JPH01259258A - ライム病抗体検出用凝集反応試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、新規なライム病抗体検出用凝集反応試薬に関
する。詳しくは、ボレリアバルグドルフ工り　（Ｂｏｒ
ｒｅｌｉａ　　ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ　）由来の抗原
成分を担体粒子に感作して成るライム病抗体検出用凝集
反応試薬である。

〔従来の技術及び発明が解決しようとする問題点〕ライ
ム病はスピロヘータによる全身性感染症である。典型的
な経過は「インフルエンザ様」や「髄膜炎様」の症状を
伴う慢性遊走性紅斑の皮膚病変で始まり、数回から数カ
月後に神経系や循環器系の症状が、更にその後関節症状
が出現する。

本庁はマダニによって媒介され、マダニの活動に一致し
て夏場に多発する。病原体であるスピロヘータは媒介種
であるマダニやライム病患者の血液、髄液、皮膚病変部
から分離され、ボレリアバルブドルフェリと命名されて
いる（サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２１６巻、１３
１７頁、１９８２年）。

従って、ライム病感染の有無を検査することは臨床上、
疫学上及び輸血において重要である。

従来、ライム病の検査方法として、細菌凝集法、酵素抗
体法、間接螢光抗体法などが開発されているが、これら
の方法は操作が煩雑で長時間を要するだけでなく、特に
細菌凝集法に関しては、感度、特異性にも問題がある。

また、これらの測定法は特別な測定組成物が必要な場合
もある。

〔問題を解決するための手段〕

本発明者らは上記血清学的検査方法の欠点を解決すべく
、特異性と感度に優れ、かつ簡便、迅速に検査する方法
を鋭意研究してきた。

その結果、本発明者らはボレリアバルブドルフェリ由来
の抗原成分を感作した担体粒子がライム病患者の抗体と
特異的に凝集反応し、極めて簡便容易に、ライム病を検
査できることを見出し、本発明を完成した。

即ち、本発明は、ボレリアバルブドルフェリ由来の抗原
成分を担体粒子に感作して成るライム病抗体検出用凝集
反応試薬である。

本発明に使用するボレリアバルブドルフェリ由来の抗原
成分は、ボレリアバルブドルフェリを破壊して得られる
、静置状態で水又は緩衝液中に分散又は溶解可能な成分
である。かかる抗原成分（以下、可溶性抗原成分という
）は、ボレリアバルブドルフェリＴ−１７、Ｂ３１、Ｔ
ＬＯ−００４、等の株病原体から公知の方法によって取
得することができる。例えば、ボレリアバルブドルフェ
リＴ−１７などの株化病原体を培養し、培養液から増殖
させたＴ−１７株病原体を回収してから、この細胞を破
砕して上清を回収することにより可溶性抗原成分を取得
すればよい。また、ボレリアバルブドルフェリは公知の
方法によりマダニから分離できるし、またライム病患者
の血液、髄液、皮膚病変からも分離できる。あるいは、
アメリカ合衆国のエール大学またばＣ［Ｉ　Ｃ（Ｃｅｎ
ｔｅｒ　ｆｏｒＤｉｓｅａｓｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　　：
疾患管理センター）から分譲を受けることもできる。上
記ボレリアバルブドルフェリは人工培地での培養が可能
である。そして、可溶性抗原成分の取得、は、増殖した
株化病原体を回収し、よく洗浄した後、超音波等で細胞
を破壊し、次いで沈澱物を除くことによって行うことが
できる。

上記したボレリアバルブドルフェリ株化病原体の培養は
、公知の培養液、例えば、ＢＳＫ培地（カレント　マイ
クロバイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎ　ｔＭｉｃｒｏｂｉｏ
ｌｏｇｙ）　、８巻、１２３〜１２６頁、１９８３年）
あるいはＫｅｌｌｙ培地（アプライドマイクロバイオロ
ジー（八ｐｐＨｅｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、２
８巻、５４０頁、１９７４年）等を用いて容易に行うこ
とができる。

また、ボレリアバルブドルフェリ株化病原体の細胞の破
砕方法は特に制限されず、水又は緩衝液中において、公
知の方法、例えば、凍結・融解の繰り返し、乳鉢での破
砕、超音波破砕等を適宜採用できるが、超音波による破
砕が効率的であり、好ましく採用される。また、破砕し
た抗原溶液から上清の採取方法は公知の方法によればよ
く、例えば、遠心分離あるいは濾過によって行うことが
できる。かかる上清中に可溶性抗原成分が存在する。

本発明に使用する担体粒子としては、感作、保存、およ
び測定を行うときに用いられる液体媒体に実質的に不溶
性の担体粒子であり、平均粒子径１０μｍ程度以下の微
粒子が好適に用いられる。

