JPH01131189A - ドコサヘキサエン酸含有リン脂質の製造法 - Google Patents

Abstract

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め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ドコサヘキサエン酸をＳｎ−２位に豊富に有
するホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノ
ールアミンを直接卵黄リン脂質から製造−する新規な方
法に関する。

〔従来の技術〕

ドコサヘキサエン酸はエイコサペンタエン酸と同様にコ
レステロール低下作用および抗高脂血作用を有すること
が知られ、その生理的重要性が認められるようになった
。一方、生化学分野においてドコサヘキサエン酸は脳や
神経系の主な構成脂質であるリン脂質中で、何らかの生
理作用を司っていることが示唆されている。また形質膜
の物性を支配するリン脂質中の高度不飽和脂肪酸が特に
注目を受け、これらの中に存在するドコサヘキサエン酸
をＳｎ−２位に豊富に有するホスファチジルコリンおよ
びホスファチジルエタノールアミンに癌などの未分化細
胞の正常誘導作用も認められている。ドコサヘキサエン
酸やアラキドン酸の様な高度不飽和脂肪酸は魚油中に多
い事が知られている。また動物の脳や臓器にホスファチ
ジルコリンやホスファチジルエタノールアミンが多いこ
とも知られている。　　　　　。

従来Ｓｎ−１，２位にドコサヘキサエン酸を豊富に有す
るホスファチジルコリンおよびホスファアシルエタノー
ルアミンを得るには次の化学合成法が知られている。例
えば、グリセロール骨格のＳｎ−１位、Ｓｎ−２位の両
方にドコサヘキサエン酸が結合しているＳｎ−１，２−
ドコサヘキサエン酸ホスファチジルコリンを得るには、
グリセロホスファチジルコリンの塩化カドミウム錯体に
ドコサヘキサエン酸の酸無水物やハロゲン化物等を反応
させ精製して得る方法がある。（特開昭６２−１６４３
９号参照。） またグリセロール骨格のＳｎ−２位にドコサヘキサエン
酸を有し、Ｓｎ−１位にドコサヘキサエン酸以外の脂肪
酸を有するホスファチジルコリンまたはホスファチジル
エタノールアミンを得るには、次の方法が知られている
。例えばグリセロホスファチジルコリンの塩化カドミニ
ウム錯体にバルミチン酸やオレイン酸の酸無水物または
ハロゲン化物等を反応させてＳｎ−１，２−バルミチン
酸ホスフプチジルコリンやＳｎ−１，２−オレイン酸ホ
スファチジルコリンが得られる。得られたこれの化合物
を酵素分解（ホスホリパーゼＡ２処理）すると１−アシ
ル型リゾリン脂質が得られる。

得られた１−アシル型リゾリン脂質とドコサヘキサエン
酸の酸無水物やハロゲン化物等と反応させて、Ｓｎ−１
−バルミトイル−２−ドコサヘキサエン酸ホスファチジ
ルコリンやＳｎ−１−オレイル−２−ドコサヘキサエン
酸ホスファチジルコリンが得られる。

しかしながら、これらの方法は複雑でありＳｎ−２−ド
コサヘキサエン酸ホスファチジルコリンの生化学的な重
要性が認められる様になったが、簡便な製造法に関して
これまで開発されていないのが現状である。

〔発明が解決しようとする問題点〕

Ｓｎ−２位にドコサヘキサエン酸を豊富に有するリン脂
質は、動物脂や肝臓等に微量に存在するが、その部位の
みを特異的に採取することは難しく適当な原料がない。

比較的容易に入手できるウシ脳の脂質中にはドコサヘキ
サエン酸が数％含まれていることが知られているが、ウ
シ脳から溶剤分画、カラム分画、精製を行い、Ｓｎ−２
位にドコサヘキサエン酸を豊富に有するリン脂質を大量
に得るには多量の溶剤と複雑な処理工程が多い為、長時
間を要し、実際の原料には不適当であった。

また、Ｓｎ−２−ドコサヘキサエン酸ホスファチジルコ
リンとＳｎ−２−ドコサヘキサエン酸ホスファチジルエ
タノールアミンを分離して得るには分析用高速液体クロ
マトグラフィーにより、単離する方法も検討されている
が、非常に困難であり、多数の脂肪酸を含むリン脂質か
ら効率よく、大量に分取する方法はまだない。また従来
のリン脂質の合成法は多段階を経る複雑な反応であり、
使用する試薬も高価なものが多い。

更に、副生成物も多く、精製に多大な労力を必要とし、
収率も低い。

また、卵黄リン脂質からホスファチジルコリンおよびホ
スファチジルエタノールアミンを分画するには、分析手
法を用いてシリカゲルやアルミナゲルを充填した吸着分
配クロマトグラフィーにより行うことはできる。しかし
、吸着分配クロマトグラフィーは高性能液体クロマトグ
ラフィーに装着して使用できるが、大量のホスファチジ
ルコリンやホスファチジルエタノールアミンを分画する
には多量の溶剤が必要であり、処理時間が長く労力を要
する。

