JP7439019B2 - 修飾型ｒｎａ（ｍｏｄ－ｒｎａ）を使用する効率的なインビボタンパク質発現 - Google Patents

修飾型ｒｎａ（ｍｏｄ－ｒｎａ）を使用する効率的なインビボタンパク質発現 Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
本願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づき、２０１１年４月３日に提出された米国特許仮出願番号第６１／４７１，１６６号、および２０１１年４月４日に提出された同第６１／４７１，５８４号の利益を主張する。これらのそれぞれの内容は、それらの全体の参照により本明細書に組み込まれる。
配列表
本願はＥＦＳ－Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩ形式で提出された配列表を含み、その配列表はその全体の参照によりここに組み込まれる。前記のＡＳＣＩＩコピーは、２０１２年３月１２日に作成され、３２５８７１５３．ｔｘｔという名称であり、サイズが２，１０５，６６８バイトである。
本発明の分野
本発明は、概して、合成修飾型ＲＮＡを使用するインビボでの筋細胞および心筋細胞における遺伝子発現ならびにその使用法に関する。本発明は、概して、合成修飾型ＲＮＡを使用する腫瘍における遺伝子発現の調節およびその使用法にさらに関する。
心血管疾患は、心血管系に関連する疾患または障害を含む。そのような疾患および障害は心膜、心臓弁、心筋、血管および静脈のものを含む。
ここ二十年で心不全の罹患率と死亡率が著しく上昇した（Ｔａｖａｚｚｉ， １９９８）。それ故、有効な治療法の発見は公衆衛生における今世紀の最大の課題のうちの一つである。心不全の治療には冠動脈バイパス移植および全心臓移植などのいくつかの代替法が存在するが、厳格な適格規準と共に心筋線維症および器官の不足のため、この疾患を治療する新しいアプローチの探索が要求されている。細胞移植によっても収縮性筋細胞の数を損傷を受けた心臓において増加させることができることが明らかになっている。しかしながら、心筋細胞（ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ）は心筋の細胞（ｃａｒｄｉａｃ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌ）としても知られるが、それは終末分化細胞であり、分裂することができず、そして、それらの細胞移植での使用は、梗塞を起こした広い部位の心筋の修復に充分な量の心筋細胞を得ることができないことから限定的である。
したがって、１つのストラテジーは、細胞死から細胞を保護するための、傷害後の心臓、例えば、心筋細胞における遺伝子発現の誘導またはタンパク質の発現であり得、あるいは、機械的ストレスや低酸素誘導ストレスへの細胞の耐性を上昇させるための、細胞への作用物質もしくは遺伝子の導入などの予防ストラテジーであり得る。作用物質の導入または遺伝子発現の誘導のための伝統的な方法は外来性ＤＮＡによるもの、または組換えウイルスベクターによるものであったが、そのような遺伝子治療法の使用は意図しない変異形成性のゲノム変化を導入する潜在的なリスクを有し、ならびに細胞に有毒である可能性や自然免疫応答を誘発する可能性がある。さらに、タンパク質補充療法も、タンパク質のインビボ送達が自然免疫応答を誘導するという問題およびタンパク質の安定性や特定の組織種および細胞種への送達に関する問題のために難しいことがある。したがって、有益な研究用途や治療用途に適したインビボ遺伝子発現やタンパク質発現の能率的な方法の必要性が存在する。
本明細書は、合成修飾型ＲＮＡ配列を使用するインビボ遺伝子発現の方法を提供し、ならびに、特に、インビボでの組織および器官における、およびまた細胞、例えば、心筋細胞および筋原細胞を含むが、これらに限定されない筋肉細胞におけるインビボタンパク質発現のための方法を提供する。他の本発明の態様は、対象における疾患および障害、例えば、限定されないが、筋肉障害ならびに心血管系の疾患および障害の治療のための、目的のタンパク質をコードする修飾型ＲＮＡの使用法に関する。他の本発明の態様は、対象の疾患または障害の治療のために対象に投与するための、目的のタンパク質をコードする少なくとも１つの合成修飾型ＲＮＡを含む医薬組成物およびそのキットに関する。いくつかの実施形態では、その疾患または障害は心血管系の疾患または障害であり、合成修飾型ＲＮＡによって発現されるその目的のタンパク質は心機能増強タンパク質である。
最近、合成修飾型ＲＮＡ（本明細書において「ＭＯＤ－ＲＮＡ」と呼ぶ）は、哺乳類細胞における目的の遺伝子の過剰発現のためにインビトロで使用することができることが報告された。合成ｍＲＮＡに行われる化学修飾および配列修飾がその分子を安定化し、転写を増強する。ＭＯＤ－ＲＮＡからのポリペプチドの発現が、宿主細胞に取り込まれ得るＤＮＡまたはウイルス性配列の導入を必要とすることなく、目的の遺伝子の非常に効率的で一過性のインビトロ発現を可能にする。
本明細書において、発明者らは合成修飾型ＲＮＡを使用する効率的なインビボタンパク質発現を実証する。本明細書において示されるように、タンパク質をインビボで発現させるためのＭＯＤ－ＲＮＡの使用は急速に生じ、そして、非ＭＯＤ ＲＮＡ（例えば、普通のＲＮＡ配列）の導入、または自然免疫系を活性化し得るタンパク質の直接細胞内導入よりもずっと効率的で細胞への有害性が低い。本明細書は、目的に合わせた形質移入技術を用いる合成修飾型ＲＮＡの送達を実証し、そしていくつかの実施形態では、組成物中のＭＯＤ－ＲＮＡの投与は導入された合成修飾型ＲＮＡの分解を阻害する特定の試薬を含むこともできる。
本発明の１つの態様は、目的のタンパク質をコードする合成修飾型ＲＮＡを組織に導入することによるインビボタンパク質発現のための組成物、方法およびキットに関する。本明細書において開示されるように、いくつかの実施形態では、本明細書に記載される少なくとも１つのインビボ合成修飾型ＲＮＡを導入するための方法はいくつかの独自の特徴を含み、それには特定の形質移入プロトコル、例えば、目的のタンパク質をコードする高濃度レベル、例えば、少なくとも約１μｇ／μｌまたは約１００μｇ／μｌのＭＯＤ－ＲＮＡの送達、ならびに目的の器官や組織への修飾型ＲＮＡを含む組成物の特異的な導入を可能とする組織特異的外科的手技が含まれる。
いくつかの実施形態では、本明細書において開示される方法、組成物およびキットはインビボタンパク質補充療法のための方法での使用に合わせることができる。いくつかの実施形態では、目的のタンパク質をコードする合成修飾型ＲＮＡは、タンパク質発現が望ましい様々な異なる疾患の治療のための方法において、インビボタンパク質発現のために組織や器官に送達することができる。いくつかの実施形態では、疾患は本明細書において開示される機能欠損型疾患、例えば、限定されないが、筋ジストロフィー、嚢胞性線維症、ならびに特定のタンパク質のタンパク質発現のレベルが不適切であるおよび／または遺伝子発現によって非機能性タンパク質がもたらされる他の疾患であり得る。
さらに、いくつかの実施形態では、本明細書において開示される、インビボタンパク質発現のための合成修飾型ＲＮＡ技術のインビボ送達のための方法は、器官全体および全身の病態生理学を研究するために使用することができる動物モデルプラットフォームの作製に用いることができる。いくつかの実施形態では、本明細書において開示される方法は、ヒトの患者での臨床用途のための治療法の試験や開発のための小動物モデルおよび大動物モデル、例えば、霊長類モデルおよび豚モデル、の両方を使用するインビボシステムを提供する。
いくつかの実施形態では、合成修飾型ＲＮＡを使用するインビボタンパク質発現のための本明細書において開示される方法および組成物およびキットは、疾患または障害の発生と治療のための物であり得る。いくつかの実施形態では、疾患または障害は、特定のタンパク質の不十分な発現または正常に動作しない型のタンパク質の発現の結果である遺伝性障害や後天性障害である。いくつかの実施形態では、疾患または障害は後天性障害、例えば、本明細書において開示される心血管系の疾患または障害である。
別の実施形態では、合成修飾型ＲＮＡを使用するインビボタンパク質発現のための本明細書において開示される方法および組成物およびキットは再生医療ストラテジーにおいてでも用いられ得る。例えば、いくつかの実施形態では、目的のタンパク質をコードする少なくとも１つの合成修飾型ＲＮＡを含む組成物は目的の細胞集団を含むこともできる。言い換えると、いくつかの実施形態では、本発明は、目的の細胞集団と少なくとも１つの合成修飾型ＲＮＡの組合せを対象に投与する工程を含む、再生細胞療法のための方法を提供する。いくつかの実施形態では、細胞集団は幹細胞集団であり、いくつかの実施形態では、幹細胞集団は心臓前駆細胞または心臓始原細胞の集団である。いくつかの実施形態では、幹細胞はＩｓｌ１＋幹細胞集団であり、または血管始原細胞集団である。そのような細胞集団は当技術分野において周知であり、そして、国際特許出願公開第２００８／０５４８１９号、同第２０１０／１４４６７８号、同第２０１０／０４２８５６号、および米国特許出願公開第２０１０／０１６６７１４号、同第２０１１／００３３４３０号、同第２０１０／０２１７１３号および同第２０１１／０００３３２７号に開示される細胞集団を含むが、これらに限定されない。それらは参照により全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、細胞集団はＩｓｌ１＋始原細胞、または国際公開第２０１０／１４４６７８号に開示されるその子孫細胞である。
本明細書において開示されるように、本発明の１つの態様は、組織、例えば、限定されないが、心筋細胞および筋細胞など、心臓組織および筋肉組織においてタンパク質発現をインビトロでもインビボでも誘導するための合成修飾型ＲＮＡ（本明細書において「ＭＯＤ－ＲＮＡ」と呼ぶ）の使用に関する。いくつかの実施形態では、その心筋細胞は哺乳類の心筋細胞、例えば、ヒト心筋細胞である。
特に、本明細書の実施例において示されるように、ＭＯＤ－ＲＮＡによる機能性心筋細胞（ＣＭ）のインビトロおよびインビボでの形質移入により、非常に速いタンパク質発現の開始が、非ＭＯＤ ＲＮＡで形質移入されている細胞と比較して有意に高い、例えば、少なくとも約２倍高いタンパク質発現レベルと共にもたらされる。本明細書はまた、ＭＯＤ－ＲＮＡによるマウス新生児の形質移入およびヒト胎児心筋細胞のインビトロでの形質移入に最適な用量の範囲が１０００細胞当たり１０～３０ｎｇの間であり、そのような用量は細胞に無毒であることを実証する。
本明細書はまた、ＭＯＤ－ＲＮＡによる心臓および筋肉組織の形質移入の後の非常に効率的で急速であるインビボタンパク質発現を実証する。発明者らは、タンパク質発現が形質移入後から少なくとも３時間以内までに起こること、および、ＭＯＤ－ＲＮＡからのインビボタンパク質発現が筋肉または心臓へのＭＯＤ－ＲＮＡの直接注入から少なくとも４～５日間生じることを示す。本明細書の実施例において開示されるように、ＭＯＤ－ＲＮＡによる心臓組織および筋肉のインビボ形質移入によって、低免疫応答がもたらされる。重要なことに、発明者らは、インビボタンパク質発現のレベルは心臓または筋肉にインビボで注入されたＭＯＤ－ＲＮＡの量に対して用量依存的であり、そのことが、所望の量の必要なタンパク質発現のためにその組織に投与されるＭＯＤ－ＲＮＡの量を決定することを可能とすることを示す。したがって、合成修飾型ＲＮＡがタンパク質補充療法または他の治療法においてインビボタンパク質発現のために使用されている場合、発現するタンパク質の量を決定する能力は非常に有用である。
本発明の別の態様は、ポリペプチドをコードする合成修飾型ＲＮＡを含む組成物をその対象に投与する工程を含む、該対象の疾患または障害を治療する方法に関する。いくつかの実施形態では、組成物は対象の特定の組織に送達することができ、いくつかの実施形態では、その組織は筋肉組織である。いくつかの実施形態では、筋肉組織は骨格筋、心筋または平滑筋である。
いくつかの実施形態では、本明細書において開示される方法は、１つ以上の疾患、例えば、限定されないが、次の筋肉疾患：心筋症（虚血性および非虚血性）、骨格筋障害、嚢胞性線維症、筋ジストロフィーの治療のために対象の筋肉組織に目的のポリペプチドをコードする合成修飾型ＲＮＡを送達する工程を含む。いくつかの実施形態では、心筋症の治療のために、ＶＥＧＦ、例えば、ｈＶＥＧＦをコードする合成修飾型ＲＮＡを対象の心臓に送達することができる。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦをコードする合成修飾型ＲＮＡは、直接心筋内注入により心筋に送達することができる。
発明者らは本明細書において、心筋梗塞のマウスモデルの心臓へのｈＶＥＧＦポリペプチドをコードする合成修飾型ＲＮＡのインビボ送達が心筋梗塞巣が発生することを防ぎ、虚血性発作後の心臓への損傷を顕著に予防することを実証している。いくつかの実施形態では、ｈＶＥＧＦポリペプチドをコードする合成修飾型ＲＮＡのインビボ送達はまた心臓の虚血からの回復を促進した。したがって、１つの実施形態では、本明細書において開示される方法は、心臓発作や心筋梗塞の治療のために対象の心臓組織、例えば、心筋組織にＶＥＧＦをコードする合成修飾型ＲＮＡを送達する方法に関する。
いくつかの実施形態では、前記方法と組成物は、例えば、１つ以上の遺伝子をコードする合成修飾型ＲＮＡを送達することができる場合、筋ジストロフィーの治療のための方法に有用であり、そして、１つ以上の筋肉組織の標的に送達することができる。例えば、いくつかの実施形態では、前記方法がデュシェンヌ型／ベッカー型筋ジストロフィーの治療のためのものである場合、非変異型のジストロフィンタンパク質をコードする合成修飾型ＲＮＡを送達することができる。前記方法がエメリー・ドレヒュス型筋ジストロフィーの治療のためのものである別の実施形態では、エメリンおよび／またはラミンタンパク質をコードする合成修飾型ＲＮＡを送達することができる。
いくつかの実施形態では、ジストロフィンおよび／またはエメリンおよび／またはラミンタンパク質をコードする合成修飾型ＲＮＡは、前記の健康状態、特に胸郭の横隔膜の衰弱に起因する不十分な呼吸および姿勢筋の衰弱に起因する歩行不能に関連する最も顕著な障害を有する筋肉組織に送達することができる。横隔膜注射については、ジストロフィンおよび／またはエメリンおよび／またはラミンタンパク質をコードする合成修飾型ＲＮＡの横隔膜筋への直接注入のための胸腔鏡アプローチを用いることができる。いくつかの実施形態では、骨格筋への注射、例えば、それぞれ姿勢の維持と腕全体の動作に関連する腰帯筋および肩帯筋への直接注入により直接的に、ジストロフィンをコードする合成修飾型ＲＮＡを送達することができる。
別の実施形態では、前記方法と組成物は、例えば、非変異型（野生型）ＣＦＴＲタンパク質をコードする合成修飾型ＲＮＡを対象の横隔膜に送達することができる場合、嚢胞性線維症の治療のための方法において有用である。いくつかの実施形態では、ＣＦＴＲをコードする合成修飾型ＲＮＡは、非変異型ＣＦＴＲタンパク質をコードする合成修飾型ＲＮＡの直接実質注入や気管支内導入によって送達することができる。したがって、疾患または障害の治療のための所望のポリペプチドをコードする合成修飾型ＲＮＡを送達するためのあらゆる手段が本明細書に包含され、例えば、それぞれ腹腔鏡アプローチおよび内視鏡アプローチを介する腸および膵臓への、これらの器官および系に関連する障害を有する対象の治療のための直接注入が本明細書に包含される。
いくつかの実施形態では、本明細書において開示される方法は、１つ以上の疾患の治療のために目的のポリペプチドをコードする合成修飾型ＲＮＡを対象の組織に送達することに向けられており、その場合、合成修飾型ＲＮＡは、埋め込み型装置、例えば、薬物送達ポンプなどの薬物送達装置によって、または代わりに、例えば、単一の進入口からの複数回の注入や単一の部位への反復注射を容易にする柔軟な注射用カテーテルを使用して送達される。
いくつかの実施形態では、目的のポリペプチドをコードする合成修飾型ＲＮＡは、埋め込み型装置の外側に着いて対象の組織に送達され、例えば、目的のポリペプチドをコードする合成修飾型ＲＮＡが埋め込み型装置の外側を被覆する。いくつかの実施形態では、治療される疾患が本明細書において開示される心臓の疾患または障害である場合、目的のポリペプチドをコードする合成修飾型ＲＮＡがステントを被覆する。
さらに、発明者らはまた、複数のＭＯＤ－ＲＮＡ、例えば、少なくとも２つの異なるタンパク質を同時に発現する少なくとも２つのＭＯＤ－ＲＮＡを用いて心筋細胞をインビトロおよびインビボで形質移入することができること、ならびに、ＭＯＤ－ＲＮＡによるヒト胎児心筋細胞の二重形質移入が細胞は、その細胞で翻訳された異なるＭＯＤ－ＲＮＡと両方のＲＮＡを区別することができないことを明らかにすることを実証している。
いくつかの実施形態では、合成修飾型ＲＮＡを使用するインビボタンパク質発現のための本明細書において開示される方法および組成物およびキットは、研究者が単一の遺伝子産物または遺伝子産物群についてのタンパク質発現の器官全体および全身性の効果を調査することができるような、そのための基盤を提供する。特定の指向性タンパク質発現を容易に実行する能力が、（遺伝子導入マウス技術および他の動物全体での遺伝的修飾技術と比較して）器官生理および全身性生理の研究における新境地を開く。そのような強力な基盤は生物学者および臨床科学者の間で広範な関心対象となり得る。いくつかの実施形態では、本発明は、遺伝子発現を活性化および／または不活化する動物モデル、例えば、誘導性タンパク質発現系の動物モデルに合成修飾型ＲＮＡをインビボ送達するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、前記方法は、特定の組織や細胞種における遺伝子のノックアウトの効果を見るために、Ｃｒｅリコンビナーゼタンパク質をコードする合成修飾型ＲＮＡを動物モデルに送達する。いくつかの実施形態では、動物モデルは大動物モデル、例えば、豚モデルである。
例えば、本明細書は、Ｃｒｅ遺伝子座からの遺伝子発現を選択的に誘導するＣｒｅ ＭＯＤ－ＲＮＡによるＲＯＳＡ－Ｃｒｅストップ－ＬａｃＺマウスのインビボ形質移入を実証する。そのインビボ形質移入は、研究目的用のツールとして有用な指向性で可逆的、且つ、特定的な一過性遺伝子発現方法のための方法を可能にする。
本発明の１つの態様は、組織においてタンパク質をインビボ発現させるための方法であって、ポリペプチドをコードする合成修飾型ＲＮＡ分子を含む組成物とその組織を接触させる工程を含み、該組織中の細胞への該合成修飾型ＲＮＡ分子の導入によって、１つ以上の修飾を含まない該ポリペプチドをコードする合成ＲＮＡ分子と接触した該組織中の細胞と比較して自然免疫応答が低下するように、該合成修飾型ＲＮＡ分子が該１つ以上の修飾を含む方法に関する。
いくつかの実施形態では、前記組織は心臓組織または心臓性組織、または筋肉組織、例えば、骨格筋、心筋、もしくは平滑筋である。いくつかの実施形態では、その組織は哺乳類の組織、例えば、ヒトの組織である。
本明細書において開示される組成物、方法およびキットにおいて使用される合成修飾型ＲＮＡは、２０１０年９月２８日に提出された米国特許仮出願第６１／３８７，２２０号、および２０１０年４月１６日に提出された米国特許仮出願第６１／３２５，００３号に記載されており、それらの両方は参照により全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、合成修飾型ＲＮＡ分子がベクターにおいて発現せず、合成修飾型ＲＮＡ分子は裸の合成修飾型ＲＮＡ分子であり得る。いくつかの実施形態では、組成物は脂質複合体中に存在する少なくとも１つの合成修飾型ＲＮＡ分子を含むことができる。
いくつかの実施形態では、合成修飾型ＲＮＡ分子は少なくとも２つの修飾ヌクレオシドを含み、例えば、少なくとも２つの修飾ヌクレオシドは、５－メチルシチジン（５ｍＣ）、Ｎ６－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、３，２'－Ｏ－ジメチルウリジン（ｍ４Ｕ）、２－チオウリジン（ｓ２Ｕ）、２'フルオロウリジン、シュードウリジン、２'－Ｏ－メチルウリジン（Ｕｍ）、２'デオキシウリジン（２'ｄＵ）、４－チオウリジン（ｓ４Ｕ）、５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ）、２'－Ｏ－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、Ｎ６，２'－Ｏ－ジメチルアデノシン（ｍ６Ａｍ）、Ｎ６，Ｎ６，２'－Ｏ－トリメチルアデノシン（ｍ６２Ａｍ）、２'－Ｏ－メチルシチジン（Ｃｍ）、７－メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）、２'－Ｏ－メチルグアノシン（Ｇｍ）、Ｎ２，７－ジメチルグアノシン（ｍ２、７Ｇ）、Ｎ２，Ｎ２，７－トリメチルグアノシン（ｍ２，２，７Ｇ）、およびイノシン（Ｉ）からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、合成修飾型ＲＮＡ分子は５'キャップ類似体などの５'キャップ、例えば、５'ジグアノシンキャップをさらに含む。いくつかの実施形態では、本明細書において開示される方法および組成物において使用される合成修飾型ＲＮＡ分子は５'三リン酸を含まない。いくつかの実施形態では、本明細書において開示される方法および組成物において使用される合成修飾型ＲＮＡ分子はポリ（Ａ）テール、コザック配列、３'非翻訳領域、５'非翻訳領域、またはそれらの任意の組合せをさらに含み、いくつかの実施形態では、合成修飾型ＲＮＡ分子は任意によりアルカリホスファターゼで処理されることもできる。
いくつかの実施形態では、本明細書において開示される方法、キットおよび組成物において使用される合成修飾型ＲＮＡ分子は、表１に記載されるもののいずれか、またはそれらの組合せから選択される目的のタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、合成修飾型ＲＮＡ分子はＶＥＧＦポリペプチド、例えば、ヒトＶＥＧＦ（ｈＶＥＧＦ）をコードする。いくつかの実施形態では、合成修飾型ＲＮＡ分子はジストロフィンポリペプチド、またはα１アンチトリプシンポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、合成修飾型ＲＮＡ分子は機能欠損型疾患のためのポリペプチド、例えば、嚢胞性線維症のためのポリペプチドをコードし、その場合、そのＭＯＤ－ＲＮＡから発現されるタンパク質は嚢胞性線維症膜コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）ポリペプチドである。
いくつかの実施形態では、合成修飾型ＲＮＡ分子は筋肉に直接注入される。いくつかの実施形態では、合成修飾型ＲＮＡ分子は埋め込み型装置の中、またはその上に存在し（例えば、その上に被覆されている）、例えば、その場合、前記埋め込み型装置はステントまたは移植可能薬物送達ポンプである。いくつかの実施形態では、合成修飾型ＲＮＡ分子はカテーテルまたは内視鏡を介して標的組織に送達される。
いくつかの実施形態では、標的組織でのインビボタンパク質発現のための、目的のタンパク質をコードする合成修飾型ＲＮＡ分子を含む組成物は、１００ｎｇ／μｌを超える濃度の、例えば、約１～２５μｇ／μｌの濃度、または２５μｇ／μｌと５０μｇ／μｌの間の濃度の合成修飾型ＲＮＡ分子を含む。
本発明の別の態様は、対象において心機能を増強するための方法であって、該対象において心機能を増強するポリペプチドをコードする合成修飾型ＲＮＡ分子を含む組成物を該対象に投与する工程を含み、該合成修飾型ＲＮＡ分子の該対象への投与によって、１つ以上の修飾を含まない該ポリペプチドをコードする合成ＲＮＡ分子の投与と比較して自然免疫応答が低下するように、該合成修飾型ＲＮＡ分子が該１つ以上の修飾を含み、かつ、該合成修飾型ＲＮＡ分子からの該ポリペプチドの発現が該対象における心機能を増強する方法に関する。
いくつかの実施形態では、対象は不十分な心機能を特徴とする疾患または障害を患っており、または対象は構造的心疾患を患っている。いくつかの実施形態では、本明細書において開示される方法は、うっ血性心不全、心筋症、心筋梗塞、組織虚血、心臓虚血、血管病、後天性心臓疾患、先天性心臓疾患、アテローム性硬化症、心筋症、刺激伝達系機能不全、冠動脈機能不全、肺性心高血圧症である疾患または障害の治療に有用である。いくつかの実施形態では、前記疾患は、うっ血性心不全、冠動脈疾患、心筋梗塞、心筋虚血、アテローム性硬化症、心筋症、特発性心筋症、心不整脈、筋ジストロフィー、筋量異常、筋変性、感染性心筋炎、薬物または毒素誘導性の筋異常、過敏性心筋炎、自己免疫性心内膜炎および先天性心臓疾患からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、心機能を増強する方法のための方法、キットおよび組成物において使用される合成修飾型ＲＮＡ分子は、表１、表２、表３、表４、表５、または表６に記載されるもののいずれか、またはそれらの組合せから選択される目的のタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、リポソーム性蓄積症を治療する方法のための方法、キットおよび組成物において使用される合成修飾型ＲＮＡ分子は、そこでＭＯＤ－ＲＮＡは、限定されないが、表７に記載されるポリペプチドのうちのいずれか、またはそれらの組合せから選択されるタンパク質をコードする。
いくつかの実施形態では、合成修飾型ＲＮＡ分子によって発現される心臓増強タンパク質はＶＥＧＦポリペプチド、例えば、ヒトＶＥＧＦ（ｈＶＥＧＦ）である。いくつかの実施形態では、合成修飾型ＲＮＡ分子はα１アンチトリプシンポリペプチドをコードし、または機能欠損型疾患のためのポリペプチドをコードし、例えば、合成修飾型ＲＮＡ分子は心臓で発現しないポリペプチド、または心臓での正常な発現と比較して低レベルで発現するポリペプチド、または天然の野生型のポリペプチドと比較して機能獲得型もしくは変異型のタンパク質として対象において発現するポリペプチドを発現する。
いくつかの実施形態では、本明細書において開示される方法は哺乳類の対象、例えば、ヒトの治療に関連する。いくつかの実施形態では、対象は心筋梗塞を患ったことが有り、または心不全を有するかまたは心不全のリスクを有し、例えば、その場合、その対象は後天性心不全を有する。さらなる実施形態では、その心不全は、アテローム性硬化症、心筋症、うっ血性心不全、心筋梗塞、虚血性心疾患、心房性不整脈および心室性不整脈、高血圧性血管疾患、末梢血管疾患と関係がある。いくつかの実施形態では、本明細書において開示される方法は、先天性心臓疾患を有する対象の治療に関し、例えば、その場合、その対象は、高血圧、血流障害、症候性不整脈、肺性高血圧、関節硬化症、刺激伝達系機能不全、冠動脈機能不全、冠動脈樹機能不全および冠動脈側副血行路形成からなる群より選択される健康状態を有する。いくつかの実施形態では、本明細書において開示される方法は心不全の治療または予防に関する。
いくつかの実施形態では、合成修飾型ＲＮＡ分子は、心内膜心筋投与経路、心筋外投与経路、心室内投与経路、冠内投与経路、後洞の投与経路、動脈内投与経路、心膜内投与経路、または静脈内投与経路を介して対象に投与され得る。いくつかの実施形態では、合成修飾型ＲＮＡ分子は筋肉内注射を介して対象に投与することができ、例えば、その場合、筋肉はインビボタンパク質発現のための生物学的なポンプ（例えば、生体ポンプ）として働き、例えば、その場合、そのＭＯＤ－ＲＮＡは分泌タンパク質をコードする。
本発明の別の態様は、インビボＣｒｅ動物モデルにおける遺伝子をノックアウトするための、Ｃｒｅリコンビナーゼポリペプチドをコードする合成修飾型ＲＮＡ分子の使用に関する。
１つの態様では、本明細書に記載される発明は、以下の工程を含む、対象において腫瘍を治療するための方法に関する：該対象において血管新生を増強するポリペプチドをコードする合成修飾型ＲＮＡ分子を含む組成物を投与する工程であって、該合成修飾型ＲＮＡ分子の該対象への投与によって、１つ以上の修飾を含まない該ポリペプチドをコードする合成ＲＮＡ分子の投与と比較して自然免疫応答が低下するように、該合成修飾型ＲＮＡ分子が該１つ以上の修飾を含み、かつ、該合成修飾型ＲＮＡ分子からの該ポリペプチドの発現が該腫瘍における血管新生を増強する、工程；および、化学療法剤を該対象に投与する工程であって、該血管新生が該対象に投与される化学療法剤の効果を増大させ、それによって該腫瘍が治療される、工程。さらなる態様では、本明細書に記載される発明は、以下の工程を含む、対象において腫瘍を治療するための方法に関する：該腫瘍においてヘッジホッグ（Ｈｅｄｇｅｈｏｇ）シグナル伝達を増強するポリペプチドの発現を阻害する合成修飾型ＲＮＡ分子を含む組成物を投与する工程であって、該合成修飾型ＲＮＡ分子の該対象への投与によって、１つ以上の修飾を含まない該ポリペプチドをコードする合成ＲＮＡ分子の投与と比較して自然免疫応答が低下するように、該合成修飾型ＲＮＡ分子が該１つ以上の修飾を含み、かつ、ヘッジホッグシグナル伝達を増強する該ポリペプチドの発現の該合成修飾型ＲＮＡ分子による阻害が該腫瘍と関連する線維形成性組織の量または増殖を低下させる、工程；および、化学療法剤を該対象に投与する工程であって、該線維形成性組織の量または増殖の低下が該対象に投与される化学療法剤の効果を増大させ、それによって該腫瘍が治療される、工程。
