JPH02119795A - ステロイド化合物の選択的側鎖減成法 - Google Patents

ステロイド化合物の選択的側鎖減成法

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JPH02119795A
JPH02119795A JP1205546A JP20554689A JPH02119795A JP H02119795 A JPH02119795 A JP H02119795A JP 1205546 A JP1205546 A JP 1205546A JP 20554689 A JP20554689 A JP 20554689A JP H02119795 A JPH02119795 A JP H02119795A
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JP1205546A
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Frank Dr Hill
フランク・ヒル
Wolfgang Preuss
ヴォルフガング・プロイス
Joachim Schindler
ヨアヒム・シンドラー
Rolf Schmid
ロルフ・シュミット
Alfred Struve
アルフレッド・ストルーヴェ
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Henkel AG and Co KGaA
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Henkel AG and Co KGaA
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07J9/005—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of more than two carbon atoms, e.g. cholane, cholestane, coprostane containing a carboxylic function directly attached or attached by a chain containing only carbon atoms to the cyclopenta[a]hydrophenanthrene skeleton
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ステロイド化合物の選択的側鎖減成方法に関
する。
特許願昭和５４年第４７８１４号（以下、原発明という
）の発明の第１の要旨は、１７−Ｃ側鎖ステロイド基質
、たとえば動物性または植物性ステロール化合物から、
ステロイド環減成および／または菌生育禁止剤の不存在
下においてム好気的条件下で、少なくとも選択的に側鎖
を減成するこにより１７−Ｃ−ステロイド−α−プロピ
オン酸載の製法。
４　欠陥性突然変異種製造法の（２）段階における野性
菌株の突然変異処理を、微生物の出発群が突然変異処理
により１０〜９９．９９９％不活性化され、致死率９０
〜９９９９％か達成される様な突然変異源の濃度および
反応時間条件で行って製造した欠陥性突然変異種を用い
る特許請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載の製法。
５　野性菌株としてＡＴＣＣ３１４，５５、ＡＴＣＣ３
１４５８、ＤＳＭ１４１８、Ｉ）３ＭＩ４．１９、ＤＳ
Ｍ１４２３、ＤＳＭ１４２４、Ｄ　Ｓ　Ｍ　１４２５、
ＤＳＭＩ４２６、ＤＳＭＩ４．２７、ＤＳＭ　１４２８
、Ｉ）８ＭＩ４２９、ＤＳＭＩ　４３０゜ＤＳＭ１４３
＋またはＤｓＭ１４３２の微生物を用いて製造した欠陥
性突然変異種を用いる特許請求の範囲第１〜４項のいず
れかに記載の製法。
６、コレステロールまたはントステＩ：１−ルにより標
準状態で培養した場合、３−オキソ−プレグナ−４−エ
ン−２０−カルボン酸および／または３−オキツープレ
グナ−１４−ジエン　２０化合物、特に３−才キツープ
レグナ−４−エン２０−カルボン酸（Δ−４，ＢＮＣ）
および／または３−オキソ−プレグナ−１４−ジエン−
２０カルボン酸（Δ−１，４，８ＮＣ）を工業的に生産
し得るブロック突然変異種微生物を製造する方法に存側
る。この原発明の製造法は、 （１）ステロール化合物を単一の炭素源として生育可能
な微生物の野性菌株、好ましくは環減成に比へて１７−
Ｃ側鎖減成を行う菌株を単離、培養し、 （２）野性菌株を自体既知の突然変異処理に付し、（３
）突然変異種群を、ｌ　７−、−　Ｃ−ステロイドα−
プロピオン酸を生産する突然変異種は実質的に生育しな
いが、共存する望ましくない突然変異種は生育して死滅
するかまたは殺すことかできる分離培地で培養し、次い
て （４）残った突然変異種の菌株を１７−Ｃ側鎖ステロー
ルにより培養し、これによりｌ　７−（、−ステロイド
−α−プロピオン酸化合物の生産性か高い菌株を分離す
ることを特徴としている。
Δ−４ＢＮＣおよびΔ−１，４８ＮＣはプロゲステロン
（ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ）系のステロイ）・化合物
を生産する場合の重要な中間体である。その構造式％式
％ ボン酸、 ３−オギソープレグナーＩ　４−ジエン−２０カルボン
酸。
原発明の製造法の（１）段階では野性菌株として１７−
Ｃ位に炭素数８〜１０の飽和または不飽和アルギル基を
有するステロール化合物で生育した場合、原発明出願の
明細書に記述された標準状態で測定して一般式 ％式％ １式中、ａは生育因子、ｂは野性菌株の選択因子であり
、選択係数ｒは少なくとも１０、好ましくは少なくとも
１００、特に少なくと６１０５である。］ に従って選択減成効果を表わす野性菌株が好ましく選択
、好気的培養される。選択因子すか少なくとも１、有利
には少なくとも２てあり、生育因子ａが同様に少なくと
も１である野性菌株を選択し、次の突然変異処理に付す
のが特に好ましい。また、野性菌株は、最初に選択因子
ｂ、多くの場合高い値のｂにより、次に生育因子ａによ
り考慮するのが望ましい。
選択因子すは、原発明出願の明細書の記載の従って野性
菌株を好気的に放射性同位体で標識したステロール化合
物、たとえば４．−”Ｃ−および２６４Ｃ−コレステロ
ールまたは放射性同位体で標識した対応するノドステ「
