JPH01128792A - Ｌ−トリプトフアンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、Ｌ−トリプトファンの新規な製造法に関し、
更に詳しくは、酵素を用いてフマル酸から一挙に光学活
性なＬ−トリプトファンを製造する方法に関する。

（従来の技術と課題） Ｌ−）リプトファンは、必須アミノ酸の１種で、特に栄
養上生理上重要なアミノ酸である。現在り一トリプトフ
ァンハ大量製造が困難であるため、その用途は主に医薬
用に限定されている。しかしながら、安価な製造技術が
確立されれば、食品、飼料添加剤、高分子素材等の新規
な規模の大きい市場が開拓されることが期待される。

従来、該アミノ酸の製法としては、インドール、アンモ
ニウムイオン及びピルビン酸、オキザロ酢酸はＬ−リン
ゴ酸を用いる方法が知られている（特公昭４９−４６９
１７号公報参照）。

しかしながら、これらの原料のうちピルビン酸オキザロ
酢酸又はＬ−リンゴ酸は大変高価であり、上記の方法は
工業的製法としては不向きである。

本発明らは先に、工業的に安価に入手しうるフマル酸を
原料とし、これとアンモニウムイオン及びインドールを （Ａ）フマラーゼ、 （Ｂ）ピルビン酸−リンゴ酸カルボキシラーゼ、（Ｃ）
トリプトファナーゼ及び （Ｄ）ＮＡＤＨオキシダーゼ の存在下に反応させてＬ−トリプトファンを効率よく製
造する方法を開発し提案したく特願昭６２−１８１２３
７号）。

本発明者らはＬ−）リプトファンをさらに効率よく高収
量で製造するため、さらに検討を加えた結果、トリプト
ファナーゼ生産菌をリンゴ酸又はその塩を炭素源として
培養することにより、トリプトファナーゼ活性は全く損
なうことなく、ピルビン酸−リンゴ酸カルボキシラーゼ
活性を増強でき、従ってそのようにして培養された菌体
を用いれば、Ｌ−トリプトファンを一層効率よく製造し
うろことを見出し本発明を完成するに至った。

（発明の構成と効果） 本発明によれば、 （Ａ）フマラーゼ、 （Ｂ）ピルビン酸−リンゴ酸カルボキシラーゼ、（Ｃ）
トリプトファナーゼ及び （Ｄ）ＮＡＤＨオキシダーゼ の存在下にフマル酸又はその塩、金属イオン、酸化型ニ
コチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ”）又は
還元型ニコチンナミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ
Ｈ）　、アンモニウムイオン及びインドールを反応せし
めてＬ−）リプトファンを製造する方法において、ピル
ビン酸−リンゴ酸カルボキシラーゼ（Ｂ）とトリプトフ
ァナーゼ（Ｃ）がリンゴ酸又はその塩を主炭素源として
培養した微生物由来のものであることを特徴とするし一
トリプトファンの製造法が提供される。

本発明の方法は、 （イ）フマラーゼの作用によるフマル酸からし一リンゴ
酸を生成せしめる反応： （ロ）生成するし一リンゴ酸をピルビン酸−リンゴ酸カ
ルボキシラーゼ（Ｌ−リンゴ酸をピルビン酸に転換する
能力をもつ酵素をいう）の作用によりピルビン酸に変換
する反応； （ハ）そのピルビン酸をアンモニウムイオン及びインド
ールとトリプトファナーゼの作用下に反応させて目的と
するし一トリプトファンを生成せしめる反応；並びに （ニ）上記（ロ）の反応により生ずる還元型補酵素ＮＡ
ＤＨをＮＡＤＨオキシダーゼにより酸化型補酵素ＮＡＤ
”に変換する反応 からなり、これらの反応をワン−ポット（ｏｎｅ　ｐｏ
ｔ）で−挙に行なうものである。

