JPH0113360B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は酸性多糖類の製法、さらに詳しくは、
ウロン酸を含む酸性多糖類の微生物的製法に関す
る。 従来から、各種の細菌がウロン酸を含む酸性多
糖類を菌体外に産生することが知られており、そ
のような細菌を液体培地中で培養し、産生された
多糖類を培養液から沈澱、精製することが行な
われている。例えば、キサントモナス・キヤンペ
ストリス（Xanthomonas campesteris）を培養
してザンサンカムを得、また、アルスロバクタ
ー・ビスコーサス（Arthrobacter viscosus）を
培養してグルコース、ガラクトースおよびマンヌ
ユロン酸を構成糖とする酸性多糖類が得られてお
り、これらの多糖類は増粘剤、ゲル化剤、賦形
剤、エマルジヨン安定剤、捺染用糊剤、サイジン
グ用糊剤、凝集剤などとして広く利用されてい
る。 本発明者は、かかる酸性多糖類の微生物的製法
について種々研究を重ねる間に、ある種の物質を
培地中に存在させると、目的とする多糖類の収率
が著しく向上することを見出し、本発明を完成す
るにいたつた。 すなわち、本発明は、ウロン酸を含む酸性多糖
類を菌体外に産生する細菌を液体培地中で培養
し、産生された酸性多糖類をその培養液より沈
澱、精製するに際し、培地中にアンカツプラーと
なる物質を添加し、培養することを特徴とする酸
性多糖類の製法を提供するものである。アンカツ
プラーは細菌の増殖に際し、ATP生成を阻害し、
ヘキソキナーゼの阻害をなくし、また、ヌクレオ
シド二リン酸の糖誘導体（糖ヌクレオシド）の酸
化、すなわち、ヌクレオシド二リン酸のウロン酸
誘導体の生成を促進し、ウロン酸を含む酸性多糖
類の収率を向上させるものと考えられる。 かくして、本発明によれば、通常用いられる液
体培地にアンカツプラーを処方し、これを用い、
常法に従つてウロン酸含有酸性多糖類を菌体外に
産生する細菌を培養することにより、ウロン酸含
有酸性多糖類が高収率で得られる。 用いる細菌としては、エンテロバクター属
（Enterobacter）、エルビニア属（Erwinia）、ア
エロモナス属（Aeromonas）、バチルス属
（Bacillus）、キサントモナス属
（Xanthomonas）、クレブシエラ属（Klebsiella）
およびアルスロバクター属（Arthrobacter）に
属する菌体外にウロン酸含有酸性多糖類を産生す
る菌が挙げられる。本発明者は、良好なウロン酸
含有酸性多糖類産生能を有する３つの新たな菌株
を見出した。これらは、各々、エンテロバクタ
ー・シマーナス（Enterobacter simanus）微工
研菌寄第5795号、エルビニア・ミツエンシス
（Erwinia mituyensis）微工研菌寄第5796号およ
びアエロモナス・ニチデニイ（Aeromonas
nichidenii）微工研菌寄第5797号として工業技術
院微生物工業技術研究所に寄託しており、これら
も本発明の方法において好適に用いられる。な
お、これらの新菌株の菌学的性質は後の実施例中
に詳記する。 また、アンカツプラーとしては、２，４−ジニ
トロフエノール（DNP）、３，５−ジ−ｔ−ブチ
ル−４−ヒドロキシベンジリデンマロノニトリル
（SF6847）、５−クロロ−ｔ−ブチル−2′−クロ