更に、ホスファチジルコリン以外のリン脂質の影響によ
り、カラム内で不溶物を生じ、めづまりや分Ｍ濃の低下
を起こすので工業的に不適当である。

本発明の目的は、経済的に高収率で且つ簡単な工程によ
りＳｎ−２にドコサヘキサエン酸を豊富に有するリン脂
質を製造する方法を提供するものである。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明は、ドコサヘキサエン酸をグリセロール骨格のＳ
ｎ−２位に豊富に有するリン脂質の製造にあたり、卵黄
リン脂質を溶剤処理してリン脂質を濃縮し、次いで遠心
液々連続多段分画装置を用いてホスファチジルコリンと
ホスファチジルエタノールアミンを分離し、次いでそれ
ぞれの成分から逆相分配カラムを装着した大量分取液体
クロマトゲラフイーを用いてドコサヘキサエン酸含有成
分を分取することを特徴とする。

本発明において、卵黄リン脂質は通常の市販品が使用で
きる。その成分は一般に中性脂質約７０％、リン脂質約
３０％程度である。これを溶剤処理してリン脂質を濃縮
して用いる。即ちアセトン処理して中性脂質を除去して
得られたリン脂質はホスファチジルコリン約７０％、ホ
スファチジルエタノールアミン約１５％を含有している
。さらにこのリン脂質をエタノール処理すると不溶分と
してホスファチジルエタノールアミンが残り、ホスファ
チジルエタノールアミフッ０％程度のものが得られる。

上記の濃縮した卵黄リン脂質、ホスファチジルコリン、
ホスファチジルエタノールアミンの脂肪酸組成の分析値
を表−１に示す。

表−１かられかるように卵黄リン脂質中にドコサヘキサ
エン酸は約６％含まれていた。また卵黄リン脂質から分
画したホスファチジルコリン中にドコサヘキサエン酸は
約５％含まれており、ホスファチジルエタノールアミン
中にはドコサヘキサエン酸は約１２％含まれていた。

従って、卵黄リン脂質からホスファチジルコリンおよび
ホスファチジルエタノールアミンを純度よく分画するこ
とによりドコサヘキサエン酸を含むホスファチジルコリ
ンおよびホスファチジルエタノールアミンを得ることが
できる。

本発明においてホスファチジルコリンおよびホスファチ
ジルエタノールアミンを精密に分離するために遠心液々
連続多段分画袋ｗ（以下ＣＰＣ）を用いる。ＣＰＣは２
相の分離液のうち一方を固定相として遠心力により保持
しつつ、他方を移動相として連続的に固定相内を通過さ
せて、移動相内に注入された試料を連続的に分画する向
流分配クロマトグラフィーである。即ち、ＣＰＣは比重
および極性が異なり、２相に分離する２種の溶媒の一方
を固定相、他方を移動相とし、遠心加速度の作用により
固定相中を移動相を移動させ、試料中の各成分を分配係
数の差を利用して多段分配平衡によりクロマトグラフィ
ー的に分画する。

本発明において用いる２相の溶離液は、ヘキサン−エタ
ノール系またはへブタン−エタノール系の溶剤が好まし
く、この際のエタノールは９０％エタノール（エタノー
ル／水：　９０／１０：Ｖ／Ｖ）が分離性能および収率
の面で特に好ましい。エタノールの代わりにメタノール
やアセトニトリル等を用いると分離不能もしくは収率が
著しく低下する。溶離液は前記２種の溶剤をあらかじめ
混合攪拌後、２相に分配し、下層液を固定相液、上層液
を移動相液として用いる。

ＣＰＣはローター（Ｒ）上に多数のカートリッジ（Ｃ）
（以下分配管）を第８図に示すように円周状に配列し、
分配管同士をチューブで直列に接続しである。分配管は
フッ素系の樹脂板に細い溝をジグザク状に施し、樹脂板
を数枚重ねて１個の分配管を構成する。固定相液をポン
プで分配管に充填した後、ローターを回転させて一定の
遠心力を与えながら、移動相液を連続的に送液する。固
定相液は遠心力により分配管の中に保持され、移動相液
がその中を微細な液滴となって連続的に通過し多段連続
液々分配抽出が行われる。溶出液を薄層クロマトグラフ
ィーでチエツクし、分画はフラクシジンコレクターで行
う。なお、移動相液の送液の終了後に、送液方向を逆転
して固定相液を入口側から押し出すと、固定相液中に保
持されていた成分を分取することができる。

