JPH01308268A - ベンゾトリアゾール誘導体およびそれを含有するカルボン酸類分析用試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 カルボン酸類は戻水化物、脂質、蛋白質の代謝産物とし
て広く生体内に存在し、それぞれ重要な役割を果たして
いる。本発明は、これらのカルボン酸類の微量分析に適
した化合物およびそれを含有する螢光ラベル化剤に関す
るものである。

従来の技術 最近では、広範な生理活性を有するプロスタグランシン
やコレステロールより生成される胆汁酸、おるいは先天
性代謝異常の診断・治療に重要と考えられるオキシ酸や
ケト酸等が注目されており、これらの簡便、迅速かつ高
感度な測定法の開発が望市れている。

工材らは９−アンスリルシアンメタンを開示している（
Ｎ、　Ｎｉｍｕｒａ、　１．　Ｋｉｎｏｓｉｔａ＋　Ａ
ｎａｌ、　Ｌｅｔｔ、。

１３、１９１　＜１９８０））。９−アンスリルシアン
メタンは室温でカルボン酸類と反応するという利点があ
るか、比較的不安定で使用時の試薬由来の妨害がしはし
は問題になっている。

上屋らは、７−アセトキシ−４−ブロモメチルクマリン
（ＡＢＭＣ）を用いてカルボン酸をラヘルし、逆相ＨＰ
ＬＣで分離後、溶出液にアルカリを加え、加水分解して
生成する７−ヒドロキシ−４−ヒドロキンメチルクマリ
ンを螢光検出リ−る方法を開示している（　Ｈ，ｌ５ｕ
ｃｈｉｙ８ａｔ　ａｌ：　Ｊ、　Ｃｂｒｏｍａ−ｔｏｇ
ｒ、　、　２３４．１２１　（１９８２）　）。この方
法は移動相溶媒の影響を受げす、検出限界か高い（数十
ｆｍｏｌ）という利点があるか、カルボン酸類とＡＢＭ
Ｃ（７）反応に加熱を要したり、分離後のアルカリ加水
分解等、操作が繁雑になる等の欠点もある。

発明が解決しようとする課題 本発明者らは以上の点に鑑み、緩和な条件下で反応し、
かつ高感度で試薬自体による分析への妨害のないラベル
化剤の開発を意図し、本発明を完成した。

課題を解決する手段 本発明が提供する次式： ［式中、Ｒ１はＣ，−Ｃ，アルキレンを意味し、Ｒ２お
よびＲ３は互いに同一または異なって、水素、０１〜Ｃ
６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルキルオキン、アミノ、モノ
−もしくはジ−Ｃ８〜Ｃ６アルキルアミノ（但し、同時
に水素である場合を除く。）を意味するか、または−緒
になって０１〜Ｃ５アルキレンンオキシを形成し、Ｒ４
は水素またはＣ８〜Ｃ６アルキルを意味する。］ で表わされる化合物またはその塩（以下、単に本発明化
合物という）は、縮合剤の存在下、室温でカルボン酸類
と短時間に反応する。反応物は強い螢光を有するアミド
体であり、過剰の試薬は容易に除去される。このように
、本発明化合物はカルボン酸類の簡便、迅速かつ高感度
な測定法を可能にした有用な化合物である。

本発明化合物は非プロトン性溶媒中、縮合剤および塩基
、またはそれに代わる酸捕捉剤の存在下、室温にて約３
０分でカルボン酸類と反応し、対応する強い螢光を有す
るアミド体を生成する。

また、過剰の試薬は前処理用シリカカラムに反応液と通
ずことにより容易に除去できるものである。本発明化合
物は脂肪族、芳香族を問わず広範囲なカルボン酸類と反
応する。置換基Ｒ２およびＲ３は電Ｔ供与性が強ければ
、化合物の螢光性が強くなり、好ましい。