ロ−4′−ニトロサリチルアニリド（Ｓ−13）、カ
ルボニルシアニド−ｐ−トリフルオロメトキシフ
エニルヒドラゾン（FCCP）、カルボニルシアニ
ド−ｍ−クロロフエニルヒドラゾン（CCCP）、
４，５，６，７−テトラクロロ−２−トリフルオ
ロメチルベンズイミダゾール（TTFB）、ペンタ
クロロフエノール（PCP）、ヘキサクロロフエ
ン、フルフエナム酸、メフエナム酸、キサントメ
ジン、２−アジド−４−ニトロフエノールおよび
ギ酸、酢酸、プロピオン酸、安息香酸、コハク
酸、酒石酸、リンゴ酸、アスコルビン酸またはこ
れらのアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、ア
ンモニウム塩もしくはアミン塩から選ばれる物質
が挙げられる。アンカツプラーの培地への添加量
は実際に用いるアンカツプラーの種類、細菌の種
類などによつて異なるが、通常、ギ酸、酢酸、プ
ロピオン酸、安息香酸、コハク酸、酒石酸、リン
ゴ酸、アスコルビン酸またはこれらのアルカリ金
属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩もし
くはアミン塩では培地中、２〜25ｇ／の濃度で
良好な結果が得られ、また、DNPでは５〜100
mg／、CCCPでは50〜1000μ／、SF6847、Ｓ
−13、FCCP、TTFBなどにおいては５〜100μ
ｇ／の濃度で良好な結果が得られる。 本発明における他の培地成分は特に限定するも
のではなく、通常用いられるいずれの成分も使用
することができ、例えば、少くとも１種の単糖類
または二糖類物質（例えば、グルコース、シヨ
糖、澱粉加水分解物など）を炭素源として約20〜
100ｇ／、酵母エキス、ペプトン、デイステイ
ラーズソルブル、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリ
ウムなどを窒素源として約１〜10ｇ／、さら
に、微量成分としてリン酸塩源約0.3〜２ｇ／、
マグネシウム源約0.1〜２ｇ／、カリウム源約
0.3〜２ｇ／、ナトリウム源約１〜10ｇ／、
カルシウム源約0.05〜10ｇ／、硫酸塩源約0.1
〜２ｇ／、モリブデン源約0.001〜0.05ｇ／、
鉄源約0.001〜0.05ｇ／を処方する。これらの
微量成分の例としてはKH₂PO₄、K₂HPO₄、
MgSO₄、NaCl、CaCl₂、CaCO₃、Na₂MoO₄、
FeSO₄、MnSO₄などが挙げられる。また、培地
PHを5.0〜9.0に調整することが目的とする多糖類
の収率向上の点で望ましい。培地PHは、細菌の培
養に対して悪影響を及ぼさないような手段で常法
に従つて調整できる。例えば、水酸化ナトリウム
水溶液のようなアルカリ溶液を培地に間けつ的に
加えることにより調整できる。 本発明の方法を実施するには、所定の成分を水
に分散、溶解して調整した滅菌液体培地に所定の
細菌を適量接種し、好気性条件下、約20〜37℃で
72〜120時間培養する。培養後、培養液を過あ
るいは遠心分離などして菌体を分離し、その液
から常法、例えば、イソプロパノールのようなア
ルコール添加により生成した酸性多糖類を沈澱さ
せ、これを、水に溶解後、第４級アンモニウムに
よる再沈澱、イオン交換樹脂による吸着のような
方法で精製して目的とする酸性多糖類を得る。 本発明の方法によれば、ザンサンガム、フコー
ス、ガラクトース、グルコースおよびガラクチユ