いくつかの実施形態では、合成修飾型ＲＮＡ分子はベクターにおいて発現しない。いくつかの実施形態では、合成修飾型ＲＮＡ分子を含む組成物は裸の合成修飾型ＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態では、合成修飾型ＲＮＡ分子を含む組成物は、脂質複合体中に存在する少なくとも１つの合成修飾型ＲＮＡ分子を含む。
いくつかの実施形態では、合成修飾型ＲＮＡ分子は少なくとも２つの修飾ヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、その少なくとも２つの修飾ヌクレオシドは、５－メチルシチジン（５ｍＣ）、Ｎ６－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、３，２'－Ｏ－ジメチルウリジン（ｍ４Ｕ）、２－チオウリジン（ｓ２Ｕ）、２'フルオロウリジン、シュードウリジン、２'－Ｏ－メチルウリジン（Ｕｍ）、２'デオキシウリジン（２'ｄＵ）、４－チオウリジン（ｓ４Ｕ）、５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ）、２'－Ｏ－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、Ｎ６，２'－Ｏ－ジメチルアデノシン（ｍ６Ａｍ）、Ｎ６，Ｎ６，２'－Ｏ－トリメチルアデノシン（ｍ６２Ａｍ）、２'－Ｏ－メチルシチジン（Ｃｍ）、７－メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）、２'－Ｏ－メチルグアノシン（Ｇｍ）、Ｎ２，７－ジメチルグアノシン（ｍ２、７Ｇ）、Ｎ２，Ｎ２，７－トリメチルグアノシン（ｍ２，２，７Ｇ）、およびイノシン（Ｉ）からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、合成修飾型ＲＮＡ分子、その中で少なくとも２つの修飾ヌクレオシドは５－メチルシチジン（５ｍＣ）およびシュードウリジンである。
いくつかの実施形態では、合成修飾型ＲＮＡ分子は５'キャップをさらに含む。いくつかの実施形態では、合成修飾型ＲＮＡ分子、その中で５'キャップは５'キャップ類似体である。いくつかの実施形態では、５'キャップ類似体は５'グアノシンキャップである。いくつかの実施形態では、合成修飾型ＲＮＡ分子は５'三リン酸を含まない。
いくつかの実施形態では、合成修飾型ＲＮＡ分子はポリ（Ａ）テール、コザック配列、３'非翻訳領域、５'非翻訳領域、またはそれらの任意の組合せをさらに含む。いくつかの実施形態では、そのポリ（Ａ）テール、コザック配列、３'非翻訳領域、５'非翻訳領域、またはそれらの任意の組合せは１つ以上の修飾ヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、その１つ以上の修飾ヌクレオシドは、５－メチルシチジン（５ｍＣ）、Ｎ６－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、３，２'－Ｏ－ジメチルウリジン（ｍ４Ｕ）、２－チオウリジン（ｓ２Ｕ）、２'フルオロウリジン、シュードウリジン、２'－Ｏ－メチルウリジン（Ｕｍ）、２'デオキシウリジン（２'ｄＵ）、４－チオウリジン（ｓ４Ｕ）、５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ）、２'－Ｏ－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、Ｎ６，２'－Ｏ－ジメチルアデノシン（ｍ６Ａｍ）、Ｎ６，Ｎ６，２'－Ｏ－トリメチルアデノシン（ｍ６２Ａｍ）、２'－Ｏ－メチルシチジン（Ｃｍ）、７－メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）、２'－Ｏ－メチルグアノシン（Ｇｍ）、Ｎ２，７－ジメチルグアノシン（ｍ２、７Ｇ）、Ｎ２，Ｎ２，７－トリメチルグアノシン（ｍ２，２，７Ｇ）、およびイノシン（Ｉ）からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、合成修飾型ＲＮＡ分子はアルカリホスファターゼで処理される。
いくつかの実施形態では、対象は腺癌を患っている。いくつかの実施形態では、対象は、線維形成性組織の層を有する腫瘍を含む癌を患っている。いくつかの実施形態では、その癌は膵管腺癌（ＰＤＡＣ）である。
血管新生が増加するいくつかの実施形態では、合成修飾型ＲＮＡ分子はＶＥＧＦポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦポリペプチドはヒトＶＥＧＦ（ｈＶＥＧＦ）である。いくつかの実施形態では、合成修飾型ＲＮＡ分子は表３に開示されるポリペプチドをコードする。
ヘッジホッグシグナル伝達を増強するポリペプチドの発現が阻害されるいくつかの実施形態では、合成修飾型ＲＮＡ分子は、ヘッジホッグ（Ｈｈ）、スムーズンド（Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ；Ｓｍｏ）、パッチド１（Ｐａｔｃｈｅｄ １；Ｐｔｃ１）、およびＧｌｉをコードするｍＲＮＡからなる群より選択されるｍＲＮＡのアンチセンス阻害剤である。いくつかの実施形態では、ヘッジホッグシグナル伝達を増強する前記ポリペプチドはヒトポリペプチドである。
いくつかの実施形態では、対象は哺乳類である。いくつかの実施形態では、その哺乳類はヒトである。
いくつかの実施形態では、組成物は静脈内投与経路または経腫瘍投与経路を介して投与される。いくつかの実施形態では、組成物は対象の血管系に投与される。いくつかの実施形態では、組成物は腫瘍への直接注入によって対象に投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、合成修飾型ＲＮＡ分子を含む、またはそれで被覆されている埋め込み型装置を使用して対象に投与される。いくつかの実施形態では、組成物はカテーテルによって対象に投与される。いくつかの実施形態では、組成物は内視鏡を介して対象に投与される。
いくつかの実施形態では、組成物は１００ｎｇ／μｌよりも高い濃度の合成修飾型ＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態では、組成物は１～２５μｇ／μｌの間の濃度の合成修飾型ＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態では、組成物は２５μｇ／μｌと５０μｇ／μｌの間の濃度の合成修飾型ＲＮＡ分子を含む。
いくつかの実施形態では、前記化学療法剤は、ゲムシタビン、フルオロウラシル、カペシタビン、シプラスチン（ｃｉｐｌａｓｔｉｎ）、イリノテカン、オキサリプラチン、５－フルオロウラシル、フォリン酸、およびエルロチニブからなる群より選択される。
図１Ａ～１Ｂは、ｅＧＦＰ修飾ｍＲＮＡ（ＭＯＤ－ＲＮＡ）を形質移入されたマウス新生児心臓細胞のＦＡＣＳ分析を示す。新生児心臓細胞が、２ｎｇ／細胞１０００個で形質移入された。図１Ａは、蛍光ＦＬ－４およびＦＬ－１を示し、図１Ｂは蛍光Ｔｈｙ－１およびｅＧＦＰ ＭＯＤ－ＲＮＡを示す。形質移入された心臓細胞は全部で５８．５％であり、６２．２％の心臓線維芽細胞が形質移入され、５２．２％の心臓非線維芽細胞が形質移入された。 図２Ａ～２Ｂは、マウス新生児心筋細胞にインビトロでｅＧＥＰ ＭＯＤ－ＲＮＡを形質移入する最適用量の実施形態を示す。単離したマウス新生児心筋細胞が異なる用量のｅＧＦＰＭＯＤ－ＲＮＡ（グリーン、０～５０ｎｇ／細胞１０００個）を形質移入された。図２Ａは、生存率を計測した細胞数と、ｅＧＦＰが存在または不存在のトロポニンＴ陽性細胞数の結果のヒストグラムを示す。図示されているのはトロポニンＴおよびｅＧＦＰに対してダブルポジティブである形質移入された細胞の％で、３ｎｇ／細胞１０００個では８１．４％の細胞がＴｎＴ＋／ｅＧＦＰ＋であり、１５ｎｇ／細胞１０００個では８９．１％の細胞がＴｎＴ＋／ｅＧＦＰ＋であり、３０ｎｇ／細胞１０００個では９０．５％の細胞がＴｎＴ＋／ｅＧＦＰ＋であることが示されている。図２Ｂは、ｅＧＦＰ ＭＯＤ－ＲＮＡの増量に伴うインタクトな生細胞％を示し、０～３０ｎｇ／細胞１０００個のＭＯＤ－ＲＮＡ濃度では細胞死が誘導されないことを示している。 図３Ａ～３Ｂは、ヒト胎児心筋細胞にインビトロでｅＧＥＰ ＭＯＤ－ＲＮＡを形質移入する最適用量の実施形態を示す。単離したヒト心筋細胞は様々な用量のｅＧＦＰ ＭＯＤ－ＲＮＡ（グリーン、０～５０ｎｇ／細胞１０００個）を形質移入された。図３Ａは、生存率を測定したヒト胎児心筋細胞数と、ｅＧＦＰが存在または不存在のトロポニンＴ陽性細胞数の結果のヒストグラムを示す。図示されているのはトロポニンＴとｅＧＦＰに対してダブルポジティブである形質移入された細胞％であり、１ｎｇ／細胞１０００個では２１．６％の細胞がＴｎＴ＋／ｅＧＦＰ＋であり、２ｎｇ／細胞１０００個では３４．４％の細胞がＴｎＴ＋／ｅＧＦＰ＋であり、５ｎｇ／細胞１０００個では４３．３％の細胞がＴｎＴ＋／ｅＧＦＰ＋であり、１０ｎｇ／細胞１０００個では６３．３％の細胞がＴｎＴ＋／ｅＧＦＰ＋であり、３０ｎｇ／細胞１０００個では７１．９％の細胞がＴｎＴ＋／ｅＧＦＰ＋であることが示されている。図３Ｂは、ｅＧＦＰ ＭＯＤ－ＲＮＡの増量に伴うインタクトな生細胞の％を示し、１～３０ｎｇ／細胞１０００個のＭＯＤ－ＲＮＡ濃度では細胞死が誘導されないことを示している。 ルシフェラーゼＭＯＤ－ＲＮＡのマウス心筋細胞（ＣＭ）または心臓線維芽細胞（ＣＦ）へのインビトロの形質移入を示す。新生児マウス心筋細胞（ＣＭ）および心臓線維芽細胞（ＣＦ）がインビトロで１μｇ／ウェル（１０００００／ウェル）のルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）ＭＯＤ－ＲＮＡを形質移入された。図４は、ルシフェラーゼＭＯＤ－ＲＮＡを１０μｇ／細胞１０００個の濃度でインビトロ形質移入した後の心筋細胞（ＣＭ）または心臓線維芽細胞（ＣＦ）におけるルシフェラーゼ（ｌｕｃ）タンパク質の発現を定量化する生物発光分析の結果を示す。ＣＭとＣＦの両方で高レベルのルシフェラーゼ発現が形質移入の少なくとも約２４時間後に検出され、ＭＯＤ－ＲＮＡルシフェラーゼの発現は形質移入後少なくとも約５０時間生じた。 ルシフェラーゼＭＯＤ－ＲＮＡのマウス心臓細胞およびマウス大腿四頭筋へのインビボの形質移入を示す。Ｂａｌｂ／ｃ骨格筋（脚部）および心筋にＬｕｃ ＭＯＤ ＲＮＡを様々な用量でインビボ注射した。ルシフェラーゼＭＯＤ－ＲＮＡを１００μｇ／組織の濃度でインビボ形質移入した後の心筋または四頭筋におけるルシフェラーゼ（ｌｕｃ）タンパク質の発現を定量化する生物発光分析の結果を示す。心組織と四頭筋の両方で高レベルのルシフェラーゼ発現がインビボ形質移入の少なくとも約２４時間後に検出され、ルシフェラーゼの発現は形質移入後心筋では少なくとも約５０時間、脚筋では少なくとも約２５時間生じた。 ルシフェラーゼＭＯＤ－ＲＮＡのマウス心臓細胞およびマウス大腿四頭筋へのインビボの形質移入を示す。Ｂａｌｂ／ｃ骨格筋（脚部）および心筋にＬｕｃ ＭＯＤ ＲＮＡを様々な用量でインビボ注射した。Ｌｕｃ ＭＯＤ ＲＮＡの注射（１００μｇ／心臓）後測定したＬｕｃ発現（Ｙ軸）の経時変化を示す。 インビトロのｈＶＥＧＦ ＭＯＤ－ＲＮＡの翻訳および機能性を示す。ヒト心臓線維芽細胞にｈＶＥＧＦ ＭＯＤ－ＲＮＡまたは非ＭＯＤ ＲＮＡを形質移入し、ＥＬＩＳＡを用いてｈＶＥＧＦを測定した。心臓線維芽細胞（ＣＦ）に１μｇ／ウェル（１００，０００／ウェル）でインビトロ形質移入したｈＶＥＧＦ ＭＯＤ－ＲＮＡと非ＭＯＤ－ＲＮＡの比較が図示され、ＭＯＤ－ＲＮＡからのｈＶＥＧＦタンパク質の発現は非ＭＯＤ－ＲＮＡからの発現の２倍であることを示しているが、これは非ＭＯＤ－ＲＮＡの翻訳の低減を示す。高ＶＥＧＦタンパク質発現が、１μｇのｈＶＥＧＦ ＭＯＤ－ＲＮＡ（左のパネル、全４０．８ｎｇのｈＶＥＧＦ）を形質移入した心筋細胞から分泌された。より低レベルのｈＶＥＧＦが１μｇの非ＭＯＤ ＲＮＡ ｈＶＥＧＦ（２２．９ｎｇ、右のパネル）を形質移入した心筋細胞から発現し分泌された。 ＭＯＤ－ＲＮＡがインビボで自然免疫応答を誘発しないことを示す。マウス心臓にｈＶＥＧＦ ＭＯＤ－ＲＮＡまたは非ＭＯＤ ＲＮＡをインビボで形質移入した後の遺伝子発現レベルの結果を示すヒストグラムが図示されている。ｈＶＥＧＦ ＭＯＤ－ＲＮＡの形質移入後、非ＭＯＤ ＲＮＡと比較して高レベルのｈＶＥＧＦ遺伝子発現が検出される。さらに、自然免疫応答が誘発されたシグナルとしてのＩＮＦα遺伝子の高レベルの発現がｈＶＥＧＦ非Ｍｏｄ ＲＮＡで検出されたが、ｈＶＥＧＦ ＲＮＡ－ＭＯＤのインビボ形質移入後は不存在であった。 インビボのｈＶＥＧＦ ＭＯＤ－ＲＮＡの免疫原性および機能性を示す。Ｂａｌｂ／ｃ骨格（脚）筋肉に１００μｇのｈＶＥＧＦ ＭＯＤ－ＲＮＡまたは非ＭＯＤ－ＲＮＡをインビボ注射した。送達後１日または４日後、筋肉を除去してＲＮＡを抽出し、ｈＶＥＧＦ、ｍＶＥＧＦ、ＩＮＦα、ＩＮＦβ、ＣＤ３１およびＦｌｋ－１のｑＰＣＲを実施した。図８は、ｈＶＥＧＦ ＭＯＤ－ＲＮＡのインビボ送達１日後（左のパネル）および４日後（右のパネル）の遺伝子発現のヒストグラムを示す。 非常に効率的なインビトロのＭＯＤ ＲＮＡおよびｈＶＥＧＦ－Ａ ＭＯＤ ＲＮＡの心筋細胞形質移入を示す。ヒト胎児の心臓（妊娠１３週）の明白な区画を消化し、リアルタイムｑＰＣＲを用いてＶＥＧＦの様々なアイソフォームの遺伝子発現を調査した実験結果を示す。過形成性内皮細胞（ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ）を対照として用いた（破線）。区画ごとに５本のバーが示され、１本目のバーはＶＥＧＦ－Ａの発現を表し、２本目のバーはＶＥＧＦ－Ｂの発現を表し、３本目のバーはＶＥＧＦ－Ｃの発現を表し、４本目のバーはＶＥＧＦ－Ｄの発現を表し、５本目のバーはＰＬＧＦの発現を表す。 非常に効率的なインビトロのＭＯＤ ＲＮＡおよびｈＶＥＧＦ－Ａ ＭＯＤ ＲＮＡの心筋細胞形質移入を示す。ベヒクルのみか、またはｅＧＦＰ ＭＯＤ ＲＮＡを様々な用量で形質移入した後の、ＭＯＤ ＲＮＡ形質移入心筋細胞（ｃＴｒｏｐＴおよびｅＧＦＰに対してダブルポジティブである細胞）を百分率で示す。 非常に効率的なインビトロのＭＯＤ ＲＮＡおよびｈＶＥＧＦ－Ａ ＭＯＤ ＲＮＡの心筋細胞形質移入を示す。ベヒクルのみか、またはｅＧＦＰ ＭＯＤ ＲＮＡを様々な用量で形質移入した後の、生存細胞を百分率で示す。 非常に効率的なインビトロのＭＯＤ ＲＮＡおよびｈＶＥＧＦ－Ａ ＭＯＤ ＲＮＡの心筋細胞形質移入を示す。Ｌｕｃタンパク質の翻訳と発現の経時変化を示す。 非常に効率的なインビトロのＭＯＤ ＲＮＡおよびｈＶＥＧＦ－Ａ ＭＯＤ ＲＮＡの心筋細胞形質移入を示す。ｈＶＥＧＦ－Ａ ＭＯＤ ＲＮＡを形質移入後のＶＥＧＦ－Ａタンパク質の翻訳と分泌の経時変化を示す。 ＭＩ（心筋梗塞）後の成体心臓におけるｈＶＥＧＦ－Ａ ＭＯＤ ＲＮＡによる心臓再生を示す。実験計画の概略図である。 ＭＩ（心筋梗塞）後の成体心臓におけるｈＶＥＧＦ－Ａ ＭＯＤ ＲＮＡによる心臓再生を示す。対照心臓（Ｃ）対被験心臓（Ｅ）の毛細血管密度の定量化を示す。 ＭＩ（心筋梗塞）後の成体心臓におけるｈＶＥＧＦ－Ａ ＭＯＤ ＲＮＡによる心臓再生を示す。対照心臓（左のバー）と被験心臓（右のバー）における線維細胞をパーセントで示す。 ＭＩ（心筋梗塞）後の成体心臓におけるｈＶＥＧＦ－Ａ ＭＯＤ ＲＮＡによる心臓再生を示す。様々な細胞種のうちＫｉ６７＋細胞を百分率で示す。各細胞群の左側のバーは対照群を表し、右側のバーは実験群を表す。 ＭＩ（心筋梗塞）後の成体心臓におけるｈＶＥＧＦ－Ａ ＭＯＤ ＲＮＡによる心臓再生を示す。対照群（左のバー）対実験群（右のバー）におけるＴＵＮＥＬ陽性細胞を百分率で示す。 ＭＩ（心筋梗塞）後の成体心臓におけるｈＶＥＧＦ－Ａ ＭＯＤ ＲＮＡによる心臓再生を示す。偽処置の心臓（上のバー）、ベヒクル処置心臓（中間のバー）またはｈＶＥＧＦ－Ａ ＭＯＤ ＲＮＡ処置心臓（下のバー）の拡大時および収縮時の体積のＣｉｎｅ－ＭＲＩ画像を示す。 ｈＶＥＧＦ－Ａ ＭＯＤ ＲＮＡがＥＰＤＣの増殖と心血管系列への細胞運命の切り替えを誘導することを示す。＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。本明細書における実験プロトコルの概略図である。 ｈＶＥＧＦ－Ａ ＭＯＤ ＲＮＡがＥＰＤＣの増殖と心血管系列への細胞運命の切り替えを誘導することを示す。＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。本明細書における実験プロトコルの概略図である。 ｈＶＥＧＦ－Ａ ＭＯＤ ＲＮＡがＥＰＤＣの増殖と心血管系列への細胞運命の切り替えを誘導することを示す。＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。異なる処置後の遺伝子標識したＷＴ１ ｅＧＦＰ＋細胞のＦＡＣＳ分別を示す。 ｈＶＥＧＦ－Ａ ＭＯＤ ＲＮＡがＥＰＤＣの増殖と心血管系列への細胞運命の切り替えを誘導することを示す。＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。異なる処置後のＷＴ１由来細胞のＦＡＣＳ分別を示す（ｅＧＦＰ＋およびＴｏｍａｔｏ）。 ｈＶＥＧＦ－Ａ ＭＯＤ ＲＮＡがＥＰＤＣの増殖と心血管系列への細胞運命の切り替えを誘導することを示す。＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。異なる処置後のＷＴ－１由来細胞の定量化を示す（ＭＩ＋ベヒクル処置（左のバー）とＭＩ＋ｈＶＥＧＦ－Ａ ＭＯＤ ＲＮＡ（右のバー）。 ｈＶＥＧＦ－Ａ ＭＯＤ ＲＮＡがＥＰＤＣの増殖と心血管系列への細胞運命の切り替えを誘導することを示す。＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。異なる処置後のＷＴ１由来細胞の細胞運命の系列追跡を示す。Ｌｕｃ ＭＯＤ ＲＮＡ （１００μｇ／心臓）注射後に測定したＬｕｃ発現（Ｙ軸）の経時変化。 ｈＶＥＧＦ－Ａ ＭＯＤ ＲＮＡがＥＰＤＣの増殖と心血管系列への細胞運命の切り替えを誘導することを示す。＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。線維性から心血管系列への細胞運命切り替えモデルを示す。 ｈＶＥＧＦ－Ａ ＭＯＤ ＲＮＡが非修飾型ＲＮＡよりも低い免疫原性を呈することを示す。ｈＶＥＧＦ－Ａ非ＭＯＤ ＲＮＡを形質移入された細胞からのＶＥＧＦ－Ａタンパク質の翻訳および分泌の経時変化を示す。 ｈＶＥＧＦ－Ａ ＭＯＤ ＲＮＡが非修飾型ＲＮＡよりも低い免疫原性を呈することを示す。１μｇのｈＶＥＧＦ－Ａ ＭＯＤまたは非ＭＯＤ ＲＮＡを成体心臓細胞に形質移入後１０日間にわたり上清から回収した全ｈＶＥＧＦ－Ａタンパク質を示す。 ｈＶＥＧＦ－Ａ ＭＯＤ ＲＮＡが非修飾型ＲＮＡよりも低い免疫原性を呈することを示す。処置なし（形質移入なし）またはベヒクル処置、ｈＶＥＧＦ－Ａ ＭＯＤ ＲＮＡ処置または非ＭＯＤ ＲＮＡ処置の生存細胞総数を示す。 ｈＶＥＧＦ－Ａ ＭＯＤ ＲＮＡが非修飾型ＲＮＡよりも低い免疫原性を呈することを示す。異なる処置群のアネキシンＶ染色を示す。 ｈＶＥＧＦ－Ａ ＭＯＤ ＲＮＡが非修飾型ＲＮＡよりも低い免疫原性を呈することを示す。成体心臓細胞にｈＶＥＧＦ－Ａ ＭＯＤまたは非ＭＯＤ ＲＮＡをインビトロまたはインビボで形質移入した後４日目のマウス（各群左のバー）またはヒト（右のバー）ＶＥＧＦ－Ａの遺伝子発現の比較を示す。 ｈＶＥＧＦ－Ａ ＭＯＤ ＲＮＡが非修飾型ＲＮＡよりも低い免疫原性を呈することを示す。異なる群間で比較した異なる自然免疫遺伝子の遺伝子発現を示す。各群の１本目のバーは遺伝子ＩＮＦ－αの発現を示し；２本目のバーはＩＮＦ－βの発現を示し；３本目のバーはＲＩＧ－１の発現を示す。 ｈＶＥＧＦ－Ａ ＭＯＤ ＲＮＡをＭＩ後のマウスの心臓に送達すると、毛細血管密度の上方調整および線維症の軽減が得られる効果があったが、偽処置の心臓では得られなかったことを示す。実験計画の概略図である。 ｈＶＥＧＦ－Ａ ＭＯＤ ＲＮＡをＭＩ後のマウスの心臓に送達すると、毛細血管密度の上方調整および線維症の軽減が得られる効果があったが、偽処置の心臓では得られなかったことを示す。梗塞部を切除して様々な心臓遺伝子の遺伝子発現を調査したＭＩの７日後のデータを示す。ＭＩ後ベヒクルのみで処置した心臓を標準化に用いた（破線）。 ｈＶＥＧＦ－Ａ ＭＯＤ ＲＮＡをＭＩ後のマウスの心臓に送達すると、毛細血管密度の上方調整および線維症の軽減が得られる効果があったが、偽処置の心臓では得られなかったことを示す。異なる治療後の毛細血管密度の定量化を示す（左のバーはＭＩ＋ベヒクル処置を表し；右のバーはＭＩ＋ｈＶＥＧＦ－Ａ ＭＯＤ ＲＮＡ処置を表す）。 ｈＶＥＧＦ－Ａ ＭＯＤ ＲＮＡをＭＩ後のマウスの心臓に送達すると、毛細血管密度の上方調整および線維症の軽減が得られる効果があったが、偽処置の心臓では得られなかったことを示す。異なる治療後の線維性部位の定量化を示す（左のバーはＭＩ＋ベヒクル処置を表し；右のバーはＭＩ＋ｈＶＥＧＦ－Ａ ＭＯＤ ＲＮＡ処置を表す）。 ｈＶＥＧＦ－Ａ ＭＯＤ ＲＮＡが、線維性系列から心血管系列へＥＰＤＣの細胞運命切り替えを誘導することを示す。実験計画の概略図である。 ｈＶＥＧＦ－Ａ ＭＯＤ ＲＮＡが、線維性系列から心血管系列へＥＰＤＣの細胞運命切り替えを誘導することを示す。実験計画の概略図である。 ｈＶＥＧＦ－Ａ ＭＯＤ ＲＮＡが、線維性系列から心血管系列へＥＰＤＣの細胞運命切り替えを誘導することを示す。ＦＡＣＳ分別し遺伝子標識したＷＴ１ ｅＧＦＰ＋細胞の様々な心臓遺伝子の遺伝子発現について調査したＭＩの７日後のデータを示す。ベヒクル処置のみの心臓から単離したＷＴ１ ｅＧＦＰ＋細胞を標準化に使用した（破線）。 ｈＶＥＧＦ－Ａ ＭＯＤ ＲＮＡが、線維性系列から心血管系列へＥＰＤＣの細胞運命切り替えを誘導することを示す。ＦＡＣＳ分別したＷＴ１由来細胞（ｅＧＦＰ＋およびＴｏｍａｔｏ＋細胞）を様々な心臓遺伝子の遺伝子発現について調査したＭＩの７日後のデータを示す。ベヒクル処置のみの心臓から単離したＷＴ１由来細胞（ｅＧＦＰ＋およびＴｏｍａｔｏ＋細胞）を標準化に使用した（破線）。 ｈＶＥＧＦ－Ａ ＭＯＤ ＲＮＡが、線維性系列から心血管系列へＥＰＤＣの細胞運命切り替えを誘導することを示す。異なる処置後ＦＬＫ－１染色したＷＴ１ ｅＧＦＰ＋細胞を示す。最初のピークは二次抗体のみの処置を示し；２番目のピークは非ＭＩ処置を示し；３番目のピークはＭＩ７日後＋ベヒクル処置を示し；４番目のピークはＭＩ７日後＋ＶＥＧＦ－Ａ ＭＯＤ ＲＮＡを示す。 ｈＶＥＧＦ－Ａ ＭＯＤ ＲＮＡが、線維性系列から心血管系列へＥＰＤＣの細胞運命切り替えを誘導することを示す。ｈＶＥＧＦ－Ａ ＭＯＤ ＲＮＡの存在または非存在下でのＷＴ１／ＣｒｅＥＲＴ２／＋：：Ｒ２６ ｍＴｍＧマウスモデルにおける漏れやすさを決定する実験計画の概略図である。
目的のポリペプチドをコードする合成修飾型ＲＮＡ（ＭＯＤ－ＲＮＡ）を送達することによる、組織でのタンパク質のインビボ発現のための組成物および方法およびキットが本明細書に記載される。その組織は対象の任意の組織であり、例えば、いくつかの実施形態では、その組織は筋肉組織または心臓組織である。いくつかの実施形態では、目的のポリペプチドをコードする合成修飾型ＲＮＡ（ＭＯＤ－ＲＮＡ）を使用する、組織でのタンパク質のインビボ発現のための本明細書において開示される方法、組成物およびキットは疾患または障害の治療のための方法に有用である。いくつかの実施形態では、その疾患または障害は本明細書において開示される心血管系の疾患または障害である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、組成物およびキットは、細胞、例えば、筋細胞、例えば、心筋細胞の性質のインビトロ、エクスビボまたはインビボでの合成修飾型ＲＮＡ（ＭＯＤ－ＲＮＡ）を使用する改変に有用である。いくつかの実施形態では、筋細胞例えば、心筋細胞は哺乳類細胞であり、例えば、それはヒト筋細胞またはヒト心筋細胞であり得る。
他の態様は、対象の心血管系の疾患または障害の治療のための方法での本明細書において開示される合成修飾型ＲＮＡの使用に関する。本発明の他の態様は、心臓の疾患または障害の治療において使用される合成修飾型ＲＮＡを含む医薬に関する。別の実施形態では、心臓細胞の集団、例えば、心筋細胞の集団、または心筋細胞前駆細胞（例えば、心臓幹細胞）の集団は合成修飾型ＲＮＡ（ＭＯＤ－ＲＮＡ）とインビトロ、インビボまたはエクスビボで接触することができ、いくつかの実施形態では、その接触がインビトロまたはエクスビボで起こる場合、心臓細胞の集団、例えば、心筋細胞の集団は、心臓疾患の治療や予防のために、または疾患もしくは傷害により損傷を受けている既存の心筋の治療のために対象に移植され得る。別の実施形態では、本発明は、対象の心血管系の疾患または障害を治療するための方法であって、心臓細胞の集団、例えば、心臓幹細胞または心室心臓幹細胞の集団、および本明細書において開示される目的のタンパク質をコードする少なくとも１つの合成修飾型ＲＮＡを含む組成物を前記対象に投与する工程を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、心臓細胞は人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）から分化した心臓細胞の集団であり、いくつかの実施形態では、そのｉＰＳ細胞は自己ｉＰＳ細胞例えば、前記医薬組成物が投与されている対象から得られた体細胞から再プログラム化されたｉＰＳ細胞である。いくつかの実施形態では、心臓細胞は、国際特許出願公開第２００８／０５４８１９、同第２０１０／１４４６７８号、同第２０１０／０４２８５６号、および米国特許出願公開第２０１０／０１６６７１４号、同第２０１１／００３３４３０号、同第２０１０／０２１７１３号および同第２０１１／０００３３２７号に開示される心臓始原細胞または心臓前駆細胞の集団である。それらの文献は参照により全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、細胞集団はＩｓｌｌ＋始原細胞、または国際公開第２０１０／１４４６７８号に開示されるその子孫細胞である。
したがって、本発明の１つの態様は、医薬組成物、例えば、心臓再生療法の必要がある対象、例えば、先天性心臓疾患を有する対象ならびに、例えば、疾患または傷害により損傷を受けた心筋のような獲得型先天性欠損症または疾患を有する対象への移植用の医薬組成物の作製のためのＭＯＤ－ＲＮＡの使用に関する。いくつかの実施形態では、組成物は、本明細書に記載される心臓増強タンパク質をコードするＭＯＤ－ＲＮＡを含み、および任意により心臓細胞を含むこともできる。いくつかの実施形態では、組成物は、心臓増強タンパク質をコードするＭＯＤ－ＲＮＡとインビトロまたはエクスビボで接触させた心臓細胞を含む。いくつかの実施形態では、本明細書において開示される医薬組成物での治療を受け入れられる対象は、例えば、うっ血性心不全、冠動脈疾患、心筋梗塞、心筋虚血、アテローム性硬化症、心筋症、特発性心筋症、心不整脈、筋ジストロフィー、筋量異常、筋変性、感染性心筋炎、薬物または毒素誘導性の筋異常、過敏性心筋炎、自己免疫性心内膜炎および先天性心臓疾患を含む。
本願において記載される本発明の他の態様は、ＭＯＤ－ＲＮＡの送達を介して化学療法剤の効力を増加させることにより患者において腫瘍を治療する方法に関する。化学療法剤の効力は、（ｉ）血管新生を上昇させること、および／または（ｉｉ）化学療法剤では通常効果が無い、腫瘍の維形成性組織の増殖量もしくは増殖速度を低減させることによりその作用物質の腫瘍への浸透能を上昇させて増強される。いくつかの実施形態では、合成修飾型ＲＮＡ分子は対象における血管新生を増強させるポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、合成修飾型ＲＮＡ分子は、腫瘍においてヘッジホッグシグナル伝達を増強するポリペプチドの発現を阻害するアンチセンス阻害剤である。
定義
便宜上、本願全体（明細書、実施例および別記の特許請求の範囲を含む）において使用されるある特定の用語がここにまとめられる。別途定義されない限り、本願において使用される全ての技術用語および科学用語は本発明が属する分野の当業者が一般に理解するものと同じ意味を有する。
「心筋細胞」という用語は、本明細書において使用される場合、心臓の筋肉細胞を広く指す。心筋細胞という用語は、心臓の平滑筋細胞ならびに心筋細胞を含み、横紋筋細胞、ならびに自然拍動性心筋細胞も含む。
「分化」という用語は、本内容では、さらに分化することができない、より特殊化し、週末分化細胞に近づきつつある細胞である細胞に関連することが知られているマーカーを発現する細胞を形成することを意味する。細胞が、あまりコミットされていない細胞から益々特定の細胞種にコミットされている細胞へ進行し、最終的に終末分化細胞へ進行する経路は漸進的分化または漸進的コミットメントと呼ばれる。より特殊化しているが（例えば、漸進的分化のある経路に沿って進行し始めたが）、未だ終末分化に至っていない細胞は部分的分化されていると呼ばれる。分化とは、細胞がより特殊化した表現型を呈する、例えば、他の細胞種と別個の１つ以上の特徴または機能を獲得する発生過程である。いくつかの事例では、分化表現型は、ある発生経路の成熟エンドポイントにある細胞の表現型（いわゆる終末分化細胞）を指す。全ての組織ではないが、多くの組織で分化過程は細胞周期からの離脱を伴う。これらの事例では、終末分化細胞はそれらの増殖する能力を失う、またはその能力を大いに制限する。しかしながら、我々は、本明細書の内容では、「分化」または「分化した」という用語は細胞の発生のある時点よりもそれらの運命または機能において特殊化している細胞を指すことに留意する。