ｌ−ルにより培養して対比試験を行って決定する。この
試験には、いわゆるワールブルグ（Ｗａｒｂｕｒｇ）容
器を用いるのが有利である。基質の分裂により発生した
放射性ＣＯ２をベースに補集し、ンンチレーノヨンカウ
ンタで計測する。選択因子すは、このようにして測定し
た放射能の無次元比として次式で表イっされる原発明に
おける野性菌株の選択、とりわ：Ｊ選択因子による選択
は、放射性同位体で標識した二種のステロール化合物に
ついて対比試験を非常に長々と行うことを必要とする。
原発明の他の要旨は、ステロール環の減成および／また
は菌生育禁止剤の不存在においても上述の製造法で得た
欠陥性ブロック突然変異種を用い、好気的条件下で１７
−Ｃ側鎖ステロイド基質を微生物的に側鎖減成して１７
−Ｃ−ステロイド−αプロピオン酸化合物、特にΔ−４
ＢＮＣおよび／またはΔ−１，４８ＮＧを製造する方法
に存する。さらに、原発明は、適当な野性菌株およびそ
れから上述の製造法により得られた新規欠陥性ブロック
突然変異種に関するものである。
本発明は、原発明のこれらの種々の技術内容のうち、側
鎖減成方法を改良することを目的とするものである。
突然変異処理ならびに突然変異種群の分離・培養および
それを用いた１７＝Ｃ側鎖ステロイド基質からの１７−
Ｃ−ステロイド−α−プロピオン酸化合物の製法に用い
る微生物の野性菌株としで、萌述のステロール化合物に
よりステロール化合物の酵素的環減成禁止剤の存在下に
生育させた場合少なくとも部分的に１７−Ｃ−ステロイ
ド−αプロピオン酸化合物を生産するような野性菌株が
特に適していることが見い出された。
本発明の改良は、所望の欠陥性突然変異種の製造法の第
１段階、ずなイっち、実際の野性菌株を選別する段階に
おいて見られる。原発明の製造法によれば適当な微生物
菌株は、側鎖減成に対する酵素活性が環減成に対する酵
素活性に比へてはっきり優れているか否かによって選ば
れたか、本発明ては、野性菌株の適合性の基準としてス
テロール環減成禁１１ユ剤の存在下に１７−Ｃ位の側鎖
変換か明らかに行われたステロ−ル化合物を生産する野
性菌株の能力が基本になっている。
ステロール化合物により微生物を培養する場合の酵素的
環減成禁止剤については、たとえばノーエッヂ・ケイ・
エイ・マーヂン（Ｃｈ、　Ｋ、　ＡＭａｒｔｉｎ）、”
ミクロヒアル・クリビジコ・オン・ステロール・サイト
・チェイノズ（ＭｉｃｒｏｂｉａｌＣｌｅａｖａｇｅ　
ｏｆ　５ｔｅｒｏｌ　５ｉｄｅ　Ｃｈａｉｎｓ）”、ア
ドブ・アプル・ミクロハイオロ（Ａｄｖ、　Ａ、Ｉ）ｐ
ＩＭｉｃｒｏｂｉｏｌ）第２２巻２９−５８頁１９７７
年、特に小見出しｉＶ、８．４０〜５０頁などおよびナ
ガサワ（Ｎ　ａｇａｓａｗａ）ら、アグリ力ルヂコラル
・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇ丁Ｂｉ
ｏ１．　Ｃｈｅｍ、）第３４巻８３８−８４４頁１９７
０年に記載されている。
このような禁止剤の存在下に、動物性または植物性天然
ステロール化合物、たとえばコレステロールまたはシト
ステロールから△−１，４８ＮＣΔ〜４　ＢＮＣおよび
／またはΔ−１，／ＩＢＮＣを生産する菌株を非常な高
成功率で単離することができる。実際、この様な菌株に
はすてに記載され寄託されているものがある。さらに、
この種の野性菌株は、１７−Ｃ側鎖ステロイド基質の微
生物的側鎖減成により工業的に高収率で１７−Ｃ−ステ
ロイ）・−α−プロピオン酸化合物を得るのに適した欠
陥性突然変異種を供給するために、原発明の技術内容に
より次段階の突然変異処理および選択を行うのに用いる
出発物として特に適していることが確認された。本発明
に使用するこの種の突然変異種は、禁止剤不存在下に△
−４Ｂ　Ｎ　Ｃおよび／またはΔ−１，４ＢＮＣを生産
するのにも顕著に適している。
既知の野性菌株としては１７−Ｃ位に飽和または不飽和
アルギル基、好ましくは炭素数８〜１０のアルキル基を
有するステロール化合物により標準状態で生育した場合
、標準試験に加えたステロール化合物基準で１７−Ｃ−
ステロイド−α−プロピオン酸化合物を少なくとも５重
量％、好ましを生成し得る既知の野性菌株は、ケイ・ア
リマ（ＫΔｒｉｍａ）ら、“ミク［１ヒアル・プロダク
シヨン・オン・３−オキソピルノルコラ−１４−ジエン
−２２−オイック・アノノド（ＭｉｃｒｏｂｉａｌＰ　
ｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　　ｏｆ　　３−　Ｏｘｏｂｉｓｎ
ｏｒｃｈｏｌａ　−１４ｄｉｅｎ　−２２−ｏｉｃ　　
Ａｃ１ｄ）”、アクリカルヂ、ラル・アン）・・バイオ
ロジカル・ケミストリ（Ａｇｒｉｃ、　Ｂ　ｉｏｌ、　
Ｃｈｅｍ、）第３４巻（２）４．１１−４１６頁１９７
８年に記載されている。
本発明の製造法は３．）、り選れ、より効果的な欠陥性
突然変異種を得ろために出発物として上述のような野性
菌株を用いる。好ましくは、厳密に選ばれたこの種の野
性菌株を欠陥性突然変異種の回収の基本と１．て用いる
。
１５（段階の突然変異処理に適しノコ微生物の野性菌株
を選択ケる場合、原発明に対して本発明は次の二点に相
違がある。すなわち、既知のステロール化合物を消費す
る微生物を捜ずことにより酵素的環減成禁止剤の存在下
にステロイド化合物１７Ｃステロイド−α−プロピオン
酸化合物、特にくは少なくともｌＯ重全形生産する菌株
が非常に好適であることが見い出された。この標準試験
の条件は、選択因子ｐの決定法と共に後述されている。
選択段階で調へられる好ましい野性菌株は、ステロール
に対する酵素的環減成禁止剤か加えられ１こ通常の培地
においてステロールを単一炭素源として生育することに
より、一般に△−４，Ｂ　Ｎ　Ｃおよび／または△−川
、　４．　ＲＮ　Ｃを生成する。従っで、野性菌株をそ
の生成能、すなわち、標準状態におＩするΔ−４Ｂ　Ｎ
　Ｃおよび／またはΔ−１，４８Ｎ　Ｃの収率に応じて
選択することができる。この能力の決定および野性菌株
の選択因子ｐの決定は、次に示す標準状態で行われろ。
収率まノコは野性菌株の選−近因Ｊ伊 微生物菌株を５００ｕρエルレンマイエルフラスコ（次
に示す組成の培地溶液１００ｍρが入れられている）中
、振盪機（振盪速度　１５０サイクル／分）により３０
°Ｃで培養ずろ。微生物培養のこの過程および後のすべ
ての過程は、好気的条件正に行われろ。
培地の組成は、次の通りである（％は重量％）。