このようにしてＣＰＣによりホスファチジルコリンとホ
スファチジルエタノールアミンを精度良く迅速に好収率
で分離することができる。次に、得られた未スフブチジ
ルコリンまたはホスファチジルエタノールアミンをそれ
ぞれ逆相分配カラムを装着した大量分取液体クロマトグ
ラフィー（以下ＨＰ　Ｌ　Ｃ’）にかけて、ドコサヘキ
サエン酸成分を分取する。

分画に使用する液体クロマトグラフィーは分取用のもの
が好ましく、特に高圧、高速、大量分取用のものが好ま
しい、クロマトグラフィーに装着するカラムはできるだ
け大きいものが好ましく、例えば２インチカラム（直径
５５．０＋ｎ、長さ６０ｃｍ）のものが使用できる。カ
ラムに充填する固定相としてはシリカゲル、アルミナゲ
ル、゛ケイソウ上等、一般にリン脂質の分画に使用され
ているものが使用できる。溶離液としては、メタノール
やアセトニトリル等のリン脂質の分画に使用する通常の
極性溶媒が使用できるが、メタノール−リン酸バッファ
ー系のものが好ましい。

ＨＰＬＣからドコサヘキサエン酸成分を分取するには、
合成した標準体のホスファチジルコリンまたはホスファ
チジルエタノールアミン（例えば１−バルミトイル−２
−ドコサヘキサエン酸ホスファチジルコリンや１−オレ
イル−２−ドコサヘキサエン酸ホスファチジルコリン、
１−バルミトイル−２−ドコサヘキサエン酸ホスファチ
ジルエタノールアミンや１−オレイル−２−ドコサヘキ
サエン酸ホスファチジルエタノールアミン）をＨＰＬＣ
にかけると最先頭に溶出してピークが現れることから類
推して、）（ＰＬＣの最初のメインピークの区分を分取
すると目的物が得られる。

この区分をＦＡＢ−質量分析計で解析した結果、ドコサ
ヘキサエン酸を含む目的物の分子イオンに相当するスペ
クトラムの強度が強いことから確認できた。このホスフ
ァチジルコリン区分はホスホリパーゼＡ２処理後、メチ
ルエステル化し、ガスクロマトグラフィーで分析を行い
脂肪酸組成を測定した結果Ｓｎ−２位の脂肪酸にドコサ
ヘキサエン酸が豊富に含まれていた。即ち、本発明の目
的物は卵黄リン脂質からＣＰＣで分取したホスファチジ
ルコリンおよびホスファチジルエタノールアミンをＨＰ
ＬＣで繰り返し目的ピークを分取すれば容易に得られる
事が判明した。

〔発明の効果〕

本発明はｃｐｃおよびＨＰＬＣを用いて卵黄リン脂質よ
り直接Ｓｎ−２位にドコサヘキサエン酸を豊富に有する
ホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノール
アミンを分離して得ることができるので、ホスファチジ
ルコリンやホスファチジルエタノールアミンを化学合成
することなく、また多量の溶剤や重金属塩等を使用せず
に、Ｓｎ−２位にドコサヘキサエン酸を豊富に有するリ
ン脂質を効率良く、多量に製造することができる。

〔実施例〕

以下実施例によって本発明を詳述する。実施例中、％は
重量％を示す。

実施例１゜ 市販卵黄リン脂質１．０ｋｇを冷アセトン１１および冷
ｎ−ヘキサン２１に溶解後、撹拌下、冷アセトン１０２
を徐々に添加し不溶物を濾過してケーキを回収した。回
収したケーキを再び冷アセトン２２および冷ｎ−ヘキサ
ン２！に溶解後、攪拌下、冷アセトン１０１を加え、濾
過後、脱溶剤して乾燥物４５０ｇを得た。得られた乾燥
物をエタノール溶液５１で４５℃にて２回繰り返し、攪
拌抽出した。次いで、エタノール層と沈澱層を分離した
。エタノール層を脱溶剤して３００ｇのリン脂質Ａを得
、沈澱層を脱溶剤してリン脂質Ｂを１１０ｇ得た。得ら
れたリン脂質Ａ、Ｂはクロロホルム／メタノール混液（
２／Ｉ　Ｖ／Ｖ）に溶解し、イヤトロスキャン法（展開
溶媒：クロロホルム／メタノール／水：　６５／２５／
４Ｖ／Ｖ／Ｖ　’）で定量した。その結果Ａにはホスフ
ァチジルコリンを７１．２％含有し、Ｂにはホスファチ
ジルエタノールアミンを７３％含有していた。

実施例２゜ 実施例１で得たリン脂質Ａを２０ｇ用いた。分配液はｎ
−ヘキサンと９０％エタノール（エタノール／水：　９
０／１０　Ｖ／Ｖ　）を混合し、２相に分離すルマで静
置し調製した。調製した分配液の上層液１０〇−と下層
液１０−を抜取り、２０ｇの卵黄リン脂質を溶解させて
試料とした。前に調製した分配液の下層液をＣＰ　Ｃ（
ＣＰＣ−Ｌ　Ｂ９２−Ｎ型、三鬼エンジニアリング■製
）の分配管に充填した。試料溶液を注入後、分配液の上
層液を１０−７分の流速で１１送液した。この際のロー
ターの回転数は１１０００ＲＰで行った。送液圧力は１
５ｋｇ／ａｄであった。上層溶出液は５〇−毎に分画し
た。