本発明化合物は有機化学の公知の反応を用いて容易に製
造可能である。例えは、以下に示すように、置換−アニ
リン（ａ＞と適当な保護基で保護されたアミノアルキル
基を有するシアン化合物（ｂ）とを公知のジアゾカップ
リング反応（第１工程）、酸化的閉環反応（第２工程）
、統いて脱保護（第３工程）に付して本発明化合物（Ｉ
＞を得る事ができる。

（以下余白） （式中、Ｒ１，Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は前記と同意義で
あり、Ｒ５は保護基を表わす。） 以下に各工程の説明をする。

（第１工程） 本反応は通常、水冷下〜１５°Ｃにて水溶液中で行なう
。シアン化合物（ｂ）に対応するアニリン誘導体を無機
酸に溶解または懸濁し、亜硝酸ナトリウム等の亜硝酸と
反応させて反応性に富んだシアン化合物（ｂ）を調製す
る。過剰の亜硝酸を除去するため、スルファミン酸や尿
素を添加してこれを分解する。

次いで、置換−アニリン化合物（ａ）を添加すれは容易
にジアゾ化合物（ｂ）とカップリングを起こして化合物
（ｃ）を与える。反応は数分〜数時間で完了する。

（第２工程） 化合物（ｃ）のアソ基は隣接するアミンと容易に酸化的
閉環し、トリアソール化合物（ｄ）を与える。酸化的閉
環反応は銅・アンモニア錯体の存在下、含水有機溶媒中
で行なえは、室温〜加熱下、数分〜数十時間で完了する
。

（第３工程） 化合物（ｄ）を酸または塩基の存在下、含水有機溶媒中
で加水分解反応に付して本発明化合物（Ｉ）を得る。反
応は室温〜加熱下で数分〜数日間で完了する。

本発明において、０１〜Ｃ６アルキレンとは直鎖状Ｃ，
−Ｃ５アルキレンを意味し、具体的にはメチレン、エチ
レン、プロピレン、ブチレン、ペンチレンであり、とり
わけメチレンまたはエチレンが好ましい。

Ｃ４〜Ｃ６アルキルとは直鎖状または分枝状０１〜Ｃ５
アルキルを意味し、具体的ｔこはメチル、エチル、ｎ−
プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、茨ｃ−フチル、
ｔａｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ネオ
ペンチルまたはｔｅｒｔ−ペンチル等が例示される。

保護基としてはアミンの保護基として公知のもの全てが
使用できるが、中でも酸に安定なものが望ましい。例え
ば、アセチル、トリフルオロアセチル、ヘンソイル等が
例示できる。

以下に本発明化合物の代表例を列挙するが、本発明はこ
れらに限定されるものではない。

（１）　　２−（ｐ−７ミノメチルフエニル）−Ｎ、Ｎ
−シメチルー２Ｈ−ベンゾトリアソリルー５−アミン、
（２）　　、！　−［ｐ、（２−アミノエチル）フェニ
ル］−Ｎ、Ｎ−ジメチル−２Ｈ−ベンゾトリアソリルー
５−アミン・２塩酸塩、 （３）　　２−（ｐ−アミノメチルフェニル）−２Ｈ−
ベンゾトリアゾリル−５−アミン、 （４）　　ｐ−（５，６−シメトキシー２Ｈ−ヘンブト
リアソール−２−イル）ベンジルアミン、 （５）　　２−［ｐ−（５、６−メチレンジオキシ−２
Ｈ−ヘンジトリアゾール−２−イル）］フェネチルアミ
ン、（６）　　４−［：、ｍ’（５−プロポキン−２Ｈ
−ヘンシトリアソール−２−イル）フェニルコブチルア
ミン、（７）４−ブトキシ−２−［（３−ｍ−メチルア
ミノプロピル）フェニル：ｌ−２Ｈ−ヘンブトリアソリ
ルー５−アミン、 （８）Ｎ−ブチル−５−［ｏ−（５−エトキシ−７−プ
チルー２Ｈ−ヘンブトリアソール−２−イル〉フェニル
コペンチルアミン、 （９）Ｎ−イソプロピル−２−［ｍ−（５、６−ｘチレ
ンジオキジ−２Ｈ−ペンツトリアソール−２−イル）］
フェネチルアミン、および ｑ■　２〜（０−アミンメチルフェニル）−Ｎ、Ｎ−ジ
メチル−２Ｈ−ヘンソトリアソリレンー５，６−シアミ
ン。