０２０％に、ＨＰｏ。
００５％Ｉ’ｔｌ　ａＨ２１）０４ ０８０％ペプトン ０．９０％酵母エキス ０３０％グルコース ｐＨ７，２ ３０°Ｃて４８時間培養した後、Ｏ１％トウイーン（Ｔ
　ｗｅｅｎ）　８０　（ボリオギシエチレンソルヒタン
モノオレエート）および０１％１７−Ｃ側鎖ステロール
化合物、たどえばコレステロールまたはントステロール
を加える。さらに４時間培養した後、１０−３モル／ρ
（Ｍ）の濃度で禁止剤を加える。
禁止剤の添加時には、培地のｐＨを８０に調節する。さ
らに６２時間培養した後、培養物を採取し、Δ−４，Ｂ
　Ｎ　Ｃおよび／またはΔ−１，４Ｂ、ＮＣの含有量を
通常の方法で測定し、加えたステロル化合物に対する重
量％を求める。
選択因子ｐは１３　Ｎ　Ｃ収率から次の式によって計ド
ロギノアンスラキノンなどが好ましく例示される。選択
因子ｐを決定するための標準試験を行うのに好ましい禁
止剤は、α１α′−ンピリノルおよび０−フェナンスロ
リンであり、これら二種の禁止剤の一種により同様の生
育条件で最小収率が達成されれば、標準試験により収率
を決定するためには充分である。
選択因子ｐの決定とは独立に、本発明の範囲で好適な野
性菌株の選択は、野性菌株の生育因子を別に決定するこ
とにより行われる。原発明における対応した生育因子ａ
の確定方法は、本発明にも応用できる。
明育個子１ 試験すべき微生物菌株を、５００酎エルレンマイエルフ
ラスコ（以下に示す組成の培養溶液１０ＣＪｖｒＱか入
れられている）中、好気的条件下に３０°Ｃで振盪機（
振盪速度　１５０ザイクル／分）により培養する。
培地は、次の組成から成る（ｌ（２当り）ｔ、ｏ９　　
Ｋｌ−（ｌ！ＰＯ。
算されろ Ｂ　Ｎ　Ｃ禁止剤の存在下に形成される微生物菌株の群
においては、ＢＮＣ収率が高く、従って選択因子ｐが大
きくなる程、一般にはその菌株は本発明にとってより好
適となる。下限としては少なくとも０５が考慮されるが
、選択因子が少なくとも１または１５である菌株が好ま
しい。選択因子ｐが２またはそれ以上の菌株が特に好ま
しいが、最良の結果によれば、４程度の選択因子も報告
されている。
ステロール環系の酵素的減成を抑制ずろ禁止剤を既知の
化合物群から示せば、α、α゛−ンピリンル、ｏ−フェ
ナンスロリン、８−オキソギノリンおよびギレート形成
により重金属と錯塩を形成するこく一般的な試薬、たと
えば１．−＝　ト０ソー２ナフト−ル、ザリヂルアルド
ギノム、ニトロソフェニルヒ）・ロギシルアミン、Ｉ−
二ｌ・ウソ−２ナフタールー３．６−ンスルポン酸、テ
トラヒ０．５９ ０２ｇ ０．０２９ ２γ ４００γ ２γ ２０００γ ４００γ ２００γ Ｍｇ５Ｏａ・　７Ｈ２Ｏ ａＣｉ２ ＣａＣｆＬ　・　２　Ｈ２Ｏ （１マＩ−（４）、Ｓｏ。
トウイーン（Ｔ　ｗｅｅｎ）　８０　（ポリオキノエヂ
レンソルビタンモノオレエ ート） ＋　７−Ｃ側鎖ステロール化合物（た とえば、コレステロールまたはン トスチロール） 酵母エキス ρ−ヒスヂノン ｄＱ−−メヂオニン ｄρ−トリプトファン ヒオヂン パントテン酸カルノウム 葉酸 イノノソト ナイアシン ｐ−アミン安息香酸 ４００γ　　ピリドギンン塩酸塩 ２００、−　　　リボフラビン ４００γ　　チアミン塩酸塩 微量元素溶液 培地のｐｌ（６、８ 生長（細胞密度）を測定するために、−・定時間毎に撹
拌した培養物から、適当量の細胞懸濁液を採取する。蒸
留水に対する吸光度（Ｅ′）を、光度計（ツアイス（Ｚ
ｅｉｓｓ）−ポトメータ、クイズＰ　Ｌ　４　）により
、波長６２０　ｎｍ（液厚ｄ−＝　Ｉ　ｃｉ）て測定す
る。
生長開始前の初期吸光度Ｅ。（すなわち、１＝１゜ての
吸光度）は約０７７５である。懸濁液は吸光度が０７程
度において測定できる様に希釈する。
生育因子ａは、」−記培養条件では遅くとも５日で到達
する対数生長期の終時点（時間ｔ１、吸光度Ｅ、）にお
ける細胞懸濁液の最大吸光度として与えられる。すなわ
ち、ａ−ΔＥ　＝＝　Ｅ　、　−Ｅ、である。
次の段階での突然変異処理および選択にとって特に好ま
しい菌株は、本発明によれば、−」−述の因子ａおよび
ｐを考慮して次式 微生物分類に見い出される。この様な菌株としては、ア
クロモバクタ−、アルスロバクタ−、バチルス、ブレビ
バクテリウム、コリネバクテリウム、フラボバクテリウ
ム、ミクロバクテリウム、ミコバクテリウ１３、ノカル
ジア、プロタミノバクテリウム、セラチアまたはストレ
プトミセスが適している。さらに、文献にはα、α′−
ジピリジルおよび０−フェナンスロリンの様な禁止剤の
存在下に１７−Ｃ側鎖ステロールにより培養した場合Δ
１．４．ＢＮＣを種々の収率で生産する菌株が示されて
いる（ケイ・アリマ（Ｋ　、　Ａ　ｒｉｍａ）らの著書
など参照）。
適当な野性菌株を選択した後、原発明と同様に突然変異
および選択を行う。その詳細を次に説明する。
突然変異処理（第２段階） 選択された野生菌株の突然変異は次の様に行う。
突然変異は、たとえば紫外線またはＸ線により高エネル
ギーを照射して行うことができる。また、突然変異誘導
剤により細胞を処理することも好適１−ａ・　１０１’ で示される選択係数が少なくとも１、好ましくは２、特
に好ましくは２０であるような選択的減成性能を示す野
性菌株である。選択係数としては、さらに高い値、たと
えばＩ≧１×１０３、さらには≧５×１０３も考慮する
ことができる。本発明においては、生育因子ａか少なく
とも０２、好ましくは少なくとち２、特に４またはそれ
以−にである野性菌株が好ましい。
本発明においても、後続段階に最も適した野性菌株を選
択する場合、因子ａとｂを相互に調整４−るのが有利で
あり、特に大きい選択因子ｐを有する菌株が有利である
。異なる分離野性菌株の間で選択する場合、まず選択因
子ｐが高い方の菌株を選択するのが有利である。一方、
非常に大きい生育因子で表わされる優秀な生長は、後続
の突然変異処理および突然変異種群の選択に好適な野性
菌株を与えることができるのはもちろんである。
禁止剤の存在下にΔ−４，Ｂ　Ｎ　Ｃおよび／またはΔ
−１，４８ＮＣを与える野性菌株は、広範囲のである。
適当な突然変異誘導剤を例示すれば、■メチル−３−二
ｌ・ロー１−ニトロソクアニノンの様なニトロソグアニ
ジン化合物またはエチルメタンスルホネートなとが挙げ
られる［詳細については、たとえば米国特許第４．　、
０２９　、５４．９号明細書第２欄５７行以下およびそ
れに引用された文献参照］。
基本的には、得られる欠陥性突然変異種の特性が詳細に