これらの担体粒子はすでに抗原抗体反応に使用されるも
のが種々知られていて、本発明にあってもこれらの公知
の微粒子が限定されずに使用できる。特に好適に使用さ
れるものを例示すると例えば、ポリスチレン、スチレン
−メタクリル酸共重合体、ポリグリシジルメタクリレー
ト、アクロレイン−エチレングリコールジメタクリレー
ト共重合体のような乳化重合により得られる有機高分子
ラテックス等の有機高分子の微粒子、ポリーＴ−メチル
グルタマート、コラーゲン等のポリペプチドの微粒子、
あるいはシリカ、シリカ−アルミナ、アルミナの様な無
機酸化物、染料と無機酸化物の複合体粒子（特願昭６１
−１４９６４４号）又は該無機酸化合物等にシランカッ
プリング処理等の操作で官能基を導入した無機粒子さら
にはヒト０型赤血球、ヒツジ赤血球等の生物由来の粒子
などである。赤血球は保存性の観点から固定赤血球を使
用するのが好ましい。固定赤血球は、例えば、アルセパ
−（Ａ　１ｓｅｖｅｒ）液に懸濁させた生赤血球を一酸
化炭素ガスで処理し、この赤血球にポルマリンを加えて
、固定化する。

上記担体粒子の粒子径は凝集反応の測定方法によって異
なるが、平均粒子径が１０μｍ程度以下、好ましくは０
．０５〜８μｍの微粒子が好適に用いられる。

本発明の凝集反応試薬を用いてライム病抗体を測定する
方法は、その目的に応じて公知の方法を利用することが
できる。例えば、平均粒子径が０．０５〜１μｍの微粒
子に感作した試薬と被検血清をガラス板上で１〜１０分
間振とうし続けて凝集の有無を肉眼で判定するスライド
テスト法、又は平均粒子径が０．０５〜０．５μｍの微
粒子に感作した試薬と被検血清を光学セル内で混合し、
抗原抗体反応の進行にともなう透過光又は散乱光の変化
を測定する光学的測定方法、さらに又は被検血清が一定
の希釈倍率で希釈添加されたマイクロタイタープレー１
−のウェル内に平均粒子径が０．５〜１０μｍの微粒子
に感作した試薬を加えて攪拌し、３０分〜１夜後に凝集
像の希釈系列を測定するマイクロタイターテスト法が利
用される。これらの測定方法の中で特に、マイクロタイ
ターテスト法は特別の測定装置を用いなくても、多量の
検体を迅速に且つ高感度で特異的に定量分析できるので
、好適に採用される。

本発明の検出試薬の製造方法において、担体粒子に前記
可溶性抗原成分を感作させる手段は、特に限定的ではな
いが、ｐ１１５〜１０、好ましくはｐｉ（６〜８の緩衝
液中において、濃度０．０５〜５％の担体粒子と可溶性
抗原成分とを４〜５０℃で１０分〜２４時間浸とうさせ
ながら接触させることにより行う方法が好適である。緩
衝液としては、例えば、グリシン緩衝液、リン酸緩衝液
等を用いることができる。担体粒子として固定化赤血球
を用いる場合には、タンニン酸、グルタヌルアルデヒド
、塩化クロム等のカップリング剤、特にタンニン酸で予
め処理することが好ましい。

担体粒子に可溶性抗原成分を感作終了後は、未感作の抗
原を生理食塩水若しくは上記緩衝液で洗浄して完全に除
去することが好ましい。更に、この感作した担体粒子は
蛋白質を含む希釈液に懸濁させて担体粒子の抗原未感作
部分を蛋白質でブロックしておくことが該試薬の保存安
定性を向上させるために望ましい。

本発明の凝集反応試薬は希釈液中に保存しておいてもよ
い。かかる希釈液としては、例えば、前記緩衝液に牛血
清アルブミンあるいは兎血清等の蛋白質を約０．１〜５
％加えたものを用い、０．０１〜０．５％のアジ化すｌ
・リウムを加えたものが一般に使用される。

本発明の凝集反応試薬は希釈液中で安定であるが、例え
ば、これを凍結乾燥することにより、更に長時間保存す
ることができる。この凍結乾燥品は使用に際して希釈液
を加えて溶解させるだけで、新鮮製品と全く同様にして
使用することができる。

更に、本発明の凝集反応試薬は、凝集反応の測定方法に
よって異なるが、試薬希釈液、血清希釈液、標準血清、
未感作担体粒子、さらには非特異反応吸収液などと組み
合わせて測定に供される。

〔作用及び効果〕

本発明の凝集反応試薬は、ライム病患者の抗体と特異的
に且つ感度よく凝集反応するという特徴を有する。従っ
て、この凝集反応試薬を用いたうイム病抗体の測定は、
本発明のボレリアハルグドルフェリ由来の抗原成分を感
作された担体粒子懸濁液をヒ１〜の血清もしくはその希
釈液と接触させ、受身凝集反応にもとずく陽性像を観察
することにより高精度で且つ容易に行うことができる。

