derivatives
US4399121A (en) * 1981-11-04 1983-08-16 Miles Laboratories, Inc. Iodothyronine immunogens and antibodies
US4434151A (en) * 1982-11-08 1984-02-28 Medi-Physics, Inc. Bifunctional chelating agents
US4548904A (en) * 1982-12-03 1985-10-22 Molecular Genetics Research & Development Protein sequencing method
US4486344A (en) * 1983-03-28 1984-12-04 Miles Laboratories, Inc. Urea-linked immunogens, antibodies, and preparative method

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Publication number Publication date
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CA1249811A (en) 1989-02-07
AU3403784A (en) 1985-07-11
DK559984D0 (da) 1984-11-26

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