は予知できないという限りにおいては、野生菌株の突然
変異処理の結果は不確実なものであるということも事実
である。けれども、微生物の群に対して統計学の法則を
応用することができるので、突然変異の最適な誘導原則
を確立することが可能である。突然変異を開始する最適
条件を決定する方法は、既知の文献に見い出される［イ
ー・ニー・アデルバーク（Ｅ　、　Ａ　、　Ａ　ｄｅｌ
ｂｅｒｇ）；エム・マンデル（Ｍ、　Ｍａｎｄｅｌ）、
シー・シー・シー・ヂエン（Ｇ、Ｃ，Ｃ，Ｃｈｅｎ）“
オプテイマル・コンデイノヨンズ・フォー・ミュータジ
エニシス・パイ・Ｎ−メチル−Ｎ゛−ニトロ−Ｎ−ニト
ロソグアニジン・イノ・エンエリデア・コリ（Ｏｐｔｉ
ｍａｌ　　Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｒｏｒ　Ｍｕｔａｇ
ｅｎｉｓｉｓ　ｂｙ　Ｎｍｅｔｈｙｌ　−Ｎ　　−ｎ１
ｔｒｏ　−Ｎ　−ｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉｄｉｎｅｉ
ｎＥｓｃｂｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）”バイオケミカ
ル・アンド・バイオフィンカル・リザーヂ・コミコニケ
ーノヨン（Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、　Ｂ　１ｏｐｈｙｓ、　
Ｒｃｓ、　　Ｃｏｍｍｕｎ、）第１８巻７８８〜７９５
頁１９６５年参照］。
一般に、微生物群における突然変異頻度を増すには、突
然変異誘導剤の濃度および作用時間を、微生物群の一部
が致死的損害を受ｉ−する程度に選ぶ。
この様にしで、微生物群の生存部分における種々の突然
変異の頻度を多少とも増加させる。
本発明の方法においては、突然変異誘導剤の濃度および
作用時間は、初期群のｌＯ〜９９．９９９％が処理によ
り不活性化される様に選ぶ。好ましくは、致死率９０〜
９９９９％が選ばれる。
第２段階の突然変異に続いで、原発間の第３および第４
段階を行う。
寒ｙ閃阜− 引き続いで、突然変異処理で得た微生物の太きは、水性
栄養培地を使用することができ、該培地は、炭素源とし
て１７−Ｃ位に限定された数の炭素を有する側鎖を有す
るステロイド化合物または全く１７−Ｃ位に側鎖を有し
ないステロイド化合物を含有する。
１７−Ｃ位に置換基を有しないステロイド化合物を除い
ては、炭素数が５を越えない側鎖を有する化合物がこの
突然変異種の分離培地に加える炭素源として適している
。
とりわけ、突然変異種の分離または濃縮培地の炭素源と
して１７−Ｃ位に炭素数３の側鎖を有するステロイド化
合物を用いるのが望ましく、１７Ｃ−ステロイド−α−
プロピオン酸化合物の１種または２種以上を単一炭素源
として用いるのが好ましい。
さらに、分離培地の炭素源としで、本発明に従い培養さ
れるブロック突然変異種により最終目的物として生産さ
れる１７−Ｃ−ステロイド−αプロピオン酸化合物を用
いるのが特に好ましい。
従っで、本発明により植物性または動物性ステロい群か
ら本発明に望ましい特定の突然変異種を選択する為に、
培養条件は、変性された特定の特性を有する突然変異菌
株の選択が有利になる様に選ぶ。
所望の欠陥性突然変異種の濃縮は、通常、特定の突然変
異種は生育しないか、または実質上生育しない（」れど
も、一方、望ましくない共存する微生物は生育して生育
中または生育後に死滅させることができる様な条件下に
行う。この様にすれば、環減成酵素はブロックされてい
るが、ステロール化合物の１７−Ｃ側鎖を以Ｏｔｊと同
様に減成することができるブロック突然変異種を効果的
に分離することができる。さらに測定を行うことにより
、この第３段階においては、側鎖の減成中に選択的にα
−プロピオン酸残基を１７−Ｃ位に形成する様なブロッ
ク突然変異種を分離できることが立証された。
この目的のため、突然変異種群を、最終的には所望の突
然変異種の濃縮培地として用いられる分離培地により培
養する。この様な分離培地とじて−ルからΔ−４ＢＮＣ
またはΔ−１４８ＮＧを最終的に得ようとする場合、第
３段階の分離または濃縮培地の単一炭素源としてΔ−４
Ｂ　Ｎ　Ｃおよび／またはΔ−１，４ＢＮＣを好ましく
用いることができる。
他方、この方法は、通常の栄養溶液を用いて好気的条件
下に行う。
突然変異処理により突然変異した微生物は、現在用いら
れている炭素源での生育能力を失っており、分離培地で
培養されても自己増殖できない、すなわち生育しない。
第２段階の突然変異処理においてそれ程損傷も受けず、
また他の害も受けていない突然変異種群の他の部分のも
のは分離培地の炭素源により生育することができる、す
なわち培養中に増殖する。
本発明では、突然変異種分離培地における条件選択の習
性の相異を利用しで、非生育突然変異種に損傷を与える
ことなく生育菌株を生育中または生育後に死滅させる。
この様な分離は、抗菌剤、たとえば、ペニンリン化合物
を加えることなどにより可能となる。ペニシリン化合物
を加えれば、非生育菌株を傷つ（Ｊずに残したまま生育
した微生物菌株を死滅させることができる。
目的とするブロック突然変異種の他の損傷を受けていな
い突然変異種から既知のレダーハーグのスタンプ法を用
いて分離することができる。
ここで使用されたペニソリン濃縮方法およびレダーハー
グのスタンプ法は、たとえばザ・ジャーナル・オン・ジ
・アメリカン・ケミカル・ソサエティ（Ｊ　、　Ａｍｅ
ｒ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、）第７０巻４２６フ Ｄａｖｉｓ）（ペニノリン農縮方法）、ンエイ・バクト
（、Ｊ　、　Ｂａｃｔ．）第６３巻３９９頁１９５２年
ジエイ・レダーハーグ（、■，　Ｌｅｄｅｒｂｅｒｇ）
およびイー・エム・レダーハーグ（Ｅ　、　Ｍ　、　Ｌ
　ｅｄｅｒｂｅｒｇ）　（レダーハーグのスタンプ法）
に記載されている。
他の分離方法は、望ましくない突然変異種を、生育細胞
に特にその構造の内部にとりこまれて最終的に損傷を与
える放射性成分を含む培地を用い合、微生物の生育にお
（づる物質代謝生産物の化学的性質および菌株の生育能
力が決定的な要因になる。最終の目的物の生産能力が最
大のブロック突然変異種か好ましいことはもちろんであ
る。
この様にして得られた菌株は、工業的規模の工程で使用
することができる。
この段階での培養および選択は１回または複数回行うこ
