JPH01299300A

JPH01299300A - ヒトＭｎスーパーオキシドジスムターゼに対するモノクローナル抗体及びそのモノクローナル抗体の製法

Info

Publication number: JPH01299300A
Application number: JP63128165A
Authority: JP
Inventors: Taizo Uda; 泰三宇田; Tetsuo Kawaguchi; 哲男川口; Shiro Noji; 野地　四郎; Naoyuki Taniguchi; 直之谷口
Original assignee: Ube Industries Ltd
Current assignee: Ube Corp
Priority date: 1988-05-27
Filing date: 1988-05-27
Publication date: 1989-12-04
Anticipated expiration: 2011-12-25
Also published as: JP2567664B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、ヒトＭｎ−ＳＯＤ（以下、ヒトＭｎ−ＳＯＤ
と略す）のみに対して高い特異性を有するモノクローナ
ル抗体及びそのモノクローナル抗体の製法に関する。

〔従来の技術〕

ヒトＭｎ５ＯＤは、ミトコンドリアのマトリックス部分
に存在する酵素（１ドメインの分子量が約２５，０００
であり、そのダイマーまたはテトラマーからなる）であ
り、次に示すように、毒性酸素の主要な分子種であるス
ーパーオキシドアニオンラジカル（０□）を不均化する
反応を触媒する。

２０Ｔ＋２Ｈ＋−一→Ｈ２０□＋０□ ところで、肝疾患における血清中のヒトＭｎ−ＳＯＤ１
度の測定には、ポリクローナル抗体を用いた検討によっ
て、高い診断的意義が存在すると考えられている（医薬
ジャーナル；稲垣、訳本、■、■、１９８４年。第５回
腫瘍マーカー研究会；飯塚、新井ら、１９８５年）。ま
た、呑口らも、ヤギに免疫して作製したポリクローナル
抗体を用いた免疫学的な方法で、ヒトＭｎ−ＳＯＤ濃度
が肺癌で高いことを示しており（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ
　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔ
ｅ、　７２．５．１９８４年）、血清中のヒトＭｎ−Ｓ
ＯＤ濃度の測定の重要性が指摘されている。

しかし、これらの各疾患における血清中のヒトＭｎ−Ｓ
ＯＤ：ａ度の測定には、ポリクローナル抗体が用いられ
ているので、ヒトＭ　ｎ　−Ｓ　ＯＤに対する反応の特
異性をさらに高め、常に同品質の高い特異的な反応性を
有する抗体を得るためにもモノクローナル抗体を作製し
、その製造方法を確立する必要があるが、今だにヒトＭ
ｎ−ＳＯＤに対して非常に高い特異的な反応性を有する
モノクローナル抗体に関する報告は認められていない。

〔発明が解決すべき問題点〕

本発明の目的は、ヒト血清中のヒトＭｎ−３゜Ｄに対し
て非常に高い特異的な反応性を有するモノクローナル抗
体、及びそのモノクローナル抗体の製法を提供すること
である。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者らは、前記の問題点を解決するために鋭意研究
した結果、ヒトＭｎ−ＳＯＤをマウスに免疫し、細胞融
合することによって得られた細胞株を培養することによ
って、ヒトＭｎ−ＳＯＤに対して非常に高い特異的な反
応性を示すモノクローナル抗体を生産できることを見出
し、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明は、ヒトＭｎ−ＳＯＤをマウスに免疫し、そのマウスから得
たリンパ球とマウスミエローマ細胞とを融合して得られ
た細胞株が産生したヒｌ−Ｍｎ−ＳＯＤのみに対して高
い特異性を有することを特徴とするモノクローナル抗体に関するものである。

さらに、本発明は、ヒトＭｎ−ＳＯＤをマウスに免疫し、そのマウスから得
たリンパ球とマウスミエローマ細胞とを融合して得られ
た細胞株を培養することを特徴とするヒトＭｎ−ＳＯＤ
のみに対して高い特異性を有するヒトＭｎ−ＳＯＤに対
するモノクローナル抗体の製法に関するものである。

以下、本発明について詳細に説明する。

本発明のモノクローナル抗体は、ヒトＭｎ−ＳＯＤをマ
ウスに免疫し、細胞融合することによって得られた細胞
株が産生ずるものであり、ヒトＭｎ−ＳＯＤに対して非
常に高い特異的な反応性を有するものである。