その際、（イ）、（ロ）、（ハ）、（ニ）の各反応系を
構成する。前記（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ＞の酵素
は、それぞれ別個の微生物起源に由来するものであって
も反応系を構成することは可能であるが、一つの微生物
起源が、複数の酵素を含有している方が有利であること
は言うまでもない。本発明はトリプトファナーゼ（Ｃ）
とピルビン酸−リンゴ酸カルボキシラーゼ（Ｂ）の両酵
素を同一の微生物供給源に求め、その供給源微生物をリ
ンゴ酸又はその塩を炭素源として培養することにより、
その微生物のトリプトファナーゼ活性には全く影響を与
えることなく、ピルビン酸−リンゴ酸カルボキシラーゼ
活性を誘導、増強することにより両酵素の産生活性の強
い菌体を生ぜしめ、それらを反応系に供することに特徴
を有するものである。

他方、上記（イ）及び（ニ）の酵素反応に使用される酵
素は、上記（イ）及び（ニ）の反応触媒作用を有するも
のであれば、その供給源には特に制限はなく、微生物由
来のものでも、動物由来のものでも或いは植物由来のも
のでも用いることができる。また、使用する酵素は単離
された純粋なものである必要はなく、例えば上記各反応
に作用する酵素を含有する微生物菌体又はその処理物を
使用することも可能である。微生物菌体の処理物として
は、例えば、ポリアクリルアミドゲル、カラギーナンゲ
ル、膜状高分子等に固定化したもの；凍結乾燥菌体；超
音波破砕等による破砕物；ボールミル等を用いる機械的
破砕物；溶媒処理、界面活性剤処理等の公知の手法によ
る処理物等が挙げられる。

フマラーゼ（Ａ）を含有する微生物としては、好ましく
はブレビバクテリウム属に属するものか挙げられ、具体
的にはブレビバクテリウム・フララバム（Ｂｒｅｖｉｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ　ｆｌａｖｕｍ）　Ｍ　Ｊ　２３３（
ＦＥＲＭ　　Ｐ−３０６８）、ブレビバクテリウム・フ
ラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｆｌａｖｕｍ
）　Ｍ　Ｊ　２３３−ＡＢ−４１（ＦＥＲＭ　　Ｐ−３
８１２）などの菌株が包含される。

また、リンゴ酸又はその塩を炭素源として培養される、
ピルビン酸−リンゴ酸カルボキシラーゼ（Ｂ＞とトリプ
トファナーゼ（Ｃ）を同時に産生する微生物は、特に制
限されるものではなく、例えばエシエリヒア・コリ（Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　Ｋ−１２ＹＫ３０
０２（ＦＥＲＭ　　Ｐ−８８４４＞。

又はエシエリヒア・コリ〈ε５ｃｈｅｒｉｃｂｉａ　ｃ
ｏｌｉ）　Ｋ−１２ＹＫ３００３（ＦＥＲＭ　　Ｐ−８
８４５＞、又はエシエリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ　ｃｏｌｉ）　Ｋ−１２ＹＫ３００４（ＦＥＲＭ
　　Ｐ−９２１９）等が挙げられる。

さらに、ＮＡＤＨオキシダーゼ（Ｄ）の供給源も、微生
物、動物及び植物のいずれであってもよく、例えば微生
物由来のものとしては、ロイコノストり・メセンテロイ
デス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ　ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉ
ｄｅｓ）ＡＴＣＣ９１３５、バチルス・セレウス（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓ）ＡＴＣＣ４３４２、ストレ
プトコッカス・フェカリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕ
ｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ）　ＡＴＣＣ１１７００などによ
って産生されるものが挙げられる。

本発明の方法はそれ自体公知の酵素反応におけると同様
にして行なうことができる。例えば、反応器に基質とな
るフマル酸又はその塩、アンモニウムイオン源、金属イ
オン源、インドール並びに酸化型又は還元型ニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチドを仕込み、水又は０．１Ｍ
リン酸緩衝液などの緩衝液中で一般にｐＨ６〜９、好ま
しくは７〜８．５の範囲内、及び温度約２０〜約５０℃
、好ましくは約３０〜約４５℃の範囲内の条件下に実施
することができ、反応時間は通常約１〜約７２時間であ
る。