とができる。
前記方法の範囲内においで、突然変異誘導剤のより強い
効果が、目的物の生産を最大にする」−で突然変異種に
望ましく現われるようにするのが望まし【′３れば、各
段階、すなわち第２段階の突然変異およびそれに続く第
３段階の突然変異種の分離を１回または複数回反復する
ことができる。そして最後に第４段階の操作を行う。
本発明によれば、特に望ましい欠陥性突然変異種は、標
準試験におけるその変換能力により調査することが好ま
しい。菌種の生産能力は、Δ−４および／またはΔ−１
．４．ＢＮＣの生成を参照して決定される。この標準試
験による収率の決定て死滅させる方法である。たとえば
、望ましくない突然変異種を３２Ｐ１特にＮａＨ３３２
ＰＯ４塩含有培地により殺ず方法か適している。不活性
化技術についてはノー・アール・フコールスト（Ｃ．Ｒ
Ｆ　ｕｅｒｓｔ）およびノー・ニス・ステント（Ｇ．Ｓ
Ｓ　ｔｅｎｔ）、インアクヂベインヨン・オン・バクテ
リア・パイ・デイケイ・才ブ・インコーホレイテッド・
ラディオアクティブ・フオスフオラス（ｌｎａｃｔｉｖ
ａｔｉｏｎ　　ｏｆ　　Ｂａｃｔｅｒｉａ　　ｂｙ　　
Ｄｅｃａｙ　ｏｆＩｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ　　Ｒａｄ
ｉｏａｃｔｉｖｅ　　Ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ）、ザ・ジ
ャーナル・オン・ジェネラル・フインオロノー（Ｊ　、
　Ｇｅｎ．　Ｐｈｙｓｉｏｌ．）第４０巻７３−９０頁
１９５６年を参照されたい。
策！Ｌ均−階 この様にして分離、選択された欠陥性ブロック突然変異
種は、ここで通常の培地により培養され、次いで、要す
ればさらに選択を行う。この選択は、たとえば用いられ
る出発物質（天然または植物性ステロール化合物など）
に依存した微生物菌株に所望される結果に従って行うこ
とができ、この場には次の条件が適用される。
標準試験によるＢＮＣ収率 すなわち、試験ずへき欠陥性ブロック突然変異種を、ペ
プトン０　８％、酵母エギス０　９％、グルコース０　
３％、トウイーン８０（ポリオキンエヂレンソルヒクン
モノオレ−１−）０．０６％およびコレステロールまた
はントステロール０　０６％の組成を有する栄養溶液（
ｐＨ　７　、、２）　Ｉ　０　０ｍＱの入った５００ｚ
Ｑエルレンマイエルフラスコで培養する。
菌株は、振盪機器を用い、振盪速度１．　５　０　ｒｐ
ｍ、温度３０°Ｃで６２時間予備培養する。次に、ＢＲ
ＩＪ３５（ポリオキンエチレンモノラウリルエーテル）
０．１％およびステロール化合物０　１％を加えて１２
０時間培養を続ける。培養を終了させた後、試Ｆｌを採
取し、抽出して薄層クロマトグラフィにより分析する。
そしで、Δ−４−および／まタハΔ−１．４８ＮＣの収
率パーセントを求める。％はずべで重量％である。収率
は、標準試験に用いられた変換されるべきステロール化
合物の重量（こ女１するものである。
本発明において好ましい欠陥性突然変異種は、ステロイ
ド基質としてコレステロールまたはシトステ［ｌ−ルを
用いたこの標学状態において少なくとも１５重量％、好
ましくは３０重量％またはそれ以−トの収率を示す。コ
レステロールをステロイド基質として用いた場合、この
コレステロールをステロイド基質として用いた場合、こ
の標準試験において収率は少なくとも５０重量％または
それ以−ヒにすることかでき、特に効果的な菌株では、
１３　Ｎ　Ｃ収率は７０〜８０重量％に達する。ステロ
イド基質としてシトステロールを用いた場合、収率はや
や低いが、それでも４０〜５０重量％に達する。
本発明は、１７−０位に側鎖を有するステロイド化合物
、特に動物性または植物性ステロイド化合物から欠陥性
ブロック突然変異種により１７Ｃ−ステロイド−α−プ
ロピオン酸化合物、特に３−オキソ−プレグナ−４−エ
ン−２０−カルボン酸および／または３−オキソ−プレ
フナ−１４−ンエンー２０−カルボン酸を製造する方法
を常、培地中のステロール化合物濃度は、２０ｇ／ｉ！
を越えないことが望ましく、多くの場合、１５９／Ｑを
越えずＩｇ／Ｑ以」二にするのが好ましい。
微生物は、炭素源として変換されるべきステロール類ま
たｆ４物質代謝できる追加の炭素源のいずれかを、通常
その微生物に必要な栄養分および育成物質と共に含有し
ている生育培地で培養する。
微生物の生育にとって特に好ましいのは、パラフィン、
グリセロール、カルボン酸、澱粉、デキストリン、蔗糖
、グルコース、フルク）・−スおよび砂糖含有不要物質
などである。好ましい窒素源は、アンモニア塩、硝酸塩
、ペプトン、とうもろこし浸漬液、大豆粉、醸造槽、魚
粉などである。
さらに、発酵促進剤として酵母エキスやビタミン類を添
加することができる。栄養培地にはカル７ウム塩、マグ
ネシウム塩、マンガン塩または鉄塩と同様、ナトリウム
塩、カリウム塩、リン酸アンモニウムなどの無機塩を含
有させることも有益である。
側鎖を減成ずべきステロイド化合物は、反応系提供する
。
天然のステロイド基質、たとえばコレステロール、ノド
ステロールなどに加えてまたは代えてこれらから誘導さ
れた化合物、たとえばコレステノン、シトステノン、ス
ヂグマステノンなどら出発物質として用いることかでき
る。
出発物質として選はれたステロール基質、たとえば天然
のステロール化合物の選択的変換は、以−ヒに述へた方
法により欠陥性ブロック突然変異種を選択した後、自体
既知の手順で行うことができる。たとえば、出発物質で
あるステロイド化合物は、培養期間中に培地に加えるこ
とができ、あるいはブロック突然変異種の培養開始前に
培地に加えておくこともできる。ステロイド化合物は１
種でまたは２種以」二の混合物として使用することがで
きる。選択的に減成されるべきステロイド化合物は、培
地ＩＱ当り約０１〜１００ｇの割合で用いるのが好まし
い。培養段階で変換されるステロイ）・化合物の最適濃
度は、一般に菌株に依存し、いずれの場合も簡単な予備
試験で決定できる。通に−度に加えるのではなく、反応
中に少量づつ加えるのが好ましい。出発物質であるステ
ロイドを、減成反応の行われる混合物へ実質上連続的に
加えるのが特に好ましい。この様にすれば、所望の減成
生成物の収量を増すことができる。
ステロール類の培地への乳化は、既知の乳化剤、たとえ
ば脂肪酸ソルビタンエステル類またはそれらのエチレン
オキシド付加物、ポリオキソエチレンモノラウリルエー