本発明でマウスの免疫に用いる免疫原としては、ヒトＭ
ｎ−ＳＯＤに対して非常に高い特異的な反応性を有する
モノクローナル抗体を得ることができるものであれば特
に制限されないが、例えば、ヒトＭｎ−ＳＯＤを構成す
る七ツマ−、ヒトＭｎ−ＳＯＤ、およびヒトＭ　ｎ　−
Ｓ　ＯＤの一部分を合成したペプチドなどを挙げること
ができるが、好ましくはヒトＭｎ−ＳＯＤを用いるのが
良い。

本発明のヒトＭｎ−ＳＯＤのみに対して高い特異性を有
するモノクローナル抗体は、ヒトＣｕ、Ｚｎスーパーオ
キシドジスム、ターゼ（以下、ヒトＣｕ、Ｚｎ−ＳＯＤ
と略す）、ヒトアルブミン、ヒトグロブリンとは反応性
が認められないものである。そのような特異性を有する
モノクローナル抗体は、例えば、ヒトＭｎ−ＳＯＤを免
疫したマウスから得たリンパ球とマウスのミエローマ細
胞とを融合して得たハイプリドーマ株のＮｉ２株（微工
研条寄第１６０６号）、ＰＥ９株（微工研条寄第１６０
７号）、ＰＣｌ３株（微工研条寄第１６０８号）などを
培養することによって得ることができる。

このようなハイプリドーマの作製は、従来公知の方法、
例えば、ＭｉｌｓｔｅｉｎとＫｈｏｌｅｒの方法（Ｎａ
ｔｕｒｅ、２５６，４９５　（１９７６）〕に準じて行
うことができる。そのようなハイブリドーマ株の好まし
い作製方法について、概略を以下順次説明する。

モノクローナル　　　　バイブ１ドーマ　の　１（ｉ）
免疫動物リンパ球の調製マウスの免疫方法は、ＰＢＳ　（リン酸緩衝食塩水）に
溶解したヒトＭｎ−ＳＯＤ　（１０〜４００μｇ）をマ
ウスに１回または敗退間隔で数回投与することで行うこ
とができる。

１回目の免疫は、アジュバント（ミョウバン、結核死菌
体、核酸などを含む免疫促進物質）を投与せずに行うこ
ともできるが、アジュバントを用いて調製したエマルジ
ョンを投与することが好ましい。

リンパ球は、その免疫動物であるマウスの充分な抗体価
を１認後、最終免疫から数日後の、血液、リンパ節、肺
臓などから得ることができるが、肺臓から得た方が好ま
しい。

（ｉｉ）ミエローマ細胞の準備細胞融合には、マウス由来のＭＰＣ−１１、Ｐ３−Ｘ６
３−Ａｇ８・６５３　（６５３Ｌ　Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ
８−Ｕｌ　（Ｐ３Ｕ１）、Ｐ３−ＮＳ−１（ＮＳ−１）
、ＳＰ２１０−Ａｇ１４　（ＳＰ２１０）など、および
ラット由来の２１０．ＲＣＹ３．Ａｇ１．２．３　（Ｙ
３）などのミエローマ細胞を用いることができるが、６
５３、Ｐ３Ｕ１、ＮＳ−１、Ｓ　Ｐ　２１０なとの細胞
外に抗体を産生分泌しないミエローマ細胞を用いた方が
好ましい。

（ｉｉｉ　）細胞融合細胞融合は、前記のようにして免疫されたマウスのリン
パ球とミエローマ細胞との細胞数を（３〜２０）：１の
割合で、細胞融合に支障をきたさない細胞懸濁溶液、例
えば、一般に用いられるリンパ球培養用培地成分（ＭＥ
Ｍ、ＤＭＥＭ、ＭｃＣｏｙ、ＲＰＭ１１６４０などの培
地成分）溶液、等張緩樹液などを用いて良く混合し、遠
心分離しり後のペレット（細胞塊）に、ＨＶＪ　（セン
ダイウィルス）またはＰＥＧ　Ｃポリエチレングリコー
ル）溶液を添加することによって行うことができるが、
好ましくはＰＥＧ溶液を用いるのがよく、さらに好まし
くは平均分子量が１０００〜８０００で３０〜６０重量
％のＰＥＧ溶液を用いるのがよい。この時、細胞融合を
促進するために、コルヒチン、ジメチルスルホキシド、
ポリーＬ−アルギニンなどを添加することもできる。