細胞を「濃縮すること」という用語は細胞を「単離すること」と同義で使用され、ある種類の細胞の収量（割合）が開始培養物または調製物におけるその種の細胞の割合よりも増加することを意味する。
コミットされていない細胞（例えば、幹細胞）から特定の分化細胞種へのコミットメントの程度が上昇した細胞への、および最終的に終末分化細胞への細胞の発生は漸進的分化または漸進的コミットメントとして知られる。始原細胞と比較して「分化した」細胞はその始原細胞と比較して１つ以上の表現型の差異を有する。表現型の差異には、形態上の差異ならびに発現マーカーの有無ばかりかマーカーの量の差および一組のマーカーの共発現パターンの差をも含む遺伝子発現および生物活性の差異が含まれるが、これらに限定されない。
「マーカー」は、本明細書において使用される場合、細胞の特徴や表現型を説明する。マーカーは目的の特徴を含む細胞の選択に使用することができる。マーカーは特定の細胞によって異なる。マーカーは、形態的特徴であれ、機能的特徴であれ、生化学的（酵素的）特徴であれ、細胞種またはその細胞種が発現する分子に特定の特徴である。そのようなマーカーはタンパク質であることが好ましく、当技術分野において利用可能な抗体または他の結合分子のエピトープを有することがより好ましい。マーカーは、細胞内または細胞の表面上に見出される、タンパク質（ペプチドおよびポリペプチド）、脂質、多糖類、核酸およびステロイドを含むが、これらに限定されないあらゆる分子から構成され得る。形態的な特徴または形質の例には、形、大きさ、および細胞質に対する核の比率が含まれるが、これらに限定されない。機能的な特徴または形質の例には、特定の物質に付着する能力、特定の色素を取り込む、または排除する能力、特定の条件下で遊走する能力、および特定の系列に沿って分化する能力が含まれるが、これらに限定されない。マーカーは、当業者が一般に利用可能な任意の方法で検出され得る。
「レポーター遺伝子」は、本明細書において使用される場合、幹細胞の表現型に加える、細胞に遺伝的に導入されているあらゆる遺伝子を包含する。本発明において開示されるレポーター遺伝子は蛍光遺伝子、酵素遺伝子および耐性遺伝子を包含するが、当業者が容易に検出できる他の遺伝子も包含することが意図されている。本発明のいくつかの実施形態では、レポーター遺伝子は、特定の幹細胞、心血管系幹細胞およびそれらの分化した子孫細胞の特定のためのマーカーとして使用される。
「系列」という用語は、本明細書において使用される場合、共通の祖先細胞を有する細胞、例えば、同じ心血管系幹細胞または他の幹細胞に由来する細胞を説明する用語を指す。
本明細書において使用される場合、「クローン細胞株」という用語は、培養で維持され得、そして、無期限で増殖する可能性を有する細胞系列を指す。クローン細胞株は幹細胞株であり得、または幹細胞に由来するものであり得、そして、そのクローン細胞株が幹細胞を含むクローン細胞株という内容で用いられる場合、その用語は、数か月～数年の間に分化することなく増殖することを可能とするインビトロ条件下で培養されてきた幹細胞を指す。そのようなクローン幹細胞株は、元の幹細胞からいくつかの細胞系列に沿って分化する可能性を有する。
「表現型」という用語は、実際の遺伝子型にかかわらず、特定のセットの環境条件下で細胞または生物を限定する１つの、または多数の全生物学的特徴を指す。
「組織」という用語は、ある特別の機能を一緒に実行する、同様に特殊化した細胞の群または層を指す。「組織特異的」という用語は、特定の組織に由来する細胞の供給源、またはその限定的特徴を指す。
「減少した（ｒｅｄｕｃｅｄ）」または「減少する（ｒｅｄｕｃｅ）」という用語は、本明細書において使用される場合、統計的に有意な量の減少を一般に意味する。しかしながら、誤解を避けるために付け加えると、「減少した（ｒｅｄｕｃｅｄ）」は、基準レベルと比べて少なくとも１０％の減少、例えば、少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％の減少、または１００％の減少を含む１００％までの減少（すなわち、基準試料と比べて存在しないレベル）、または基準レベルと比べた１０～１００％の間の任意の減少を意味する。
「増加した（ｉｎｃｒｅａｓｅｄ）」または「増加する（ｉｎｃｒｅａｓｅ）」という用語は、本明細書において使用される場合、統計的に有意な量の増加を一般に意味する。誤解を避けるために付け加えると、「増加した（ｉｎｃｒｅａｓｅｄ）」は、基準レベルと比べて少なくとも１０％の増加、例えば、少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％の増加、または１００％の増加を含む１００％までの増加、または基準レベルと比べた１０～１００％の間の任意の増加、または少なくとも約２倍、または少なくとも約３倍、または少なくとも約４倍、または少なくとも約５倍または少なくとも約１０倍の増加、または基準レベルと比べた２倍と１０倍の間もしくはそれ以上の任意の増加を意味する。
「濃縮すること（ｅｎｒｉｃｈｉｎｇ）」または「濃縮した（ｅｎｒｉｃｈｅｄ）」という用語は本明細書において互換的に使用され、ある種類の細胞の収量（割合）が開始培養物または調製物におけるその種の細胞の割合よりも少なくとも１０％増加することを意味する。
特定の細胞集団に関して「実質的に純粋な」という用語は、全細胞集団を構成する細胞に関して少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、および最も好ましくは少なくとも約９５％純粋な細胞の集団を指す。書き直すと、「実質的に純粋な」または「基本的に精製された」という用語は、１つ以上の部分的分化細胞種や終末分化細胞種の調製に関して、約２０％より少ない、より好ましくは約１５％、１０％、８％、７％より少ない、最も好ましくは約５％、４％、３％、２％、１％より少ない、または１％未満の幹細胞ではない細胞または幹細胞の子孫細胞ではない細胞を含む細胞の集団を指す。
本明細書において使用される場合、「タンパク質」は、２０アミノ酸のうちのいずれかより基本的になる高分子である。「ポリペプチド」は、多くの場合、比較的に大きいポリペプチドへの言及で使用され、「ペプチド」は、多くの場合、小さいポリペプチドへの言及で使用されるが、当技術分野におけるこれらの用語の使用は重複しており、そして、変化する。「ペプチド」、「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、本明細書において互換的に使用される。
「野生型」という用語は、通常インビボで存在するように、それぞれ天然のタンパク質もしくはその一部をコードするポリヌクレオチド配列、またはタンパク質配列、またはその一部を指す。
「変異体」という用語は、生物の遺伝物質のあらゆる変化は、特に野生型ポリヌクレオチド配列における変化（すなわち、欠失、置換、付加、または変化）または野生型タンパク質配列におけるあらゆる変化を指す。「異型体」という用語は「変異体」と互換的に使用される。遺伝物質中の変化がタンパク質の機能の変化をもたらすとみなされることが多いが、「変異体」および「異型体」という用語は、その変化がそのタンパク質の機能を変える（例えば、機能を増強する、機能を低減する、新しい機能を加える）かどうかに関係なく、またはその変化がそのタンパク質の機能に影響を有する（例えば、その変異または異型がサイレントである）かどうかに関係なく、野生型タンパク質の配列の中の変化を指す。変異という用語は、本願において多型と本明細書において互換的に使用される。
本明細書において使用される場合、「核酸」という用語はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）および適切な場合はリボ核酸（ＲＮＡ）などのポリヌクレオチドを指す。その用語はまた、等価物として、ヌクレオチド類似体から形成されるＲＮＡまたはＤＮＡのどちらかの類似体を、および記載されているところの実施形態に適用可能である場合は、一本鎖ポリヌクレオチド（センスまたはアンチセンス）および二本鎖ポリヌクレオチドを含むと理解されるべきである。「ポリヌクレオチド配列」および「ヌクレオチド配列」という用語もまた本明細書において互換的に使用される。
本明細書において使用される場合、「遺伝子」または「組換え遺伝子」という用語は、エクソンと（任意により）イントロンの配列の両方を含む、ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸を指す。
「組換え」という用語は、本明細書において使用される場合、タンパク質が原核生物の発現系または真核生物の発現系から得られることを意味する。
本明細書において使用される場合、「ベクター」という用語はそれが結合した別の核酸を伝達することができる核酸分子を指す。好ましいベクターは自律的複製とそれらが結合している核酸の発現の両方、またはいずれか一方ができるものである。機能するようにベクターに結合している遺伝子の発現を導くことができるベクターは本明細書において「発現ベクター」と呼称される。
「対象」および「個体」という用語は本明細書において互換的に使用され、そして、本明細書に記載される方法および組成物を用いる、予防的処置を含む治療が提供される動物、例えば、ヒトを指す。ヒト対象などの特定の動物に特異的な感染症、健康状態または疾患状態の治療にとって、「対象」という用語はその特定の動物を指す。「非ヒト動物」および「非ヒト哺乳類」という用語は本明細書において互換的に使用され、そして、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、および非ヒト霊長類などの哺乳類を含む。
「再生」という用語は疾患または外傷の後の細胞集団、器官または組織の再成長を意味する。
「疾患」または「障害」という用語は本明細書において互換的に使用され、そして、機能の実施を中断もしくは妨害する、および／または症状、例えば、不快、機能不全、苦痛もしくは死さえも苦しめられている人物もしくは人と接触している人物に引き起こす、身体または器官のいくつかの状態のあらゆる変化を指す。疾患または障害は病気（ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ）、病気（ａｉｌｉｎｇ）、病気（ａｉｌｍｅｎｔ）、疾病（ｍａｌａｄｙ）、障害（ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、病気（ｓｉｃｋｎｅｓｓ）、病気（ｉｌｌｎｅｓｓ）、病状（ｃｏｍｐｌａｉｎｔ）、不快（ｉｎｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）または疾患（ａｆｆｅｃｔｉｏｎ）にも関連し得る。
本明細書において使用される場合、「心血管系の健康状態、疾患または障害」という語句は不十分な、望ましくない、または異常な心機能、例えば、虚血性心臓疾患、高血圧性心臓疾患および肺性高血圧性心臓疾患、弁膜症、先天性心臓疾患、および対象、特にヒト対象においてうっ血性心不全を引き起こすあらゆる健康状態を特徴とする全ての障害を含むことが意図されている。不十分または異常な心機能は疾患、傷害や加齢の結果であり得る。背景として、心筋の傷害に対する応答は、いくつかの細胞は死ぬが、他の細胞は、細胞は未だ死んではいないが、機能不全である休止状態に入る、明確に定義された経路に従う。この後に炎症性細胞の浸潤、瘢痕化の一部としてのコラーゲンの沈着が続き、それらの全てが新しい血管の内殖およびある程度の継続的細胞死と並行して起こる。本明細書において使用される場合、「虚血」という用語は、血液の流入の低下に起因するあらゆる局所組織の虚血を指す。「心筋虚血」という用語は、冠動脈アテローム性硬化症や心筋への不十分な酸素供給を原因とする循環障害を指す。例えば、急性心筋梗塞は心筋組織への不可逆性虚血性発作を表す。この発作は、冠循環に閉塞性（例えば、血栓性または塞栓性）事象をもたらし、心筋の代謝要求が心筋組織への酸素の供給を越える環境を作り出す。
「病的状態」という用語は、本明細書において使用される場合、疾患または障害の原因となる、症状、例えば、細胞、組織または器官における構造的および機能的変化を指す。例えば、病的状態は特定の核酸配列、すなわち全体的または部分的にその病的状態の原因となる核酸配列を指す「病的核酸」に関連する場合があり、例として、その病的核酸は、特定の病的状態を引き起こす、または特定の病的状態に関連する変異または多型を有する遺伝子をコードする核酸であり得る。病的状態は、全体的または部分的に、特定の疾患または障害と関連がある病的状態の原因となる病的タンパク質または病的ポリペプチドの発現と関係がある場合がある。別の実施形態では、病的状態は、例えば、他の要因、例えば、虚血などと関連がある。
本明細書において使用される場合、「治療する（ｔｒｅａｔ）」または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」という用語は治療的処置を指し、ここで、目的は疾患の発生を予防することまたは遅らせること、例えば、心臓障害の発生を遅らせること、または心血管系の健康状態、疾患もしくは障害、すなわち、不十分なもしくは望ましくない心機能を特徴とするあらゆる障害の少なくとも１つの有害影響または症状を低減させることである。心臓障害の有害影響または症状は当技術分野において周知であり、それには呼吸困難、胸部痛、心悸亢進、めまい、失神、浮腫、チアノーゼ、蒼白、倦怠感および死が含まれるが、これらに限定されない。１つ以上の症状または臨床マーカーが、本明細で定義される通りに減少する場合、治療は一般に「有効」である。あるいは、疾患の進行が低下または停止している場合、治療は「有効」である。すなわち、「治療」は症状の改善またはその疾患のマーカーの減少だけではなく、治療が無い場合に予想され得る症状の進行または悪化の停止または遅延化も含む。有益な、または望ましい臨床成果には、検出可能であれ、検出不可能であれ、１つ以上の症状の軽減、疾患の程度の縮小、疾患の安定化（すなわち、非悪化）状態、疾患進行の遅延または減速、疾患状態の改善または緩和、および（部分的にせよ、全体的にせよ）寛解が含まれるが、これらに限定されない。「治療」は、治療を受けなかった場合に予想される生存期間と比べた生存期間の延長を意味することもできる。治療を必要とする人には心臓疾患を有すると既に診断されている人、ならびに遺伝的感受性または体重、食事および健康などの他の要因のために心臓疾患を発生する可能性がある人が含まれる。いくつかの実施形態では、治療することという用語は予防的手段および／または予防的処置も包含し、それには疾患または障害の発症を防ぐために本明細書において開示される医薬組成物を投与することが含まれる。
「有効量」という用語は、本明細書において使用される場合、医薬組成物からなる治療薬の量、例えば、疾患または障害の少なくとも１つ以上の症状を減少させるために十分な量のタンパク質を発現する合成修飾型ＲＮＡの量を指し、そして、所望の効果をもたらすために十分な量の薬理学的組成物に関連する。例えば、本明細書において開示される合成修飾型ＲＮＡの「治療上有効量」という語句は、本明細書において使用される場合、あらゆる医療に適用できる妥当なリスク・ベネフィット比で障害を治療するために十分な量の組成物を意味する。「治療上有効量」という用語は、したがって、本明細書において開示される組成物の、例えば、心血管系の健康状態、疾患または障害を有する典型的な対象に投与されると心機能不全または障害に関係がある症状または臨床マーカーの治療的または予防的に有意な軽減をもたらすために十分な量を指す。
症状の治療的に有意な軽減は、例えば、対照または非治療対象と比べて測定パラメータの少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１２５％、少なくとも約１５０％またはそれ以上の軽減である。測定パラメータまたは測定可能パラメータには、疾患の臨床的に検出可能なマーカー、例えば、生物学的マーカーのレベルの上昇または抑制、ならびに疾患または障害の臨床的に許容される規模の症状またはマーカーに関連するパラメータが含まれる。本明細書において開示される組成物および製剤の総１日使用量は、確実な根拠がある医学的判断の範囲内で担当医によって決定されることが理解される。必要とされる正確な量は治療される疾患の種類などの要因に応じて左右される。
例えば、対象における心血管系の健康状態または疾患の治療に関連して、「治療上有効量」という用語は、心血管系の疾患または障害の発生を防ぐ、または遅らせるために安全で十分な量を指す。その量は、そのため、心血管系の疾患もしくは障害を治癒することができ、または心血管系の疾患もしくは障害の寛解を引き起こすことができ、心血管疾患の進行過程を遅らせることができ、心血管系の疾患もしくは障害の症状を遅延化もしくは抑制することができ、心血管系の疾患もしくは障害の副次的症状の成立を遅延化もしくは抑制することができ、または心血管系の疾患もしくは障害の副次的症状の発生を抑制することができる。心血管系の疾患もしくは障害の治療にとっての有効量は、治療される心血管疾患の種類、その症状の重症度、治療されている対象、その対象の年齢および一般健康状態、投与モードなどによって左右される。したがって、正確な「有効量」を特定することは不可能である。しかしながら、あらゆる所与の事例にとって、適切な「有効量」は日常の実験法のみを用いて当業者によって決定され得る。治療効力は当業者によって判断され得、例えば、効力は本明細書において考察されるとおりに心血管系の疾患または障害の動物モデルにおいて評価され得る。例えば、急性心筋梗塞または虚血再灌流障害を有するげっ歯類の治療、ならびに本明細書において開示される心血管系の疾患または障害の少なくとも１つの症状の減少、例えば、心臓の駆出率の上昇、心不全の割合の減少、梗塞巣のサイズの減少、合併症（肺浮腫、腎不全、不整脈）の罹患率の減少、運動耐容能または他の生活の質の測定基準の改善、および死亡率の低下をもたらすあらゆる治療または組成物もしくは製剤の投与が有効な治療を表す。その組成物が心血管系の疾患または障害の治療のために使用される実施形態では、その組成物の効力は心血管疾患の実験動物モデル、例えば、虚血再灌流障害の動物モデル（Ｈｅａｄｒｉｃｋ ＪＰ， Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｈｅａｒｔ ｃｉｒｃ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２８５；Ｈ１７９７；２００３）および急性心筋梗塞の動物モデル（Ｙａｎｇ Ｚ， Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ． Ｐｈｙｓｉｏｌ ２８２：Ｈ９４９：２００２、Ｇｕｏ Ｙ， Ｊ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ ３３；８２５～８３０，２００１）を使用して判断され得る。実験動物モデルを使用するとき、治療効力は、心血管系の疾患または障害の症状の低減、例えば、呼吸困難、胸部痛、心悸亢進、めまい、失神、浮腫、チアノーゼ、蒼白、倦怠感および高血圧のうちの１つ以上の症状の低減が治療されていない動物と比べて治療されている動物で早く起こるとき、明らかとなる。「より早く」という言葉によって、例えば、腫瘍のサイズの減少が少なくとも５％早く起こるが、好ましくはより早く起こる、例えば、１日早く、２日早く、３日早く、またはそれ以上早く起こることを意味する。
本明細書において使用される場合、「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」という用語は、心血管系の疾患または障害の治療に関して使用されるとき、心血管系の疾患または障害の症状や生化学的マーカーの低減について言及するために使用され、例えば、心血管疾患の少なくとも１つの生化学的マーカーの少なくとも約１０％の低減は有効な治療とみなされ得る。心血管疾患のそのような生化学的マーカーの例には、血液中の、例えば、クレアチンホスフォキナーゼ（ＣＰＫ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の減少、および／または心血管疾患の症状の減少、および／または心電図（ＥＣＧまたはＥＫＧ）もしくは心エコー図（心臓超音波）、ドップラー超音波画像法および核医学画像法によって測定される、幾人かの当業者によって決定される血流および心機能の改善が含まれる。心血管疾患の症状の少なくとも約１０％の減少も本明細書において開示される方法による有効な治療とみなされ得る。別の例として、心血管疾患の症状の減少、例えば、次の、呼吸困難、胸部痛、心悸亢進、めまい、失神、浮腫、チアノーゼなどのうちの少なくとも１つの少なくとも約１０％の減少、またはそのような系の停止、または心血管疾患の１つのそのような症状のサイズの少なくとも約１０％の減少も本明細書において開示される方法によって有効な治療とみなされ得る。いくつかの実施形態では、治療薬が、単に症状を管理可能な程度にまで軽減するよりも、実際に心血管系の疾患または障害を除去することが好ましいが、必須ではない。
本明細書において開示される方法による治療を受け入れることができる対象は、心筋梗塞（一般に心臓発作と呼ばれる）または癌を診断するためのあらゆる方法によって特定され得る。これらの健康状態を診断する方法は当業者に周知である。非限定的な例として、心筋梗塞は（ｉ）クレアチンホスフォキナーゼ（ＣＰＫ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）および心筋梗塞の間に放出される他の酵素のレベルを検出するための血液検査、（ｉｉ）心臓活動の紙またはコンピュータモニターのどちらかでの図による記録である心電図（ＥＣＧまたはＥＫＧ）によって診断され得る。ＥＣＧは、疾患や損傷の検出に有益であり得る。（ｉｉｉ）先天性心臓疾患の調査ならびに心臓の壁、弁および血管の機能の異常を含む心臓壁の異常を評価するために使用される心エコー図（心臓超音波）、（ｉｖ）ドップラー超音波画像法は心臓弁を越える血流の測定のために使用することができる。（ｖ）核医学画像法（当技術分野において放射性核種スキャニング法とも呼称される）は生体構造と器官の機能の画像化を可能とし、冠動脈疾患、心筋梗塞、弁疾患、心臓移植拒絶反応を検出し、バイパス手術の有効性をチェックし、または血管形成術または冠動脈バイパス移植の患者を選択するために使用することができる。
「冠動脈疾患」および「急性冠動脈症候群」という用語は、本明細書において互換的に使用され、心筋梗塞を指す場合、心血管系の健康状態、疾患または障害を指し、不十分な、望ましくない、または異常な心機能を特徴とするあらゆる障害、例えば、虚血性心臓疾患、高血圧性心臓疾患および肺性高血圧性心臓疾患、弁膜症、先天性心臓疾患および対象、特にヒト対象においてうっ血性心不全に至るあらゆる健康状態を含む。不十分な、または異常な心機能は疾患、傷害や加齢の結果であり得る。背景として、心筋の傷害に対する応答は、いくつかの細胞は死ぬが、他の細胞は、細胞は未だ死んではいないが、機能不全である休止状態に入る、明確に定義された経路に従う。この後に炎症性細胞の浸潤、瘢痕化の一部としてのコラーゲンの沈着が続き、それらの全てが新しい血管の内殖およびある程度の継続的細胞死と並行して起こる。
本明細書において使用される場合、「虚血」という用語は、血液の流入の低下に起因するあらゆる局所組織の虚血を指す。「心筋虚血」という用語は、冠動脈アテローム性硬化症や心筋への不十分な酸素供給を原因とする循環障害を指す。例えば、急性心筋梗塞は心筋組織への不可逆性虚血性発作を表す。この発作は、冠循環に閉塞性（例えば、血栓性または塞栓性）事象をもたらし、心筋の代謝要求が心筋組織への酸素の供給を越える環境を作り出す。
本明細書において互換的に使用される「組成物」または「医薬組成物」という用語は、当技術分野において従来型であり、哺乳類および好ましくはヒトまたはヒト細胞への投与に適切である薬学的に許容可能な担体などの賦形剤を通常含む組成物または製剤を指す。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、標的の組織または器官への直接送達、例えば、標的組織への直接注入またはカテーテル注射による直接送達のために特定的に製剤され得る。他の実施形態では、組成物は、経口経路、眼球非経口経路、静脈内経路、動脈内経路、皮下経路、鼻腔内経路、舌下経路、髄腔内経路、脳室経路などを含むが、これらに限定されない多数の経路のうちの１つ以上を介する投与のために特定的に製剤され得る。さらに、局所（例えば、口腔粘膜、呼吸器粘膜）投与や経口投与のための組成物は溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、持続放出性製剤、含嗽剤、または粉剤を形成することができ、当技術分野において公知であるように本明細書に記載される。その組成物は安定化剤および保存剤を含むこともできる。担体、安定化剤およびアジュバントの例については、フィラデルフィア科学大学（２００５年） Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ｗｉｔｈ Ｆａｃｔｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ，第２１版。
本明細書において使用される場合、「投与すること（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ）」、「導入すること（ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ）」および「移植すること（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｉｎｇ）」という用語は互換的に使用され、そして、少なくとも１つのＭＯＤ－ＲＮＡを含む医薬組成物、または細胞集団および少なくとも１つのＭＯＤ－ＲＮＡを含む組成物、または本明細書に記載されるようにＭＯＤ－ＲＮＡで形質移入されている心筋細胞の集団を含む組成物の対象への、その医薬組成物を所望の部位または組織の位置に少なくとも部分的に局在させる方法または投与経路による設置を指す。本明細書において使用される場合、「投与すること」、「導入すること」および「移植すること」という用語は互換的に使用され、そして、少なくとも１つのＭＯＤ－ＲＮＡを含む医薬組成物、または心臓細胞の集団および少なくとも１つのＭＯＤ－ＲＮＡを含む組成物、または本明細書に記載されるようにＭＯＤ－ＲＮＡで形質移入されている心筋細胞の集団を含む組成物の対象への、その医薬組成物を所望の部位または組織の位置に少なくとも部分的に局在させる方法または投与経路による設置を指す。いくつかの実施形態では、ＭＯＤ－ＲＮＡを含むその医薬組成物は対象に有効な治療をもたらすあらゆる適切な経路により投与され得る、すなわち、投与によって、そのＭＯＤ－ＲＮＡが発現するタンパク質の少なくとも一部が所望の標的組織または標的細胞の位置に局在する、対象内の所望の位置または組織への送達がもたらされる。
「非経口投与」および「非経口的に投与される」という語句は、本明細書において使用される場合、経腸投与および局所投与以外の投与モードであって、通常注射による投与モードを意味し、そして、限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、心室内、関節包内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、髄腔内、脳脊髄内、および胸骨内の注射および点滴を包含する。「全身投与」、「全身投与される」、「末梢投与」および「末梢投与される」という語句は、本明細書において使用される場合、ＭＯＤ－ＲＮＡを含む医薬組成物が動物の系に進入し、そうして代謝および他のそのような過程の対象となるような、標的の組織または器官への直接的な投与以外のＭＯＤ－ＲＮＡを含む医薬組成物の投与を意味する。
「薬学的に許容可能な」という語句は、確実な根拠がある医学的判断の範囲内で、ヒトおよび動物の組織との接触での使用に適切な、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題、または合併症を持たず、妥当なリスク・ベネフィット比にふさわしい化合物、物質、組成物、および／または剤形を指すために本明細書において使用される。
「薬学的に許容可能な担体」という語句は、本明細書において使用される場合、ある器官、または身体の部分から別の器官または身体の部分への対象作用物質の移送または輸送に関わる薬学的に許容可能な物質、組成物または液体もしくは固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒もしくはカプセル化物質などのベヒクルを意味する。各担体は製剤の他の成分と適合するという意味で「許容可能」でなくてはならない。医薬製剤は１つ以上の薬学的に許容可能な成分と併せて本発明の化合物を含有する。担体は固形物、半固形物、または液体希釈剤、クリームまたはカプセルの形状であり得る。これらの医薬調製物は本発明のさらなる課題である。活性化合物の量は通常調製物の０．１～９５重量％の間であり、好ましくは非経口使用のための調製物においては０．２～２０重量％の間であり、そして、好ましくは調製物においては１重量％と５０重量％の間である。いくつかの実施形態では、ＭＯＤ－ＲＮＡを含む医薬組成物は１つ以上の薬学的に許容可能な成分と組み合わさっていてよい。担体は固形物、半固形物、または液体希釈剤、クリームまたはカプセルの形状であり得る。