テルまたは脂肪酸アミノ−アルキルベタインを用いて行
うことかできる。
使用培地は、微生物培養前に加熱して殺菌するのが好ま
しい。培地を冷却し、微生物菌株の適当な種菌を接種し
た後、２５〜５５°Ｃ１好ましくは２７〜３０°Ｃで培
養する。培地のｐ　Ｈは４〜８５、好ましくは７０〜８
０にする。培地には、振盪、撹拌また（Ｊ吹込みにより
酸素を供給し、ステロールが所望量減成されるまで培養
を続（Ｊる。減成に要する時間は、ステロイド濃度およ
び発酵条件に依存するが、一般に２４〜１６０時間を要
する。
この様にして得られた生成物は、通常、発酵液中に蓄積
され、次いて反応混合物から既知の方法で回収される。
たとえば、ＢＮＣ化合物は、細胞の分離を行う前または
行った後に、有機溶媒を用いて培地から抽出される。有
機溶媒として（Ｊ、メチルイソブヂルケトン、酢酸エス
テル、ｎ−ヘキサノール、ｎ−オクタツール、クロロホ
ルムまたはｎ−ヘキサジなどが用いられる。
具体的には、ＢＮＣの分離は、ＢＮｅ　ｔ９を含有する
発酵液ｔＣに対し、はぼ同量の前述のような有機溶媒を
用い、パーコレータ、ポモノナイザ、分液漏斗で行う。
後二者による場合、乳濁液からＢＮＣ含有有機相を分離
する為に遠心操作を加えなければならない。
溶媒を蒸発させた後、ＢＮＣ含有残渣を、たとえばベン
ゼンから再結晶化して純品とする。融点は２３３〜２３
６８Ｃである。
溶媒抽出は、とりわ（プ酸性領域で可能である。
この場合、たとえば試料を５０％硫酸でｐＨ約２に調節
し、メチルイソブヂルケトン、酢酸エステノ区ｎ−ヘキ
サノール、■−オクタツール、クロ過により簡単に単離
できる。この場合、発酵液をアルカリ性にし、まず濾過
して細胞質および他の固形成分を除去する。その後、酸
性化してＢＮＣを固体状で沈殿させ、たとえば吸引濾過
して容易に回収することができる。
酸性化には、いずれの鉱酸も使用でき、また、酢酸のよ
うな有機酸、さらに気体状二酸化炭素も使用てきる。ｐ
＋−１５においで、完全な沈殿が行われる。Ｉヒ濁液を
少しの間加熱すれば１１６！過を有利に行える。
単離された固体物は、最高９０％のＢＮＣ化合物を含有
している。純品は、再結晶により得ることができる。
前記野性菌株の選択方法により、前記突然変異処理の出
発物として基本的に適している多数の野性菌株を比較的
短時間に分離することができる。
これらのうち最も重要なものは、次の寄託番号により寄
託されている　ＡＴＣＣ３１４５５、ＡＴＣＣ３１４，
５８、ＤＳＭ１４１８、ＤＳＭ＋４．１９、ＤＳＭ＋４
２３、ＤＳＭＩ４２４、ＤＳＭＩロホルムまたはｎ−ヘ
キサジて上述の様に抽出する。有機相を蒸発ざ且た後、
Ｂ　Ｎ　Ｃ含有残渣を再結晶化して純品を得る。融点は
２３３〜２３６°Ｃである。抽１」月よ、中性領域にお
いても行うことができろ。
精製は、陰イオン交換によ−〕でも行うことができる。
この場合、発酵液は、まず望ましい濃度に濃縮し、アル
カリ性、たとえばｐＨ］　２に調節する。現定量のメタ
ノールを加え、ポモシナイザーで撹拌した後、細胞塊を
バスケット遠心分離機で分離する。上清のアルコール−
水をポンプで取り出し、イオン交換カラムに通ｄ−、イ
オン交換樹脂としては、たとえばアセテート型の陰イオ
ン交換樹脂を用いる。ＢＮＣ化合物は、完全にイオン交
換樹脂に結合する。酢酸のメタノール１０％溶液で溶出
すれば、主としてＢＮＣを含有した生成物が得られる。
再結晶すれば、融点２３３〜２３６℃の純ＢＮＣが得ら
れる。
本発明の好ましい具体例によれば、ＢＮＣ化合物は、発
酵液から酸性領域における沈殿および濾４２５、Ｉ）８
Ｍ１４．２６、ＤＳＭ＋４２７．０８Ｍ１４２８、ＤＳ
Ｍ１４２９、ＤＳＭ１４３０、ＤＳＭ１４．３＋、ＤＳ
Ｍ＋４．３２゜バクテリアの特殊な菌がこれらの微生物
と関係があり、これらは部分的にコリネ型バクテリアに
帰属させることができる。正確な同定は近く行われる。
実際、野性菌株コール（ｃｈ○１）７３［ＣＢ８６６０
７７としてオランダ国バール（Ｂ　ａａｒ）在、セント
ラールヒューロー・フォール・シメルクルトウールス（
Ｃｅｕｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ　ｖｏｏｒ　Ｓｃｈｉｍ
ｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ）に、ＡＴＣＣ３１３８４とし
て米国メリーランド、ロックビル（＋−１ｏｃｋｖｉ　
ｌ　ｌｅ）在、シ・アメリカン・タイプ・カルチャー・
コレクション（ｔｈｅ　ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ　Ｃ
ｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）に、また微工研
菌寄第４４９１号として工業技術院微生物工業技術研究
所に寄託］は、前記選択方法を満足する、すなわち禁止
剤の存在下にΔ−４−および／またはΔ１．４．ＢＮＣ
化合物を相当量生産することが確認されノこ。
前述の野性菌株ＡＴＣＣ３１４５５から前記突然変異処
理により欠陥性突然変異種が得られ、この変異種は、本
発明にとって非常に効果的であり、たとえは禁止剤の不
存在Ｆでコレステ［１−ルまたは）Ｉ・ステロールから
Δ−４−および／またはΔ］　、　４．１３　Ｎ　Ｃ化
合物を工業的に生産ｌ−ることを可能にする。このこと
は、他の野性菌株、たとえばＡＴＣＣ３１４，５８の突
然変異種についてもあてはまる。野性菌株ＡＴＣＣ３１
４５５から誘導された突然変異種ＡＴＣＣ３１４５６お
よびＡＴＣＣ３１４５７か特に効果的である。欠陥性突
然変異種ＡＴＣＣ３１４５９およびＡＴＣＣ３１４６０
か野性菌株ＡＴＣＣ３１４５８から開発され寄託されて
いる。
次に実施例を示し本発明を具体的に説明する。
実施例Ｉ Ａ　適当な野生菌株の回収 常套の濃縮方法に従ってステロール減成微生物を土壌試
料からｍ離し、平板試験法でよずβ−ンシトテロールに
よる生育能力を試験する。明確な１％およびコレステロ
ール０．１％を加え、さらに４時間後α、α゛−ジピリ
ジル１０”Ｍを加える。
禁止剤の添加時には、ｐＨを８０に調節する。６２時間
後、培養物を採取し、ＢＮＣ含量を常套の薄層クロマト
グラフィにより決定する。
Ｄ１本発明による定義に相応する野性菌株試験された菌
株のうち最も効果的なものは、シ・アメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクノヨン（前出）または西ドイツ３