細胞融合に用いるミエローマ細胞としては、免疫された
マウスと異種の動物由来のものを使用することもできる
が、得られるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株
の抗体産生量および安定性の面を考えると、免疫された
マウスとは同種のミエローマ細胞を用いた方がよく、さ
らに好ましくは同系のものを用いた方がよい。

（ｉｖ）ハイブリドーマの選択ハイブリドーマの選択は、細胞融合の操作後の細胞をＨ
ＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン
、ウシ胎児血清を含有した培地。

この培地成分としては一般に用いられるリンパ球培養用
培地成分を用いることができる）で培養して行うことが
できる。

ハイブリドーマの培養は、培養プレートの各ウェル（゛
培養ウェル）に抗体産生ウェルの検索に適した細胞個数
を入れて行い、この時、ハイブリドーマの増殖促進物質
またはそれを産生ずる細胞（例えば、胸腺、肺臓、リン
パ節由来のリンパ球など）をフィーダー細胞として必要
に応じて使用することができる。

ＨＡＴ培地で増殖することによって選択されたハイブリ
ドーマは、抗体産生ウェルの検索に適した細胞個数に達
するまで、ＨＴ培地（ヒポキサンチン、チミジン、ウシ
胎児血清を含有した培地、この培地成分としては一般に
用いられるリンパ球培養用培地成分を用いることができ
る）で数日間培養し、さらに、−船釣に用いられるウシ
胎児血清を含有するリンパ球培養用培地で培養する。

（ｖ）抗体産生ハイブリドーマの選択前記（ｉｖ）で得られたハイブリドーマが、目的とする
抗体を産生じているか否かの検定は、例えば、ＥＬＩＳ
Ａ法（酵素免疫測定法）、プラーク形成法、凝集反応法
、ＲＩＡ（ラジオアイソ）　−プを用いた方法）、間接
蛍光抗体法（ＩＦＡ）などで行うことができるが、検定
数が非常に多い場合には、ＥＬＩＳＡ法で行うことが好
ましい。

このＥＬ　Ｉ　ＳＡ法は、以下のようにして行う。

ヒトＭｎ−ＳＯＤを固定化したＥＬＩＳＡプレ−トの各
ウェル（測定ウェル）に、ハイブリドーマ培養上清を加
えて一定時間静置する。そして、これらの洗浄した各測
定ウェルに結合したマウス由来の抗体と反応して結合す
ることができる酵素標識抗体（標識に用いる酵素は、例
えば、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、
β−ガラクトシダーゼなどを挙げることができる。標識
される抗体は測定ウェルに結合した動物由来の抗体だけ
と反応して結合することができる限り特に限定されず、
例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギなどから得られ
た血清、またはマウス細胞などを用いて作製されたハイ
プリドーマ株が産生したモノクローナル抗体を挙げるこ
とができる。）をこれらの測定ウェルに加えて一定時間
静置する。

次に、これらの測定ウェルを洗浄し、用いた酵素に対応
した基質溶液を加えて酵素活性を測定する。

そして、酵素活性が認められれば、その培養上清をとっ
た培養ウェル中に目的とする抗体を産生ずるハイブリド
ーマが存在していたことがわかる。

このようにして、細胞増殖が認められ、かつ抗体を産生
じているハイブリドーマを得ることができる。

（ｖｉ）ハイブリドーマの株化（クローニング）抗体産
性が認められた培養ウェル中のハイブリドーマは、限界
希釈法、シングル・セル・マニプレーション法（倒立顕
微鏡下、１ウエルに１個のハイブリドーマを入れる方法
）、軟寒天を用いてコロニーを拾い上げる方法、ＦＡＣ
３（Ｆ　ｌ　ｕ　。

ｒｅｃｅｎｔ　　Ａｃｔｉｖａｔｅｄ　　Ｃｅ１ｌＳｏ
ｒｔｅｒ）を用いた方法などでクローニングすることが
できる。この時、前記のいずれかのクローニング方法に
よって（ｖ）で見出した抗体産生ハイブリドーマを培養
し、その増殖が認められた培養ウェルの上滑を用い、（
Ｖ）の抗体産生ハイブリドーマの選択で行ったＥＬＩＳ
Ａ法と同様の方法で、抗体産生ウェルを検索する。