「薬物」または「化合物」という用語は、本明細書において使用される場合、疾患または健康状態を治療、または予防または管理するために対象に投与される化学物質または生物学的製剤、または複数の化学物質または生物学的製剤の組合せを指す。化学物質または生物学的製剤は、必ずしもそうではないが、低分子量化合物であることが好ましいが、より大きい化合物、例えば、限定されないが、タンパク質、オリゴヌクレオチド、リボザイム、ＤＮＡザイム、糖タンパク質、ｓｉＲＮＡ、リポタンパク質、アプタマー、ならびにそれらの修飾および組合せを含む、核酸、アミノ酸、または炭水化物からなるオリゴマーであってもよい。
「作用物質」という用語は、通常存在しない、または細胞、組織もしくは対象に投与されているレベルでは存在しないあらゆる実体を指す。作用物質は、化学物質、小分子、核酸配列、核酸類似体、タンパク質、ペプチド、アプタマー、抗体、またはそれらの機能性断片を含む群から選択され得る。核酸配列はＲＮＡまたはＤＮＡであってよく、一本鎖または二本鎖であってよく、そして、目的のタンパク質をコードする核酸、オリゴヌクレオチド、および核酸類似体、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、偽相補性ＰＮＡ（ｐｃ－ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）などを含む群より選択され得る。そのような核酸配列には、核酸配列をコードする例えば、転写抑制因子として作用するタンパク質、アンチセンス分子、リボザイム、低分子阻害性核酸配列、例えば、限定されないが、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡｉ（ｍＲＮＡｉ）、アンチセンスオリゴヌクレオチドをコードする核酸配列が含まれるが、これらに限定されない。タンパク質および／またはペプチドまたはその断片は細胞内で通常存在しないか、またはより低いレベルで発現しているタンパク質であるあらゆる目的のタンパク質、例えば、限定されないが、変異タンパク質、治療用タンパク質、短縮型タンパク質であり得る。タンパク質は、変異タンパク質、遺伝的改変タンパク質、ペプチド、合成ペプチド、組換えタンパク質、キメラタンパク質、抗体、ミニボディ、トリボディ、ヒト化タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、修飾化タンパク質およびそれらの断片を含む群から選択されることもできる。作用物質は培地に適用されてよく、そこでその作用物質は細胞と接触し、その効果を誘発する。あるいは、作用物質は、その作用物質をコードする核酸配列の細胞への導入の結果として細胞内に存在してよく、そして、その転写は、細胞内でその核酸および／またはタンパク質の環境刺激を産生することになる。いくつかの実施形態では、その作用物質は、限定されないが、合成および天然の非タンパク質性物質を含む、任意の化学物質の全体または部分である。ある特定の実施形態では、その作用物質は化学的成分を有する小分子である。例えば、化学的成分には、マクロライド、レプトマイシン類（ｌｅｐｔｏｍｙｃｉｎｓ）および関連の天然産物またはそれらの類似体を含む、不飽和型または飽和型のアルキル成分、芳香族成分または複素環成分分が含まれた。作用物質は望ましい活性や特質を有することが知られていることがあり、または様々な化合物からなるライブラリーから選択することができる。
「１つ」および「ある」という冠詞は、１つ、または１つよりも多く（すなわち、少なくとも１つ）のその冠詞の文法上の目的語を指すために本明細書において使用される。例として、「要素（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）」は１つの要素、または１つよりも多くの要素を意味する。
「統計的に有意な」または「有意に」という用語は統計的な有意性を指し、一般に平均より標準偏差の２倍分（２ＳＤ）下の、またはそれより下のマーカーの濃度を意味する。その用語は、差異が存在するという統計的な証拠を指す。それは、帰無仮説が実際に真であるときに、帰無仮説を拒絶する決定を行う確率として定義される。その決定は、多くの場合、ｐ値を使用してなされる。
実施例、または別途指示される場合を除いて、本明細書において使用される成分または反応条件の量を表す全ての数は全ての事例で「約」という用語によって修飾されると理解されるべきである。「約」という用語は、パーセンテージとの関連で使用されるとき、±１％を意味し得る。本発明は以下の実施例によって詳細にさらに説明されるが、本発明の範囲はそれらに限定されないべきである。
本発明は、本明細書に記載される特定の方法、プロトコル、および試薬などに限定されず、したがって、変更し得ることが理解されるべきである。本明細書において使用される用語法は特定の実施形態を説明することを目的とするだけのものであり、本発明の範囲を制限するものと意図されてはおらず、その本発明の範囲は特許請求の範囲によってのみ限定される。
インビボタンパク質補充療法の方法
本明細書に記載される合成修飾型ＲＮＡは、合成修飾型ＲＮＡ組成物の個体への投与により、または別の実施形態では、細胞を合成修飾型ＲＮＡとエクスビボで接触させ、次にそのような細胞を対象に投与することにより、治療上の目的のタンパク質を標的の組織または器官で発現させるために使用されることもできる。１つの態様では、細胞を患者から取り出し、例えば、電気穿孔法またはリポフェクションにより形質移入し、そして、その患者に再導入するエクスビボアプローチを用いて、修飾型ＲＮＡにより細胞を形質移入して治療用タンパク質を発現させることができる。この方法での連続投与または持続型投与は、患者に再注入する血液細胞の電気穿孔法により達成することができる。
本明細書において開示されるように、発明者らは、心臓および筋肉組織のＭＯＤ－ＲＮＡによる形質移入の後の非常に効率的で、迅速なインビボタンパク質発現を示す。発明者らは、タンパク質発現が形質移入後から３時間以内までに起こること、および、インビボタンパク質発現が筋肉または心臓へのＭＯＤ－ＲＮＡの直接注入後に少なくとも４～５日間起こることを示す。重要なことに、発明者らは、インビボタンパク質発現のレベルは心臓または筋肉にインビボで注入されたＭＯＤ－ＲＮＡの量に対して用量依存的であり、そのことが、所望の量のタンパク質が発現するためにその組織に投与されるＭＯＤ－ＲＮＡの量を決定することを可能とすることを示す。したがって、合成修飾型ＲＮＡがタンパク質補充療法または他の治療法においてインビボタンパク質発現のために使用されている場合、発現するタンパク質の量を決定する能力は非常に有用である。
本明細書の実施例において開示されるように、ＭＯＤ－ＲＮＡを使用する心臓組織および筋肉のインビボ形質移入は低免疫応答をもたらす。
したがって、本発明の１つの態様は、組織においてタンパク質をインビボ発現させるための方法（例えば、対象の組織）であって、目的のタンパク質をコードするＭＯＤ－ＲＮＡを含む組成物とその組織を接触させる工程を含む方法に関する。いくつかの実施形態では、組織は、目的のタンパク質のタンパク質発現を増加させたことが望ましい任意の器官である。
「組織」という用語は、本明細書において使用される場合、特定の機能を実行する細胞からなる任意の群に適用される広義の用語であり、いくつかの例では、器官全体（例えば、副甲状腺）および／または膵島などの器官の一部を含む。組織は必ずしも層を形成せず、したがって、筋肉、心臓、骨髄、皮膚、結合組織（例えば、他の身体組織を支える体性の中の線維を構成する細胞）、および造血性組織およびリンパ組織（例えば、身体を細菌や他の外来物質から保護するのに役立つ身体の免疫系の一部として機能する細胞）、膵臓、胃、腸、肺などを含む広範囲の組織を包含する。
いくつかの実施形態では、ＭＯＤ－ＲＮＡと接触する標的組織は筋肉組織、例えば、心筋、または骨格筋または平滑筋である。いくつかの実施形態では、その組織は心臓組織である。いくつかの実施形態では、その組織は心臓の血管新生化組織である。
いくつかの実施形態では、組織を、目的のタンパク質をコードするＭＯＤ－ＲＮＡを含む組成物と接触させる。「接触させる」または「接触」という用語は、組織を本明細書において開示されるＭＯＤ－ＲＮＡと接触させることとの関連で本明細書において使用される場合、インビボでＭＯＤ－ＲＮＡを組織、器官または標的細胞集団と接触させること、またはＭＯＤ－ＲＮＡの極近傍に組織、器官または標的細胞集団を置くことを含む。したがって、いくつかの実施形態では、「組織を接触させる」または「細胞集団を接触させる」という語句は、曝露の方法であって、直接的または間接的であり得る方法を指す。一方法では、そのような接触は、直接心臓注射など、当技術分野において周知のあらゆる手法を介した組成物の組織への直接注入を含む。別の実施形態では、接触はまた、間接接触、例えば、組織を取り囲む局所的媒体を介した間接接触、または対象への投与、または当技術分野において公知の任意の経路を介した投与を包含する。別の実施形態では、「接触させる」という用語は、本明細書において開示されるＭＯＤ－ＲＮＡ分子が治療を受けている対象に導入され、その分子がインビボで標的組織に接触することが可能になることを意味する。それぞれの可能性は本発明の異なる実施形態を表す。
いくつかの実施形態では、ＭＯＤ－ＲＮＡは組織の直接注入により組織に送達される。本明細書において開示されるように、ＭＯＤ－ＲＮＡを含む組成物の心臓への直接注入によって、強固なタンパク質発現が約３日以内にそのＭＯＤ－ＲＮＡから起こり、発現が約４～５日間続いた。
いくつかの実施形態では、ＭＯＤ－ＲＮＡは当業者に知られている任意の方法により組織に送達され得、そして、例えば、カテーテルによる送達を含むことができ、そのカテーテルは、ＭＯＤ－ＲＮＡ組成物を標的組織に送達するための永久カテーテルまたは一時的カテーテルであり得る。いくつかの実施形態では、ＭＯＤ－ＤＮＡは内視鏡を使用して送達される。いくつかの実施形態では、カテーテルや内視鏡による送達のために、そのカテーテルや内視鏡は装着型カメラを有することができ、撮影によって臨床医がＭＯＤ－ＲＮＡを含む組成物を所望の組織位置へ正確に送達することを助けることができる。
いくつかの実施形態では、本明細書において開示されるＭＯＤ－ＲＮＡを含む組成物は、埋め込み型装置を使用して標的組織に送達することができる。いくつかの実施形態では、その埋め込み型装置は薬物送達装置であり、その薬物送達装置はＭＯＤ－ＲＮＡ組成物を標的組織に送達するための送達用カテーテルを含む。
いくつかの実施形態では、「薬物送達装置」は、本明細書において使用される場合、送達用要素、例えば、ＭＯＤ－ＲＮＡを含む医薬組成物を対象の所望の標的組織または標的生体構造、例えば、心臓に輸送するための送達用カテーテルを指す。いくつかの実施形態では、薬物送達装置は「薬物溶出モジュール」または「制御型薬物ポンプ装置」を含むことができ、それらは、本明細書に記載される方法に従った、ＭＯＤ－ＲＮＡを含む組成物の貯蔵とそれの標的領域または標的組織への制御放出に適切なあらゆる埋め込み型装置を指す。そのような「薬物送達装置」の使用によって、ＭＯＤ－ＲＮＡを含む組成物のポンプからの、その装置自身によって制御または決定される、制御された方式（例えば、放出速度、放出のタイミング）での放出が可能になる。「薬物溶出モジュール」という用語はまた、分散系、受食系または対流系を含む任意の作用機序を有する任意の埋め込み型装置、例えば、浸透圧ポンプ、生体分解性移植物、電気拡散システム、電気浸透システム、蒸気圧ポンプ、電解ポンプ、発泡性ポンプ、圧電ポンプ、浸食系システム、または電気機械式システムを包含する。いくつかの実施形態では、ＭＯＤ－ＲＮＡを含む組成物の薬物送達装置からの放出はプログラムすることができ、いくつかの実施形態では、その送達装置はリモートコントロールを用いてプログラムすることができ、それは医師やその埋め込み型装置が移植される対象によってプログラムされ得る。
別の実施形態では、本明細書において開示されるＭＯＤ－ＲＮＡを含む組成物は、特定の疾患または障害の治療のための埋め込み型装置を使用して標的組織に送達することができる。いくつかの実施形態では、前記埋め込み型装置はステントである。例えば、ＭＯＤ－ＲＮＡを含む組成物が心血管系の疾患または障害の治療のために使用されるいくつかの実施形態では、そのＭＯＤ－ＲＮＡはステントを被覆するために使用することができる。
心筋細胞および筋細胞細胞
本発明の１つの実施形態は、対象の心血管系の疾患または障害を治療する方法であって、本明細書において開示される少なくとも１つの合成修飾型ＲＮＡ（ＭＯＤ－ＲＮＡ）を含む組成物の有効量を心血管系の疾患または障害を有する対象に投与する工程を含む方法に関する。
発明者らは、ｈＶＥＧＦを発現するＭＯＤ－ＲＮＡの心臓または筋肉組織への直接注入後から３時間以内もの早さでの心臓組織における非常に効率的なインビボタンパク質発現を本明細書において示す。発明者らは、タンパク質発現が少なくとも４～５日間続き、それが非修飾型ＲＮＡと比べて低免疫応答をもたらすことを示す。前に論じたように、発明者らはまた、インビボタンパク質発現のレベルは心臓または筋肉にインビボで注入されたＭＯＤ－ＲＮＡの量に対して用量依存的であり、そのことが、必要とされる所望の量のタンパク質発現のためにその組織に投与されるＭＯＤ－ＲＮＡの量を決定することを可能とすることも示す。
したがって、本発明の１つの態様は、疾患または障害の治療のために対象の組織においてインビボでポリペプチドを発現する合成修飾型ＲＮＡを含む方法および組成物に関する。本発明の別の態様は、目的のポリペプチドをコードする合成修飾型ＲＮＡを含む組成物を投与する工程を含む、対象の疾患または障害を治療するための方法に関する。
いくつかの実施形態では、前記組成物は、対象の特定の組織に送達することができ、いくつかの実施形態では、その組織は筋肉組織である。いくつかの実施形態では、その筋肉組織は骨格筋、心筋または平滑筋であり得る。
いくつかの実施形態では、本明細書において開示される方法は、心血管疾患などの１つ以上の疾患の治療のために、心臓増強ポリペプチドをコードする合成修飾型ＲＮＡを対象の筋肉組織に送達する工程を含む。いくつかの実施形態では、心血管疾患は次の筋肉疾患、すなわち心筋症（虚血性および非虚血性）、骨格筋障害、嚢胞性線維症、筋ジストロフィーであるが、これらに限定されない。
発明者らは、ｈＶＥＧＦポリペプチドをコードする合成修飾型ＲＮＡの心筋梗塞のマウスモデルの心臓へのインビボ送達は心筋梗塞巣が発生することを防ぎ、そして、心臓への損傷を有意に防ぎ、ならびに心臓の回復を促進したことを本明細書において示した。したがって、１つの実施形態では、本明細書において開示される方法は、心臓発作および心筋梗塞の治療のために、心臓増強ポリペプチド、例えば、ＶＥＧＦをコードする合成修飾型ＲＮＡを対象の筋肉組織に送達する方法に関する。いくつかの実施形態では、心臓増強ペプチドをコードする合成修飾型ＲＮＡは、直接心筋内注入を介して心筋に送達することができる。
いくつかの実施形態では、心血管疾患の治療にとり、ＭＯＤ－ＲＮＡが発現する心臓増強ペプチドは心臓の血管新生を増強するための、および／または虚血もしくは心臓梗塞の後の心臓の再血管形成のためのポリペプチドである。いくつかの実施形態では、前記ＭＯＤ－ＲＮＡが発現する心臓増強ペプチドはＶＥＧＦ、例えば、ｈＶＥＧＦである。
「血管新生を増強する」という用語は、本明細書において使用される場合、新生血管網の形成速度の上昇または加速化を指す。いくつかの実施形態では、血管新生の増強は、前記方法が無い場合（例えば、心臓増強ポリペプチドをコードするＭＯＤ－ＲＮＡを投与することが無い場合に起こり得る血管新生）と比較して、より密な毛細管または新生血管網の形成を指す。言い換えると、血管新生の増強は新生血管網の形成速度の統計的に有意な上昇、または代わりに、新生血管網のを形成する毛細管の量の統計的に有意な増加を指す。
「再血管形成する（ｒｅｖａｓｃｕｌａｒｉｚｅ）」、「再血管形成すること（ｒｅｖａｓｃｕｌａｒｉｚｉｎｇ）」、「血管新生（ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）」、または「再血管形成（ｒｅｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）」という用語は、本明細書において使用される場合、既存の血管網を改善もしくは修正すること、または疾患、先天性の欠陥、もしくは傷害に通常起因する虚血性区域の血管が無い、もしくは血管が少ない区域を有する組織もしくは器官に新しい機能的な、もしくは実質的に機能的な血管網を構築することを指す。そのような血管が無い、または血管が少ない組織または器官は、多くの場合、完全もしくは部分的に機能不全であり、または限定的な機能を有し、そして、再血管形成を必要とする場合がある。そのような組織または器官に血管を再形成することによって、器官または組織に機能が回復または増強することになる場合がある。
いくつかの実施形態では、ＭＯＤ－ＲＮＡは融合タンパク質、例えば、ＶＥＧＦを特定の細胞に標的化するために標的化タンパク質にＶＥＧＦが融合されている融合タンパク質をコードすることができる。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦを内皮細胞に標的化することが望ましい場合、ＭＯＤ－ＲＮＡはＶＥＧＦ－ｖＷＦ融合タンパク質をコードすることができ、ここでｖＷＦはＶＥＧＦを内皮細胞に標的化するためのホーミングペプチドとして機能する。他の標的化ペプチドおよびホーミングペプチドは本発明に包含される。
いくつかの例では、ＭＯＤ－ＲＮＡに分泌タンパク質をコードさせることが望ましい。そのような場合では、ＭＯＤ－ＲＮＡはタンパク質の分泌を容易にする分泌シグナル配列を含むタンパク質をコードする。例えば、ＭＯＤ－ＲＮＡが目的のタンパク質として血管新生性タンパク質をコードする場合、当業者であれば、天然のシグナル配列を有する血管新生性タンパク質、例えば、ＶＥＧＦを選択することができるか、ルーチンの遺伝子操作を用いてそのような配列を含むように遺伝子産物を修飾することができる（Ｎａｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， １９９３を参照のこと）。
あるいは、いくつかの実施形態では、ＭＯＤ－ＲＮＡは修飾されて、標的組織の特定の細胞種にＭＯＤ－ＲＮＡを標的化するために、本明細書において開示されるように付加された特定の標的化成分を有することができる。いくつかの実施形態では、その成分はＭＯＤ－ＲＮＡに直接付加された標的化成分、または代わりに、間接的に付加された標的化成分であることができ、例えば、そのＭＯＤ－ＲＮＡがリポソームまたはナノ粒子中に製剤される場合、そのリポソームまたはナノ粒子の表面は、組織内の特定の細胞によるＭＯＤ－ＲＮＡの取込を管理するための標的化成分を含むことができる。
いくつかの実施形態では、ＭＯＤ－ＲＮＡが発現する心臓増強ペプチドは、心臓細胞の生存および／または増殖を促進するためのあらゆる心臓栄養因子または成長因子であり得る。最近、心臓発作後の心筋梗塞巣に心臓幹細胞が存在することが報告された。したがって、心筋梗塞の治療のために心臓増強ペプチドをコードするＭＯＤ－ＲＮＡを心臓に投与することができる。心臓栄養因子は当技術分野において周知であり、そして、心臓栄養性作用物質、クレアチン、カルニチン、タウリン、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００３／００２２３６７号に開示される心臓作用因子、アクチビンＡ、アクチビンＢなどのＴＧＦβリガンド、インスリン様成長因子、骨形成タンパク質、線維芽細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、ナトリウム利尿因子、インスリン、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＴＧＦα、およびＢＭＰまたはクリプト経路の産物を含むが、これらに限定されない。ＭＯＤ－ＲＮＡから発現し得る他の心臓増強ペプチドには、本明細書において開示される、サイトカインおよび成長因子のような細胞分化作用物質が含まれる。様々な細胞分化作用物質の例は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願番号第２００３／００２２３６７号、またはＧｉｍｂｌｅ ｅｔ ａｌ．， １９９５、 Ｌｅｎｎｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９５、 Ｍａｊｕｍｄａｒ ｅｔ ａｌ．， １９９８、 Ｃａｐｌａｎ ａｎｄ Ｇｏｌｄｂｅｒｇ， １９９９、 Ｏｈｇｕｓｈｉ ａｎｄ Ｃａｐｌａｎ， １９９９、 Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９９、 Ｃａｐｌａｎ ａｎｄ Ｂｒｕｄｅｒ， ２００１、 Ｆｕｋｕｄａ， ２００１、 Ｗｏｒｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２００１、 Ｚｕｋ ｅｔ ａｌ．， ２００１において開示される。
別の実施形態では、本明細書において開示される合成修飾型ＲＮＡは、組織再生に関与するそれらの能力を増強するために、または治療用タンパク質を投与部位に送達するために使用されてタンパク質を発現することができる。成長因子であるポリペプチドをコードする、本明細書において開示される合成修飾型ＲＮＡが特に興味深く、例えば、細胞が筋原細胞、例えば、心筋細胞である場合、本明細書において開示される方法において有用な合成修飾型ＲＮＡは様々な種類の１つ以上の成長因子、心房性ナトリウム利尿因子などの心臓作用因子、クリプト、ならびにＧＡＴＡ－４、Ｎｋｘ２．５およびＭｅｆ２－Ｃなどの心臓転写調節因子を発現することができる。本明細書において開示される方法および組成物の中のＭＯＤ－ＲＮＡによって発現され得るサイトカインおよび成長因子の他の例には、心臓栄養性作用物質、クレアチン、カルニチン、タウリン、アクチビンＡ、アクチビンＢなどのＴＧＦβリガンド、インスリン様成長因子、骨形成タンパク質、線維芽細胞増殖因子、血小板由来増殖因子ナトリウム利尿因子、インスリン、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＴＧＦα、およびＢＭＰまたはクリプト経路の産物が挙げられるが、これらに限定されない。
したがって、１つの実施形態では、本発明は、心筋梗塞を治療するための方法であって、心臓増強ポリペプチドをコードする少なくとも１つの合成修飾型ＲＮＡ（ＭＯＤ－ＲＮＡ）を含む組成物を心筋梗塞を有する対象に、心臓発作を有する対象の心臓に、または心臓発作があったことがある対象の心臓に投与する工程を含む方法を提供する。
さらに、出生後心房筋細胞は増殖することができないが、それらは再プログラム化されて、Ｉｓｌ１を再発現し、細胞周期に再び入り、そして、増殖することができる。そのような方法は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１１／０００３３２７号に開示される。したがって、いくつかの実施形態では、Ｉｓｌ１タンパク質を発現するＭＯＤ－ＲＮＡを含む組成物は心房筋細胞においてＩｓｌ１を再発現するために使用することができ、その後、その心房筋細胞は、心臓栄養性成長因子を発現するＭＯＤ－ＲＮＡと接触させることにより血管平滑筋細胞ならびに心室筋細胞へ分化するように誘導され得る。したがって、本発明は、心房筋細胞をＩｓｌ１ ＭＯＤ ＲＮＡで形質導入し、それらの増殖とその後の心室筋細胞への分化を誘導することを考えている。さらに、いくつかの実施形態では、ＭＯＤ－ＲＮＡは、心筋細胞の増殖を促進するために使用されるタンパク質、例えば、表４に開示される任意の遺伝子を発現することができる。
本明細書において使用される場合、「Ｉｓｌ１」という用語はＩｓｌｅｔ１遺伝子、および機能の構造に有害な影響を与えることがない保存的置換、付加、欠失をその中に含むそのホモログをコードする核酸を指す。Ｉｓｌ１は当技術分野においてＩｓｌｅｔ １、ＩＳＬ ＬＩＭホメオボックス１またはＩｓｌ－１とも呼ばれる。ヒトＩｓｌ１はＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＣ０３１２１３またはＮＭ＿００２２０２に対応する核酸によってコードされ、ヒトＩｓｌ１はＲｅｆＳｅｑ識別番号ＡＡＨ３１２１３に対応するタンパク質配列に対応する。
いくつかの実施形態では、前記方法および組成物は、筋肉の疾患および障害の治療、例えば、筋ジストロフィーの治療のための筋肉タンパク質をコードするＭＯＤ－ＲＮＡの使用に関する。筋ジストロフィーは筋肉の遺伝性疾患のファミリーを表す。いくつかの型は子供を冒し（例えば、デュシェンヌ型ジストロフィー）、そして、２０年～３０年以内に致死となる。他の型は成人期に存在し、より時間をかけて進行する。いくつかのジストロフィーの遺伝子が特定されており、それにはデュシェンヌ型ジストロフィー（ジストロフィン遺伝子内の変異によって引き起こされる）ならびに十代および成人発症性三好型ジストロフィーまたはその異型体である肢帯型ジストロフィー２ＢすなわちＬＧＭＤ－２Ｂ（ジスフェリン遺伝子内の変異によって引き起こされる）が含まれる。これらは、筋肉での関連のタンパク質の発現を妨げ、それによって筋肉機能不全を引き起こす「機能欠損型」変異である。自然発生した、または、適切な遺伝子の不活化もしくは欠失により作製された、これらの変異のマウスモデルが存在する。これらのモデルは、筋肉内で失われているタンパク質を補充し、正常な筋肉機能を回復することができる治療法の試験に有用である。
いくつかの実施形態では、１つ以上の遺伝子をコードする合成修飾型ＲＮＡを含む組成物は、１つ以上の筋肉組織標的に送達することができる。例えば、その方法がデュシェンヌ型／ベッカー型筋ジストロフィーの治療のためのものである実施形態では、非変異型のジストロフィンタンパク質をコードする合成修飾型ＲＮＡを送達することができ、それは１つ以上の筋肉組織標的に送達され得る。例えば、前記方法がエメリー・ドレヒュス型筋ジストロフィーの治療のためのものである実施形態では、エメリンおよび／またはラミンタンパク質をコードする合成修飾型ＲＮＡを送達することができ、それは１つ以上の筋肉組織標的に送達され得る。
いくつかの実施形態では、前記方法および組成物は、筋肉の疾患および障害の治療、例えば、骨格筋障害の治療のための筋肉タンパク質をコードするＭＯＤ－ＲＮＡの使用に関する。いくつかの実施形態では、α１アンチトリプシンタンパク質をコードする合成修飾型ＲＮＡを含む組成物は、１つ以上の筋肉組織標的に送達することができる。
いくつかの実施形態では、ジストロフィンおよび／またはエメリンおよび／またはラミンタンパク質をコードする合成修飾型ＲＮＡは、前記健康状態、特に胸郭の横隔膜の衰弱に起因する不十分な呼吸および姿勢筋の衰弱に起因する歩行不能に関連する最も顕著な障害を有する筋肉組織に送達することができる。横隔膜注射のために、ジストロフィンおよび／またはエメリンおよび／またはラミンタンパク質をコードする合成修飾型ＲＮＡの横隔膜筋への直接注入のための胸腔鏡アプローチを用いることができる。いくつかの実施形態では、骨格筋への注射、例えば、それぞれ姿勢の維持と腕全体の動作に関連する腰帯筋および肩帯筋への直接注入により直接的に、ジストロフィンをコードする合成修飾型ＲＮＡを送達することができる。
本発明の別の実施形態は、対象の傷害を受けた組織を治療する方法であって、（ａ）その対象の組織傷害部位を決定する工程、および（ｂ）少なくとも１つの合成修飾型ＲＮＡ（ＭＯＤ－ＲＮＡ）を含む組成物を組織傷害部位およびその周りに投与する工程を含む方法であり、少なくとも１つの合成修飾型ＲＮＡ（ＭＯＤ－ＲＮＡ）を含むその組成物がその傷害を受けた組織の治療にとって有益であるタンパク質を発現させる方法をさらに提供する。１つの実施形態では、その組織は心臓組織または心筋である。さらなる実施形態では、その組織傷害は心筋梗塞、心筋症または先天性心臓疾患である。いくつかの実施形態では、その組織は皮膚であり、その傷害を受けた組織は創傷治癒部である。前記組織が皮膚であるそのような実施形態では、ＭＯＤ－ＲＮＡを含む組成物は皮膚に局所的に投与され得る。
いくつかの実施形態では、表１、２、３、４、５および６に記載される１つ以上の遺伝子をコードする合成修飾型ＲＮＡを含む組成物は、インビボタンパク質発現のために対象の１つ以上の標的組織に送達することができる。いくつかの実施形態では、その標的組織は筋肉組織であり、いくつかの実施形態では、その筋肉組織は心筋組織、骨格組織または平滑筋組織である。
（表１）対象の標的組織でのインビボタンパク質発現のための合成修飾型ＲＮＡによってコードされる遺伝子の例
Figure 0007439019000001