フマル酸は遊離の酸として使用する場合には、水酸化ナ
トリウム、水酸化カリウム、アンモニア水等のアルカリ
で上述のｐＨに中和して用いられるが、本発明の方法は
アンモニアイオンを一反応成分としているから、アンモ
ニア水を用いるのがより好ましい。また、フマル酸の塩
としては特に制限はなく、アンモニウム塩、ナトリウム
塩、カリウム塩、カルシウム塩等の各種の塩を使用する
ことができる。反応系中におけるフマル酸又はその塩の
濃度は、厳密に制限されるものではないが、一般には０
．１〜２０％（ｗｔ／ｖｏｌ）の範囲が適当である。フ
マル酸又はその塩はこの範囲内の濃度で初発から加えて
もよく、或いは逐次添加により最終的に上記濃度となる
ようにするのも好ましい方法である。

金属イオンとしては、Ｍ　ｎ　”１Ｍ　ｇ　”、Ｃｏ”
、Ｎ　ｉ　”、Ｚｎ”等が好ましいが、より好ましくは
Ｍｎ２°、Ｍｇ２°、Ｃｏ”であり、これら金属イオン
は通常０．１〜２０ｍＭの範囲の濃度で用いられる。こ
れら金属イオンは塩化物、硫酸塩等の水溶性塩の形で加
えられるのが好ましい。ＮＡＤ”又はＮＡＤＨについて
は、ＮＡＤ“の場合はそのまま、ＮＡＤＨの場合は共存
するＮＡＤＨオキシダーゼによりＮ、ＡＤ”に変換させ
たのち利用され、反応液中における濃度は０，０１〜１
０ｍＭの範凹円とするのが適当である。

インドールの濃度も一般に０．１〜２０％（ｗｔ／ｖｏ
ｌ）の範囲内とするのが好都合である。

使用しうるアンモニウムイオン源としては、例えば、［
酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウ
ム、酢酸アンモニウムなどの無機酸又は有機酸のアンモ
ニウム塩が好適に使用できる。

一方、前述した酵素又は酵素を含有する微生物若しくは
その処理物の使用量もまた厳密に制限されるものではな
く、酵素活性等に応じて広く変えることができるが、フ
マラーゼ（Ａ）、ピルビン酸−リンゴ酸カルボキシラー
ゼ（Ｂ）、ＮＡＤＨオキシダーゼ（Ｃ）はそれぞれ一般
に０．１〜１０％（ｗｔ／ｖｏｌ）の範囲内で用いるの
が適当である。

本発明の方法に用いる酵素の供給源として使用しうる微
生物菌体の培養は、それ自体既知の方法に従い合成培地
又は天然培地を用いて行なうことができる。

ピルビン酸−リンゴ酸カルボキシラーゼ（Ｂ）とトリプ
トファナーゼ（Ｃ）を産生ずる微生物をリンゴ酸又はそ
の塩を主炭素源として培養する場合には、Ｌ−又はＤＬ
−リンゴ酸を０．１〜３０％（ｗｔ／ｖｏｌ）の濃度、
好ましくは０．５〜２０％（ｗｔ／ｖｏｌ）の濃度で培
地に添加する。この濃度は初発濃度であってもよいし、
逐次添加の結果、最終的にこの濃度となるようにしても
よい。リンゴ酸の塩としてはナトリウム塩、カリウム塩
、アンモニウム塩等が挙げられる。

一方、その他の酵素を産生する微生物を培養する場合に
は、炭素源としてグルコース、フラクトース、シュクロ
ース、グリセロール、糖蜜等の炭水化物を使用すること
ができ、さらにブレビバクテリウム属の微生物を培養す
る場合には、上記の炭素源の他にエタノールを炭素源と
して用いることもできる。