このようにして、ＨＩＶに対して特異性が高く、かつ抗
体価が高いモノクローナル抗体を産生ずるハイプリドー
マ株を選択することができる。

モノクロ−ル　　のＩＩ法ヒトＭｎ−ＳＯＤに対して特異性が高く、かつ抗体価が
高いモノクローナル抗体の生産は、前記（ｖｉ）で得た
ハイプリドーマ株をフラスコ内で培養したり、または動
物の腹腔内で培養することによって行うことができる。

前記（ｖｉ）で得たハイブリドーマ株のフラスコ内培養
での該モノクローナル抗体の生産は、例えば、０〜２０
％ウシ胎児血清を含む一般的に用いられるリンパ球培養
用培地（例えば、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＭｃＣｏｙ、ＲＰ
ＭＩ　１６４０などの培地成分を含む培地）で細胞濃度
が上限に達するまで培養することによって行うことがで
きる。この時、該モノクローナル抗体は、遠心操作で得
た培養上清中に含まれている。

一方、前記（ｖｉ）で得たハイプリドーマ株の動物腹腔
内培養での該モノクローナル抗体の生産は、細胞融合に
用いた細胞が由来する動物とは異種の動物を用いて行う
こともできるが、同種の動物を用いて行った方が好まし
く、さらに好ましくは同系の動物を用いて行った方がよ
い。

このような方法によるヒトＭｎ−ＳＯＤに対して特異性
が高く、かつ抗体価が高い該モノクローナル抗体の生産
は、マウス、ラット、ハムスターなどの適当な動物の腹
腔内にこの動物の免疫能を低下させる物質、例えば、ブ
リスタンなどの鉱物油を投与し、数週間後に１０ｈ〜１
０７個の前記（ｖｉ）で得たハイブリドーマ株細胞を投
与し、その腹腔内にこの株細胞を数週間で高密度に増殖
させることによって行うことができる。この時、該モノ
クローナル抗体は、遠心操作で得た腹水上清中に含まれ
ている。そして、その抗体濃度は、フラスコ内培養で得
た時の培養上清の抗体濃度の１０〜１０００倍である。

ハイプリドーマ株のフラスコ内または動物腹腔内での培
養で得られた該モノクローナル抗体は、蛍白質の一般的
な精製法に適用されている塩析、透析、イオン交換クロ
マトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーな
どを行うことによって精製され、高純度のモノクローナ
ル抗体となる。

前記のようにして得た該モノクローナル抗体は、ヒトＭ
ｎ−ＳＯＤに対して非常に高い特異的な反応性を有する
ものである。

〔実施例〕以下、本発明の実施例を具体的に説明する。なお、これ
らの実施例は、本発明の範囲を限定するものではない。

実施例１〔ヒトＭｎ−ＳＯＤに対するモノクローナル抗体産生ハ
イブリドーマ株の作製〕（ａ）マウスの免疫及び肺臓リンパ球の調製８０μｇの
ヒトＭｎ−ＳＯＤを溶解した１ｍｊ２のＰＢＳ　（リン
酸緩衝液、ｐ　Ｈ７，４）とＩｍｆのフロイントの完全
アジュバントとを充分に混合して得られたエマルジョン
の０．５　ｍ　ｌをＢＡＬＢ／Ｃマウス（♀、８週齢）
の腹腔内に投与した。

この初回免疫から２周間後にフロイントの完全アジュバ
ントのかわりにフロイントの不完全アジュバントを用い
た以外は前記と同様にして調製したエマルジョンの０．
５　ｍ　ｌを前記マウスの腹腔内に投与した。

さらに、２週間後に、最終免疫として、前記のヒトＭｎ
−ＳＯＤを２０ｕｇ溶解した０、　２　ｍ　Ｉ！のＰＢ
Ｓを前記マウスの尾静脈に投与した。

このようにして免疫されたマウスから、最終免疫から４
日目に摘出した肺臓を、水冷下に、１０ｍ２のＲＰＭ１
１６４０溶液（リンパ球培養用培地粉末を蒸溜水に溶解
したもの）を入れたシャーレ中で洗い、新たに用意した
ＲＰＭ１１６４０溶液の中に移し、ハサミで４等分し、
ピンセットでほぐした。