分画した溶出液を濃縮後、薄層クロマトグラフィー（以
下ＴＬＣ）でチエツクしながらホスファチジルコリンと
ホスファチジルエタノールアミン部分を分画した。ＴＬ
Ｃの展開溶媒はクロロホルム／メタノール／水（２／１
１０．Ｉ　Ｖ／Ｖ／Ｖ）　テ行い、発色はアニスアルデ
ヒド試薬（アニスアルデヒド／酢酸／メタノール／硫酸
：　０．５／１０／８５１５　Ｖ／Ｖ／Ｖ／Ｖ）を噴霧
してホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノ
ールアミンの青紫色を呈する方法で行った。

得られた上層溶出液画分の１８フラクシヨンは濃縮後、
ＴＬＣでチエツクし、その結果を第１図に示した。また
フラクション毎の収量も求めた。ＴＬＣの結果と収量か
らホスファチジルエタノールアミン画分は２．４ｇ得ら
れ、ホスファチジルコリンとホスファチジルエタノール
アミンが混存する両分は２．６ｇであった。

分配管に保持されているホスファチジルコリンを分離す
るために次の方法で行った。分配液の下層液１１は、分
配管の出口側から逆方向に送液した。流速は１０ｄ／分
、送液圧力は１５ｋｇ／ｃ１１、ローターの回転数は１
１０００ＲＰで行った。溶出液は５〇−毎に分画した。

１６フラクシヨンを濃縮し、上記同様ＴＬＣでチエツク
した。ＴＬＣの結果を第２図に示した。ホスファチジル
コリン画分は１４．５　ｇ得られた。

得られたホスファチジルコリンをイヤトロスキャン法（
ヤトロン社）で定量した結果９５．３％であった。１サ
イクルにおける総溶出量は１９．５　ｇであった。イヤ
トロスキャン法で定量したホスファチジルコリンを分析
用ＨＰ　Ｌ　Ｃ（ＨＬＣ−８０３Ａ型、東洋曹達工業■
製、シリカカラム：　４．６ｍｍ　Ｘ　２５ｃｌＩ＋、
流速１．０１＃１／分、溶離液ニアセトニトリル／メタ
ノール／リン酸（９００／９５１５　Ｖ／Ｖ／Ｖ）、検
出：　ＵＶ２１０ｎｍ）で測定した。クロマトグラムか
らホスファチジルコリン純度９８．２％であった。ｃｐ
ｃで分画したホスファチジルコリンの分子種分離を行う
ため分画したホスファチジルコリンを直接ＨＰＬＣに注
入した。その方法を下記に示した。

ＣＰＣで分画したホスファチジルコリンの一部１ｇをメ
タノール／１ｍＭリン酸パンファー（９５：５　Ｖ／Ｖ
　、　ＰＨ＝７．４）の溶離液１００−に溶解して試料
とした。１％溶液２０−を全自動分取型高速液体クロマ
トグラフィー（ＨＬＣ−８３７型、東洋曹達工業■製）
に注入した。カラムは逆相分配カラムで、粒径２０−の
高保持力ＯＤＳ化学結合型を充填した２インチカラム（
カラム径Ｘカラム長さ：５５．ＯｍｍＸ６０ｃｍ、断面
積２３．７．ｊ、カラム体積１４２３ｃｄ）を用いた。

溶離液は上記試料を溶解したものを用いた。

流速は４０−７分で送液した。検出はＵ　Ｖ　２０Ｓｎ
ｍで行った。

得られたクロマトグラムを第３図に示した。分画時間は
１０〜１５分の範囲とし、−工程を１５０分として３０
回の連続稼動を行った。分画されたＡ区分の総溶出液量
は１２１であった。得られたＡ区分全量を濃縮した。濃
縮物全量は、分液ロートに移し濃縮物に対して５倍量の
クロロホルムを加えて抽出した。抽出液を硫酸ナトリウ
ムに通して脱水した。脱水した抽出液を：ａ縮後、６６
７．３ｍｇのホスファチジルコリンが得られた。得られ
たホスファチジルコリンの一部を三フッ化ホウ素メタノ
ールでメチルエステル化した。