４００ケツヂンゲン（Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ）、グリセ
バッハシュトラアセ（Ｇ　ｒｉｓｅｂａｃｈｓｔｒ、）
　８番在、ドイツチエ・ザムルンク・フォノ・ミクロオ
ルガニスメン（Ｄ　ｅｕＬｓｈｅＳａｍｍｌｕｎｇ　ｖ
ｏｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ）に寄託されて
いる。
コロニー発育を示す菌株を純微生物として採取し、さら
に選択操作にイ」する。
Ｂ　生育因子ａ０′）決定 生育因子ａを決定するｆコめに、分離した純微生物を前
述の好気的条件下で培養する。細胞懸濁液の吸光度を測
定するため、２４時間間隔でそれぞれの試料を採取し、
前述の標準試験中の記載に従って測定する。実際細胞密
度が最大になった時点で実験を停止する。
Ｃ選択因子ｐの測定。
β−ンシトテロールによる振盪フラスコ試験において最
良の生育を示す野性菌株を、次に中間ＢＮＣ蓄積能力に
関し禁止剤試験により試験する。
菌株の好気的培養をこの目的のために次の組成を（′ｉ
′づ−る培養溶ｔｌｊＬ］００ｙｉρ中て行う。０．２
０％Ｋ。
１−（Ｐ　Ｏ、，００５％Ｎ　ａＨ２Ｐ　Ｏ−、０、８
０％ペプトン、０９０％酵母エキス、０３０％クルコー
ス（ｐ＋−（７、２）。培養物を振盪機により３０°Ｃ
で４８時間培養した後、トウィーン（Ｔ　ｗｅｅｎ）　
８０　（ボリオギンゴ、ヂレンソルヒタンモノオレエー
ト）０実施例２ Δ　突然変異 Ｉ　化学的手段による突然変異処理 菌株５Ｃ−３０９を次の栄養溶液により繁殖させろ　（
栄養溶液Ａ）０．８％ペプトン、０９％酵母エキス、０
３％クルコース、００６％ｌ・ウィーン８０（ボリオギ
ンエヂレンソルヒタンモノオレエ−）・）、００６％６
％ノドステロールｉ−１７、２゜対数発育期に達した後
、培養溶液を突然変異誘導剤１−メチル−３−ニトロ−
１−ニトロソグアニジン（濃度１１Ｒｇ／ｖｒρ培養発
酵液）により１５時間処理する。次いで、細胞を遠心分
離て採取し、突然変異誘導剤を生理食塩水で洗浄除去し
、細胞を栄養溶液に再懸飢して培養する。
２　紫外線照射による突然変異処理 上記ＡＩで用いたのど同様の細胞物質を紫外線照射によ
り突然変異処理する。対数発育期に達した後、５Ｃ−３
０９菌株の細胞を無菌状態で遠心分離し、殺菌した０、
１Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＩ−１６５）により２回洗浄し
、次いて同し緩衝液に再懸養溶液により約１０６細胞／
ｍＱに希釈した後、ベニノリンＧ１００ＯＩＵを加え、
培養をさらに７時間続（）る。次いで、抗生物質を遠心
分離により除去し、細胞を殺菌生理食塩水で洗浄した後
、ＢＮＣの代わりに０２％ノドステロールを含む上述の
培地でさらに３日間培養する。ペニノリン処理をもう１
回繰り返し、最後に細胞懸濁液を、１６％寒天を加えた
栄養溶液へに取り出す。細胞か目視できるコロニーに繁
殖した後、レプリカスタンプ法を行うために、■　６％
寒天を加えた栄養溶液Ｂに移し、この培地で全くまたは
ほとんど生育し得ないコロニーを選択し、用いる。
２、Ｐ”分離法およびレプリカスタンプ法ＡＩにおいて
処理した培養物を、振盪機により３０°Ｃで約４８時間
培養して培養液１ｍ（！当り１０９以」二の細胞を得る
。
生育培養物を遠心分離により採取し、生理食塩水により
２回洗浄する。細胞を、次の組成を有する無リン酸塩栄
養溶液に浮かせる　０．１％ビスノルコレノン酸、０，
２％ＢＲＩＪ３５．０２％副し、細胞密度を顕微鏡によ
り１０８細胞／ｎρに調節する。この細胞懸濁液８ｍＱ
をぺｌ・り皿に移（２、紫外線を９０秒間照射する（距
離３０ｃｍ、紫外線ランプ　ニー・ノコｙ１〜・ユニオ
ール（ＥＳ　ｃｈｕｅｔｔ　　Ｊ　ｕｎ、）（ゲツヂン
ゲン（Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ）在）社製）。この様に処
理された細胞懸濁液を、新鮮な栄養溶液Δに再懸濁し、
培養する。
Ｂ　所望欠陥性突然変異種の選択および分離１　ベニノ
リンおよびレプリカ平板法 Δにおいて処理した培養物を、振盪機により３０°Ｃで
約７２時間培養して培養溶液１肩σ当り１０″以上の細
胞を得る。この細胞懸濁液０１肩σを次の栄養溶液１０
ｍＱに移“４−ｏ（栄養溶液Ｂ）００５％ＮａＨ２ＰＯ
４，０２０％に２ＨＰＯ４，０゜０５％ＭｇＳＯ４・７
ＨｐＯ１００２％ＣａＣρ、・２Ｈ７０，０００５％Ｍ
ｎＳＯ４・４Ｈ＋０１０００５％Ｆｅ２５０４−７Ｈ７
Ｏ１０１０％（ＮＨ，）。
Ｓ０４．０．０００１％ヒヂオン、０．１０％Ｉ・ウィ
ーン８０および０．１０％ＢＮＣ０３０°Ｃで１８時間
振盪し、同一組成の新鮮な予備加熱した栄硫酸アンモニ
ウム、０８％塩化ナトリウム、残部水（ｐＨ７，０）。
これを３０°Ｃて２４時間振盪する。この間に、接種し
た１０８細胞／叶は倍になる。比活性２００ｍＣ／ミリ
モルのＮａ１−（２′″’Ｐ（ｌｔＩｍＣを試料２０叶
に加える。３０℃でさらに２４時間振盪し、培養物を遠
心分離し、生理食塩水で３回洗浄した後、１０％クリセ
ロール溶液２０ｍＱに混合し、２ｕａづつ小試験管１０
本中で凍結する。
種々の長さの時間貯蔵した後、凍結培養物を解かし、グ
ルコース−ペプトン−酵母エキス栄養寒天培地に接種す
る。３週間貯蔵した後においても生存している菌の割合
は、約９９６９％に減少した。これらの試料から得た生
存菌を、ヒスノルコレノン酸を炭素源として含む寒天の
完全栄養培地でコロニーに生育させた後、スタンプし、
後者の培地で全くまたはほとんと生育しなかったコロニ
ーを選択する。
Ｃ最も活性な欠陥性突然変異種の選択 Ｂ１また＋Ｊ：Ｂ２の手順により約９０種の菌株を分離
する。
Ｂ　Ｎ　Ｃ蓄積活性が優れた突然変異種を選ぶために、
全菌株を再び液中培養により試験ずろ。培養は栄養溶液
Ａ、２ｍＱを含む試験管中で行う。ローラー・デユープ
（Ｒｏｌｅｒ　ｔｕｂｅ）により３０°Ｃで２０時間培
養した後、０．１％トウイーノ８０および０１％β−ン
トシトロールを加え、さらに９６時間後、変換生成物を
、抽出および薄層クロマ）・グラフィにより分析する。
これにより、ペニシリン法により分離された突然変異種
からはＢＮＣ生成率３０％の５ｃ−３０９−１７９（Δ
ＴＣＣ３１４，５９）か、またｐ　３２法により分離さ
れた突然変異種からは生成率３５％の５Ｃ−３０１−１