このようにして得た浮遊リンパ球を、ＲＰＭＴ１６４０
溶液に懸濁して、遠心分離しく回転数；１１０００ｒｐ
、時間；５分間）、ＲＰＭ１１６４０溶液に再懸濁し、
細胞融合に使用するマウス肺臓リンパ球とした。

（ｂ）細胞融合１．８２ＸＩＯ’個の対数増殖期にある８−アザグアニ
ン耐性のマウスミエローマ細胞（ＮＳ−１）と前記のマ
ウスの肺臓９７３球１．３９Ｘ１０Ｂ個とを５０ｍｆ容
プラスチック製コニカル遠心管に入れ、混合し、次いで
、上清を遠心分離した後に（回転数；１５００ｒｐｍ、
時間；５分間）０、同遠心管を軽くたたいてペレットを
ほぐした。

このペレットを激しく振とうしながら、この中に、５０
％ＰＥＧ４０００溶液（３７’Ｃ）を１分間かけてＩｍ
ｆ入れ、さらに、１分間激しく振とうした。

同遠心管を穏やかに振とうしながら１０ｍｆのＲＰＭＴ
１６４０溶液（３７°Ｃ）を３分間かけて徐々に加え、
さらに４０ｍ１のＲＰＭ１１６４０溶液（３７°Ｃ）を
加え、室温で２０分間静置した。

その後、室温で遠心分離（回転数；１０１０００ｒｐ時
間；５分間）して、上清を吸引除去した。

同遠心管を軽くたたいてペレットをほぐし、７５ｍ２の
ＨＡＴ培地（ＩＸＩＯ−４Ｍヒボキサンチン、４Ｘ１０
−’Ｍアミノプテリン、１．６Ｘ１０−５Ｍチミジン及
び２０％ウシ胎児血清を含有するＲＰＭ１１６４０培地
、３７°Ｃに保温）に懸濁して、９６ウエルの培養プレ
ート７枚の各培養ウェルに１００μβづつ分注して、Ｃ
Ｏｚインキュベーターを用いて培養した（５％ＣＯ□、
９５％空気、３７°Ｃ１湿度１００％）。

細胞融合から４日目と６日゛目に上記ＨＡＴ培地を５０
μβづつ加え、それ以後は２日おきに５０μｌのＨＴ培
地（ＩＸＩＯ−’Ｍヒポキサンチン。

１．６Ｘ１０−’Ｍチミジン及び２０％ウシ胎児血清を
含有するＲＰＭ１１６４０培地、３７°Ｃに保温）と同
量交換した。

（Ｃ）ハイブリドーマの選択前述Φ）の培養開始から１〜３週間かけて、細胞増殖が
認められた培養プレートの各ウェルの培養上滑中に、ヒ
トＭｎ−ＳＯＤに対する抗体が含まれているか否かを、
次に示すＥＬＩＳＡ法で検討した。

まず、９６ウエル平底Ｅｌ、ＩｓＡプレートの各分析ウ
ェルに、ヒトＭｎ−ＳＯＤに対するポリクローナル抗体
溶液（ヤギ製、１００μｇ　／　ｍ　ｌ、ｐ　Ｈ９，８
の０．０５　Ｍ炭酸緩衝液に溶解）を５０μ２づつ分注
し、室温で２時間静置した。

次いで、ＥＬ　Ｉ　ＳＡプレートの各分析ウェルを洗浄
液（０，０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で２回
洗浄した後、０．１％のＯＶＡ　（卵白アルブミン）溶
液（ＰＢＳに溶解）を各分析ウェルに１００μ２づつ分
注して室温で３０分間静置し、゛洗浄液で２回洗浄し、
ヒトＭｎ−ＳＯＤ溶液（１μｇ／ｍｆ）を５０μｌづつ
分注し、４℃で１晩静置した。この各分析ウェルを同洗
浄液で２回洗浄した後、前記培養プレートの各培養ウェ
ルの培養上清を、これらの各分析ウェルに５０μｌづつ
分注して３７°Ｃで１時間静置した（陰性対照には、マ
ウスミエローマ細胞を同様に培養して得た上清を用いた
。一方、陽性対照には、本発明での細胞融合に用いたマ
ウスの血清を洗浄液で１０倍に希釈したものを用いた。

）。

次に、ＥＬＩＳＡプレートの各分析ウェルを洗浄液で３
回洗浄し、マウスのＩｇＧ及びＩｇＭと反応性を有する
西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗体溶液を、５０μ２
づつ、各分析ウェルに分注し、室温で１時間静置した。