エステル化物の脂肪酸組成は、カーボワックス２０Ｍの
５ＣＯＴカラムを装着したガスクロマトグラフィー（Ｈ
Ｐ−５８８ＯＡ、ヒユーレットパラカード社製）を用い
て定量した。また、Ａ区分のホスファチジルコリン１０
０ｍｇをジクロロメタン１−にン容解した・ハブ毒（Ｔ
ｒｔｍｅｒｅｓｕｒｕｓ　ｆｌａｖｏｖｉｒｉｄｉｓ和
光純薬工業側製）　５０ｎ＋ｇをスクリューキャップに
計りとり０，１Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ＝５．４）を２
〇−加えた。この酵素液を９０℃以上の湯浴に５分間浸
して酵素中のタンパク質を凝集させ氷冷した。水冷後、
遠心分離機（３００ＯＲＰＭ　Ｘ１０分）で遠心分離を
行った。タンパク質は沈澱し上澄み液（ホスホリパーゼ
Ａ２溶液とする）を１−使用した。０．２　Ｍ　）リス
−塩酸緩衝液（ｐＨ７，４）を２−１０．１Ｍ塩化カル
シウム２．０ｍｌ、ジエチルエーテル１−を加えた。

反応混合物は１０−のスクリューキャップ付試験管中に
テフロンスターラーバーを入れて３７℃で２時間激しく
攪拌しながらインキュページ目ンした。

反応混合物は、プライ・ダイア−抽出法により抽出した
。抽出液を乾固し、窒素気流下で濃縮した。この中にア
セトン１−を加えて洗浄し、遊離脂肪酸を除去した。こ
の溶液を濃縮し、上記と同様にメチルエステル化した。

エステル化物はガスクロマトグラフィーを用いて脂肪酸
組成を測定した。

ＣＰＣで分画したホスファチジルコリンと、それをＨＰ
ＬＣで分取したＡ区分のホスファチジルコリンと、Ａ区
分のホスファチジルコリンを酵素分解（ホスホリパーゼ
Ａ！処理）して得られた各々の脂肪酸組成の分析結果は
、次の表−２の通りである。

表−２から、ＨＰＬＣ処理したものは、ドコサヘキサエ
ン酸成分が著しく高いことがわかり、また、酵素分解処
理の結果からＳｎ−２位にドコサヘキサエン酸成分が高
いことがわかる。

ＨＰＬＣで分取したＡ区分のホスファチジルコリンの分
析値は、ＦＡＢ−質量分析により分子量８０５（ＣＭ　
＋　Ｈ）　＋８ｏ６　）に強度が強く認められた（第７
図）。

実施例３゜ ｎ−へブタン／９０％エタノールを用いる他は実施例２
に記載した方法と同様の方法でホスファチジルコリンを
分画した０分配液の上層液から１００ｍ１と、下層液か
ら９０−を抜き取り、２０ｇの卵黄リン脂質を溶解させ
て試料とした。下層液はＣＰＣの分配管に充填した。

試料溶液を注入後、上層液は１０ｍｊ／分の流速で１１
を送液した。ローターの回転数は１１０００ＲＰで行っ
た。送液圧力は２０ｋｇ／ａｄであった。上層溶出液は
５０１１１１毎に分画した。分画した溶出液を濃縮後、
ＴＬＣでチエツクしながらホスファチジルコリン部分を
分画した。ＴＬＣ条件は実施例２と同様に行った。ＴＬ
Ｃの結果と重量からホスファチジルエタノールアミン画
分は２．８ｇ得られ、ホスファチジルコリンとホスファ
チジルエタノールアミンが混在する両分は２．６ｇであ
った。

分配管に保持されているホスファチジルコリンを分離す
るために、次の方法で行った。下層液１１は分配管の出
口側から逆方向に送液した。流速は、２０−７分、送液
圧力は３５ｋｇ／ｃｊ、ローター回転数は１１０００Ｒ
Ｐで行った。溶出液は５〇−毎に分画した。　１６フラ
クシヨンを濃縮し、実施例２と同様ＴＬＣでチエツクし
た。ホスファチジルコリン画分は、１３．１ｇ得られた
。

得られたホスファチジルコリンをイヤトロスキャン法で
定量した結果、９６．０％であった。イヤトロスキャン
法で定量したホスファチジルコリンを実施例２と同様に
分析用ＨＰＬＣで測定した。クロマトグラムからホスフ
ァチジルコリン純度９８．０％であった。ＣＰＣで分画
したホスファチジルコリンの分子種分離を行うため実施
例１と同様に直接ＨＰＬＣに注入した。ＨＰ　Ｌ　Ｃ（
ＨＬＣ−８３７型）条件は実施例工と同様に行った。得
られたクロマトグラムは実施例１と同じであった。得ら
れたＡ区分は全量濃縮しクロロホルムで抽出した。抽出
液は硫酸ナトリウムに通して脱水した。脱水後、濃縮し
、６８３．４ｍｇのホスファチジルコリンが得られた。

得られたホスファチジルコリンの一部をメチルエステル
化した。また、ホスファチジルコリンを酵素分解くホス
ホリパーゼＡ２処理）し、遊離脂肪酸を除去した。この
溶液を濃縮しメチルエステル化した。エステル化物をガ
スクロマトグラフィーを用いて脂肪酸組成を測定した。