ロン酸を構成糖とする多糖類、フコース、グルコ
ース、ガラクトースおよびグルクロン酸を構成糖
とする多糖類、キシロース、マンノース、ガラク
トース、グルコースおよびマンヌユロン酸を構成
糖とする多糖類、マンノース、グルコース、ガラ
クトースおよびグルクロン酸を構成糖とする多糖
類、グルコース、ガラクトースおよびマンヌユロ
ン酸を構成糖とする多糖類などのウロン酸含有多
糖類がきわめて良好な収率で得られ、これらは、
増粘剤、ゲル化剤、賦形剤、エマルジヨン安定
剤、捺染用糊剤、サイジング用糊剤、凝集剤など
として利用することができる。 つぎに実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説
明するが、これらに限定されるものではない。 実施例 １ つぎの菌学的性質を有するエンテロバクター・
シマーナス 微工研菌寄第5795号を用いた。 (1) 形態的性質 形態：球形〜短桿菌、胞子形成せず 運動性：周毛を有し、運動性を示す 大きさ：1.0×1.0〜3.0μ グラム染色：陰性 抗酸性：陰性 (2) 各培地における生育状態 肉汁培地：白濁 リトマスミルク培地：凝固、赤変する 肉汁寒天培地：黄色円形コロニーを形成し、も
り上る グルコース肉汁寒天培地：黄色円形コロニーを
形成し、もり上る ゼラチン穿刺培養：変化せず (3) 生理学的性質 至適生育温度：30〜37℃ 生育PH：５〜９（至適生育PH：６〜７） 酸素要求性：通性嫌気性 インドール生成：陽性 硫化水素生成：陽生 硝酸塩の還元：陽性 脱窒反応：陽生 メチルレツド試験：陰性 Ｖ−Ｐ反応：陽性 澱粉の分解：陰性 カタラーゼ：陽性 オキシダーゼ：陰性 クエン酸の利用：陽性 無機窒素源の利用：（NH₄）₂SO₄を利用、
NaNO₃は利用せず ウレアーゼ：陰性 Ｏ−Ｆテスト：醗酵的 色素生成：キングＡ培地で黄色々素生成、キン
グＢ培地で螢光色素生成なし 炭素化合物の利用：グルコース（＋）、マルト
ース（＋）、シヨ糖（＋）、乳糖（＋）、マン
ノース（＋）、ガラクトース（＋）、ラムノー
ス（＋）、ラフイノース（＋）、キシロース
（＋）、グリセリン（＋）、ソルビツト（＋）、
アラビノース（−）、マロン酸（＋）（＋：生
育し、ガス発生、−：生育せず） フエルアラニン脱アミノ反応：陰性 この菌株を寒天斜面上、30℃で48時間培養し、
その１白金耳を、グルコース100ｇ、酵母エキス
５ｇ、K₂PO₄0.5ｇ、KH₂PO₄0.5ｇ、MgSO₄・
7H₂O0.3ｇ、CaCO₃10ｇおよびつぎの第１表に示
す各有機酸塩10ｇを水に加えて１とした液体培
地（PH7.0、オートクレーブ中、120℃20分間滅
菌）に接種し、軌道シエーカー上、200r.p.m.で
振とうし、30℃で96時間培養した。培養終了後、
培養液を遠心分離して菌体を除去し、これにイソ
プロパノールを加えて沈澱を生じさせた。沈澱を
取し、105℃で24時間乾燥して、フコース：ガ
ラクトース：グルコース：ガラクチユロン酸＝
1.0：0.75：0.55：0.54（モル比）の組成を有する
（加水分解物のペーパークロマトグラフイーおよ
びガスクロマトグラフイーのRf値および保持時
間により測定）酸性多糖類を得た。同様に、対照
として、有機酸塩を添加しない培地を用いて酸性
多糖類の製造を行なつた。 用いた有機酸塩の種類と酸性多糖類の収量を第
１表に示す。