そして、ＥＬ　Ｉ　ＳＡプレートの各分析ウェルを洗浄
液で４回洗浄後、基質溶液（２０ｍｇの０−）ユニレン
ジアミン、１０μ！の３５％Ｈ２ＯＲをＰ　Ｈ５，０の
０．１Ｍクエン酸緩衝液５０ｍ１に溶解）を１００μβ
づつ各分析ウェルに分注し、遮光して室温で３０分反応
後、各分析ウェルに５０μｌの２Ｎ硫酸を分注して酵素
反応を停止し、マイクロプレート用の吸光度測定装置を
用いて各ウェルの４９０ｎｍにおける吸光度を測定した
。

このような検討の結果、培養プレート中の６７８個の培
養ウェルの中の８個で、ヒトＭｎ−３゜Ｄに対する抗体
の産生が認められた。

（ｄ）ハイブリドーマの株化（クローニング）２０％ウ
シ胎児血清を含むＲＰＭ１１６４０培地を用いて、前述
の（Ｃ）工程において示した抗体産生が確認された８個
の培養ウェルのうちの１個の培養ウェルについて限界希
釈法でハイブリドーマをクローニングした。

培養には、９６ウエル培養プレートを用い、支持細胞と
してＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスの胸腺細胞懸濁液（
１０？個／　ｍ　ｊ１！　）を使用して、（ハイブリド
ーマ０．１〜５個）／（胸腺細胞懸濁液１００μり／ウ
ェルで培養した。

前記の１個の培養ウェルのクローニングにおいて、１０
日目頃から単一コロニーとして観察される培養ウェルの
上清を採取して、ヒトＭｎ−３０Ｄを用いたＥＬＩＳＡ
法（前述の（Ｃ）工程と同様の方法）で抗体産生ウェル
のスクリーニングを行なった。ヒトＭｎ−ＳＯＤに対し
て抗体産生が認められた上清については、さらに、ヒト
グロブリン、ヒトアルブミン及びヒトＣｕ、Ｚｎ−ＳＯ
Ｄとの反応性をＥＬＩＳＡ法（前述の（Ｃ）工程と同様
の方法）で検討した。このようにして、ヒトＭｎ−ＳＯ
Ｄのみと反応性を示す抗体を産生したハイブリドーマ株
を、各々のクローニングにおいて少なくとも１株づつ得
、これらを再クローニングした。

このようにして得られた株をＮ１８株（微工研条寄第１
６０６号）と称し、この株が産生したモノクローナル抗
体を、Ｎ１３と称す。

Ｎ１８株の培養上清中に含まれるモノクローナル抗体の
クラス・サブクラスを次の測定試験■で決定し、ヒトＭ
ｎ−ＳＯＤとモノクローナル抗体との反応性を測定試験
■で確認し、各種蛍白質に対する反応性を測定試験■で
検討した。

■定蕃鼓土〔ヒトＭｎ−ＳＯＤに対するモノクローナル抗体のクラ
ス・サブクラスの決定〕Ｎ１８株が産生じた免疫グロブリンのクラス・サブクラ
スの決定は、マウス抗体の各クラス・サブクラスに特異
的な抗体溶液（Ｉ　ｇＧｔ　、Ｉ　ｇＧ２ａ、Ｉ　ｇＧ
ｔ　ｂ　、Ｉ　ｇＧ３、ＩｇＭ、ＩｇＡなどに対する抗
体）を用いたオフタロニー法で行った。

その結果、Ｎ１８株が産生したモノクローナル抗体（Ｎ
１３）は、ＩｇＭに属する抗体であることがわかった。

貫定拭荻工〔ヒトＭｎ−ＳＯＤとモノクローナル抗体との反応性の
確認〕３０μ２のヒトＭｎ−３００（１０ｕ　ｇ／ｍりと５０
ｍ１のＮ１Ｂを含む培養上清（１倍、１０倍または１０
０倍希釈液を使用）とを混合して、３７°Ｃで３０分間
反応させた後、プロティンＡアガロース溶液（プロティ
ンへの結合量；１〜２　ｍ　ｇ　／　ｍ　ｆアガロース
ゲル）を１０ｕｌ加え、さらに、３７°Ｃで１０分間反
応させた後に、遠心分離しく１万ｒｐｍ、５分間）、上
澄液のヒトＭｎ−ＳＯＤ活性を測定した（なお、陰性の
コントロールにはミエローマの上清を用いた）。