以下に実施例および実験例を示し、本発明を更に詳しく
説明するが、これらは本発明を何部限定するものではな
い。

寒墓忽 以下に示す実施例１〜５で本発明化合物１〜５を製造し
た。物理恒数を表１に示す。

実施例Ｉ Ｎ−（ｐ−アミノヘンシル）アセトアミド（６，６ｇ）
を１０％塩酸１００ｍ１に溶かし、水冷下、攪拌しなが
ら１０％亜硝酸す）・リウム水溶液（３０ｍｌ）を加え
た。１５分後、１０％スルファミン酸アンモニウム水溶
液（５０ｍｌ）を加え、さらに１５分攪拌した。酢酸す
）〜リウノ、にて反応液の液性を約ｐＨ５とした後、Ｎ
、Ｎ−ジメチル〜ｍ−フェニレンノアミン２塩酸塩（８
，４ｇ、　）を加え、さらに４時間攪拌した。

１、　Ｎ水酸化ナトリウム水溶液にて反応液の液性り約
ｐＨ９とした後、析出物を濾取し、水で十分に洗った。

ジメチル、」フルムアミド／メタノール溶液より再結晶
することにより、アソ化合物を紗点１３８〜１３９°Ｃ
の赤色プレー１晶として得た。

このアソ化合物（８，７ｇ　）をピリジン（１００ｍｌ
）に溶かし、アンモニア性硫酸鋼／＃液（硫酸銅・５水
和物を１４％アンモニア水１５０ｍ１に溶かしたもの）
を加えた後、４時間還流した。反応終了後、冷却してか
ら酢酸ニブルにて抽出した。

酢酸エチル層を無水硫酸す）・リウムにて乾燥させた後
、減圧下で濃縮した。含水エタノールより再結晶するこ
とにより、化合物（１）のアセチル体を融点１９６〜１
９７°Ｃの黄色釧状晶として得た。

このアセチル体（７ｇ）をエタノール（２００ｍ〕、）
に溶かした後、１０％塩酸（５０ｍｌ）を加え、５日間
還流した。反応終了後、全量が約５０ｍ１になるまで濃
縮した後、濾過した。濾液を炭酸水素ナトリウムにて中
和した後、析出物を濾取し、水で十分洗った。メタノー
ルより再結晶することにより、目的化合物（１）を得た
。

実施例２ Ｎ−（ｐ−アミノヘンシル）アセトアミドをＮ−（ｐ−
アミノフェネチル）−２，２，２−ｈリフルオロアセト
アミド塩酸塩（８，１ｇ）に代える以外は実施例１の製
造法に準した操作を行なった。ただし、アンモニア性硫
酸鋼溶液にて酸化閉環後、抽出した生成物を再結晶する
ことなく、エタノール（５０ｍｌ）に溶かし、５Ｎ水酸
化ナトリウム水溶液（２０ｍｌ）を加えて２時間還流し
た。反応終了後、水（１００ｍｌ）を加えた後、酢酸エ
チルにて抽出した。酢酸エチル層を減圧下で濃縮し、得
られた油状物質をエチルエーテル（２０ｍｌ）に溶かし
た。この溶液をｍ週した後、濾液をエタノール性塩酸溶
液に加えることにより、目的化合物（２〉を得た。

実施例３ Ｎ、Ｎ−レノチル−ｍ−フェニレンジアミン２塩酸塩を
ｍ〜ノエニレンシアミン２塩酸塩（７，２ｇ　）に代え
る以外は実施例１の製造法に準じた操作を行ない、目的
化合物（３）を得た。