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの合成修飾型ＲＮＡ（ＭＯＤ－ＲＮＡ）を含む方法および組成物は、心筋症、心筋梗塞および先天性心臓疾患からなる群より選択される循環障害を治療するために使用することができる。いくつかの実施形態では、心血管系の疾患または障害は心筋梗塞である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの合成修飾型ＲＮＡ（ＭＯＤ－ＲＮＡ）を含む組成物は組織、例えば、心筋梗塞巣を有する心臓組織と接触し、そこでタンパク質のインビボ発現が心筋梗塞巣のサイズを減少させることにより心筋梗塞を治療する。心臓増強タンパク質をインビボで発現する少なくとも１つの合成修飾型ＲＮＡ（ＭＯＤ－ＲＮＡ）を含む組成物は、心筋梗塞巣の結果生じる瘢痕組織のサイズを減少させることにより心筋梗塞を治療するために使用され得ることも意図される。いくつかの実施形態では、本発明は、少なくとも１つの合成修飾型ＲＮＡ（ＭＯＤ－ＲＮＡ）を含む組成物は対象の心臓組織に直接投与される、または全身的に投与されることを考えている。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの合成修飾型ＲＮＡ（ＭＯＤ－ＲＮＡ）を含む方法および組成物は、心筋症、心筋梗塞および先天性心臓疾患からなる群より選択される循環障害を治療するために使用することができ、例えば、ＭＯＤ－ＲＮＡは、表２に開示されるような、心不全を治療するためのＭＯＤ－ＲＮＡ、または血管形成を促進するためのＭＯＤ－ＲＮＡ、例えば、表３に開示される遺伝子のうちのいずれか、またはそれらの組合せを発現することができる。
（表２）心不全の治療用の対象の標的組織でのインビボタンパク質発現のための合成修飾型ＲＮＡによってコードされる遺伝子の追加の代表例
Figure 0007439019000002
（表３）心不全の治療用の対象の標的組織でのインビボタンパク質発現のための合成修飾型ＲＮＡによってコードされる遺伝子の追加の代表例
Figure 0007439019000003
いくつかの実施形態では、本発明はまた、対象の遺伝的欠陥、肉体的傷害、環境障害、または脳卒中、心臓発作もしくは（ほとんどの場合、虚血に起因する）心血管疾患に由来する損傷の結果として生じる心臓または末梢脈管構造の損傷が存在する場合に対象の心血管系の疾患または障害を治療する方法であって、対象の心臓において有効量の心臓増強ポリペプチドをインビボで発現させるための少なくとも１つの合成修飾型ＲＮＡ（ＭＯＤ－ＲＮＡ）を含む組成物をその対象に投与する工程を含む方法に関する。そのような治療の医学的適応には、様々な種類の急性および慢性の心臓疾患、例えば、冠動脈心臓疾患、心筋症、心内膜炎、先天性心血管系障害およびうっ血性心不全の治療が含まれる。治療の効力は、瘢痕組織によって占められる面積の減少または瘢痕組織の再血管形成、および狭心症の頻度と重症度において、または最大圧、収縮期圧、拡張終期圧、患者の運動能および生活の質の改善などの臨床的に受け入れられている基準によってモニターすることができる。
いくつかの実施形態では、心臓増強ポリペプチドをコードする少なくとも１つの合成修飾型ＲＮＡ（ＭＯＤ－ＲＮＡ）を含む組成物の投与の効果は、限定されないが、次の臨床的尺度：心臓駆出率の上昇、心不全の割合の減少、梗塞巣のサイズの減少、合併症の罹患率の減少（肺浮腫、腎不全、不整脈）運動耐容能または他の生活の質の測定基準の改善、および死亡率の低下のうちの１つによって実証され得る。心臓増強ポリペプチドのタンパク質発現の効果は組成物の投与計画の投与開始後から数日～数週間の期間にわたって明らかである場合があり、しかし、インビボ投与後から３時間もの早い時期にインビボタンパク質発現が検出され得るので、発現する心臓増強タンパク質の発現の有益な効果は最初の投与後から数時間もの早い時期に観察する場合があり、そして、その効果は少なくとも数日、数か月から数年持続する場合がある。
いくつかの実施形態では、心臓増強タンパク質をインビボで発現する少なくとも１つの合成修飾型ＲＮＡ（ＭＯＤ－ＲＮＡ）を含む組成物は、特別な装置を使用して心臓に送達することができ、その装置は組成物を心室および心房、心膜、または心筋の内側の所望の位置に直接投与するために利用可能であり、適合している。本明細書において開示される組成物は冠内注射により受容者の心臓に、例えば、冠循環に投与され得る。別の実施形態では、心臓増強タンパク質をインビボで発現する少なくとも１つの合成修飾型ＲＮＡ（ＭＯＤ－ＲＮＡ）を含む組成物は、筋肉内注射により心臓の壁に投与することもできる。
いくつかの実施形態では、心臓における目的のタンパク質、例えば、心臓増強タンパク質のインビボタンパク質発現のためのＭＯＤ－ＲＮＡを含む組成物は心臓への注射、例えば、心臓の心室壁への直接注入により投与され得る。
いくつかの実施形態では、心臓における目的のタンパク質、例えば、心臓増強タンパク質のインビボタンパク質発現のためのＭＯＤ－ＲＮＡを含む組成物は、対象の遺伝的欠陥、肉体的傷害、環境障害、または脳卒中、心臓発作もしくは（ほとんどの場合、虚血に起因する）心血管疾患に由来する損傷の結果として生じる心臓または末梢脈管構造の循環損傷を治療するために使用することができ、その方法は、心臓における目的のタンパク質、例えば、心臓増強タンパク質のインビボタンパク質発現のためのＭＯＤ－ＲＮＡを含む組成物を対象に（移植する工程を含む）投与する工程を含む。そのような治療の医学的適応には、様々な種類の急性および慢性の心臓疾患、例えば、冠動脈心臓疾患、心筋症、心内膜炎、先天性心血管系障害およびうっ血性心不全の治療が含まれる。治療の効力瘢痕組織によって占められる面積の減少または瘢痕組織の再血管形成、および狭心症の頻度と重症度において、または最大圧、収縮期圧、拡張終期圧、患者の運動能および生活の質の改善などの臨床的に受容されている基準によってモニターすることができる。
いくつかの実施形態では、心臓における目的のタンパク質、例えば、心臓増強タンパク質のインビボタンパク質発現のためのＭＯＤ－ＲＮＡを含む組成物の効果は、限定されないが、次の臨床的尺度：心臓駆出率の上昇、心不全の割合の減少、梗塞巣のサイズの減少、合併症の罹患率の減少（肺浮腫、腎不全、不整脈）運動耐容能または他の生活の質の測定基準の改善、および死亡率の低下のうちの１つによって実証され得る。心臓における目的のタンパク質、例えば、心臓増強タンパク質のインビボタンパク質発現のためのＭＯＤ－ＲＮＡを含む組成物の効果は前記手法後から数日～数週間の期間にわたって明らかである場合がある。しかしながら、有益な効果は、前記手法後から数時間もの早い時期に観察する場合があり、そして、その効果は数年持続する場合がある。
いくつかの実施形態では、心臓増強タンパク質をコードするＭＯＤ－ＲＮＡを含む組成物は、筋原細胞をエクスビボで修飾するために使用することができ、その筋原細胞は対象に移植することができ、いくつかの実施形態では、心臓増強タンパク質をコードする少なくとも１つの他のＭＯＤ－ＲＮＡの存在下で対象に移植することができる。いくつかの実施形態では、本明細書において開示される合成修飾型ＲＮＡが使用されて、例えば、遺伝子産物を置換するために、または心臓性組織の再生を促進するために、疾患を治療するために、または傷害後または筋原細胞の対象への移植後の筋原細胞の生存を改善するために（すなわち、移植拒絶を防ぐために）細胞、例えば、筋原細胞、例えば、心筋細胞を修飾することができる。
別の実施形態では、合成修飾型ＲＮＡを使用するインビボタンパク質発現のための本明細書において開示される方法および組成物およびキットは再生医学ストラテジーにおいて同様に使用することができる。例えば、いくつかの実施形態では、目的のタンパク質をコードする少なくとも１つの合成修飾型ＲＮＡを含む組成物は目的の細胞集団を含むこともできる。言い換えると、いくつかの実施形態では、本発明は、目的の細胞集団と少なくとも１つの合成修飾型ＲＮＡの組合せを対象に投与する工程を含む再生細胞療法のための方法を提供する。したがって、目的のタンパク質をコードする少なくとも１つの合成修飾型ＲＮＡおよび目的の細胞の集団を含む組成物は、そのような治療を必要とするヒト患者または他の対象における組織の再構成または再生に使用することができる。ＭＯＤ－ＲＮＡと細胞を含む組成物は、意図した組織部位に移植または移動することができ、機能的な欠損が有る領域を再構成または再生することができるような方式で投与され得る。
いくつかの実施形態では、組織再生のために細胞と併せて投与される合成修飾型ＲＮＡを使用するインビボタンパク質発現のための本明細書において開示される方法および組成物およびキットは、心筋細胞の増殖や生存を促進するタンパク質をコードするあらゆるＭＯＤ－ＲＮＡであり得、例えば、そのような遺伝子は本明細書において開示される表４に記載される遺伝子を含むが、それらに記載されない。
（表４）心不全の治療のための、または心筋細胞の増殖を促進するための対象の標的組織におけるインビボタンパク質発現のための合成修飾型ＲＮＡによってコードされる遺伝子の代表的な例
Figure 0007439019000004
他の機能欠損型疾患の治療
いくつかの実施形態では、合成修飾型ＲＮＡを使用するインビボタンパク質発現のための本明細書において開示される方法、組成物およびキットは、機能欠損型疾患の治療の方法において使用することができる。機能欠損型疾患は、タンパク質機能の低減または消失の原因となる遺伝子内の変異と関連がある疾患である。
いくつかの実施形態では、機能欠損型遺伝子は腫瘍抑制遺伝子、またはＤＮＡ修復、細胞分裂周期チェックポイント、細胞運動能、転写調節およびアポトーシスに機能する遺伝子内の変異である。機能欠損型は、本明細書において使用される場合、遺伝子または遺伝子産物の正常な活性の低下または消失を指す。活性の喪失は転写やＲＮＡのプロセッシングの低減、翻訳、安定性、輸送もしくは遺伝子産物の活性の低減、またはそれらの任意の組合せに起因し得る。腫瘍抑制遺伝子および腫瘍抑制遺伝子であると疑われる遺伝子には、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＥＰＨＡ３、ＥＰＨＡ４、ＡＰＨＢ２、ＩＮＩ１、ＡＸＩＮ１、ＡＸＩＮ２、ＭＬＬ３、ＥＰ３００、ＮＦ１、ＴＰ５３、ＡＰＣ、ＶＨＬ、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ４、ＫＥＡＰ１、ＣＤＫＮ２Ａ、ＲＢ１、ＭＥＮ、ＮＦ２／ＳＣＨ、ＰＴＣＨ、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＡＣＶＲ１Ｂ、ＡＶＣＲ２、ＭＲＥ１１、ＭＡＰ２Ｋ４、およびＬＫＢ１／ＳＴＫ１１が含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、本明細書において開示される方法、組成物およびキットは、本明細書において開示される表５～７に記載される遺伝子のうちのいずれかをコードする合成修飾型ＲＮＡを使用する、対象の組織でのインビボタンパク質発現のために使用することができる。いくつかの実施形態では、本明細書において開示される方法、組成物およびキットは、不整脈の治療のために表５に記載される遺伝子のうちのいずれかをコードする合成修飾型ＲＮＡを使用する、対象の組織でのインビボタンパク質発現のために使用することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書において開示される方法、組成物およびキットは、ミオパチーの治療のために表６に記載される遺伝子のうちのいずれかをコードする合成修飾型ＲＮＡを使用する、対象の組織でのインビボタンパク質発現のために使用することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書において開示される方法、組成物およびキットは、対象のリポソーム性蓄積症の治療のために表７に記載される遺伝子のうちのいずれかをコードする合成修飾型ＲＮＡを使用する、対象の組織でのインビボタンパク質発現のために使用することができる。
（表５）不整脈の治療のための対象の組織でのインビボタンパク質発現のための合成修飾型ＲＮＡによってコードされる遺伝子の代表例
Figure 0007439019000005
（表６）ミオパチーの治療のための対象の組織でのインビボタンパク質発現のための合成修飾型ＲＮＡによってコードされる遺伝子の代表例
Figure 0007439019000006
（表７）リポソーム性蓄積性疾患および障害の治療のための対象の組織でのインビボタンパク質発現のための合成修飾型ＲＮＡによってコードされる遺伝子の代表例
Figure 0007439019000007
別の実施形態では、合成修飾型ＲＮＡを使用するインビボタンパク質発現のための本明細書において開示される方法、組成物およびキットは、嚢胞性線維症の治療のための方法において使用することができる。いくつかの実施形態では、非変異型（野生型）ＣＦＴＲタンパク質をコードする合成修飾型ＲＮＡを対象の横隔膜に送達することができる。いくつかの実施形態では、ＣＦＴＲをコードする合成修飾型ＲＮＡは、非変異型ＣＦＴＲの発現を管理する修飾型ＲＮＡの直接実質注入や気管支内導入によって送達することができる。疾患または障害の治療のための所望のポリペプチドをコードする合成修飾型ＲＮＡを送達するためのあらゆる手段が本明細書に包含され、例えば、それぞれ腹腔鏡アプローチおよび内視鏡アプローチを介する腸および膵臓への直接注入が、これらの器官系に関連する障害を有する対象の治療のために用いられ得る。
１４ｋＤａの血管新生性リボヌクレアーゼをコードするＡＮＧは、ＡＬＳにおいて特定された機能欠損型遺伝子である。したがって、別の実施形態では、ＡＮＧポリペプチドを発現する少なくとも１つのＭＯＤ－ＲＮＡを含む組成物は、ＡＬＳの治療のために筋肉においてＡＮＧタンパク質を発現するために使用することができる。いくつかの実施形態では、ＡＮＧタンパク質をコードする合成修飾型ＲＮＡをＡＬＳと診断された対象の筋肉に送達することができる。
他の機能欠損型疾患の治療は本発明の方法に包含され、そして、部分的機能欠損型疾患を含む。例えば、プレセニリンタンパク質をコードするＭＯＤ－ＲＮＡを含む組成物を対象のアルツハイマー病の治療のために投与することができる。
機能欠損型疾患はαサラセミア、βサラセミア、ターナー症候群、網膜芽細胞腫を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書において開示される方法は、１つ以上の疾患の治療のために目的のポリペプチドをコードする合成修飾型ＲＮＡを対象の組織に送達する工程を含み、その合成修飾型ＲＮＡは埋め込み型装置、例えば、薬物送達ポンプなどの薬物送達装置によって、または代わりに、例えば、単一の進入口からの複数回の筋肉注射を容易にし得る柔軟な注射用カテーテルを使用して送達される。いくつかの実施形態では、目的のポリペプチドをコードする合成修飾型ＲＮＡ埋め込み型装置の外側に付いて対象の組織に送達され、例えば、目的のポリペプチドをコードする合成修飾型ＲＮＡで埋め込み型装置の外側を被覆する。いくつかの実施形態では、治療される疾患が本明細書において開示される心臓の疾患または障害であるとき、目的のポリペプチドをコードする合成修飾型ＲＮＡでステントを被覆する。
いくつかの実施形態では、合成修飾型ＲＮＡを使用するインビボタンパク質発現のための本明細書において開示される方法、組成物およびキットは、皮膚障害、例えば、皮膚色素障害の治療のための方法において使用することができる。そのような実施形態では、目的のタンパク質をコードする合成修飾型ＲＮＡを含む組成物の局所投与は、皮膚障害や皮膚色素障害の治療において用いることができる。いくつかの実施形態では、前記方法は、白斑の治療のためのタンパク質をコードする合成修飾型ＲＮＡを使用するインビボタンパク質発現に関する。いくつかの実施形態では、皮膚障害は湿疹（多くの場合、機能欠損型のフィラグリン遺伝子と関連がある）、または白皮症、例えば、ヘルマンスキー・パドラック症候群（中でもＨＰＳ１遺伝子およびＨＰＳ３遺伝子の変異と関連がある）、色素失調症（ＩＫＢＫＧ遺伝子の変異と関連がある）、眼皮膚白皮症（ＭＣ１Ｒ遺伝子、ＯＣＡ２遺伝子、ＳＬＣ４５Ａ２遺伝子、ＴＹＲ遺伝子、ＳＬＣ４５Ａ２遺伝子およびＴＹＲＰ１遺伝子のうちの１つ以上の変異と関連がある）、ワーデンブルグ症候群（ＥＤＮ３遺伝子、ＥＤＮＲＢ遺伝子、ＭＩＴＦ遺伝子、ＰＡＸ３遺伝子、ＳＮＡＩ２遺伝子、およびＳＯＸ１０遺伝子の変異と関連がある）、および色素性乾皮症（ＥＲＣＣ２遺伝子、ＥＲＣＣ３遺伝子、ＰＯＬＨ遺伝子、ＸＰＡ遺伝子およびＸＰＣ遺伝子の変異と関連がある）である。したがって、本発明は、皮膚障害と関連があるタンパク質のインビボ発現によるそのような障害の治療であって、タンパク質発現がその皮膚障害に関連がある１つ以上のタンパク質をコードするＭＯＤ－ＲＮＡの局所投与によって起こる、治療に関する。
癌の治療
多くの腫瘍、特に腺癌は、化学療法剤の送達に対して抵抗性を示す間質細胞からなる外層（線維形成性組織）を特徴とする。線維形成性組織の量を減少させること、線維形成性組織の増殖速度を低下させること、および／または線維形成性組織が化学療法剤では効果が無い程度にまで程度を減少させることにより、化学療法剤がより効果的に腫瘍に浸透することが可能となり、効力を増強し、必要な用量を減少させることができる。本明細書は、化学療法剤の効力を増大する２つの方法で線維形成性組織を変化させる方法を記載する。いくつかの実施形態では、線維形成性組織の血管形成の程度が上昇し、化学療法剤が腫瘍の全体に届く機会が多くなる。いくつかの実施形態では、線維形成性組織の量または線維形成性組織の増殖速度はヘッジホッグシグナル伝達を阻害することにより低下し、ヘッジホッグシグナル伝達は線維形成性組織の増殖に関連があるとされている。本明細書に記載される合成修飾型ＲＮＡは（ｉ）対象の腫瘍の線維形成性組織において血管新生を増強するポリペプチドを発現するために、および／または（ｉｉ）標的の腫瘍においてヘッジホッグシグナル伝達を増強するポリペプチドの発現阻害剤として、合成修飾型ＲＮＡ組成物の個体への投与により、または別の実施形態では、腫瘍をその合成修飾型ＲＮＡと接触させることにより使用することができる。いくつかの実施形態では、細胞を合成修飾型ＲＮＡとエクスビボで接触させ、次にそのような細胞を対象に投与する。１つの態様では、細胞を患者から取り出し、例えば、電気穿孔法またはリポフェクションにより形質移入し、そして、その患者に再導入するエクスビボアプローチを用いて、修飾型ＲＮＡにより細胞を形質移入して治療用タンパク質を発現させることができる。この方法での連続投与または持続型投与は、患者に再注入する血液細胞の電気穿孔法により達成することができる。
本明細書において開示されるように、発明者らは、様々な組織のＭＯＤ－ＲＮＡによる形質移入後の非常に効率的で、迅速なインビボタンパク質発現を示す。発明者らは、タンパク質発現が形質移入後から３時間以内までに起こること、および、インビボタンパク質発現が組織へのＭＯＤ－ＲＮＡの直接注入後に少なくとも４～５日間起こることを示す。重要なことに、発明者らは、インビボタンパク質発現のレベルは組織にインビボで注入されたＭＯＤ－ＲＮＡの量に対して用量依存的であり、そのことが、所望の量のタンパク質が発現するためにその組織に投与されるＭＯＤ－ＲＮＡの量を決定することを可能とすることを示す。したがって、合成修飾型ＲＮＡが治療法におけるインビボタンパク質発現のために使用されている場合、発現するタンパク質の量を決定する能力は非常に有用である。
本明細書の実施例において開示されるように、組織のＭＯＤ－ＲＮＡによる形質移入はインビボで低免疫応答をもたらす。
したがって、本明細書に記載される本発明の１つの態様は、腫瘍（例えば、対象内の腫瘍）においてポリペプチドをインビボで発現させるための方法であって、その対象において血管新生を増強するポリペプチドをコードする合成修飾型ＲＮＡ分子を含む組成物を投与する工程を含む方法であり、その結果生じる血管新生が前記対象に投与される化学療法剤の効果を上昇させる方法に関する。いくつかの実施形態では、腫瘍はＭＯＤ－ＲＮＡまたはＭＯＤ－ＲＮＡを含む組成物と接触させられる。いくつかの実施形態では、化学療法剤はＭＯＤ－ＲＮＡと同時に投与される。いくつかの実施形態では、組成物は化学療法剤と血管新生を増強するポリペプチドをコードするＭＯＤ－ＲＮＡの両方を含む。
血管新生を増強するポリペプチドは、そのポリペプチドと接触した組織において血管形成の増加を引き起こすあらゆるポリペプチド、その異型体、またはその機能性断片であり得る。血管新生を増強する例示的なポリペプチドは本明細書の表３に記載される。いくつかの実施形態では、その血管新生を増強するポリペプチドはＶＥＧＦポリペプチドである。いくつかの実施形態では、そのＶＥＧＦポリペプチドはヒトＶＥＧＦポリペプチドである。
本明細書に記載される本発明の１つの態様は、対象の腫瘍においてヘッジホッグシグナル伝達を増強するポリペプチドの発現を阻害することにより腫瘍を治療するための方法であって、ヘッジホッグシグナル伝達を増強するポリペプチドの発現の合成修飾型ＲＮＡ分子アンチセンス阻害剤を含む組成物対象に投与する工程を含む方法であり、ヘッジホッグシグナル伝達の阻害により線維形成性組織が減少または線維形成性組織の増殖が減少することになり、その結果、前記対象に投与される化学療法剤の効果が上昇する方法に関する。いくつかの実施形態では、腫瘍はＭＯＤ－ＲＮＡまたはＭＯＤ－ＲＮＡを含む組成物と接触させられる。いくつかの実施形態では、化学療法剤はＭＯＤ－ＲＮＡと同時に投与される。いくつかの実施形態では、組成物は化学療法剤と血管新生を増強するポリペプチドをコードするＭＯＤ－ＲＮＡの両方を含む。
「ヘッジホッグシグナル伝達経路（Ｈｅｄｇｅｈｏｇ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ）」、「ヘッジホッグ経路」および「ヘッジホッグシグナル伝達経路（Ｈｅｄｇｅｈｏｇ ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙ）」という用語は全て、何よりもヘッジホッグ、スムーズンド、Ｐｔｃｈ１、およびＧｌｉが通常介在し、遺伝子発現の変化およびヘッジホッグ活性に典型的な他の表現型の変化をもたらす一連の事象を指すために使用される。下流の構成要素の活性化はヘッジホッグタンパク質が無い場合であってもヘッジホッグ経路を活性化することができる。例えば、スムーズンドの過剰発現はヘッジホッグが無い場合にその経路を活性化し、ＧｌｉおよびＰｔｃｈ１の遺伝子発現は活性があるヘッジホッグシグナル伝達経路の指標である。したがって、本明細書に記載される化合物は、ヘッジホッグシグナル伝達のレベルを低下させるために使用することができる。
ヘッジホッグシグナル伝達を増強するポリペプチドは、活性が有ると、ヘッジホッグシグナル伝達経路が伝播するシグナル伝達を増大する；またはヘッジホッグシグナル伝達の下流の標的である；またはヘッジホッグシグナル伝達経路のメンバーの発現もしくは活性を増加させるあらゆるポリペプチドであり得る。いくつかの実施形態では、ヘッジホッグシグナル伝達を増強するポリペプチドはヘッジホッグ（ＳＨＨ；ＮＣＢＩ Ｒｅｆ Ｓｅｑ；ＮＰ＿０００１８４；配列番号０８７）；スムーズンド（Ｓｍｏ；ＮＣＢＩ Ｒｅｆ Ｓｅｑ；ＮＰ＿００５６２２；配列番号０８８）；パッチド（ＰＴＣＨ１；ＮＣＢＩ Ｒｅｆ Ｓｅｑ；ＮＰ＿０００２５５；配列番号０８９）またはＧｌｉ（ＮＣＢＩ Ｒｅｆ Ｓｅｑ；ＮＰ＿００１１５３５１７；配列番号０９０）であり得る。いくつかの実施形態では、ヘッジホッグシグナル伝達を増強するポリペプチドはヒトポリペプチドであり得る。
あらゆる特定の理論に捉われるつもりはないが、Ｐｔｃｈ１は細胞に直接シグナルを伝達することはできず、むしろ、ヘッジホッグシグナル伝達においてＰｔｃｈ１の下流に位置する別の膜結合タンパク質であるスムーズンドの活性を調節することが留意されたい（Ｍａｒｉｇｏ ｅｔ ａｌ．， （１９９６） Ｎａｔｕｒｅ ３８４： １７７～１７９； Ｔａｉｐａｌｅ ｅｔ ａｌ． （２００２） Ｎａｔｕｒｅ ４１８， ８９２～８９６）。遺伝子ｓｍｏはショウジョウバエの全てのセグメントの正確なパターン形成に必要とされるセグメントポラリディー遺伝子である（Ａｌｃｅｄｏ ｅｔ ａｌ．， （１９９６） Ｃｅｌｌ ８６：２２１２３２）。ｓｍｏのヒトホモログが特定されている。例えば、Ｓｔｏｎｅ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｎａｔｕｒｅ ３８４：１２９～１３４、およびＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ８４４０１を参照のこと。スムーズンド遺伝子はヘテロ三量体Ｇ－タンパク質共役受容体の特徴、すなわち、７回膜貫通領域を有する膜内タンパク質をコードする。このタンパク質はｗｉｎｇｌｅｓｓ経路のメンバーであるショウジョウバエのＦｒｉｚｚｌｅｄ（Ｆｚ）タンパク質に対する相同性を示す。ＰｔｃはＨｈ受容体である。Ｓｍｏを発現する細胞はＨｈに結合できず，このことはｓｍｏがＨｈと直接結合しないことを示す（Ｎｕｓｓｅ， （１９９６） Ｎａｔｕｒｅ ３８４： １１９１２０）。むしろ、ソニック・ヘッジホッグ（ＳＨＨ）のその受容体であるＰＴＣＨへの結合がスムーズンドのＰＴＣＨによる正常な阻害を妨げると考えられている。活性化スムーズンド変異が散発性基底細胞癌において（Ｘｉｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， １９９８， ３９１： ９０～９２）、そして、中枢神経系の未分化神経外胚葉性腫瘍において（Ｒｅｉｆｅｎｂｅｒｇｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， １９９８， ５８：１７９８～１８０３）生じることが知られている。
ヘッジホッグ遺伝子の脊椎動物のファミリーにはデザート・ヘッジホッグ（Ｄｈｈ）、ソニック・ヘッジホッグ（Ｓｈｈ）およびインディアン・ヘッジホッグ（Ｉｈｈ）として知られる、哺乳類において存在する３つのメンバーが含まれ、それらの全てが分泌タンパク質をコードする。これらの様々なヘッジホッグタンパク質はシグナルペプチド、非常に保存的なＮ末端領域、およびより分化しているＣ末端ドメインからなる。生化学的研究により、Ｈｈ前駆タンパク質の自己タンパク質分解性切断が、後に求核置換において切断されるチオエステル中間産物を介して進行することが示されている。その求核種は、Ｎ－ペプチドのＣ末端に共有結合し、それを細胞表面に連結する小親油性分子である可能性がある。生物学的な意味は重大である。その連結の結果として、局所的に高濃度のＮ末端ヘッジホッグペプチドがヘッジホッグ産生細胞の表面に形成される。このＮ末端ペプチドが短期および長期のヘッジホッグシグナル伝達活性に必要かつ十分である。
ヘッジホッグシグナル伝達経路は、経膜タンパク質受容体であるパッチド（Ｐｔｃ）が７回経膜タンパク質であるスムーズンド（Ｓｍｏ）の活性を阻害する場合に不活性である。Ｈｈシグナル伝達の下流の構成要素である転写因子Ｇｌｉはプロセッシングを受けて抑制因子型になり、そして、活性化型の核内蓄積は、ＦｕｓｅｄおよびＳｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｏｆ ｆｕｓｅｄ（Ｓｕｆｕ）を含む細胞質タンパク質との相互作用を介して妨げられる。結果として、ヘッジホッグ標的遺伝子の転写活性化が抑制される。その経路の活性化は３つの哺乳類リガンド（Ｄｈｈ、ＳｈｈまたはＩｈｈ）のうちのいずれかのＰｔｃへの結合によって開始される。リガンドの結合によってＳｍｏの抑制が逆転し、それによって、活性型の転写因子Ｇｌｉの核への移動に至るカスケードを活性化する。核内のＧｌｉがＰｔｃおよびＧｌｉ自体を含む標的遺伝子の発現を活性化する。ヘッジホッグシグナル伝達のレベルの上昇は腫瘍と関連がある線維形成性組織の増殖の原因となり得る。
いくつかの実施形態では、ヘッジホッグシグナル伝達を増強するポリペプチドの発現を阻害するＭＯＤ－ＲＮＡは「遺伝子サイレンシング」作用物質（例えば、ＲＮＡｉ分子）である。遺伝子サイレンシング作用物質は、標的ｍＲＮＡに相補的であり、標的ｍＲＮＡに結合し、それによって標的遺伝子のｍＲＮＡの発現を阻害する核酸配列、修飾型核酸配列、または核酸類似体の配合を含む。本明細書において使用される場合、核酸作用物質（例えば、遺伝子サイレンシング作用物質）の活性への言及における「遺伝子サイレンシング」または「サイレンシングを受けた遺伝子」は、その遺伝子サイレンシング作用物質が存在しない細胞で見られる標的遺伝子のｍＲＮＡレベルの少なくとも約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９９％またはそれ以上の細胞での標的遺伝子のｍＲＮＡレベルの減少を指す。１つの好ましい実施形態では、ｍＲＮＡレベルは少なくとも約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９９％またはそれ以上減少する。いくつかの実施形態では、遺伝子サイレンシング作用物質はアンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る。標的遺伝子が産生するメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に結合し、それを不活化し、その遺伝子を効果的に「オフ」にする核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡまたは化学的類似体）の鎖を合成することができる。この理由は、ｍＲＮＡは翻訳されるためには一本鎖でなくてはならないからである。この合成核酸は、その塩基配列が遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に対して相補的であり、これは「センス」配列と呼ばれるので、「アンチセンス」オリゴヌクレオチドと呼ばれる（ｍＲＮＡ「５'－ＡＡＧＧＵＣ－３'」のセンスセグメントはアンチセンスｍＲＮＡセグメント「３'－ＵＵＣＣＡＧ－５'」によってブロックされ得る）。