その結果、上澄液のヒトＭｎ−ＳＯＤ活性は、低下して
いた（第１図に示す）。

１定成験ｌ［ヒトＭｎ−ＳＯＤに対するモノクローナル抗体と各種
蛋白質との反応性の検討］Ｎ１３の反応特異性について、ヒトアルブミン、ヒトグ
ロブリン、ヒトＣｕ、Ｚｎ−ＳＯＤ、ヒトＭｎ−ＳＯＤ
などの各種蛍白質との反応性をウェスタンブロッティン
グ法によって検討した。その結果、Ｎ１３はヒトＭｎ−
ＳＯＤとのみ反応性が認められ、その他の蛋白質とは反
応性が認められなかった。

実施例２〔ヒトＭｎ−ＳＯＤに対するモノクローナル抗体産生ハ
イブリドーマ株の作製〕（ａ）マウスの免疫及び肺臓リンパ球の調製実施例１と
同様にして、免疫及び肺臓リンパ球の調製を行った。

■）細胞融合実施例１に記載した操作のうちで、１．７　Ｘ　１０フ
個の対数増殖期にある８−アザグアニン耐性のマウスミ
エローマ細胞（Ｐ３Ｕ１）と前記の調製したマウスの肺
臓リンパ球８．５Ｘ１０’個とを用いた以外は、同様の
操作で行った。

（Ｃ）ハイブリドーマの選択実施例１に記載した操作で行った。

このような検討の結果、培養プレート中の６７８個の培
養ウェルの中の２０個で、ヒトＭｎ−ＳＯＤに対する抗
体の産生が認められた。

（ｄ）ハイブリドーマの株化（クローニング）２０％ウ
シ胎児血清を含むＲＰＭ１１６４０培地を用いて、前述
の（Ｃ）工程において示した抗体産生が確認された２０
個の培養ウェルのうちの１個の培養ウェルについて、実
施例１と同様の操作を行うことによって、ハイブリドー
マをクローニングした。

このようにして得られた株をＰＥ９株（微工研条寄第１
６０７号）と称し、この株が産生したモノクローナル抗
体を、ＰＥ９と称す。

ＰＥ９株の培養上清中に含まれるモノクローナル抗体の
諸性質を実施例１と同様の操作を行うことによって検討
した。その結果、ＰＥ９のクラス・サブクラスは、Ｉｇ
Ｍに属していた。ＰＥ９とプロティンＡアガロース溶液
とを反応させて得られた上澄液のヒトＭｎ−ＳＯＤ活性
は、低下していた（第１図に示す）。ＰＥ９はヒトＭｎ
−３゜Ｄとのみ反応性が認められ、その他の蛋白質とは
反応性が認められなかった。

実施例３〔ヒトＭｎ−ＳＯＤに対するモノクローナル抗体産生ハ
イブリドーマ株の作製〕（ａ）マウスの免疫及び肺臓リンパ球の調製実施例１と
同様にして、免疫及び肺臓リンパ球の調製を行った。

（ｂ）細胞融合実施例１に記載した操作のうちで、１．４　Ｘ　１０７
個の対数増殖期にある８−アザグアニン耐性のマウスミ
エローマ細胞（Ｐ　３　Ｕ　１　）と前記の調製したマ
ウスの肺臓リンパ球５．３Ｘ１０７個とを用いた以外は
、同様の操作で行った。

このような検討の結果、培養プレート中の６７８個の培
養ウェルの中の１５個で、ヒトＭｎ−３○Ｄに対する抗
体の産生が認められた。

（ｄ）ハイブリドーマの株化（クローニング）２０％ウ
シ胎児血清を含むＲＰＭ１１６４０培地を用いて、前述
の（Ｃ）工程において示した抗体産生が確認された１５
個の培養ウェルのうちの１個の培養ウェルについて、実
施例１と同様の操作を行うことによって、ハイブリドー
マをクローニングした。

このようにして得られた株をＰＣ；１１株（微工研条寄
第１６０８号）と称し、この株が産生したモノクローナ
ル抗体を、ＰＧＩ　１と称す。

２６１１株の培養上清中に含まれるモノクローナル抗体
の諸性質を実施例１と同様の操作を行うことによって検
討した。その結果、ＰＧＩＩＯクラス・サブクラスは、
ＩｇＧ、ａに属していた。