実施例４ Ｎ、Ｎ−ジメチル−ｍ−フェニレンシアミン２塩酸塩を
３．４−ジメトキシアニリン（６，４ｇ　）に代える以
外は実施例１の製造法に準した操作を行ない、目的化合
物（４）を得た。

実施例５ 聚１ Ｎ、Ｎ−ジメチル−ｍ−フェニレンジアミン２塩酸塩を
３．４−メチレンジオキシアニリン（５，６ｇ）に代え
る以外は実施例２の製造法に準した操作を行なった。た
だし、加水分解終了後、生成物を酢酸エチルにて抽出し
、次いで減圧下で酢酸エチルを濃縮して得た残渣をメタ
ノールより再結晶することにより、目的化合物（５）を
得た。

（以下余白） 衷験碧 （一般分析法） カルボン酸化合物を含むアセトニトリル溶液０５ｍｌを
１０ｍ１バイアルにとり、これに２−ブロモ−１−エチ
ルピリジニウムテトラフルオロボレート（３，７ｍＭ）
、９−メチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピリド［１，
２−ａコピリジン−２−オン（２’、７ｍＭ）および本
発明化合物（３，７ｍＭ）のアセトニトリル溶液各５０
μｍを加え、約１０秒間混和する。

この溶液を室温下で約３０分間放置する。

この反応液０　、５　ｍｌを前処理用シリカカラムに通
し、アセトニトリル（１，５ｍ１）にて溶出する。全量
をアセトニトリルにて２５ｍ１とした後、その２０μｍ
をＨＰＬＣに付す。尚、各試薬についてのアセトニトリ
ル溶液中の励起波長および螢光波長は表２に示す。

実験例１（本発明化合物１を試薬として使用）フルフェ
ナム酸を３．６．１５．３０または６０ｎｇ含有するア
セトニトリル溶液の各０　、５　ｍｌを１０ｍ１バイア
ルにとり、これに２−ブロモ−１−エ＝１６− チルピリンニウムテトラフルオロボレート（３゜７ｍＭ
）、９−メチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピリド［１
，２−ミコピリジン−２−オン（２，７ｍＭ）および本
発明化合物１　（３、、，７，、ｍＭ）のアセトニトリ
ル溶液各５０μｍを加え、１０秒間混和した。この溶液
を室温下で約３０分間放置した。

この反応液０　、５　ｍｌをボンドエルート（シリカ）
に通し、アセトニトリル（１５ｍｌ）にて溶出する。全
量をアセトニトリルにて２　、５　ｍｌとした後、その
２０μｍをＨＰＬＣに付した。

（測定条件） 測定装置：高滓ＬＣ−４Ａ（高滓製作所製）高滓ＲＦ−
５３５螢光検出器（同前） カラム：ツバパックＣ１ｓ　（３，９Ｘ　１５０ｎｗｎ
　；ウォーターズ社製） ガードカラム；ヌクレオシル５ＣＩＪ（４、ＯＸ３０ｍ
ｌｌｌｉナーゲル社製） 移動相ニアセトニトリル／水＝２／１ 流速：１．２ｍｌ／分 測定波長：励起波長３９５ｎｍ、螢光波長５１０Ｉ（結
果） 以上の実験より得たフルフェナム酸濃度とクロマトグラ
ムのピーク面積との関係を第１図に示し、クロマ１〜グ
ラムを第２図に示した。

実験例２（本発明化合物５を試薬として使用）イブプロ
フェンを０６．３．６．１５．３０または６０ｎｇ含む
アセトニトリル溶液の各０５ｍ１について、本発明化合
物５を試薬として使用した以外は、実験例１と同様の操
作を行なった。