【表】 この結果から明らかなごとく、有機酸塩を添加
すると、いずれも、対照に比して酸性多糖類の収
量が著しく向上する。一般に、微生物の培養にお
いて、PH調整剤あるいは炭素源として有機酸塩が
培地に添加される場合もあるが、本発明において
は、これらの有機酸塩はアンカツプラーとして作
用しているものと考えられる。 実施例 ２ 実施例１と同様にして、ただし、有機酸塩とし
て酢酸ナトリウムを用い、その培地中濃度を種々
変化させてエンテロバクター・シマーナス 微工
研菌寄第5795号を培養し、同様な酸性多糖類を製
造した。 酢酸ナトリウムの培地中濃度と酸性多糖類の収
量との関係を第２表に示す。

【表】 他の有機酸塩も同様な傾向を示し、約２〜25
ｇ／の有機酸塩濃度で良好な収量が得られる。 実施例 ３ 実施例２と同様に、ただし、酢酸ナトリウムの
代りに２，４−ジニトロフエノール（DNP）を
用い、その倍地中濃度を種々変えて多糖類を製造
した。 DNPの培地中濃度と酸性多糖類の収量との関
係を第３表に示す。

【表】 この結果から明らかなごとく、約５〜100mg／
のDNP濃度で良好な結果が得られる。 実施例 ４ つぎの菌学的性質を有するエルビニア・ミツエ
ンシス 微工研菌寄第5796号を用いた。 (1) 形態的性質 形態：桿菌、胞子形成せず 運動性：極鞭毛を有し、運動性を示す 大きさ：0.5〜0.7×1.0〜1.5μ グラム染色：陰性 抗酸性：陰性 (2) 各培地における生育状態 肉汁培地：沈査 リトマスミルク培地：生育するが変色せず 肉汁寒天培地：黄色〜赤色の円形スムーズコロ
ニーを形成する グルコース肉汁寒天培地：黄色〜赤色の円形ス
ムーズコロニーを形成する ゼラチン穿刺培養：液化せず (3) 生理学的性質 至適生育温度：30℃ 生育PH：３〜10（至適生育PH：５〜６） 酸素要求性：通性嫌気性 インドール生成：陰性 硫化水素生成（SIM培地）：陽生 硝酸塩の還元：陽性 脱窒反応：陰生 メチルレツド試験：陰性 Ｖ−Ｐ反応：陰性 澱粉の分解：陽性 カタラーゼ：陽性 オキシダーゼ：陰性 クエン酸の利用：弱陽性 無機窒素源の利用：利用せず ウレアーゼ：陰性 Ｏ−Ｆテスト：醗酵的（非常に弱い） 色素の生成：キングＡ培地で赤色色素生成、キ
ングＢ培地で螢光色素生成なし 炭素化合物の利用：ソルビツト（＋）、シヨ糖
（＋）、メリビオース（＋）、グルコース
（＋）、ラムノース（＋）、マンノース（＋）、
ラフイノース（−）、キシロース（−）、グリ
セリン（＋）、マンニツト（−）、イノシツト
（−）、メチル−α−Ｄ−グルコース（＋）、
ガラクトース（＋）、乳糖（＋）、マロン酸
（−）（＋：生育する、ガス発生せず、グルコ
ースより酸生成、−：生育せず） フエニルアラニン脱アミノ反応：陰性 この菌株を、実施例１と同様にして、ただし、
培地中のグルコース濃度を50ｇ／とし、有機酸
塩として安息香酸ナトリウムを用い、その培地中
濃度を種々変えて培養し、フコース：グルコー
ス：ガラクトース：グルクロン酸＝1.0：3.75：
0.72：1.18（モル比）の組成を有する酸性多糖類
を得た。 安息香酸ナトリウムの培地中濃度と酸性多糖類
の収量との関係を第４表に示す。

【表】 実施例 ５ 実施例４と同様に、ただし、安息香酸ナトリウ
ムの代りに３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−ヒドロ
キシベンジリデンマロノニトリル（SF6847）を
用い、その培地中濃度を種々変えて多糖類を製造
した。 SF6847の培地中濃度と酸性多糖類の収量との
関係を第５表に示す。