その結果、ＣＰＣで分画したホスファチジルコリンと、
ＨＰＬＣで分取したへ区分と、へ区分を酵素分解したも
のは実施例２の表−２とほぼ同様の結果であった。

実施例４゜ 実施例１で得たリン脂質Ｂを２０ｇ用いた。分配液はｎ
−ヘキサンと９０％エタノールを２相に分離するまで加
えて調製した。調製した分配液の上層液１００−と下層
液１０−を抜取り、２０ｇの卵黄リン脂質を溶解させて
試料とした。分配液の下層液をＣＰ　Ｃ（ＣＰＣ−Ｌ　
８９２−Ｎ型、三鬼エンジニアリング側製）の分配管に
充填した。試料溶液を注入後、分配液の上層液を１０１
ｎ１／分の流速で１１を送液した。この際のローターの
回転数は１１０００ＲＰで行った。送液圧力は１５ｋｇ
／ｃａｌであった。上層溶出液は５０Ｍ１毎に分画した
。

分画した溶出液を濃縮後、ＴＬＣでチエツクしながらホ
スファチジルエタノールアミン部分を分画した。ＴＬＣ
の展開溶媒はクロロホルム／メタノール／水（２／１１
０．Ｉ　Ｖ／Ｖ／Ｖ）で行い、発色はアニスアルデヒド
試薬（アニスアルデヒド／酢酸／メタノール／硫酸？　
０．５／１０／８５１５　Ｖ／Ｖ／Ｖ／Ｖ）を噴霧して
ホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノール
アミンの青紫色を呈する方法で行った。

得られた上ｔｉｔ溶出液画分の１８フラクシ日ンは濃縮
後、ＴＬＣでチエツクし、その結果を第４図に示した。

また、フラクション毎の収量も求めた。

ＴＬＣの結果と収量からホスファチジルエタノールアミ
ン画分は６．３ｇ得られ、ホスファチジルコリンとホス
ファチジルエタノールアミンが混在する両分は４．１ｇ
であった。

分配管に保持されているホスファチジルコリンを追い出
すために次の方法で行った。分配液の下層液１１を分配
管の出口側から逆方向に送液した。

流速は３０ｍｆ／分、送液圧力は３０　ｋｇ　／　ｃ＋
ａ、ローグーの回転数は１１０００ＲＰで行った９溶出
液は１５〇−毎に分画した。６フラクシヨンを濃縮し、
上記同様ＴＬＣでチエ７りした。ＴＬＣの結果を第５図
に示した。ホスファチジルコリン画分は９．０ｇ得られ
た。

上記で得られたホスファチジルエタノールアミンをイヤ
トロスキャン法で定量した結果９４．２％であった。定
量したホスファチジルエタノールアミンを分析用ＨＰ　
Ｌ　Ｃ（ＨＬＣ−８０３Ａ型、東洋曹達工業■製、シリ
カカラム：　４．６ｍｍ　Ｘ　２５ｃｍ、流速１．９ｍ
１７分、溶離液ニアセトニトリル／メタノール／リン酸
（９００／９５１５　Ｖ／Ｖ／Ｖ）、検出：　ＵＶ２１
０ｎｍ）　テ測定した。クロマトグラムからホスファチ
ジルエタノールアミン純度９７．５％であった。分画し
たホスファチジルエタノールアミンの分子種分離を行う
ため分画したホスファチジルエタノールアミンを直接Ｈ
ＰＬＣに注入した。その方法を下記に示した。

ＣＰＣで分画したホスファチジルエタノールアミンの一
部１ｇをメタノール／　１　ｍ　Ｍリン酸バッフｙ−（
９５：５　Ｖ／Ｖ　５ＰＨ−７，４）（７）溶離液１０
０ｍｆニ溶解して試料とした。１％溶液２０−を全自動
分取型高速液体クロマトグラフィー（ＨＬＣ−８３７型
、東洋曹達工業■製）に注入した。カラムは逆相分配カ
ラムで、粒径２０Ｉ！ｍの高保持力ＯＤＳ化学結合型を
充填した２インチカラム（カラム径×カラム長さ：　５
５．０ｍｍ　Ｘ　６０ｃｍ、断面積２３．７ｃｌＪ、カ
ラム体積１４２３ｄ）を用いた。溶離液は上記試料を溶
解したものを用いた。流速は４０−７分で送液した。検
出はＵ　Ｖ　２０Ｓｎｍで行った。

得られたクロマトグラムを第６図に示した。分画時間は
１０〜１５分の範囲とし、−工程を１５０分として３０
回の連続稼動を行った。分画されたＡ区分の総溶出液量
は１２１であった。得られたＡ区分全量を濃縮した。濃
縮物全量は、分液ロートに移し濃縮物に対して５倍量の
クロロホルムを加えて抽出した。抽出液を硫酸ナトリウ
ムに通して脱水した。脱水した抽出液を濃縮後、６３４
．３ｍｇのホスファチジルエタノールアミンが得られた
。その一部を常法によりメチルエステル化した。