いくつかの実施形態では、遺伝子サイレンシング作用物質は、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびその修飾型を含む、ＲＮＡ干渉誘導分子（ＲＮＡｉ）であり得、ＲＮＡｉ作用物質は標的遺伝子の遺伝子発現を停止させる。ＲＮＡｉ分子の例にはｄｓＲＮＡ、ｓｈＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡｉ（ｍＲＮＡｉ）、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどが挙げられるが、これらに限定されない。他の配列も存在し得る。本明細書において使用される場合、「ＲＮＡｉ」という用語は、作用物質がＲＮＡｉを引き起こす、例えば、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が相同性があるｍＲＮＡの特異的な分解を引き起こし、そうして遺伝子産物の発現を抑制する現象を指す（Ｃｏｂｕｒｎ， Ｇ． ａｎｄ Ｃｕｌｌｅｎ， Ｂ． （２００２） Ｊ． ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７６：９２２５を参照のこと）。この過程は植物、脊椎動物および哺乳類細胞において説明されている。ＲＮＡｉは、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、内在性マイクロＲＮＡおよび人工マイクロＲＮＡを含むが、これらに限定されないあらゆる種類の干渉性ＲＮＡによって引き起こされ得る。
ＲＮＡｉ作用物質は標的遺伝子（例えば、ヘッジホッグ）またはゲノム配列、またはその断片に対して実質的に相同であり得る。本内容において使用される場合、「相同である」という用語は、標的遺伝子のＲＮＡ干渉をもたらすほど標的のｍＲＮＡまたはその断片に対して実質的に同一である、十分に相補的である、または類似していると定義される。天然のＲＮＡ分子に加えて、標的遺伝子の発現を阻害または干渉するのに適切なＲＮＡにはＲＮＡの誘導体および類似体が含まれる。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉ作用物質は標的ｍＲＮＡまたはその断片に対して実質的に相同であり得る。非限定的な例として、ＲＮＡｉは次の遺伝子またはそれらの断片：ヘッジホッグ（例えば、ＮＣＢＩ Ｒｅｆ Ｓｅｑ；ＮＰ＿０００１９３；配列番号０９１）、スムーズンド（例えば、ＮＣＢＩ Ｒｅｆ Ｓｅｑ；ＮＰ＿００５６３１；配列番号０９２）、パッチド（例えば、ＮＣＢＩ Ｒｅｆ Ｓｅｑ；ＮＰ＿０００２６４；配列番号０９３）またはＧｌｉ（例えば、ＮＣＢＩ Ｒｅｆ Ｓｅｑ；ＮＰ＿００１１６００４５；配列番号０９４）から発現されるｍＲＮＡに対して実質的に相同であり得る。いくつかの実施形態では、ヘッジホッグシグナル伝達を増強するポリペプチドはヒトポリペプチドであり得る。
いくつかの実施形態では、真核細胞において内在的に見つかるＲＮＡの形態である一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）は、ＲＮＡｉ分子を形成するために使用することができる。細胞性ｓｓＲＮＡ分子にはメッセンジャーＲＮＡ（および始原細胞であるプレメッセンジャーＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ、核小体低分子ＲＮＡ、トランスファーＲＮＡおよびリボソーマルＲＮＡが含まれる。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉ分子はｄｓＲＮＡである。二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）はそのｄｓＲＮＡトリガーに対して相補的である一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）標的の分解を引き起こすことが示されている（Ｆｉｒｅ Ａ， １９９９， Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ １５：３５８～３６３）。ｄｓＲＮＡによって引き起こされるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の効果は植物、原生動物、線虫および昆虫を含む多数の生物において示されている（Ｃｏｇｏｎｉ Ｃ． ａｎｄ Ｍａｃｉｎｏ Ｇ，２０００， Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｇｅｎｅｔ Ｄｅｖ １０：６３８～６４３）。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉ分子は低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。ｓｉＲＮＡは転写後遺伝子サイレンシングを仲介し、そして、哺乳類細胞においてＲＮＡｉを誘導するために使用することができる。遺伝子発現のｓｉＲＮＡ依存性転写後サイレンシングは、ｓｉＲＮＡによって導かれた部位での標的メッセンジャーＲＮＡ分子の切断を伴う。ｓｉＲＮＡは化学的に合成することができ、インビトロ転写によって産生することができ、または宿主細胞内で産生することができる。１つの実施形態では、ｓｉＲＮＡは約１５～約４０ヌクレオチド長の、好ましくは約１５～約２８ヌクレオチドの、より好ましくは約１９～約２５ヌクレオチド長の、およびより好ましくは約１９、２０、２１、２２、または２３ヌクレオチド長の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子であり、そして、各鎖に約０、１、２、３、４、または５ヌクレオチドの長さを有する３'および／または５'突出部を含むことができる。その突出部の長さはその２本の鎖の間で独立している、すなわち、一方の鎖の突出部の長さは第二の鎖の突出部の長さに左右されない。ｓｉＲＮＡ分子は３'ヒドロキシル基を含むこともできる。ｓｉＲＮＡ分子は一本鎖または二本鎖であり得る。そのような分子は平滑末端になっている、または突出末端（例えば、５'突出末端、３'突出末端）を含むことができる。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡ配列は、アンチセンス鎖の５'末端での結合についての最低の自由エネルギーを有する配列をスキャンすることにより選択される。好ましくは、そのｓｉＲＮＡは標的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の分解または特異的な転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）を介するＲＮＡ干渉を促進することができる。
１つの実施形態では、３'突出部は分解に対して安定化され得る。非限定的な例として、ＲＮＡはアデノシンヌクレオチドまたはグアノシンヌクレオチドなどのプリンヌクレオチドを含むことにより安定化され得る。あるいは、ピリミジンヌクレオチドの修飾型類似体による置換、例えば、ウリジン２ヌクレオチドの３'突出部の２'－デオキシチミジンによる置換は忍容され、ＲＮＡｉの効率に影響を与えることがない。２'ヒドロキシルが無いことが、組織培養培地においてその突出部のヌクレアーゼ耐性を著しく増強する。
ｓｉＲＮＡはまた低分子ヘアピン（ステムループとも呼ばれる）ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）も含む。１つの実施形態では、これらのｓｈＲＮＡは短（例えば、約１９～約２５ヌクレオチドの）アンチセンス鎖とそれに続く約５～約９ヌクレオチドからなるヌクレオチドループ、および類似するセンス鎖から構成される。あるいは、センス鎖はヌクレオチドループ構造に先行することができ、アンチセンス鎖が続くことができる。これらのｓｈＲＮＡはプラスミド、レトロウイルスおよびレンチウイルスに含まれることができ、そして、例えば、ｐｏｌＩＩＩ Ｕ６プロモーターまたは別のプロモーターから発現させることができる（例えば、Ｓｔｅｗａｒｔ， ｅｔ ａｌ． （２００３） ＲＮＡ Ａｐｒ；９（４）：４９３～５０１を参照のこと；参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
その３'末端もしくは５'末端のどちらか、またはそれらの両方に共有結合している様々な「尾部」を有するｓｉＲＮＡ分子およびｍｉＲＮＡ分子は当技術分野において公知でもあり、そして、本発明の方法を用いて送達されるｓｉＲＮＡ分子およびｍｉＲＮＡ分子を安定化するために使用することができる。一般的に述べると、ＲＮＡ分子の３'末端または５'末端に結合するインターカレート基、様々な種類のレポーター基および親油性基は当業者に周知であり、本発明の方法に従うと有用である。本発明に従うと有用である修飾型ＲＮＡ分子の調製に適用可能な３'－コレステロール修飾化オリゴヌクレオチドまたは３'－アクリジン修飾化オリゴヌクレオチドの合成についての説明は、例えば、次の論文：Ｇａｍｐｅｒ， Ｈ． Ｂ．， Ｒｅｅｄ， Ｍ． Ｗ．， Ｃｏｘ， Ｔ．， Ｖｉｒｏｓｃｏ， Ｊ． Ｓ．， Ａｄａｍｓ， Ａ． Ｄ．， Ｇａｌｌ， Ａ．， Ｓｃｈｏｌｌｅｒ， Ｊ． Ｋ．， ａｎｄ Ｍｅｙｅｒ， Ｒ． Ｂ． （１９９３） Ｆａｃｉｌｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ３'－Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２１ １４５～１５０、および Ｒｅｅｄ， Ｍ． Ｗ．， Ａｄａｍｓ， Ａ． Ｄ．， Ｎｅｌｓｏｎ， Ｊ． Ｓ．， ａｎｄ Ｍｅｙｅｒ， Ｒ． Ｂ．，Ｊｒ． （１９９１） Ａｃｒｉｄｉｎｅ ａｎｄ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ－Ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ Ｓｏｌｉｄ Ｓｕｐｐｏｒｔｓ ｆｏｒ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ３'－Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ． Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． ２ ２１７～２２５ （１９９３）に見出すことができる。
遺伝子サイレンシング作用物質がアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはＲＮＡｉ作用物質である場合、標的配列に対して相同性を有するその作用物質の領域は所与の標的遺伝子配列、例えば、開始コドンの約２５ヌクレオチドから５０ヌクレオチドまで下流、約５０ヌクレオチドから７５ヌクレオチドまで下流、または約７５ヌクレオチドから１００ヌクレオチドまで下流で始まるヘッジホッグのコード配列から選択され得る。ヌクレオチド配列は５'ＵＴＲまたは３'ＵＴＲおよび開始コドンの近傍の領域を含み得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびＲＮＡｉ作用物質を予測する方法および選択する方法は当技術分野において公知であり、またＧＥＮＳＣＲＩＰＴ、ＡＭＢＩＯＮ、ＤＨＡＲＭＡＣＯＮ、ＯＬＩＧＯＥＮＧＩＮＥのウェッブサイトで見出され、そして、米国特許第６，０６０，２４８号に記載されている。
非限定的な例として、本発明のｓｉＲＮＡ分子を設計する一つの方法はＡＡ（Ｎ１９）ＴＴ（配列番号３５５）（Ｎは任意のヌクレオチドであり得る）という２３ヌクレオチドの配列モチーフを特定する工程、および少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％または７５％のＧ／Ｃ含量を有するヒットを選択する工程を含む。その配列の「ＴＴ」部分は任意に選択される部分である。あるいは、そのような配列が見つからない場合、Ｎが任意のヌクレオチドであり得るＮＡ（Ｎ２１）というモチーフを使用して検索を拡張することができる。この状況では、センス鎖と３'突出アンチセンス鎖からなる配列組成物に関して、センスｓｉＲＮＡの３'末端は、対称性の二本鎖部分の形成を可能にするためにＴＴに変換され得る。その後、アンチセンスｓｉＲＮＡ分子はその２３ヌクレオチド配列モチーフの１～２１のヌクレオチド位置に対する相補物として合成され得る。
遺伝子サイレンシング作用物質は一つの配列だけを標的とすることが好ましい。ｓｉＲＮＡなどの遺伝子サイレンシング作用物質の各々は、例えば、発現プロファイリングにより、可能性があるオフ・ターゲット効果についてスクリーニングすることができる。そのような方法は当業者に知られており、そして、例えば、Ｊａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：６３５～６３７， ２００３に記載される。発現プロファイリングに加えて、オフ・ターゲット効果を有することができる潜在的な配列を特定するために配列データベース中に類似の配列について潜在的な標的配列をスクリーニングすることもできる。例えば、最小で１１連続ヌクレオチドからなる配列同一性は非標的化転写物のサイレンシングを導くのに十分である。それ故、可能性がある標的外サイレンシングを避けるために、ＢＬＡＳＴなどの任意の公知の配列比較法による配列同一性分析を用いて提唱されている遺伝子サイレンシング作用物質を最初にスクリーニングすることができる。
いくつかの実施形態では、遺伝子特異的な遺伝子サイレンシング作用物質を使用する標的遺伝子の発現および／またはノックダウンの評価は、ウエスタンブロット分析または酵素活性検定などの当技術分野において周知である方法によって決定され得る。当業者は、標的ｍＲＮＡの既知の配列に基づいて他の方法を容易に用意することができる。
本明細書に記載される方法および組成物は固形腫瘍、軟組織腫瘍、および腫瘍の転移の治療において有用である。いくつかの実施形態では、化学療法剤はＭＯＤ－ＲＮＡの後に投与される。本明細書において使用される場合、「腫瘍」は制御されていない増殖を行っている組織塊を指す。腫瘍は癌性腫瘍であり得る。いくつかの実施形態では、腫瘍は、様々な器官系のうちの１つの悪性腫瘍（例えば、肉腫、腺癌、または癌腫）、例えば、肺、乳腺、リンパ系、胃腸（例えば、大腸）、および泌尿生殖管（例えば、腎臓腫瘍、尿路上皮腫瘍、または精巣腫瘍）、膵臓、咽頭、前立腺、および卵巣の悪性腫瘍である。いくつかの実施形態では、腫瘍は間質層を有する腫瘍でありうる。いくつかの実施形態では、癌は非小細胞肺癌である。いくつかの実施形態では、癌は腺癌である。いくつかの実施形態では、癌は膵管腺癌（ＰＤＡＣ）である。腺癌の例には大腸直腸癌、腎細胞癌、肝臓癌、非小細胞肺癌および小腸癌が挙げられるが、これらに限定されない。追加の代表的な固形腫瘍には線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、胃腸系の癌、大腸癌、膵臓癌、乳癌、泌尿生殖器系の癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頚部癌、内分泌系の癌、精巣腫瘍、肺癌腫、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺癌、膀胱癌、上皮性癌、グリオーマ、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫瘍、希突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、および網膜芽細胞腫が含まれる。
本明細書において使用される場合、「化学療法剤」は、異常な細胞増殖を特徴とする疾患の治療において治療的有用性を有するあらゆる化学的作用物質を指す。そのような疾患には腫瘍、新生物および癌ならびに肥厚成長を特徴とする疾患が含まれる。化学療法剤は、本明細書において使用される場合、化学的作用物質および生物学的作用物質の両方を包含する。これらの作用物質は、持続生存のために癌細胞が依存する細胞活動を阻害するように機能する。化学療法剤の分類にはアルキル化／アルカロイド剤、抗代謝剤、ホルモンまたはホルモン類似体、および多方面の抗新生物薬物が含まれる。これらの薬剤の全てではなくともほとんどが癌細胞にとって直接的に有毒であり、免疫刺激を必要としない。１つの実施形態では、化学療法剤は固形腫瘍などの新生物の治療において使用される薬剤である。１つの実施形態では、化学療法剤は放射活性分子である。当業者は使用する化学療法剤を容易に特定することができる（例えば、Ｓｌａｐａｋ ａｎｄ Ｋｕｆｅ， Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ｃｈａｐｔｅｒ ８６ ｉｎ Ｈａｒｒｉｓｏｎ'ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， １４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ、 Ｐｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ， Ｃｈ． １７ ｉｎ Ａｂｅｌｏｆｆ， Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２．ｓｕｐ．ｎｄ ｅｄ．， ．ＣＯＰＹＲＧＴ． ２０００ Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ， Ｉｎｃ、Ｂａｌｔｚｅｒ Ｌ， Ｂｅｒｋｅｒｙ Ｒ （ｅｄｓ）： Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｐｏｃｋｅｔ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ， ２ｎｄ ｅｄ． Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｏｓｂｙ－Ｙｅａｒ Ｂｏｏｋ， １９９５、Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｄ Ｓ， Ｋｎｏｂｆ Ｍ Ｆ， Ｄｕｒｉｖａｇｅ Ｈ Ｊ （ｅｄｓ）： Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ， ４ｔｈ ｅｄ． Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｏｓｂｙ－Ｙｅａｒ Ｂｏｏｋ， １９９３を参照のこと）。
いくつかの実施形態では、化学療法剤は細胞傷害性化学療法剤である。「細胞傷害剤」という用語は、本明細書において使用される場合、細胞の機能を阻害もしくは妨害する物質および／または細胞の破壊を引き起こす物質を指す。その用語は放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２およびＬｕの放射性同位体）、化学療法剤、ならびに、細菌起源、真菌起源、植物起源または動物起源の低分子毒素または酵素的活性毒素などの、断片および／または異型体を含む、毒素を包含することが意図されている。
いくつかの実施形態では、化学療法剤はゲムシタビンである。「ゲムシタビン」または「２'－デオキシ－２'，２'－ジフルオロシチジン塩酸塩（ｂ－異性体）」は抗腫瘍活性を示すヌクレオシド類似体である。ゲムシタビン塩酸はジェムザール（商標）の商標でＥｌｉ Ｌｉｌｌｙが販売している。いくつかの実施形態では、化学療法剤はゲムシタビン、フルオロウラシル、カペシタビン、シプラスチン（ｃｉｐｌａｓｔｉｎ）、イリノテカン、オキサリプラチン、５－フルオロウラシル、フォリン酸、またはエルロチニブであり得る。いくつかの実施形態では、２つ以上の化学療法剤、例えば、２つの薬剤、３つの薬剤またはそれ以上の薬剤が投与され得る。複数の化学療法剤が別々に、または同時に投与され得る。本明細書に記載される方法において使用され得る化学療法剤の非限定的な例にはシスプラチン、ドキソルビシン、イリノテカン（カンプトテシン１１（ＣＰＴ１１））、パクリタキセル、５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）、カペシタビン（ゼローダＴＭ）、６－メルカプトプリン、ベバシズマブ、メトトレキサート、６－チオグアニン、ペメトレキセド、ラルチトレキセド、アラビノシルシトシンＡＲＡ－Ｃシタラビン（シトサール－Ｕ（登録商標））、ダカルバジン（ＤＴＩＣＤＯＭＥ＠）、アゾシトシン、デオキシシトシン、ピリドミデン（ｐｙｒｉｄｍｉｄｅｎｅ）、フルダラビン（フルダラ（ＦＬＵＤＡＲＡ）（登録商標））、クラドラビン（ｃｌａｄｒａｂｉｎｅ）、および２－デオキシ－Ｄ－グルコースが挙げられる。化学療法剤のさらなる非限定的な例には、チオテパおよびシトキサン（登録商標）シクロホスファミドなどのアルキル化剤；ブスルファン、イムプロスルファンおよびピポスルファンなどのスルホン酸アルキル類；ベンゾドパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）、およびウレドパ（ｕｒｅｄｏｐａ）などのアジリジン類；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミドおよびトリメチロロメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）を含むエチレンイミン類およびメチラメラミン類（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅ）；ＴＬＫ２８６（ＴＥＬＣＹＴＡＴＭ）；アセトゲニン類（特にブラタシンおよびブラタシノン）；デルタ－９－テトラヒドロカナビノール（ドロナビノール、ＭＡＲＩＮＯＬ（登録商標））；β－ラパコン；ラパコール；コルヒチン類；ベツリン酸；カンプトテシン（合成類似体のトポテカン（ハイカムチン（登録商標））、ＣＰＴ－１１（イリノテカン、カンプトサル（ＣＡＭＦＦＯＳＡＲ）（登録商標））、アセチルカンプトテシン、スコポレクチン（ｓｃｏｐｏｌｅｃｔｉｎ）、および９－アミノカンプトテシンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン（ｃａｌｌｙｓｔａｔｉｎ）；ＣＣ－１０６５（そのアドゼレシン、カルゼルシンおよびビゼレシン合成類似体を含む）；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸；テニポシド；クリプトフィシン類（特にクリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体であるＫＷ－２１８９およびＣＢ１－ＴＭ１を含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン（ｐａｎｃｒａｔｉｓｔａｔｉｎ）；サルコジクチイン；スポンジスタチン（ｓｐｏｎｇｉｓｔａｔｉｎ）；クロラムブチル、クロルナファジン、コロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベムビチン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン、プレドニムスチン、トロフォスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード類；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムスチンなどのニトロソウレア類；クロドロネートなどのビスホスホネート類、；エンジイン抗生物質（例えば、カリケアマイシン、特にカリケアマイシンガンマＩＩおよびカリケアマイシンオメガＩＩ（例えば、Ａｇｎｅｗ，Ｃｈｅｍ Ｉｎｔｌ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ．，３３： １８３～１８６ （１９９４）を参照のこと）およびアナマイシン、ＡＤ３２、アルカルビシン（ａｌｃａｒｕｂｉｃｉｎ）、ダウノルビシン、デクスラゾキサン、ＤＸ－５２－１、エピルビシン、ＧＰＸ－１００、イダルビシン、ＫＲＮ５５００、メノガリルなどのアントラサイクリン類、ジネマイシンＡを含むジネマイシン、エスペラマイシン、ネオカルジノスタチンクロモフォアおよび関連のクロモタンパク質エンジイン抗生物質クロモフォア、アクラシノマイシン類、アクチノマイシン、オートラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン類、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシニス、ダクチノマイシン、デトルビシン、６－ジアゾ－５－オキソＬ－ノルロイシン、アドリアマイシン（登録商標）ドキソルビシン（モルホリノ－ドキソルビシン、シアノモルホリノ－ドキソルビシン、２－プロリノ－ドキソルビシン、リポソーム性ドキソルビシン、およびデオキシドキソルビシンを含む）、エソルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン類などのマイトマイシンＣ、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン類、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、ケラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメックス、ジノスタチン、およびゾルビシンなどの抗生物質；デノプテリン、プテロプテリン、およびトリメトレキサートなどの葉酸類似体；フルダラビン、６－メルカプトプリン、チアミプリン、およびチオグアニンなどのプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６－アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルウリジン、エノシタビン、およびフロクスウリジンなどのピリミジン類似体；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、およびテストラクトンなどのアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、およびトリロスタンなどの抗副腎剤；フォリン酸（ロイコボリン）などの葉酸補充剤；アセグラトン；アリムタ（ＡＬＩＭＴＡ）（登録商標）、ＬＹ２３１５１４ペメトレキセド、メトトレキサートのようなジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤、５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）ならびにＵＦＴ、Ｓ－ｌおよびカペシタビンのようなそのプロドラッグなどの抗代謝剤、ならびにラルチトレキセド（ＴＯＭＵＤＥＸ（登録商標）、ＴＤＸ）などのチミジレートシンターゼ阻害剤およびグリシンアミドリボヌクレオチドホルミルトランスフェラーゼ阻害剤のような抗葉酸抗新生物剤；エニルウラシルなどのジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼの阻害剤；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルシン；ジアジコン；エルホミチン（ｅｌｆｏｍｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダイニン（ｌｏｎｉｄａｉｎｉｎｅ）；マイタンシンおよびアンサマイトシン類などのマイタンシノイド類；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール（ｍｏｐｉｄａｎｍｏｌ）；ニトラエリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；２－エチルヒドラジン；プロカルバジン；ＰＳＫＳ多糖複合体（ＪＨＳＮａｔｕｒａｌＰｒｏｄｕｃｔｓ、ユージーン、オレゴン州）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２'，２"トリクロロトリエチルアミン；トリコテカセン類（特にＴ－２トキシン、ベラクリン（ｖｅｒｒａｃｕｒｉｎ）Ａ、ロリジンＡおよびアングイジン）；ウレタン；ビンデシン（ＥＬＤＩＳＩＮＥ（登録商標）、ＦＩＬＤＥＳＩＮ（登録商標））；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ－Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド類およびタキサン類、例えば、ＴＡＸＯＬ（登録商標）パクリタキセル（Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、プリンストン、ニュージャージー州）、ＡＢＲＡＸＡＮＥＴＭ Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒフリー、パクリタキセルのアルブミン結合ナノ粒子製剤（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐａｒｔｎｅｒｓ、シャンバーグ、イリノイ州）、およびＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）ドセタキセルクロラムブシル（Ｒｈｏｎｅ－Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ、アントニー、フランス）；クロランブシル（ｃｈｌｏｒａｎｂｕｃｉｌ）；６－チオグアニン；メルカプトプリン；プラチナ；シスプラチン、オキサリプラチンおよびカルボプラチンなどのプラチナ類似体またはプラチナ系類似体；ビンブラスチン（ＶＥＬＢＡＮ（登録商標））；エトポシド（ＶＰ－１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン（オンコビン（登録商標））；ビンカアルカロイド；ビノレルビン（ナベルビン（登録商標））；ノバントロン；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロミフィン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸などのレチノイド；上記のもののいずれかの薬学的に許容可能な塩、酸または誘導体；ならびにシクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニソロンからなる併用療法の略語であるＣＨＯＰ、および５－ＦＵおよびロイコボリンとオキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮＴＭ）を併用する治療計画の略語であるＦＯＬＦＯＸなどの上記のもののうちの２つ以上からなる組合せが挙げられる。