【表】 この結果から明らかなごとく、SF6847の培地
中濃度約５〜100μｇ／で良好な収率が得られ
る。 実施例 ６ つぎの菌学的性質を有するアエロモナス・ニチ
デニイ 微工研菌寄第5797号を用いた。 (1) 形態的性質 形態：桿菌、胞子形成せず 運動性：極鞭毛を有し、運動性を示す 大きさ：0.5〜1.0×1.0〜8.0μ グラム染色：陰性 抗酸性：陰性 (2) 各培地における生育状態 肉汁培地：表面に膜を形成し、白濁 リトマスミルク培地：凝固し、赤変 肉汁寒天培地：半透明乳白色円形のコロニー形
成 グルコース肉汁寒天培地：半透明乳白色円形の
コロニー形成 ゼラチン穿刺培養：液化 (3) 生理学的性質 至適生育温度：37℃ 生育PH：４〜10（至適PH：５〜６） 酸素要求性：通性嫌気性 インドール生成：陰性 硫化水素生成：陰生 硝酸塩の還元：陽性 脱窒反応：陰性 メチルレツド試験：陽性 Ｖ−Ｐ反応：弱陽性 澱粉の分解：陽性 カタラーゼ：陽性 オキシダーゼ：陽性 クエン酸の利用：陽性 無機窒素源の利用：利用せず ウレアーゼ：陽性 Ｏ−Ｆテスト：醗酵的 色素の生成：キングＡ培地で色素生成せず、キ
ングＢ培地で螢光色素生成せず 炭素化合物の利用：グルコース（＋）、マンノ
ース（＋）、澱粉（＋）、乳糖（＋）、キシロ
ース（＋）、マンノース（＋）、アラビノース
（＋）、ラムノース（＋）、シヨ糖（−）、ソル
ビツト（−）、ラフイノース（−）、グリセリ
ン（−）（＋：生育し、ガス発生、−：生育せ
ず） この菌株を実施例１と同様にして、ただし、グ
ルコースの代りに澱粉分解物（デキストリン
DE10〜25）を用い、有機酸塩として種々の濃度
の酒石酸ナトリウムを用いて培養し、キシロー
ス：マンノース：ガラクトース：グルコース：マ
ンヌユロン酸＝1.0：3.8：0.8：2.4：1.7（モル比）
の組成の酸性多糖類を得た。 酒石酸ナトリウムの培地中濃度と多糖類収量と
の関係を第６表に示す。

【表】 実施例 ７ バチルス・ブチリス（Bacillus subtilis）
AJ3304（微工研より入手）を、尿素１ｇ、グルコ
ース30ｇ、KH₂PO₄0.5ｇ、K₂HPO₄0.5ｇ、
MgSO₄・7H₂O0.5ｇ、FeSO₄・7H₂O0.01ｇ、
MnSO₄0.001ｇおよびギ酸ナトリウム（第７表に
示す量）を水に加えて１とした液体培地（PH
7.0、オートクレーブ中、120℃、20分間滅菌）に
接種し、軌道シエーカー上、200r.p.m.で振とう
しながら、34℃で96時間培養した。培養中、1N
水酸化ナトリウムを添加してPHを7.0に保持した。
培養後、実施例１と同様に処理してフコース：グ
ルコース：ガラクトース：グルクロン酸＝1.0：
1.8：2.1：0.9（モル比）の組成を有する酸性多糖
類を得た。 ギ酸ナトリウムの培地中濃度と多糖類収量との
関係を第７表に示す。

【表】

【表】 実施例 ８ キサントモナス・キヤンペストリスIFO13303
（醗酵研より入手）を、グルコース60ｇ、デイス
テイラーズ・ソルブル４ｇ、K₂HPO₄4ｇ、
MgSO₄・7H₂O0.7ｇ、MnSO₄0.05ｇおよびDNP
（第８表に示す量）を水に加えて１とした液体
培地（PH7.0、オートクレーブ中、120℃、20分間
滅菌）に接種し、軌道シエカー上、200r.p.m.で
振とうしながら、30℃で96時間培養した。培養
中、1N水酸化ナトリウムを添加してPHを7.0に保
持した。培養後、実施例１と同様に処理してグル
コース：マンノース：グルクロン酸＝１：1.1：
0.7（モル比）の組成を有する、酢酸およびピルビ
ン酸を含有する酸性多糖類を得た。 DNPの培地中濃度と多糖類収量との関係をつ
ぎの第８表に示す。