エステル化物の脂肪酸組成はカーボワックス２０Ｍの５
ＣＯＴカラムを装着したガスクロマトグラフィ　（ＩＩ
Ｐ−５８８ＯＡ、ヒューレソトバッカード社製）を用い
て定量した。また得られたホスファチジルエタノールア
ミンのＡ区分の一部を酵素分解した。

ホスファチジルエタノールアミン１００ｍｇをジクロロ
メタンｌｄに溶解した。ハブ毒（Ｔｒｉｍｅｒｅｓｕｒ
ｕｓｆｌａｖｏｖｉｒｉｄｉｓ和光純薬工業■製）５０
ｍｇをスクリューキャップに計りとり、０．１Ｍ酢酸バ
ッファー（ｐＨ＝　５．４）を２０−加えた。この酵素
液を９０℃以上の湯浴に５分間浸して、酵素のタンパク
質を凝集させ氷冷した。水冷後、遠心分離機（３０００
ＲＰＭ　ｘ１０分）で遠心分離を行った。タンパク質は
沈澱し上澄み液（ホスホリパーゼＡ２溶液とする）を１
−使用した。０．２Ｍ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，４
）を２−１０．１　Ｍ塩化カルシウム２−、ジエチルエ
ーテル１−を加えた。反応混合物は１０−のスクリュー
キャップ付試験管中にテフロンスターラーバーを入れて
３７℃で２時間激しく攪拌しながらインキエベーション
した。

反応混合物は、ブライ・ダイア−抽出法により抽出した
。抽出液を乾固し、窒素気流下で濃縮した。この中にア
セトン１−を加えて洗浄し、遊離脂肪酸を除去した。こ
の溶液を濃縮し、上記と同様にメチルエステル化した。

エステル化物はガスクロマトグラフィーを用いて脂肪酸
組成を測定した。

ＣＰＣで分画したホスファチジルエタノールアミンと、
それをＨＰＬＣで分取したＡ区分のホスファチジルエタ
ノールアミンと、Ａ区分のホスファチジルエタノールア
ミンを酵素分解（ホスホリパーゼＡ２処理）して得られ
た各々の脂肪酸組成の分析結果は、次の表−３の通りで
ある。

表−３から、ＨＰＬＣ処理したものは、ドコサヘキサエ
ン酸成分が著しく高いことがわかり、また、酵素処理の
結果からＳｎ−２位にドコサヘキサエン酸成分が高いこ
とがわかる。

ＨＰＬＣで分取したＡ区分のホスファチジルエタノール
アミンの分析値はＦ　Ａ　Ｂ　−′Ｉｔ！分析から、分
子量７６３　（（Ｍ　＋　Ｈ）　”　７６４）に強度が
強く認められた。

実施例５゜ ｎ−へブタン／９０％エタノールを用いる他は、実施例
４に記載した方法でホスファチジルエタノールアミンを
分画した。分配液の上層液１００ｄと下層液９０Ｍ１を
抜取り、２０ｇの卵黄リン脂質を溶解させて試料とした
。下層液はＣＰＣの分配管に充填した。試料溶液を注入
後、分配液の上層液を１〇−７分の流速で１１送液した
。ローターの回転数は１１０００ＲＰで行った。送液圧
力は２０ｋｇ／−であった。上層溶出液は５０ｉｄ毎に
分画した。

分画した溶出液を濃縮後、ＴＬＣでチエツクしながらホ
スファチジルエタノールアミン部分を分画した。ＴＬＣ
条件は実施例４と同様に行った。

ＴＬＣの結果と収量からホスファチジルエタノールアミ
ン画分は６．０ｇ得られ、ホスファチジルコリンとホス
ファチジルエタノールアミンが混在する両分は４．５ｇ
であった。分配管に保持されているホスファチジルコリ
ンを追い出すために次の方法で行った。

分配液の下層液１１は、分配管の出口側から逆方向に送
液した。流速は３０Ｗｄ／分、送液圧力は３５ｋｇ　／
　ｃｄ、ローターの回転数は１１０００ＲＰで行った。

溶出液は１５０１１１１毎に分画した。６フラクシヨン
を濃縮し、実施例４と同様ＴＬＣでチエツクした。

ホスファチジルコリン画分は８．９ｇ得られた。

得られたホスファチジルエタノールアミン画分をイヤト
ロスキャン法で定量した結果９５．０％であった。イヤ
トロスキャン法で定量したホスファチジルエタノールア
ミンを実施例４と同様に分析用ＨＰＬＣで測定した。ク
ロマトグラムからホスファチジルエタノールアミン純度
９８．０％・であった。