いくつかの実施形態では、ＭＯＤ－ＲＮＡは腫瘍の直接注入により組織に送達される。本明細書において開示されるように、ＭＯＤ－ＲＮＡを含む組成物の組織への直接注入は約３日以内にそのＭＯＤ－ＲＮＡからの強固なタンパク質発現をもたらすことができ、発現は約４～５日間続き得る。
いくつかの実施形態では、ＭＯＤ－ＲＮＡは当業者に知られている任意の方法により組織（例えば、腫瘍）に送達することができ、そして、例えば、カテーテルによる送達を含むことができ、そのカテーテルは、ＭＯＤ－ＲＮＡ組成物を標的組織に送達するための永久カテーテルまたは一時的カテーテルであり得る。いくつかの実施形態では、ＭＯＤ－ＤＮＡは内視鏡を使用して送達される。いくつかの実施形態では、カテーテルや内視鏡による送達のために、そのカテーテルや内視鏡は装着型カメラを有することができ、撮影によって臨床医がＭＯＤ－ＲＮＡを含む組成物を所望の組織位置へ正確に送達することを助けることができる。
いくつかの実施形態では、本明細書において開示されるＭＯＤ－ＲＮＡを含む組成物は、埋め込み型装置を使用して標的組織に送達することができる。いくつかの実施形態では、埋め込み型装置は薬物送達装置であり、その薬物送達装置ＭＯＤ－ＲＮＡ組成物を標的組織に送達するための送達用カテーテルを含む。
いくつかの実施形態では、ＭＯＤ－ＲＮＡは融合タンパク質、例えば、ＶＥＧＦを特定の細胞に標的化するために標的化タンパク質にＶＥＧＦが融合されている融合タンパク質をコードすることができる。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦを内皮細胞に標的化することが望ましい場合、ＭＯＤ－ＲＮＡはＶＥＧＦ－ｖＷＦ融合タンパク質をコードすることができ、それでは、ｖＷＦはＶＥＧＦを内皮細胞に標的化するためのホーミングペプチドとして機能する。他の標的化ペプチドおよびホーミングペプチドは本発明に包含される。
いくつかの例では、ＭＯＤ－ＲＮＡに分泌タンパク質をコードさせることが望ましい。そのような場合では、ＭＯＤ－ＲＮＡはタンパク質の分泌を容易にする分泌シグナル配列を含むタンパク質をコードする。例えば、ＭＯＤ－ＲＮＡが目的のタンパク質として血管新生性タンパク質をコードする場合、当業者であれば、天然のシグナル配列を有する血管新生性タンパク質、例えば、ＶＥＧＦを選択することができるか、ルーチンの遺伝子操作を用いてそのような配列を含むように遺伝子産物を修飾することができる（Ｎａｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， １９９３を参照のこと）。
あるいは、いくつかの実施形態では、ＭＯＤ－ＲＮＡは修飾されて、標的組織の特定の細胞種にＭＯＤ－ＲＮＡを標的化するために、本明細書において開示されるように付加された特定の標的化成分を有することができる。いくつかの実施形態では、その成分はＭＯＤ－ＲＮＡに直接付加された標的化成分、または代わりに、間接的に付加された標的化成分であることができ、例えば、そのＭＯＤ－ＲＮＡがリポソームまたはナノ粒子中に製剤される場合、そのリポソームまたはナノ粒子の表面は、組織内の特定の細胞によるＭＯＤ－ＲＮＡの取込を管理するための標的化成分を含むことができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物は腫瘍の治療に関する。そのような治療の医学的適応には癌の診断が含まれる。癌を診断する方法は医療分野の当業者に周知である。非限定的な例として、ＰＤＡＣは、無痛性黄疸、背中へと広がる心窩部痛、体重減少、吐き気、および掻痒症を含み得る症状を特徴とする。診断は、例えば、腹部動悸、超音波、ＰＤＡＣの血清学的マーカー（例えば、ＣＡ１９－９）のレベル上昇の検出、および／または、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＢｏｒｔｅｓｉ ｅｔ ａｌ． Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ （２０１１） ４に記載されるような、対象からの生検試料もしくは切除試料の組織学的検査を含む検査に基づいて行われ得る。治療の効力は、本明細書に記載される方法に従う治療を受けていない対象と比べた腫瘍体積の減少、腫瘍の成長の低下、または転移もしくは腫瘍増殖の低下などの臨床的に受け入れられている基準によってモニターすることができる。
いくつかの実施形態では、腫瘍の治療のための少なくとも１つの合成修飾型ＲＮＡ（ＭＯＤ－ＲＮＡ）を含む組成物の投与の効果は、限定されないが、次の基準、すなわち血管新生の増加または線維形成性組織の減少または腫瘍の線維形成性組織の増殖速度の低下のうちの１つによって実証され得る。血管新生は、例えば、癌のマウスモデルにおいて肉眼検査およびヘマトキシリン・エオシン染色によって決定され得る。線維形成性組織または腫瘍の線維形成性組織の増殖速度に対する効果は組織学的に決定され得る。
いくつかの実施形態では、対象において本明細書に記載されるように癌を治療するためにＭＯＤ－ＲＮＡを投与する方法は、症状緩和を目的とした減量治療または外科的治療を用いて治療されてもいる対象を治療するために使用することができる。いくつかの実施形態では、減量治療または外科的治療の間にＭＯＤ－ＲＮＡが投与される。いくつかの実施形態では、減量治療または外科的治療の後にＭＯＤ－ＲＮＡが投与される。
対象に投与されるＭＯＤ－ＲＮＡの用量
いくつかの実施形態では、目的のタンパク質または作用物質をコードするＭＯＤ－ＲＮＡを含む組成物の有効量をインビボで所望の組織に送達することができる。いくつかの実施形態では、本発明のＭＯＤ－ＲＮＡの様々な用量範囲が包含される。いくつかの実施形態では、ＭＯＤ－ＲＮＡは１００ｎｇ／μｌよりも高い（例えば、多い）濃度で送達される。いくつかの実施形態では、インビボで組織に送達される組成物中のＭＯＤ－ＲＮＡの濃度は少なくとも約０．５μｇ／μｌ、または少なくとも約１μｇ／μｌ、または少なくとも約２μｇ／μｌ、または少なくとも約３μｇ／μｌ、または少なくとも約４μｇ／μｌ、または少なくとも約５μｇ／μｌ、または少なくとも約６μｇ／μｌ、または少なくとも約７μｇ／μｌ、または少なくとも約８μｇ／μｌ、または少なくとも約９μｇ／μｌ、または少なくとも約１０μｇ／μｌ、または少なくとも約１２μｇ／μｌ、または少なくとも約１４μｇ／μｌ、または少なくとも約１６μｇ／μｌ、または少なくとも約１８μｇ／μｌ、または少なくとも約２０μｇ／μｌ、または少なくとも約２５μｇ／μｌ、または少なくとも約３０μｇ／μｌ、または少なくとも約４０μｇ／μｌ、または少なくとも約５０μｇ／μｌ、または約０．５μｇ／μｌと２５μｇ／μｌの間の任意の整数の濃度である。いくつかの実施形態では、インビボで組織に送達される組成物中のＭＯＤ－ＲＮＡの濃度は５０μｇ／μｌよりも高く、そして、少なくとも約６０μｇ／μｌ、または少なくとも約７０μｇ／μｌ、または少なくとも約８０μｇ／μｌ、または少なくとも約９０μｇ／μｌ、または少なくとも約１００μｇ／μｌ（０．１ｍｇ／ｍｌ）であり得る、または１００μｇ／μｌよりも高くてよい。
いくつかの実施形態では、インビボで組織に投与される組成物中のＭＯＤ－ＲＮＡの用量は約５０μｇ、または約１００μｇ、または約２００μｇ、または約３００μｇ、または約４００μｇ、または約５００μｇ、または約６００μｇ、または約７００μｇ、または約８００μｇ、または約９００μｇ、または約１ｍｇ、または約５０μｇと１ｍｇの間の任意の量のＭＯＤ－ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、インビボで組織に投与される組成物中のＭＯＤ－ＲＮＡの用量は約１００μｇ／ｋｇ体重、または約１００μｇ／ｋｇ体重、または約２００μｇ／ｋｇ体重、または約３００μｇ／ｋｇ体重、または約４００μｇ／ｋｇ体重、または約５００μｇ／ｋｇ体重、または約６００μｇ／ｋｇ体重または約０．７ｍｇ／ｋｇ体重または約０．８ｍｇ／ｋｇ体重または約０．９ｍｇ／ｋｇ体重または約１ｍｇ／ｋｇ体重である。
いくつかの実施形態では、インビボで組織に投与される組成物中のＭＯＤ－ＲＮＡの用量は約１００μｇ／ｋｇ組織重量（例えば、ＭＯＤ－ＲＮＡを送達している組織）、または約１００μｇ／ｋｇ組織重量、または約２００μｇ／ｋｇ組織重量、または約３００μｇ／ｋｇ組織重量、または約４００μｇ／ｋｇ組織重量、または約５００μｇ／ｋｇ組織重量、または約６００μｇ／ｋｇ組織重量、または約０．７ｍｇ／ｋｇ組織重量または約０．８ｍｇ／ｋｇ組織重量、または約０．９ｍｇ／ｋｇ組織重量、または約１ｍｇ／ｋｇ組織重量である。
いくつかの実施形態では、組織に与えられる投薬の頻度はＭＯＤ－ＲＮＡのインビボ半減期によって決定される。いくつかの実施形態では、半減期はインビボで約４８時間であり、それによりＭＯＤ－ＲＮＡを含む組成物の投与頻度は毎日であり得、またはいくつかの実施形態では、隔日であり得る。いくつかの実施形態では、ＭＯＤ－ＲＮＡからのインビボタンパク質発現は約４～５日間続き得るので、いくつかの実施形態では、ＭＯＤ－ＲＮＡを含む組成物の投与頻度は４日毎、または５日毎、または週毎または１０日毎または２週毎であり得る。いくつかの実施形態では、投与頻度は月毎である。
１つの実施形態では、インビボで組織に投与される組成物中のＭＯＤ－ＲＮＡの用量は１０～１００μｇ／日の範囲内にある。別の実施形態では、投与量は約５０～２００μｇ／日である。別の実施形態では、投与量は５０～２００μｇ／日である。いくつかの実施形態では、投与量は約１００μｇ／日である。
別の実施形態では、投与量は１日用量である。別の実施形態では、投与量は１週間用量である。別の実施形態では、投与量は１月用量である。別の実施形態では、投与量は１年用量である。別の実施形態では、用量は一連の限定された数の用量のうちの１つである。別の実施形態では、用量は、１回限りの用量である。以下に記載するように、別の実施形態では、本明細書において開示されるＭＯＤ－ＲＮＡの利点は非修飾型ＲＮＡも高いそれらのインビボでの力価であり、それがより少ない用量を使用することを可能にする。
さらに、いくつかの実施形態では、ＭＯＤ－ＲＮＡを含む組成物の用量は、組織において複数の異なるタンパク質および／または作用物質をインビボで同時に発現するための複数のＭＯＤ－ＲＮＡ、例えば、少なくとも２つ、または少なくとも約３、または少なくとも約４、または少なくとも約５、または少なくとも約５、または少なくとも約６、または少なくとも約７、または少なくとも約８、または少なくとも約９、または少なくとも約１０の異なるＭＯＤ－ＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、組成物が１つより多くのＭＯＤ－ＲＮＡを含み、組織がコードされるタンパク質のうちの少なくとも１つをインビボで発現する場合、その組織は異なるＭＯＤ－ＲＮＡに由来する他のタンパク質のうちの少なくとも１つ、全て、または任意の組合せを発現することもできる。
ポリペプチドを発現する合成修飾型ＲＮＡ
本明細書は、心臓細胞、例えば、心筋細胞の集団をポリペプチドをコードする少なくとも１つの合成修飾型ＲＮＡ（ＭＯＤ－ＲＮＡ）を含む組成物と接触させることによる組織、例えば、心臓組織、または心筋細胞におけるインビボタンパク質発現のための方法を記載する。
本明細書において開示される組成物、方法およびキットにおいて使用される合成修飾型ＲＮＡは、２０１０年９月２８日に提出された米国特許仮出願第６１／３８７，２２０号、および２０１０年４月１６日に提出された米国特許仮出願第６１／３２５，００３号に記載されており、それらの両方が参照により全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書において使用される場合、「合成修飾型ＲＮＡ」という用語は（本明細書においてＭＯＤ－ＲＮＡとも呼ばれる）、宿主細胞で発現するポリペプチドなどの因子をコードする核酸分子を指し、それは少なくとも１つの修飾ヌクレオシドを含み、その用語が本明細書において使用される場合、少なくとも次の特徴を有する：（ｉ）合成修飾型ＲＮＡはインビトロ転写により生成することができ、細胞から単離されない、（ｉｉ）合成修飾型ＲＮＡは哺乳類（および、好ましくはヒト）細胞においてインビボで翻訳可能である、および（ｉｉｉ）合成修飾型ＲＮＡは、同じ配列の合成非修飾型ＲＮＡと比較して、それが導入されている、または接触している細胞において自然免疫応答またはインターフェロン応答を誘発しない、または著しく軽減された自然免疫応答またはインターフェロン応答を誘発する。本明細書に記載されるような合成修飾型ＲＮＡは標的細胞または組織におけるインビボでの反復形質移入を可能にする、すなわち、本明細書に記載されるような合成修飾型ＲＮＡ分子によってインビボで形質移入された細胞または細胞集団は自然免疫応答またはインターフェロン応答を顕著に誘導することなくそのような合成修飾型ＲＮＡでの反復形質移入を許容する。上記の合成修飾型ＲＮＡ分子についてのこれら３つの主要な基準は以下により詳細に説明されている。
第一に、合成修飾型ＲＮＡは鋳型ＤＮＡのインビトロ転写によって生成可能でなくてはならない。鋳型を生成する方法は標準的な分子クローニング技術を用いる当業者にとって周知である。制限エンドヌクレアーゼ切断部位の存在に依存しない鋳型ＤＮＡの構築に対する追加的なアプローチ（「スプリント介在性ライゲーション」と呼称される）も本明細書に記載される。転写された合成修飾型ＲＮＡ高分子は、例えば、キャップまたは他の官能基を付加することにより、転写後にさらに修飾され得る。
インビトロ転写に適切であるためには、修飾ヌクレオシドは、ＭＯＤ－ＲＮＡで形質移入されている組織または細胞が発現する少なくとも１つのＲＮＡポリメラーゼ酵素によって基質として認識されなくてはならない。一般に、天然のＧ、Ａ、Ｕ、およびＣヌクレオシド塩基は互いにかなり異なることを少なくとも部分的な理由として、ＲＮＡポリメラーゼ酵素は様々なヌクレオシド塩基修飾を許容することができる。したがって、本明細書に記載される合成修飾型ＲＮＡの生成に使用される修飾ヌクレオシド塩基の構造は一般にその修飾ヌクレオシドの糖－リン酸部分よりも多様であり得る。そうは言っても、ＲＮＡポリメラーゼによる転写が可能なリボースとリン酸が修飾されているヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体は当技術分野において公知である。本明細書に記載される態様のいくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼはファージのＲＮＡポリメラーゼである。修飾ヌクレオチドであるシュードウリジン、ｍ５Ｕ、ｓ２Ｕ、ｍ６Ａ、およびｍ５ＣはファージのＲＮＡポリメラーゼを使用する転写に適合することが知られているが、一方、Ｎ１－メチルグアノシン、Ｎ１－メチルアデノシン、Ｎ７－メチルグアノシン、２'－）－メチルウリジン、および２'－Ｏ－メチルシチジンは適合しない。修飾ヌクレオシドを受容するポリメラーゼは当業者に知られている。
合成修飾型ＲＮＡを本明細書に記載されるように生成するために修飾型ポリメラーゼを使用することができることも意図される。したがって、例えば、特定の修飾ヌクレオシドを基質として許容または受容するポリメラーゼを、その修飾ヌクレオシドを含む合成修飾型ＲＮＡを生成するために使用することができる。
第二に、合成修飾型ＲＮＡは、真核生物細胞、好ましくは哺乳類細胞、およびより好ましくはヒト細胞の翻訳機構によってインビボで翻訳可能でなくてはならない。インビボ翻訳は一般に少なくともリボソーム結合部位、メチオニン開始コドン、およびポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを必要とする。好ましくは、合成修飾型ＲＮＡはまた、５′キャップ、終止コドン、コザック配列およびポリＡテールを含む。さらに、真核細胞内のｍＲＮＡは分解によって調節されており、そのため、本明細書に記載される合成修飾型ＲＮＡは、ＲＮＡ分解速度を減少させる修飾を組み込むことにより（例えば、合成修飾型ＲＮＡの血清中安定性を増加させることにより）さらに修飾して細胞中での半減期を延長させることができる。
ヌクレオシド修飾は翻訳に干渉することができる。所与の修飾が翻訳に干渉する限り、それらの修飾は本明細書に記載される合成修飾型ＲＮＡによって包含されない。インビボ翻訳アッセイを用い（例えば、インビボマウスｃｒｅモデルアッセイにおけるｃｒｅリコンビナーゼ遺伝子をコードするＭＯＤ－ＲＮＡ、またはルシフェラーゼをコードするＭＯＤ－ＲＮＡを使用し、翻訳タンパク質の生物発光アッセイを用いてインビボ発現を検出して）、そして、作製されたポリペプチドの量を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ウエスタンブロット、または免疫化学、生物発光アッセイなどを用いて検出して合成修飾型ＲＮＡをその翻訳される能力および翻訳効率について試験することができる。候補修飾を含む合成修飾型ＲＮＡの翻訳が、候補修飾を持たないＲＮＡの翻訳と比較され、候補修飾を有する合成修飾型ＲＮＡの翻訳が同程度のままである、または増加する場合、その候補修飾は本明細書に記載される組成物および方法に関して使用されることが企図される。フルオロ修飾ヌクレオシドは一般に翻訳可能ではなく、そして、インビトロ翻訳アッセイの負の対照として本明細書において使用することができることに留意されたい。
第三に、合成修飾型ＲＮＡは形質移入された組織または細胞集団による低下した（または存在しない）自然免疫応答をインビボで、または低下したインターフェロン応答をインビボで誘発する。真核細胞、例えば、哺乳類細胞またはヒト細胞で産生されたｍＲＮＡはかなり修飾されており、その修飾によって細胞はその細胞により産生されていないＲＮＡを検出することが可能になる。細胞は翻訳を停止することにより応答し、他には、自然免疫応答またはインターフェロン応答を開始することにより応答する。したがって外部より付加されるＲＮＡが、標的細胞が産生する内在性ＲＮＡに生じている修飾を模倣するために修飾され得る限り、その外来性ＲＮＡは外来性核酸に対する標的細胞の防御の少なくとも一部を避けることができる。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載され合成修飾型ＲＮＡには真核生物／哺乳類／ヒトＲＮＡにおいてインビボで見つかる修飾を含むインビトロで転写されたＲＮＡが含まれる。そのような天然の修飾を模倣する他の修飾は、細胞が許容する合成修飾型ＲＮＡ分子の生産において有用でもあり得る。これを背景として、または合成修飾型ＲＮＡの必要条件についての理解の開始点として、本明細書に記載される合成修飾型ＲＮＡにおいて意図されるまたは有用な様々な修飾は、本明細書の以下でさらに考察される。
ＲＮＡの修飾
いくつかの態様では、本明細書は、ポリペプチドをコードする、またはそれ自体がアンチセンス阻害剤である合成修飾型ＲＮＡ分子（ＭＯＤ－ＲＮＡ）であって、１つ以上の修飾を含む合成修飾型ＲＮＡ分子であり、その合成修飾型ＲＮＡ分子の細胞または組織へのインビボでの導入によって、前記ポリペプチドをコードする、該１つ以上の修飾を含まない合成ＲＮＡ分子と接触している細胞と比較して、その組織の自然免疫応答が低下することになる合成修飾型ＲＮＡ分子を提供する。
本明細書に記載される合成修飾型ＲＮＡは、エンドヌクレアーゼおよびエクソヌクレアーゼによる急速な分解を防ぐため、および、そのＲＮＡに対する細胞の自然免疫応答またはインターフェロン応答を避ける、または低下させるために修飾を含む。修飾には、例えば、（ａ）末端修飾、例えば、５'末端修飾（リン酸化、脱リン酸化、複合体化、逆結合（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｌｉｎｋａｇｅ）など）、３'末端修飾（複合体化、ＤＮＡヌクレオチド、逆結合など）、（ｂ）塩基修飾、例えば、修飾型塩基、安定化塩基、脱安定化塩基、または広範囲の相手と塩基対合する塩基、または複合塩基との置換、（ｃ）糖修飾（例えば、２'位または４'位での）または糖の置換、ならびに（ｄ）ホスホジエステル結合の修飾または置換を含むヌクレオシド間結合修飾が含まれるが、これらに限定されない。そのような修飾が翻訳に干渉する限り（すなわち、例えば、ウサギ網状赤血球インビトロ翻訳アッセイにおいてその修飾が無いときと比べて５０％以上の低下がもたらされる限り）、その修飾は本明細書に記載される方法および組成物に適切ではない。本明細書に記載される方法について有用な合成修飾型ＲＮＡ組成物の具体例には、修飾ヌクレオシド間結合または非天然型ヌクレオシド間結合を含むＲＮＡ分子が含まれるが、これらに限定されない。修飾ヌクレオシド間結合を有する合成修飾型ＲＮＡには、何よりも、ヌクレオシド間結合内にリン原子を持たないＲＮＡが含まれる。他の実施形態では、合成修飾型ＲＮＡはそのヌクレオシド間結合内にリン原子を有する。
修飾ヌクレオシド間結合の非限定的な例には、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルホスホネートならびに３'－アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含む他のアルキルホスホネート、ホスフィナート、３'－アミノホスホルアミデートおよびアミノアルキルホスホルアミデートを含むホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、ならびに通常の３'－５'結合を有するボラノホスフェート、これらの２'－５'結合類似体、ならびに隣接するヌクレオシド単位の対が３'－５'から５'－３'へ、または２'－５'から５'－２'へ結合している逆転した極性を有するものが挙げられる。様々な塩、混合塩、および遊離酸型も含まれる。
上記のリン含有結合の調製を教示する代表的な米国特許には米国特許第３，６８７，８０８号、第４，４６９，８６３号、第４，４７６，３０１号、第５，０２３，２４３号、第５，１７７，１９５号、第５，１８８，８９７号、第５，２６４，４２３号、第５，２７６，０１９号、第５，２７８，３０２号、第５，２８６，７１７号、第５，３２１，１３１号、第５，３９９，６７６号、第５，４０５，９３９号、第５，４５３，４９６号、第５，４５５，２３３号、第５，４６６，６７７号、第５，４７６，９２５号、第５，５１９，１２６号、第５，５３６，８２１号、第５，５４１，３１６号、第５，５５０，１１１号、第５，５６３，２５３号、第５，５７１，７９９号、第５，５８７，３６１号、第５，６２５，０５０号、第６，０２８，１８８号、第６，１２４，４４５号、第６，１６０，１０９号、第６，１６９，１７０号、第６，１７２，２０９号、第６，２３９，２６５号、第６，２７７，６０３号、第６，３２６，１９９号、第６，３４６，６１４号、第６，４４４，４２３号、第６，５３１，５９０号、第６，５３４，６３９号、第６，６０８，０３５号、第６，６８３，１６７号、第６，８５８，７１５号、第６，８６７，２９４号、第６，８７８，８０５号、第７，０１５，３１５号、第７，０４１，８１６号、第７，２７３，９３３号、第７，３２１，０２９号、および米国再発行特許第３９４６４号が含まれるが、これらに限定されず、それらのそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
リン原子を中に含まない修飾ヌクレオシド間結合は、短鎖アルキルヌクレオシド間結合もしくは短鎖シクロアルキルヌクレオシド間結合、ヘテロ原子およびアルキル混合ヌクレオシド間結合もしくはヘテロ原子およびシクロアルキル混合ヌクレオシド間結合、または１つ以上の短鎖ヘテロ原子性ヌクレオシド間結合もしくは複素環ヌクレオシド間結合によって形成されるヌクレオシド間結合を有する。これらはモルホリノ結合（部分的にはヌクレオシドの糖部分から形成される）、シロキサン骨格、スルフィド、スルフオキシドおよびスルホン骨格、ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、アルケン含有骨格、スルファメート骨格、メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格、スルホネートおよびスルホンアミド骨格、アミド骨格を有するヌクレオシド間結合、ならびにＮ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２構成要素部分を混合して有する他のヌクレオシド間結合を形成する。
修飾オリゴヌクレオシドの調製を教示する代表的な米国特許には米国特許第５，０３４，５０６号、第５，１６６，３１５号、第５，１８５，４４４号、第５，２１４，１３４号、第５，２１６，１４１号、第５，２３５，０３３号、第５，６４，５６２号、第５，２６４，５６４号、第５，４０５，９３８号、第５，４３４，２５７号、第５，４６６，６７７号、第５，４７０，９６７号、第５，４８９，６７７号、第５，５４１，３０７号、第５，５６１，２２５号、第５，５９６，０８６号、第５，６０２，２４０号、第５，６０８，０４６号、第５，６１０，２８９号、第５，６１８，７０４号、第５，６２３，０７０号、第５，６６３，３１２号、第５，６３３，３６０号、第５，６７７，４３７号、および第５，６７７，４３９号が含まれるが、これらに限定されず、それらのそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載される合成修飾型ＲＮＡのいくつかの実施形態は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を有する核酸およびヘテロ原子性ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオシドを含み、特に上で参照した米国特許第５，４８９，６７７号の－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）－Ｏ－ＣＨ２－［メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩとして知られる］、－ＣＨ２－Ｏ－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２－および－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２－ＣＨ２－［元々のホスホジエステルヌクレオシド間結合が－Ｏ－Ｐ－Ｏ－ＣＨ２－と表されている］、ならびに上で参照した米国特許第５，６０２，２４０号のアミド骨格を含み、それらの特許の両方がその全体の参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、本明細書に取り上げられる核酸配列は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、上で参照した米国特許第５，０３４，５０６号のモルホリノ骨格を有する。