（測定条件） 測定装置：実験例１に同し。

カラム：ヌクレオジル５Ｃ＋ａ（４，６Ｘ１５０ｍｍ；
ナーゲル社製） ガードカラム；実験例１に同し。

移動相ニアセトニトリル／水−５／３ 流速：１．Ｏｍｌ／分 測定波長：励起波長３３３ｎｍ、螢光波長３７５ｎｍ（
結果） 以上の実験より得たイブプロツエン濃度とクロマトダラ
ムのピーク面積との関係を第３図に示し、クロマ）〜ク
ラムを第４図に示した。

実験例３ 本発明化合物（１）〜（５）と安息香酸との反応物であ
るアミド体のアセトニ）・リル溶液中における励起・螢
光波長は表２に示す通りである。また、各アミド体のＨ
ＰＬＣによる検出限界を合わせて示す。

表　　２

【図面の簡単な説明】

第１図はフルフェナム酸ａ度とクロマトグラムのピーク
面積の関係を示す図であり、縦軸はピーク面積（Ｘ１０
’）を表わし、横軸はフルフェナム酸濃度（ｎｇ／　５
００μｍ）を表わす。 第２図（Ｊ実験例１で得たクロマトダラムであ−１９〜 す、横軸は保持時間（分）を表わし、図中の矢印で示し
たピークがフルフェナム＠（約０　、２　ｎｇ）に相当
する。 第３図はイブプロフェン濃度とクロマトダラムのピーク
面積の関係を示す図であり、縦軸はピーク面積（×１０
６）を表わし、横軸はイブプロフェン濃度（ｎｇ／　５
００μｍ）を表わす。 第４図は実験例２で得たクロマドグラドであり、横軸は
保持時間（分）を表わし、図中の矢印で示したピークが
イブプロフェン（約０．０２ｎｇ）に相当する。 特許出願人：塩野義製薬株式会社 第１図 第３図 第４図 手続ネ市正書（自発） １．事件の表示 昭和６３午特訂願第１３８０３９号 ２、発明の名称 ヘンソトリアソール誘導体およびそれを含有するカルボ
ン酸類分析用試薬 ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 住所大阪府大阪市東区道修町３丁目１２番地４、代理人 住所大阪市福島区鷺洲５丁目１２番４号〒５５３塩野義
製薬株式会社　特許部 （電話　０６−４５８−５８６１） ５、補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄 ６、補正の内容 （１）　　明細書第１７頁第７行目の１ピリジン」を「
ピリミジン、と訂正する。 （２）　　同第１８頁第３行目の「ピリジン、を「ビリ
ミジンコと訂正する。 以上

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）次式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｒ＾１はＣ＿１〜Ｃ＿６アルキレンを意味し、
   Ｒ＾２およびＲ＾３は互いに同一または異なって、水素
   、Ｃ＿１〜Ｃ＿６アルキル、Ｃ＿１〜Ｃ＿６アルキルオ
   キシ、アミノ、モノ−もしくはジ−Ｃ＿１〜Ｃ＿６アル
   キルアミノ（但し、同時に水素である場合を除く。）を
   意味するか、または一緒になってＣ＿１〜Ｃ＿６アルキ
   レンジオキシを形成し、Ｒ＾４は水素またはＣ＿１〜Ｃ
   ＿６アルキルを意味する。］で表わされる化合物または
   その塩。
2. （２）次式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｒ＾１はＣ＿１〜Ｃ＿６アルキレンを意味し、
   Ｒ＾２およびＲ＾３は互いに同一または異なって、水素
   、Ｃ＿１〜Ｃ＿６アルキル、Ｃ＿１〜Ｃ＿６アルキルオ
   キシ、アミノ、モノ−もしくはジ−Ｃ＿１〜Ｃ＿６アル
   キルアミノ（但し、同時に水素である場合を除く。）を
   意味するか、または一緒になってＣ＿１〜Ｃ＿６アルキ
   レンジオキシを形成し、Ｒ＾４は水素またはＣ＿１〜Ｃ
   ＿６アルキルを意味する。］で表わされる化合物または
   その塩を含有する事を特徴とするカルボン酸類の分析用
   試薬。