ＣＰＣで分画したホスファチジルエタノールアミンの分
子種分離を行うため実施例４と同様に直接ＨＰＬＣに注
入した。ＨＰ　Ｌ　Ｃ（ＩＩＬｃ−８３７型）条件は実
施例４と同様に行った。得られたクロマトグラムは実施
例１と同じであった。得られたＡ区分を全ｆｆｉ　９ｍ
縮し、クロロホルムで抽出した。抽出液を硫酸ナトリウ
ムに通して脱水した。脱水した抽出液を濃縮後、６５３
．４ｍｇのホスファチジルエタノールアミンが得られた
。得られたホスファチジルエタノールアミンの一部をメ
チルエステル化した。

またホスファチジルエタノールアミンを酵素分解（ホス
ホリパーゼＡ２処理）し遊離脂肪酸を除去した。この溶
液を濃縮し、メチルエステル化した。

エステル化物は、ガスクロマトグラフィを用いて脂肪酸
組成を測定した。その結果、ＣＰＣで分画したホスファ
チジルエタノールアミンと、）ＩＰＬＣで分取したＡ区
分と、Ａ区分を酵素分解したものは、実施例４の表−３
と、はぼ同様の結果であった。

比較例１゜ 実施例２と同様に２０ｇのリン脂質Ａを用いた。

分配液はｎ−ヘキサン／アセトニトリルを用いてＣＰＣ
でホスファチジルコリンを分画した。ＣＰＣの条件は、
実施例２と同様に行った。下層液を分配管に充填後、試
料を注入した。上層液を送液後、上層溶出液は５〇−毎
に分画した。１６フラクシヨンを各々濃縮し、ＴＬＣで
チエツクした。その結果、原料の卵黄リン脂質組成と殆
ど同じであり、ホスファチジルコリンとホスファチジル
エタノールアミンに分離されなかった。また、その溶出
量は１９．３　ｇであった。次に下層液を逆送して得ら
れたホスファチジルコリン画分は、イヤトロスキャン法
で９６．９％であったが、ホスファチジルコリン画分の
溶出量は０．３ｇと非常に少なかった。

比較例２゜ 実施例４と同様に２０ｇの卵黄リン脂質Ｂを用いた。分
配液はｎ−ヘキサン／アセトニトリルを用いてＣＰＣで
ホスファチジルエタノールアミンを分画した。ＣＰＣの
条件は実施例４と同様に行った。下層液を分配管に充填
後、試料を注入した。

上層液を送液後、上層溶出液は５０ｙｄ毎に分画した。

１６フラクシヨンを各々濃縮し、ＴＬＣでチエツクした
。その結果、原料の卵黄リン脂質組成と殆ど同じであり
分離されなかった。また、その溶出量は１９．０　ｇで
あった。次に下層液を送液して得られたホスファチジル
エタノールアミン画分は、イヤトロスキャン法で９７．
１％であったが、ホスファチジルコリン画分の溶出量は
０．５ｇと非常に少なかった。

比較例３゜ 実施例２において、ＣＰＣの分配液としてｎ−ヘキサン
／メタノールを用いた以外は、実施例２と同様に行った
。しかし、溶剤系とリン脂質がすべて均一になり、ホス
ファチジルエタノールアミンとホスファチジルコリンを
全く分離できなかった。

【図面の簡単な説明】

第１図と第２図は実施例２において得られたＴＬＣの展
開図である。図中、ＰＣはホスファチジルコリン、ＰＥ
はホスファチジルエタノールアミンである。 第３図は実施例２において得られたホスファチジルコリ
ン分子種のＨＰＬＣクロマトグラムである。 第４図と第５図は実施例４において得られたＴＬＣの展
開図である。図中、ＰＣはホスファチジルコリン、ＰＥ
はホスファチジルエタノールアミンである。 第６図は実施例４において得られたホスファチジルエタ
ノールアミン分子種のＨＰＬＣクロマトグラムである。 第７図は実施例２で得られたＳｎ−２位にドコサヘキサ
エン酸を豊富に有するホスファチジルコリンの質量分析
計で得たマススペクトグラムである。 第８図は本発明に使用するｃｐｃの概略線図である。 Ｒ・・・ローター、　　　　　Ｃ・・・カートリッジ。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ドコサヘキサエン酸をグリセロール骨格のＳｎ−２位に
   豊富に有するリン脂質の製造にあたり、卵黄リン脂質を
   溶剤処理してリン脂質を濃縮し、次いで遠心液々連続多
   段分画装置を用いてホスファチジルコリンとホスファチ
   ジルエタノールアミンを分離し、次いでそれぞれの成分
   から逆相分配カラムを装着した大量分取液体クロマトグ
   ラフィーを用いてドコサヘキサエン酸含有成分を分取す
   ることを特徴とするドコサヘキサエン酸含有リン脂質の
   製造法。