特に、マイクロタイター法によるものが最も好ましい。

本発明の凝集反応試薬を用いたマイクロタイター法によ
るライム病抗体の測定は、（１１操作が極めて簡単であ
る、（２）−度に多検体の測定が容易である、（３）僅
か３０〜２０時間で判定が可能である、（４）特別の装
置を必要としない、（５）感度が高い、（６）特異性が
高い、（７）低価格で実施できる、等の特徴がある。

このように、本発明の凝集反応試薬は、ライム病抗体測
定の特異性と感度に優れ、かつ簡便、迅速に検査する方
法を可能とするものである。

〔実施例〕

以下、実施例により更に本発明の詳細な説明するが、本
発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

実施例１ （ａｉボレリアハルグドルフェリ由来の抗原成分の作製 アメリカ合衆国エール大学から分譲されたボレリアバル
グドルフェリＴ−１７株を、ウサギ血清を加えたＢＳＫ
培地（カレント　マイクロバイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎ
ｔ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）　、８巻、１２３〜１
２６頁、１９８３年）にて継代培養した。

ＢＳＫ培地で十分に増殖させたＣ−１７株を回収し、リ
ン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄した。

次いで、菌体を超音波装置で破砕後、冷却下に１０．０
００ｃにて３０分間遠心分離して、上清を得ることによ
り、可溶性抗原成分、即ち、ポレリアバルグドルフェリ
由来の抗原成分を回収した。

（ｂｌ担体粒子の作製 攪拌機付きガラス製フラスコ中にメタノール２８００ｍ
１、アンモニア水（２５％重量％）６１６ｍｌ、水酸化
ナトリウム水溶液（５モル／１２０ｍ１を加え、１０°
Ｃに保った後に、テトラエチルシリケートのメタノール
溶液（２２重量％）２５０ｍｌを２５ｍ１／ｈｒの速度
で清々添加し、シリカ粒子を作った。このシリカ粒子を
含む反応液中にさらにテトラエチルシリケートのメタノ
ール溶液（４４重量％）６２５ｍｌとダイアクリレッド
ＭＳ−Ｎ染料のメタノール溶液（１，２５重量％）４０
０ｍｌを同時に２５ｍ１／ｈｒの速度で満々添加し、先
に該染料のメタノール溶液の滴下が終了するように染料
で着色した粒子径が１．８μｍのシリカ粒子を合成した
。得られたシリカ粒子をメタノールでデカンテーション
による精製と洗浄を繰り返した。次いで得られた着色粒
子を１０重量％濃度になる様にメタノールに分散し、そ
の分散液１００ｍ１にトリフェニルクロルシランが０．
５重量％濃度になるように添加し、１０°Ｃで１６時間
表面処理して、担体粒子（ＨＤＰ）を得た。

（Ｃ）ボレリアバルブドルフェリ抗原の成分の感作（ｂ
）で得られたＩ−Ｉ　Ｄ　ＰのＰＢＳ５％懸濁液１容量
とポレリアハルグドルフェリ抗原成分を１７０μｇ／　
ｍ　Ｉ濃度で含むＰＢＳ溶液１容量を室温で５分毎に振
とうしながら１時間混合した。次いで、感作ＨＤＰをＰ
ＢＳで２回洗浄したから、３％ウサギ血清含有ＰＢＳ分
散媒に０．５％濃度になるように分散させて、ボレリア
ハルグドルフェリ抗原成分を感作した凝集反応試薬を作
製した。

（ｄｌ凝集反応試験 ５６℃で３０分間非働化した被検血清を３％ウサギ血清
含有ＰＢＳ分散媒で倍数希釈した２５μ１と（Ｃ）で得
られた０、５％濃度の凝集反応試薬２５μｌをマイクロ
プレートウェル内で混合し、次いでマイクロプレートミ
キサーで十分に振とうしてから室温で６０分放置して抗
体価を測定した。凝集反応が陽性と判定した最大希釈倍
数をもって抗体価とした。その結果を表１に示した。尚
、表１には酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ）の結果も合わせて
示した。

表１ Ａ　　　　　６４０　　　　１．６５ Ｂ　　　　　３２０　　　　０．６６ Ｄ　　　　　１６０　　　　０．３１ Ｅ　　　　　＜　４０　　　　０．２５上記の結果より
、凝集反応抗体価はＥＬＩＳＡと一定の相関が見られる
ことがわかる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ボレリアバルグドルフェリ（￥Ｂｏｒｒｅｌｉａ￥￥ｂ
   ｕｒｇｄ−ｏｒｆｅｒｉ￥）由来の抗原成分を担体粒子
   に感作して成るライム病抗体検出用凝集反応試薬。