窒素源としては、トリプトン、酵母エキス、コーン・ス
チーブリカー、カゼインの加水分解物等の天然有機窒素
源が挙げられ、これらは窒素源と同時に炭素源にもなり
得る。その他の栄養源として、リン酸−カリウム、リン
酸二カリウム等のリン酸塩、硫酸鉄、塩化鉄、硫酸マン
ガン、塩化マンガン、硫酸マグネシウム、塩化マグネシ
ウム等のミネラル分；必要に応じて、ビオチン、チアミ
ン塩酸等のビタミン類を加えることができる。

培養は、振盪培養成いは通気撹拌槽培養などの好気的条
件下に行なうことができる。培養温度は一般に２０〜５
０℃の範囲内であり、培地中の培地のｐＨは中性または
微アルカリ性付近に維持することが望ましい。培養期間
は、通常約５時間〜約３日である。

上記のような培養法によって得られる菌体はそのまま又
はその処理物として本発明の方法に使用することができ
、フマル酸又はその塩、金属イオン、ＮＡＤ”又はＮＡ
ＤＨ、アンモニウムイオン及びインドールからＬ−）リ
プトファンを高収量で生成せしめることができる。

反応液中に生成するし一トリプトファンの分離、精製そ
れ自体既知の方法、例えばイオン交換樹脂、活性炭等に
よる吸着、脱着処理等により行うことができる。

以下、参考例及び実施例を掲げて本発明の方法をさらに
具体的に説明する。尚、以下の実施例においてＬ−トリ
プトファンの定量は高速液体クロマトグラフィーにより
行った。

下記第１表に示す組成の培地１００論２２組を５００−
の三角フラスコ２本に別々に分注し、１２０℃で１５分
間加熱滅菌したものの各々にエタノールを２容量％無菌
的に添加し、これらにブレビバクテリウム・フラバム（
Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｆｌａｖｕｍ）ＭＪ２
３３（ＦＥＲＭ　　Ｐ−３０６８）又はブレビバクテリ
ウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｆｌ
ａｖｕｎ）ＭＪ２３３−ＡＢ−４１（ＦＥＲＭ　　Ｐ−
３８１２）を−白金耳ずつ植菌し、３０℃にて２４時間
振盪培養した。

これら二組の培養液２０Ｉ２を２１容ジャーファーメン
タ−注の下記第２表に示す組成の培地１２にそれぞれ別
に接種し、３３℃、ｐＨ７，６、通気ｉ１ＶＶＭの条件
下にて撹拌し、エタノール濃度が１．０〜１．５容量％
に保たれるようにエタノールを断続的に添加した。３０
時間の培養後、培養液を遠心骨Ｍ　（６、ＯＯＯｒｐｍ
、１５分）して得た菌体それぞれを供試菌体とした。

第　　１　　表 尿素　　　　　　　　　　　　　　　４．０ｇＩａ酸ア
ンモニウム　　　　　　　　１４．０ｇＫＨ２ＰＯ４０
゜５ｇ Ｋ２ＨＰＯ４０，５ｇ Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ４・７Ｈ２００，５ｇ Ｆ　ｅ　Ｓ　Ｏ＜　・７　Ｈ２０６、ＯｇＭｎＳＯ４・
４〜６Ｈ２０６，０ｇ 酵母エキス　　　　　　　　　　　　１．０ｇカザミノ
酸　　　　　　　　　　　　　１．０ｇビオチン　　　
　　　　　　　　　２００μｇチアミン塩酸塩　　　　
　　　　　１００μｇ蒸留水　　　　　　　　　　　　
１０１００Ｏ第２表 硫酸アンモニウム　　　　　　　　２３．０ｇＫ　８２
　Ｐ　Ｏ−０、５ｇ Ｋ２ＨＰＯ，０，５ｇ Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ４・７　Ｈ２００、５ｇＦｅＳＯ＜・７
Ｈ２０２０ｍｇ Ｍ　ｎ　Ｓ　Ｏ４・４〜６８２０　　　　　　２０　ｍ
　ｇ酵母エキス　　　　　　　　　　　　３ｇカザミノ
酸　　　　　　　　　　　　　３ｇビオチン　　　　　
　　　　　　　２００μｇチアミン塩酸塩　　　　　　
　　　１００μｇ蒸留水　　　　　　　　　　　　１０
００ａ＋７２参考例２　：　ＮＡＤＨキシダーゼの調　
゛ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎ
。

ｓｔｏｃｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）　（ＡＴＣＣ９
１３５）株を、ザ・ジャーナル・オブ・ジェネラル・ア
ンド・アプライド・マイクロバイオロジー（Ｔｈｅ　Ｊ
ｏｕｒｎａｌｏｆ　Ｇｅｎｅｒａｌ　ａｎｄ　Ａｐｐｌ
ｉｅｄ　Ｈｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）第１７巻、５１〜
５２ページ（１９７１年）に記載されているＫａｗａ　
ｉ等の方法により、培養し且つ生成するＮＡＤＨオキシ
ダーゼを精製して、比活性がおよそ１６０　（ｕｎｉｔ
ｓ／　Ｂ）のＮＡＤＨオキシダーゼを得た（ただし、１
　ｕｎｉｔは１分間あたり１μ鴨０１の補酵素を再生し
うる酵素量である）。

黍考例３：エシエリヒア・コリ菌　の＝。

下記第３表に示す組成の培地５０−を５０〇−容三角フ
ラスコ分注し、１２０℃で１５分間滅菌したものに別途
滅菌したグルコース又はＬ−リンゴ酸水溶液（５Ｎ　　
ＮａＯＨにてＰＨ７，０に調整済）を、濃度１％（ｗｔ
／ｖｏｌ）になるように添加したものに、エシエリヒア
・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｔｉ）Ｋ１２系
菌株（ＹＫ３００２　（ＦＥＲＭＰ−８８４４＞、ＹＫ
３００３（ＦＥＲＭ　　Ｐ−８８４５）又はＹＫ３００
４（ＦＥＲＭ　　Ｐ−９２１９）＞を−白金耳植菌し、
３７℃にて１日振盪培養したものを、同様に滅菌調製し
たＬ−トリプトファンを２００μｇ　／　ｄの濃度で含
有する１％（ｗｔ／ｖｏｌ）濃度でグルコース又はＬ−
リンゴ酸を含有する下記第３表に示した培地１，０ＯＯ
−に２０ｄ接種し、同じく３７℃にて８時間振盪培養し
た。培養終了液を遠心骨１１（６，ＯＯＯｒｐｍ、１５
分間、４°ＣＡして得た菌体を供試菌体とした。

第　　３　　表 ペプトン　　　　　　　　　　　　　１ｇ酵母エキス　
　　　　　　　　　　　１ｇ硫酸アンモニウム　　　　
　　　　　　３ｇＫＨ２ＰＯ４１，６ｇ Ｋ２）（Ｐｏ、　　　　　　　　　　　　　　５．５ｇ
Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ＜・７Ｈ２００，２ｇ Ｆｅ５０＜−７８２０５０ｍｇ 蒸留水　　　　　　　　　　　　１０００ｍｊ１００Ｏ
，２ 参考例４ 参考例３に示したようにグルコース、Ｌ−リンゴ酸を主
炭素源として培養したエシエリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｅｈｉａ　ｃｏｌｉ）　Ｋ　−１２ＹＫ　３００２
　（ＦＥＲＭ　　Ｐ−８８４４）、ＹＫ３００３（ＦＥ
ＲＭ　　Ｐ−８８４５＞又はＹＫ３００４　（ＦＥＲＭ
Ｐ−９２１９）菌体１ｇを２ｎ＋ＲのｐＨ７，０５０ｍ
Ｍリン酸緩衝液に懸濁し、超音波破砕を行い、遠心処理
（１２，ＯＯＯｒｐｍ　４０分　４℃）上清を調製し、
該画分におけるトリプトファナーゼ及びピルビン酸−リ
ンゴ酸カルボキシラーゼ活性を測定した。トリプトファ
ナーゼ活性は、０゜９−注に１００１ｉｎｏｌｅリン酸
緩衝液（ｐＨ８，０）、５μｍｏｌｅＬ−トリプトファ
ン、０．０４　μｍｏｌｅピリドキサルリン酸を含む反
応液０．９−に、適当に希釈前記遠心処理上清０　、１
　ｍｌを加え３７℃２０分間反応させた後、常法［０，
Ｈ，Ｓｍ１ｔｈ　＆Ｃ，Ｙａｎｏｆｓｋｙ：　　”Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｗ＋ｏｌｏｇｙｌｌ。

Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ
　　ｖｏｌ、５ｐｐ　７９４−８０６　（１９６２）］
に従い生成するインドールを定量して求めた。またピル
ビン酸−リンゴ酸カルボキシラーゼ活性はザ・ジャーナ
ル・オブ・バイオケミストリー（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａ
ｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｎｉｓｔｒｙ）第７１巻、１０
１５〜１０２８ページ（１９７２年）に記載されている
Ｍｕｒａ　ｉ等の方法に従いＮＡＤＨによる吸光の増大
を測定して求めた。

グルコース、Ｌ−リンゴ酸を主炭素源として培養して得
た菌体のそれぞれについて測定した活性の値を下記第４
表に示す。尚、活性は、グルコースを主炭素源として生
育させた時の活性を１００とする相対活性で示す。

実施例１ 下記第５表による示す組成の反応液５０−を５００−容
三角フラスコに分注したのち、該反応液に前記参考例１
で調製したブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉ
ｂａｃｔｅｒｉｕＬＩｆｌａｖｕｍ）　Ｍ　Ｊ　２３３
（ＦＥＲＭ　　Ｐ−３０６８＞の培養液４０−から得た
菌体と、前記参考例２で示したＭＡＤＨオキシダーゼ液
２−と、参考例３でＬ−リンゴ酸を主炭素源として調製
したエシエリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏ
ｌｉ）　Ｋ−１２ＹＫ　　３００２　（ＦＥＲＭ　　Ｐ
−８８４４）の培養液４０Ｉ６ｊ２から得た菌体とを添
加し、３７℃にて２４時間振盪反応を行った。反応終了
後、遠心分離にて菌体を除去し、その上清中のＬ−）リ
プトファンを定量したところ９８ｍｇ／ｌの生成が認め
られた。

第　　５　　表 インドール　　　　　　　　　　　　２０ｍＭフマル酸
ナトリウム　　　　　　　　　５０ｍＭ塩化アンモニウ
ム　　　　　　　　３００ｍＭＮＡＤ”　　　　　　　
　　　　　　　０．１　　ｍＭＭｎＣ１２２２ｍ　Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ８，０）　　　　　　１００ｍＭ反
応上清液４０−をアンモニア型強酸性イオン交換樹脂（
ダイアイオン５Ｋ−ＩＢ、三菱化成製）のカラムを通し
てＬ−１−リプトファンを吸着させた後、アルカリ溶液
で溶出後濃縮しＬ〜トリプトファンの粗結晶を析出させ
た。これをアセトンで洗浄し乾燥してし一トリプトファ
ンの結晶２．９ｍｇを得た。

実施例２ 実施例１の第５表による示す組成の反応液５０ｍ１を５
００ｍ１容三角フラスコに分注したのち、該反応液に前
記参考例１で調製したブレビバクテリウム・フラバム（
Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｎ　ｆｌａｖｕｖａ）　Ｍ
　Ｊ　２３３−ＡＢ−４１（ＦＥＲＭ　　Ｐ−３８１２
）の培養液４０ｍｊｌｔから得た菌体と、前記参考例２
で示したＮＡＤＨオキシダーゼ液２ｍｊ！と、参考例３
でＬ−リンゴ酸を主炭素源として調製したエシエリヒア
・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　Ｋ　−
１２ＹＫ　３００２　（ＦＥＲＭ　　Ｐ−８８４４）の
培養液４０−から得た菌体とを添加し、３７℃にて１５
時間振盪反応を行った。反応終了後、遠心分離にて菌体
を除去し、その上清中の１−一トリブトファンを定量し
たところ１０４ｍｇ／ｌの生成が認められた。