【表】 実施例 ９ クラブシエラ・ニユーモニア（Klebsiella
pneumoniae）ATCC31314（アメリカン・タイ
プ・カルチヤー・コレクシヨンより入手）を、澱
粉分解物50ｇ、肉エキス10ｇ、ペプトン10ｇ、
NaCl5ｇおよび酢酸ナトリウム（第９表に示す
量）を水に加えて１とした液体培地（PH7.0、
オートクレーブ中、120℃、20分間滅菌）に接種
し、軌道シエーカー上、200r.p.m.で振とうしな
がら、30℃で96時間培養した。培養後、実施例１
と同様に処理して、マンノース：グルコース：ガ
ラクトース：グルクロン酸＝１：0.8：0.6：0.5
（モル比）の組成の、酢酸およびピルビン酸を含
有する酸性多糖類を得た。 酢酸ナトリウムの培地中濃度と多糖類収量との
関係を第９表に示す。

【表】 実施例 10 アルスロバクター・ビスコーサスATCC19584
（アメリカン・タイプ・カルチヤー・コレクシヨ
ンより入手）を、グルコース30ｇ、カゼイン分解
物2.5ｇ、K₂HPO₄4ｇ、MgSO₄・7H₂O0.7ｇ、
MnSO₄0.05ｇおよびCCCP（第10表に示す量）を
水に加えて１とした液体培地（PH7.0、オート
クレーブ中、120℃、20分間滅菌）に接種し、軌
道シエーカー上、200r.p.m.で振とうしながら、
30℃で96時間培養した。培養後、実施例１と同様
に処理して、グルコース：ガラクトース：マンヌ
ユロン酸＝1.0：0.9：1.0（モル比）の組成の、酢
酸を含有する酸性多糖類を得た。 CCCPの培地中濃度と酸性多糖類との関係を第
10表に示す。

【表】

【表】

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ エンテロバクタター属（Enterobacter）、エ
   ルウイニア属（Erwinia）、アエロモナス属
   （Aeromonas）、バチルス属（Bacillus）、キサン
   トモナス属（Xanthomonas）、クレブシエラ属
   （Klebsiella）およびアルスロバクター属
   （Arthrobacter）からなる群から選ばれる、ウロ
   ン酸を含む酸性多糖類を菌体外に産生する細菌
   を、アンカツプラーとなる物質を添加した液体培
   地中で培養し、産生された酸性多糖類をその培養
   液から沈澱、生成することを特徴とする酸性多糖
   類の製法。 ２ 該アンカツプラーとなる物質が２，４−ジニ
   トロフエノール、３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−
   ヒドロキシベンジリデンマロノニトリル、５−ク
   ロロ−ｔ−ブチル−2′−クロロ−4′−ニトロサリ
   チルアニリド、カルボニルシアニド−ｐ−トリフ
   ルオロメトキシフエニルヒドラゾン、カルボニル
   シアニド−ｍ−クロロフエニルヒドラゾン、４，
   ５，６，７−テトラクロロ−２−トリフルオロメ
   チルベンズイミダゾール、ペンタクロロフエノー
   ル、ヘキサクロロフエン、フルフエナム酸、メフ
   エナム酸、キサントメジンおよび２−アジド−４
   −ニトロフエノールからなる群から選ばれる物質
   である前記第１項の製法。 ３ アンカツプラーとなる物質が２，４−ジニト
   ロフエノールである前記第２項の製法。 ４ 培地中、２，４−ジニトロフエノールを５〜
   100mg／の濃度で処方した前記第３項の製法。 ５ アンカツプラーとなる物質がギ酸、酢酸、プ
   ロピオン酸、安息香酸、コハク酸、酒石酸、リン
   ゴ酸、アスコルビン酸またはこれらのアルカリ金
   属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩もし
   くはアミン塩である前記第１項の製法。 ６ ギ酸、酢酸、プロピオン酸、安息香酸、コハ
   ク酸、酒石酸、リンゴ酸、アスコルビン酸または
   これらのアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、
   アンモニウム塩もしくはアミン塩を、培地中、２
   〜25ｇ／の濃度で処方した前記第５項の製法。