ＰＧＩＩとプロティンＡアガロース溶液とを反応させて
得られた上澄液のヒト　Ｍ　ｎ　−Ｓ　ＯＤ活性は、Ｉ
ｇＭである抗体のＮＩＢ及びＰＥ９よりもプロティンＡ
と反応し易いので、これらの場合よりも著しく低下して
いた（第１図に示す）。ＰＣＩＩはヒトＭｎ−ＳＯＤと
のみ反応性が認められ、その他の蛋白質との反応性は認
められなかった。

実施例４〔フラスコ培養でのヒトＭｎ−ＳＯＤに対するモノクロ
ーナル抗体の生産〕１５％ウシ胎児血清を含むＲＰＭ１１６４０培地で培養
して得たＮ１８株の培養細胞を１０ｍ！のＲＰＭ１１６
４０液（ウシ胎児血清を含まない）に移しかえて、死滅
直前まで培養した。

ヒトＭｎ−ＳＯＤに対するモノクローナル抗体（ＮＩＢ
）は、培養液を遠心分離（回転数；３０００ｒｐｍ、時
間；５分間）して得られた上清中に３５μｇ／ｍｊ２　
（−次元平板免疫拡散法により測定）含有されていた。

実施例５〔マウス腹腔内でのヒトＭｎ−８ＯＤに対するモノクロ
ーナル抗体の生産〕ヒトＭｎ−ＳＯＤに対する大量のモノクローナル抗体を
得るために、マウス腹腔内でＰＣＩＩ株の細胞を培養し
た。

Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　Ｃ７ウス（♀、６周齢、２週間前
にプリスタンを０．５　ｍ　ｌ腹腔内に投与しておく）
の腹腔内に、ＲＰＭ１１６４０で浮遊させた２６１１株
の細胞を５Ｘ１０６個投与した。

このマウスの体重は、１週間目頃から顕著な増加を示し
、２週間目に腹水（１０ｍｌ／匹）を採取した。この腹
水を遠心分離（回転数；３０００ｒｐｍ、時間；５分間
）して、腹水上清を得た。

ヒトＭｎ−ＳＯＤに対するモノクローナル抗体（ＰＣ，
１１）は、この腹水上清中に８．０ｍｇ／ｍｊ２（−次
元平板免疫拡散法により測定）含有されていた。

〔発明の効果〕

本発明のｒｔｉｓ胞株の培養によって得られたヒトＭｎ
−ＳＯＤに対して非常に高い特異的な反応性を有するモ
ノクローナル抗体」は、ヒトＭｎ−ＳＯＤに関する基礎
研究のための試薬、および臨床検査において用いる測定
試薬などへの用途として期待できる。

４、図面の説明第１図は、ヒトＭｎ−ＳＯＤとＮＩＢ　（ロ）、ＰＥ９
（■）またはＰＧＩＩ（・）を含む培養上清（１倍、１
０倍または１００倍希釈液を使用）とを混合して、３７
°Ｃで３０分間反応させた後、プロティンＡアガロース
を加え、さらに、３７°Ｃで１０分間反応させた後に、
遠心分離して得られた上澄液のヒトＭｎ−８ＯＤの相対
活性を示す〔なお、対照としては、Ｎ５−１株の培養上
清（○）を用いた〕。

特許出願人　　宇部興産株式会社

Claims

【特許請求の範囲】

（１）ヒトＭｎスーパーオキシドジスムターゼ（以下、
ヒトＭｎ−ＳＯＤと略す）をマウスに免疫し、そのマウ
スから得たリンパ球とマウスミエローマ細胞とを融合し
て得られた細胞株が産生したヒトＭｎ−ＳＯＤのみに対
して高い特異性を有することを特徴とするヒトＭｎ−Ｓ
ＯＤに対するモノクローナル抗体。
（２）ヒトＭｎスーパーオキシドジスムターゼ（以下、
ヒトＭｎ−ＳＯＤと略す）をマウスに免疫し、そのマウ
スから得たリンパ球とマウスミエローマ細胞とを融合し
て得られた細胞株を培養することを特徴とするヒトＭｎ
−ＳＯＤのみに対して高い特異性を有するヒトＭｎ−Ｓ
ＯＤに対するモノクローナル抗体の製法。