反応上清液４０ｍ１をアンモニア型強酸性イオン交換樹
脂（ダイアイオン５Ｋ−ＩＢ、三菱化成製）のカラムを
通してＬ−トリプトファンを吸着させた後、アルカリ溶
液で溶出後濃縮しＬ−トリプトファンの粗結晶を析出さ
せた。これをアセトンで洗浄し乾燥してＬ−）−リプト
ファンの結晶３．０ｍｇを得た。

実施例３ 実施例１の第５表による示す組成の反応液５０−を５０
０−容三角フラスコに分注したのち、該反応液に前記参
考例１で調製したブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒ
ｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｆｌａｖｕｍ）　Ｍ　Ｊ　
２３３−ＡＢ−４１（ＦＥＲＭ　　Ｐ−３８１２＞の培
養液４０ｍ２から得た菌体と、前記参考例２で示したＮ
ＡＤＨオキシダーゼ液２＋ｎＪと、参考例３でＬ−リン
ゴ酸を主炭素源として調製したエシエリヒア・コリ（Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　Ｋ　−１２ＹＫ　
　３００３（ＦＥＲＭ　　Ｐ−８８４５）の培養液４０
−から得た菌体とを添加し、３７°Ｃにて１５時間振盪
反応を行った９反応終了後、遠心分離にて菌体を除去し
、その上清中のＬ−）リプトファンを定量したところ９
９ｍｇ／ｆの生成が認められた。

反応上清液４０−をアンモニア゛型強酸性イオン交換樹
脂（ダイアイオン５Ｋ−ＩＢ、三菱化成製）のカラムを
通してＬ−）リプトファンを吸着させた後、アルカリ溶
液で溶出後濃縮しＬ−）リプトファンの粗結晶を析出さ
せた。これをアセトンで洗浄し乾燥してＬ−）リプトフ
ァンの結晶３．０ＩＩ１ｇを得た。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、（Ａ）フマラーゼ、 （Ｂ）ピルビン酸−リンゴ酸カルボキシラーゼ、（Ｃ）
   トリプトファナーゼ及び （Ｄ）ＮＡＤＨオキシダーゼ の存在下にフマル酸又はその塩、金属イオン、酸化型ニ
   コチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＾＋）又
   は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡ
   ＤＨ）、アンモニウムイオン及びインドールを反応せし
   めてＬ−トリプトファンを製造する方法において、ピル
   ビン酸−リンゴ酸カルボキシラーゼ（Ｂ）とトリプトフ
   ァナーゼ（Ｃ）がリンゴ酸又はその塩を主炭素源として
   培養した微生物由来のものであることを特徴とするＬ−
   トリプトファンの製造法。 ２、リンゴ酸又はその塩を主炭素源として培養した微生
   物が、少くともトリプトファナーゼの構造遺伝子を含有
   するプラスミドで形質転換されたエシエリヒア・コリ（
   Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）種に属するトリプト
   ファナーゼ生産菌である特許請求の範囲第１項記載の方
   法。 ３、リンゴ酸又はその塩を主炭素源として培養した微生
   物が、エシエリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃ
   ｏｌｉ）Ｋ−１２ＹＫ３００２（ＦＥＲＭＰ−８８４４
   ）、エシエリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏ
   ｌｉ）Ｋ−１２ＹＫ３００３（ＦＥＲＭＰ−８８４５）
   又はエシエリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏ
   ｌｉ）Ｋ−１２ＹＫ３００４（ＦＥＲＭＰ−９２１９）
   である特許請求の範囲第１項記載の方法。