８９（Ａ、ＴｅＯ２ｔ　４．６０）か最も活性な菌株で
あることが示された。
実施例３ Ａ、最も活性な突然変異種のＢＮＣ収率１．５Ｃ−３０
９−１７９菌株のＢＮＣＮＣ収率＞３０９−１７９菌株
を次の組成の栄養溶液を入れた５００！ｌＱエルレンマ
イエルフラスコ中および痕跡量のＡＤならびにＡＤＤが
生成された。
特許出願人　ヘンケル・コマンデイソトゲゼルシャフト
・アウフ・アクチェン 代理人弁理士　青山葆　はか１名 で培養する　０８％ペプトン、０９％酵母エキス、０３
％クルコース、００６％トウィーン８０（ポリオギノエ
ヂレンソルピタンモノオレエート）、００６％β−ノド
ステロール、ｐＨ７，２゜培養物を振盪機（振盪速度１
５０　ｒｐｍ）により３０°Ｃで６２時間振盪した後、
０．１％ＢＲＩＪ３５（ポリオギノエヂレンモノラウリ
ルエステル）および０，１％β−ノドステロールをＪ損
え、さら（こ１２０時間培養する。培養を停止した後、
試料を取り出し、抽出し、薄層クロマ）・グラフィで分
析する。仕込んだ基質量を基準にしで、３−オキソプレ
フナ−１４−ジェノ−２０−カルボン酸３５％、３−オ
キソ−プレグナ−４−エン−２０カルボン酸４％および
少量のアントロスト−１４−ツエン−３１７−シオンが
生成された。
２．８Ｃ−３０９−１８９菌株のＢＮＣ収率。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、（ａ）ステロイド減成および／または菌の生育を抑
    制する禁止剤の不存在下においても１７−Ｃ−α−プロ
    ピオン酸残基を有するステロイド化合物を生産する微生
    物突然変異種を、水性培地において好気的条件下、ステ
    ロイド基質の存在下に培養して発酵液中に１７−Ｃ−ス
    テロイド−α−プロピオン酸を蓄積し、次いで （ｂ）得られた１７−Ｃ−ステロイド−α−プロピオン
    酸を分離することから成る１７−Ｃ側鎖の微生物的減成
    による１７−Ｃ−ステロイド−α−プロピオン酸の製法
    において、（１）ステロール化合物を単一の炭素源とし
    て生育可能な微生物の野性菌株であって、ステロール化
    合物の酵素的環減成禁止剤の存在下で１７−Ｃ位に炭素
    数８〜１０の飽和または不飽和アルキル基を有するステ
    ロール化合物で生育した場合標準状態で測定して、一般
    式： Ｉ＝ａ・１０ｐ ［式中、ａは生育因子、ｐは選択因子であり、選択係数
    Ｉは少なくとも１、好ましくは２、特に少なくとも２０
    である。］ に従って１７−Ｃ側鎖の選択減成効果を表わす野生菌株
    を単離、培養し、 （２）野生菌種を自体既知の突然変異処理に付し、 （３）突然変異種群を、１７−Ｃ−ステロイド−α−プ
    ロピオン酸を生産する突然変異種は実質的に生育しない
    が、共存する望ましくない突然変異種は生育して死滅す
    るかまたは殺すことができる分離培地で培養し、次いで （４）残った突然変異種の菌株を１７−Ｃ側鎖ステロー
    ルにより培養し、これにより１７−Ｃ−ステロイド−α
    −プロピオン酸化合物の生産性が高い菌株を分離するこ
    とから成る、１７−Ｃ側鎖ステロイド基質から好気的条
    件下でステロイド環の減成および／または菌の生育を抑
    制する禁止剤の不存在下においても少なくとも高選択的
    に側鎖を減成することにより１７−Ｃ−ステロイド−α
    −プロピオン酸化合物を工業的規模で生産することがで
    きる欠陥性突然変異種の製造法により生産された欠陥性
    突然変異種を前記微生物突然変異種として用いることを
    特徴とする製法。 ２、欠陥性突然変異種製造法の（１）段階で、１７−Ｃ
    位に炭素数８〜１０の飽和または不飽和アルキル基を有
    するステロール化合物により生育した場合、１７−Ｃ−
    ステロイド−α−プロピオン酸化合物を標準状態で測定
    して、加えたステロール化合物基準で少なくとも５重量
    ％、好ましくは少なくとも１０重量％の収率で生産した
    野性菌株を単離、培養して製造した欠陥性突然変異種を
    用いる特許請求の範囲第１項記載の製法。 ３、欠陥性突然変異種製造法の（１）段階で、標準状態
    において生育因子ａが少なくとも０．２、好ましくは少
    なくとも１および選択因子ｐが少なくとも０．５、好ま
    しくは少なくとも１であった野性菌株を単離、培養して
    製造した欠陥性突然変異種を用いる特許請求の範囲第１
    項または第２項記載の製法。 ４　欠陥性突然変異種製造法の（２）段階における野性
    菌株の突然変異処理を、微生物の出発群が突然変異処理
    により１０〜９９．９９９％不活性化され、致死率９０
    〜９９．９９％が達成される様な突然変異源の濃度およ
    び反応時間条件で行って製造した欠陥性突然変異種を用
    いる特許請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載の製法
    。 ５　野性菌株としてＡＴＣＣ３１４５５、ＡＴＣＣ３１
    ４５８、ＤＳＭ１４１８、ＤＳＭ１４１９、ＤＳＭ１４
    ２３、ＤＳＭ１４２４、ＤＳＭ１４２５、ＤＳＭ１４２
    ６、ＤＳＭ１４２７、ＤＳＭ１４２８、ＤＳＭ１４２９
    、ＤＳＭ１４３０、ＤＳＭ１４３１またはＤＳＭ１４３
    ２の微生物を用いて製造した欠陥性突然変異種を用いる
    特許請求の範囲第１〜４項のいずれかに記載の製法。 ６、コレステロールまたはシトステロールにより標準状
    態で培養した場合、３−オキソ−プレグナ−４−エン−
    ２０−カルボン酸および／または３−オキソ−プレグナ
    −１，４−ジエン−２０−カルボン酸を、加えたステロ
    イド化合物基準で少なくとも収率１５％、好ましくは少
    なくとも３０％で生産し、コレステロールにより培養し
    た場合は特に少なくとも５０％で与える欠陥性突然変異
    種を用いる特許請求の範囲第１〜５項のいずれかに記載
    の製法。 ７、欠陥性突然変異種ＡＴＣＣ３１４５６、ＡＴＣＣ３
    １４５７、ＡＴＣＣ３１４５９およびＡＴＣＣ３１４６
    ０の一種を用いる特許請求の範囲第１〜６項のいずれか
    に記載の製法。
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