本明細書に記載される合成修飾型ＲＮＡは１つ以上の置換糖成分を含有することもできる。本明細書に取り上げられる核酸は以下のうちの１つを２'位に含むことができる：Ｈ（デオキシリボース）；ＯＨ（リボース）；Ｆ；Ｏ－、Ｓ－、またはＮ－アルキル；Ｏ－、Ｓ－、またはＮ－アルケニル；Ｏ－、Ｓ－またはＮ－アルキニル；またはＯ－アルキル－Ｏ－アルキル、そのアルキル、アルケニルおよびアルキニルは置換型または非置換型のＣ１～Ｃ１０アルキルまたはＣ２～Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルであり得る。例となる修飾には、ｎとｍが１から約１０までである、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２が含まれる。いくつかの実施形態では、合成修飾型ＲＮＡは以下：Ｃ１～Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ－アルカリルまたはＯ－アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、レポーター基、インターカレーター、ＲＮＡの薬物動態特性を改善する基、または合成修飾型ＲＮＡの薬力学的特性を改善する基、および類似の特性を有する他の置換基のうちの１つを２'位に含む。いくつかの実施形態では、前記修飾には２'メトキシエトキシ（２'－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２'－Ｏ－（２－メトキシエチル）または２'－ＭＯＥとしても知られる）（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｈｅｌｖ． Ｃｈｉｍ． Ａｃｔａ， １９９５， ７８：４８６～５０４）、すなわち、アルコキシ－アルコキシ基が含まれる。別の例示的な修飾は２'－ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、２'－ＤＭＡＯＥとしても知られるＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、および２'－ジメチルアミノエトキシエトキシ（当技術分野において２'－Ｏ－ジメチルアミノエトキシエチルまたは２'－ＤＭＡＥＯＥとしても知られる）、すなわち、２'－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ２）２である。
他の修飾には、２'－メトキシ（２'－ＯＣＨ３）、２'－アミノプロポキシ（２'－ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）および２'－フルオロ（２'－Ｆ）が含まれる。類似の修飾は核酸配列上の他の位置、特に３'末端ヌクレオチドの糖の３'位または２'－５'結合ヌクレオチド内の糖の３'位および５'末端ヌクレオチドの５'位に行うこともできる。合成修飾型ＲＮＡはペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル成分などの糖模倣物を有することもできる。そのような修飾型糖構造の調製を教示する代表的な米国特許には米国特許第４，９８１，９５７号、第５，１１８，８００号、第５，３１９，０８０号、第５，３５９，０４４号、第５，３９３，８７８号、第５，４４６，１３７号、第５，４６６，７８６号、第５，５１４，７８５号、第５，５１９，１３４号、第５，５６７，８１１号、第５，５７６，４２７号、第５，５９１，７２２号、第５，５９７，９０９号、第５，６１０，３００号、第５，６２７，０５３号、第５，６３９，８７３号、第５，６４６，２６５号、第５，６５８，８７３号、第５，６７０，６３３号、および第５，７００，９２０号が含まれるが、これらに限定されず，それらのうちのある特定のものは本願と共通しており、それらの特許のそれぞれはその全体の参照により本明細書に組み込まれる。
非限定的な例として、本明細書に記載される合成修飾型ＲＮＡは、２'－Ｏ－メチル修飾ヌクレオシド、５'ホスホロチオエート基を含むヌクレオシド、２'－アミノ－修飾ヌクレオシド、２'－アルキル－修飾ヌクレオシド、モルホリノヌクレオシド、ホスホルアミデートまたは非天然塩基含有ヌクレオシド、またはそれらの任意の組合せを包含する少なくとも１つの修飾ヌクレオシドを含むことができる。
本明細書に記載されるこの態様および他の全てのそのような態様のいくつかの実施形態では、少なくとも１つの修飾ヌクレオシドは、５－メチルシチジン（５ｍＣ）、Ｎ６－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、３，２'－Ｏ－ジメチルウリジン（ｍ４Ｕ）、２－チオウリジン（ｓ２Ｕ）、２'フルオロウリジン、シュードウリジン、２'－Ｏ－メチルウリジン（Ｕｍ）、２'デオキシウリジン（２'ｄＵ）、４－チオウリジン（ｓ４Ｕ）、５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ）、２'－Ｏ－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、Ｎ６，２'－Ｏ－ジメチルアデノシン（ｍ６Ａｍ）、Ｎ６，Ｎ６，２'－Ｏ－トリメチルアデノシン（ｍ６２Ａｍ）、２'－Ｏ－メチルシチジン（Ｃｍ）、７－メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）、２'－Ｏ－メチルグアノシン（Ｇｍ）、Ｎ２，７－ジメチルグアノシン（ｍ２，７Ｇ）、Ｎ２，Ｎ２，７－トリメチルグアノシン（ｍ２，２，７Ｇ）、およびイノシン（Ｉ）からなる群より選択される。
あるいは、合成修飾型ＲＮＡは最大でオリゴヌクレオチドの全長までで、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個またはそれ以上の修飾ヌクレオシドを含むことができる。少なくとも１つの修飾型ヌクレオシドを含む合成修飾型ＲＮＡ分子は、最低でも、本明細書に記載される修飾を有する１つのヌクレオシドを含む。所与の合成修飾型ＲＮＡ内の全ての位置が必ずしも均等に修飾されている訳ではなく、実際には、前述の修飾のうちの１つよりも多くが１つの合成修飾型ＲＮＡ内または合成修飾型ＲＮＡ内のたった１つのヌクレオシドに組み込まれ得る。しかしながら、分子内の各事例の所与のヌクレオシドが修飾されている（例えば、各シトシンが修飾型シトシン例えば、５ｍＣである）ことが好ましいが、必要とは限らない。しかしながら、所与の合成修飾型ＲＮＡ分子において、異なる事例の同じヌクレオシドが異なる様に修飾され得ることも意図される（例えば、いくつかのシトシンは５ｍＣとして修飾されており、他のシトシンは２'－Ｏ－メチルシチジンまたは他のシトシン類似体として修飾されている）。前記修飾は合成修飾型ＲＮＡ内の複数の修飾ヌクレオシドのうちのそれぞれについて同一である必要はない。さらに、本明細書に記載される態様のいくつかの実施形態では、合成修飾型ＲＮＡは少なくとも２つの異なる修飾ヌクレオシドを含む。本明細書に記載される態様のいくつかのそのような好ましい実施形態では、その少なくとも２つの異なる修飾ヌクレオシドは５－メチルシチジンおよびシュードウリジンである。合成修飾型ＲＮＡは修飾ヌクレオシドおよび非修飾ヌクレオシドの両方の混合物を含むこともできる。
本明細書において使用される場合、「非修飾型」または「天然」のヌクレオシドまたは核酸塩基はプリン塩基であるアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基であるチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）を含む。いくつかの実施形態では、合成修飾型ＲＮＡは少なくとも１つのヌクレオシド（「塩基」）修飾または置換を含む。修飾ヌクレオシドは他の合成および天然の核酸塩基、例えば、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌブラリン（ｎｕｂｕｌａｒｉｎｅ）、イソグアニシン（ｉｓｏｇｕａｎｉｓｉｎｅ）、ツベルシジン、２－（ハロ）アデニン、２－（アルキル）アデニン、２－（プロピル）アデニン、２（アミノ）アデニン、２－（アミノアルキル）アデニン、２（アミノプロピル）アデニン、２（メチルチオ）Ｎ６（イソペンテニル）アデニン、６（アルキル）アデニン、６（メチル）アデニン、７（デアザ）アデニン、８（アルケニル）アデニン、８－（アルキル）アデニン、８（アルキニル）アデニン、８（アミノ）アデニン、８－（ハロ）アデニン、８－（ヒドロキシル）アデニン、８（チオアルキル）アデニン、８－（チオール）アデニン、Ｎ６－（イソペンチル）アデニン、Ｎ６（メチル）アデニン、Ｎ６，Ｎ６（ジメチル）アデニン、２－（アルキル）グアニン、２（プロピル）グアニン、６－（アルキル）グアニン、６（メチル）グアニン、７（アルキル）グアニン、７（メチル）グアニン、７（デアザ）グアニン、８（アルキル）グアニン、８－（アルケニル）グアニン、８（アルキニル）グアニン、８－（アミノ）グアニン、８（ハロ）グアニン、８－（ヒドロキシル）グアニン、８（チオアルキル）グアニン、８－（チオール）グアニン、Ｎ（メチル）グアニン、２－（チオ）シトシン、３（デアザ）５（アザ）シトシン、３－（アルキル）シトシン、３（メチル）シトシン、５－（アルキル）シトシン、５－（アルキニル）シトシン、５（ハロ）シトシン、５（メチル）シトシン、５（プロピニル）シトシン、５（プロピニル）シトシン、５（トリフルオロメチル）シトシン、６－（アゾ）シトシン、Ｎ４（アセチル）シトシン、３（３アミノ－３カルボキシプロピル）ウラシル、２－（チオ）ウラシル、５（メチル）２（チオ）ウラシル、５（メチルアミノメチル）－２（チオ）ウラシル、４－（チオ）ウラシル、５（メチル）４（チオ）ウラシル、５（メチルアミノメチル）－４（チオ）ウラシル、５（メチル）２，４（ジチオ）ウラシル、５（メチルアミノメチル）－２，４（ジチオ）ウラシル、５（２－アミノプロピル）ウラシル、５－（アルキル）ウラシル、５－（アルキニル）ウラシル、５－（アリルアミノ）ウラシル、５（アミノアリル）ウラシル、５（アミノアルキル）ウラシル、５（グアニジニウムアルキル）ウラシル、５（１，３－ジアゾール－１－アルキル）ウラシル、５－（シアノアルキル）ウラシル、５－（ジアルキルアミノアルキル）ウラシル、５（ジメチルアミノアルキル）ウラシル、５－（ハロ）ウラシル、５－（メトキシ）ウラシル、ウラシル－５オキシ酢酸、５（メトキシカルボニルメチル）－２－（チオ）ウラシル、５（メトキシカルボニル－メチル）ウラシル、５（プロピニル）ウラシル、５（プロピニル）ウラシル、５（トリフルオロメチル）ウラシル、６（アゾ）ウラシル、ジヒドロウラシル、Ｎ３（メチル）ウラシル、５－ウラシル（すなわち、シュードウラシル）、２（チオ）シュードウラシル、４（チオ）シュードウラシル、２，４－（ジチオ）シュードウラシル、５－（アルキル）シュードウラシル、５－（メチル）シュードウラシル、５－（アルキル）－２－（チオ）シュードウラシル、５－（メチル）－２－（チオ）シュードウラシル、５－（アルキル）－４（チオ）シュードウラシル、５－（メチル）－４（チオ）シュードウラシル、５－（アルキル）－２，４（ジチオ）シュードウラシル、５－（メチル）－２，４（ジチオ）シュードウラシル、１置換シュードウラシル、１置換２（チオ）－シュードウラシル、１置換４（チオ）シュードウラシル、１置換２，４－（ジチオ）シュードウラシル、１（アミノカルボニルエチレニル）－シュードウラシル、１（アミノカルボニルエチレニル）－２（チオ）－シュードウラシル、１（アミノカルボニルエチレニル）－４（チオ）シュードウラシル、１（アミノカルボニルエチレニル）－２，４－（ジチオ）シュードウラシル、１（アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル）－シュードウラシル、１（アミノアルキルアミノ－カルボニルエチレニル）－２（チオ）－シュードウラシル、１（アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル）－４（チオ）シュードウラシル、１（アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル）－２，４－（ジチオ）シュードウラシル、１，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェノキサジン－１－イル、１－（アザ）－２－（チオ）－３－（アザ）－フェノキサジン－１－イル、１，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェンチアジン－１－イル、１－（アザ）－２－（チオ）－３－（アザ）－フェンチアジン－１－イル、７－置換１，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェノキサジン－１－イル、７－置換１－（アザ）－２－（チオ）－３－（アザ）－フェノキサジン－１－イル、７－置換１，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェンチアジン－１－イル、７－置換１－（アザ）－２－（チオ）－３－（アザ）－フェンチアジン－１－イル、７－（アミノアルキルヒドロキシ）－１，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェノキサジン－１－イル、７－（アミノアルキルヒドロキシ）－１－（アザ）－２－（チオ）－３－（アザ）－フェノキサジン－１－イル、７－（アミノアルキルヒドロキシ）－１，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェンチアジン－１－イル、７－（アミノアルキルヒドロキシ）－１－（アザ）－２－（チオ）－３－（アザ）－フェンチアジン－１－イル、７－（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）－１，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェノキサジン－１－イル、７－（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）－１－（アザ）－２－（チオ）－３－（アザ）－フェノキサジン－１－イル、７－（グアニジニウムアルキル－ヒドロキシ）－１，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェンチアジン－１－イル、７－（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）－１－（アザ）－２－（チオ）－３－（アザ）－フェンチアジン－１－イル、１，３，５－（トリアザ）－２，６－（ジオキサ）－ナフタレン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌブラリン（ｎｕｂｕｌａｒｉｎｅ）、ツベルシジン、イソグアニシン（ｉｓｏｇｕａｎｉｓｉｎｅ）、イノシニル、２－アザ－イノシニル、７－デアザ－イノシニル、ニトロイミダゾリル、ニトロピラノゾリル、ニトロベンズイミダゾリル、ニトロインダゾリル、アミノインドリル、ピロロピリミジニル、３－（メチル）イソカルボスチリリル、５－（メチル）イソカルボスチリリル、３－（メチル）－７－（プロピニル）イソカルボスチリリル、７－（アザ）インドリル、６－（メチル）－７－（アザ）インドリル、イミダゾピリジニル、９－（メチル）－イミダゾピリジニル、ピロロピリジニル（ｐｙｒｒｏｌｏｐｙｒｉｚｉｎｙｌ）、イソカルボスチリリル、７－（プロピニル）イソカルボスチリリル、プロピニル－７－（アザ）インドリル、２，４，５－（トリメチル）フェニル、４－（メチル）インドリル、４，６－（ジメチル）インドリル、フェニル、ナフタレニル、アントラセニル、フェナントラセニル、ピレニル、スチルベニル、テトラセニル、ペンタセニル、ジフルオロトリル、４－（フルオロ）－６－（メチル）ベンズイミダゾール、４－（メチル）ベンズイミダゾール、６－（アゾ）チミン、２－ピリジノン、５ニトロインドール、３ニトロピロール、６－（アザ）ピリミジン、２（アミノ）プリン、２，６－（ジアミノ）プリン、５置換ピリミジン、Ｎ２－置換プリン、Ｎ６－置換プリン、Ｏ６－置換プリン、置換１，２，４－トリアゾール、ピロロ－ピリミジン－２－オン－３－イル、６－フェニル－ピロロ－ピリミジン－２－オン－３－イル、パラ－置換－６－フェニル－ピロロ－ピリミジン－２－オン－３－イル、オルト－置換－６－フェニル－ピロロ－ピリミジン－２－オン－３－イル、ビス－オルト－置換－６－フェニル－ピロロ－ピリミジン－２－オン－３－イル、パラ－（アミノアルキルヒドロキシ）－６－フェニル－ピロロ－ピリミジン－２－オン－３－イル、オルト－（アミノアルキルヒドロキシ）－６－フェニル－ピロロ－ピリミジン－２－オン－３－イル、ビス－オルト－（アミノアルキルヒドロキシ）－６－フェニル－ピロロ－ピリミジン－２－オン－３－イル、ピリドピリミジン－３－イル、２－オキソ－７－アミノ－ピリドピリミジン－３－イル、２－オキソ－ピリドピリミジン－３－イル、またはそれらのあらゆるＯ－アルキル化またはＮ－アルキル化誘導体を含む。修飾ヌクレオシドはまた複合体化成分、例えば、リガンドを含む天然塩基も包含する。本明細書において上で論じたように、修飾ヌクレオシドを含有するＲＮＡは宿主細胞内で翻訳可能でなくてはならない（すなわち、その修飾型ＲＮＡがコードするポリペプチドの翻訳を妨げない）。例えば、ｓ２Ｕおよびｍ６Ａを含有する転写物はウサギ網状赤血球溶解物ではほとんど翻訳されないが、一方、シュードウリジン、ｍ５Ｕおよびｍ５Ｃは効率的な翻訳に適合する。さらに、転写物のヌクレアーゼ耐性を上昇させるのに有用な２'－フルオロ－修飾型塩基によって翻訳が非常に非効率的になることが当技術分野において公知である。当業者は、例えば、ウサギ網状赤血球溶解物翻訳アッセイを用いて翻訳を分析することができる。
さらなる修飾核酸塩基には米国特許第３，６８７，８０８号に開示されるもの、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ， Ｐ． ｅｄ． Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ， ２００８に開示されるもの、２００９年３月２６日に提出された国際特許出願番号第ＵＳ０９／０３８４２５号に開示されるもの、Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ８５８～８５９ページ， Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ， Ｊ． Ｌ， ｅｄ． Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， １９９０に開示されるもの、およびＥｎｇｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ， Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ， １９９１， ３０， ６１３に開示されるものが含まれる。
上記の修飾核酸塩基ならびに他の修飾核酸塩基のうちのある特定のものの調製を教示する代表的な米国特許には上記の米国特許第３，６８７，８０８号ならびに米国特許第４，８４５，２０５号、第５，１３０，３０号、第５，１３４，０６６号、第５，１７５，２７３号、第５，３６７，０６６号、第５，４３２，２７２号、第５，４５７，１８７号、第５，４５７，１９１号、第５，４５９，２５５号、第５，４８４，９０８号、第５，５０２，１７７号、第５，５２５，７１１号、第５，５５２，５４０号、第５，５８７，４６９号、第５，５９４，１２１号、第５，５９６，０９１号、第５，６１４，６１７号、第５，６８１，９４１号、第６，０１５，８８６号、第６，１４７，２００号、第６，１６６，１９７号、第６，２２２，０２５号、第６，２３５，８８７号、第６，３８０，３６８号、第６，５２８，６４０号、第６，６３９，０６２号、第６，６１７，４３８号、第７，０４５，６１０号、第７，４２７，６７２号、および第７，４９５，０８８号が含まれるが、これらに限定されず、それらのそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれ、および、米国特許第５，７５０，６９２号もまた全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載される合成修飾型ＲＮＡに関して使用される別の修飾は、そのＲＮＡの活性、細胞内分布または細胞取込を増強する１つ以上のリガンド、成分または複合化物のＲＮＡへの化学結合を含む。リガンドは、例えば、合成修飾型ＲＮＡがインビボで投与される場合、特に有用であり得る。そのような成分には、コレステロール成分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃｉｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， １９８９， ８６： ６５５３～６５５６，その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔ．， １９９４， ４：１０５３～１０６０，その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、チオエーテル、例えば、ベリル－Ｓ－トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， １９９２， ６６０：３０６～３０９、Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔ．， １９９３， ３：２７６５～２７７０，それらのそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １９９２， ２０：５３３～５３８，その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオール残基またはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ－Ｂｅｈｍｏａｒａｓ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ， １９９１， １０：１１１１～１１１８、Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．， １９９０， ２５９：３２７～３３０、Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ， １９９３， ７５：４９～５４，それらのそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる）、リン脂質、例えば、ジ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロールまたはトリエチル－アンモニウム１，２－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロ－３－ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．， １９９５， ３６：３６５１～３６５４、Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １９９０， １８：３７７７～３７８３，それらのそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる）、ポリアミン鎖またはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ， １９９５， １４：９６９～９７３，その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．， １９９５， ３６：３６５１～３６５４，その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、パルミチル成分（Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ， １９９５， １２６４：２２９～２３７，その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、またはオクタデシルアミン成分またはヘキシルアミノ－カルボニルオキシコレステロール成分（Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒ．， １９９６， ２７７：９２３～９３７，その全体が参照により本明細書に組み込まれる）などの脂質成分が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書に記載される合成修飾型ＲＮＡは５'キャップをさらに含むことができる。本明細書に記載される態様のいくつかの実施形態では、合成修飾型ＲＮＡは、５'－５'トリホスフェート結合を用いてＲＮＡ分子の５'末端に結合する修飾グアニンヌクレオチドを含む５'キャップを包含する。本明細書において使用される場合、「５'キャップ」という用語には、例えば、５'ジグアノシンキャップ、メチレン－ビス（ホスホネート）成分を有するテトラホスフェートキャップ類似体（例えば、Ｒｙｄｚｉｋ， ＡＭ ｅｔ ａｌ．， （２００９） Ｏｒｇ Ｂｉｏｍｏｌ Ｃｈｅｍ ７（２２）：４７６３～７６を参照のこと）、ホスホロチオエート修飾を有するジヌクレオチドキャップ類似体（例えば、Ｋｏｗａｌｓｋａ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．， （２００８） ＲＮＡ １４（６）：１１１９～１１３１を参照のこと）、非架橋酸素の代わりにイオウ置換を有するキャップ類似体（例えば、Ｇｒｕｄｚｉｅｎ－Ｎｏｇａｌｓｋａ， Ｅ． ｅｔ ａｌ．， （２００７） ＲＮＡ １３（１０）： １７４５～１７５５を参照のこと）、Ｎ７－ベンジル化ジヌクレオシドテトラホスフェート類似体（例えば、Ｇｒｕｄｚｉｅｎ， Ｅ． ｅｔ ａｌ．， （２００４） ＲＮＡ １０（９）：１４７９～１４８７を参照のこと）、または抗リバースキャップ類似体（例えば、Ｊｅｍｉｅｌｉｔｙ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．， （２００３） ＲＮＡ ９（９）： １１０８～１１２２ ａｎｄ Ｓｔｅｐｉｎｓｋｉ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．， （２００１） ＲＮＡ ７（１０）：１４８６～１４９５を参照のこと）を含む、他の５'キャップ類似体を包含することも意図されている。１つのそのような実施形態では、５'キャップ類似体は５'グアノシンキャップである。いくつかの実施形態では、合成修飾型ＲＮＡは５'三リン酸を含まない。
５'キャップは翻訳を開始するためのｍＲＮＡの認識とリボソームへの結合に重要である。５'キャップはまた５'エクソヌクレアーゼ介在性分解から合成修飾型ＲＮＡを保護する。合成修飾型ＲＮＡが５'キャップを含むことは絶対条件ではなく、したがって他の実施形態では、合成修飾型ＲＮＡは５'キャップを持たない。しかしながら、５'キャップを含む合成修飾型ＲＮＡの比較的長い半減期と翻訳効率の上昇のため、５'キャップを含む合成修飾型ＲＮＡが本明細書において好ましい。
本明細書に記載される合成修飾型ＲＮＡは５'および／または３'非翻訳領域（ＵＴＲ）をさらに含むことができる。非翻訳領域は開始コドン（５'）の前および終止コドン（３'）の後のＲＮＡの領域であり、それ故、翻訳機構によって翻訳されない。１つ以上の非翻訳領域によるＲＮＡ分子の修飾は、非翻訳領域がリボヌクレアーゼおよびＲＮＡ分解に関与する他のタンパク質に干渉することができるので、ｍＲＮＡの安定性を向上することができる。さらに、５'非翻訳領域および／または３'非翻訳領域によるＲＮＡの修飾は、ｍＲＮＡへのリボソームの結合を変化させる結合タンパク質によって翻訳効率を向上させることができる。ＲＮＡの３'ＵＴＲによる修飾はそのＲＮＡの細胞質内局在を維持し、その細胞の細胞質において翻訳が起こるようにするために使用することができる。１つの実施形態では、本明細書に記載される合成修飾型ＲＮＡは５'ＵＴＲまたは３'ＵＴＲを含まない。別の実施形態では、合成修飾型ＲＮＡは５'ＵＴＲまたは３'ＵＴＲのどちらかを含む。別の実施形態では、本明細書に記載される合成修飾型ＲＮＡは５'ＵＴＲおよび３'ＵＴＲの両方を含む。１つの実施形態では、５'ＵＴＲおよび／または３'ＵＴＲは細胞内で高い安定性を有することが知られているｍＲＮＡから選択される（例えば、マウスα－グロビン３'ＵＴＲ）。いくつかの実施形態では、５'ＵＴＲ、３'ＵＴＲ、またはそれらの両方が１つ以上の修飾ヌクレオシドを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される合成修飾型ＲＮＡはコザック配列をさらに含む。「コザック配列」は、開始コドン（ＡＵＧ）の３塩基上流のＲがプリン（アデニンまたはグアニン）であり、その開始コドンにもう一つの「Ｇ」が続く、（ｇｃｃ）ｇｃｃＲｃｃＡＵＧＧというコンセンサスを有する真核生物のｍＲＮＡ上の配列を指す。コザックコンセンサス配列はポリペプチドの翻訳を開始するためにリボソームによって認識される。通常、翻訳開始は、転写物の５'末端の近位にある、翻訳機構が遭遇した最初のＡＵＧコドンで起こる。しかしながら、いくつかの事例では、このＡＵＧコドンは読みもらし（ｌｅａｋｙ ｓｃａｎｎｉｎｇ）と呼ばれる過程においてバイパスされることがある。そのＡＵＧコドンの近くにコザック配列が存在することで翻訳開始部位としてそのコドンが強化され、正確なポリペプチドの翻訳が起こる。さらに、開始コドンについてあいまいさがなかったとしても、合成修飾型ＲＮＡへのコザック配列の付加により効率的な翻訳が促進される。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載される合成修飾型ＲＮＡは、正確な長さのポリペプチドを作製するために、所望の翻訳開始部位にコザックコンセンサス配列をさらに含む。いくつかのそのような実施形態では、コザック配列は１つ以上の修飾ヌクレオシドを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される合成修飾型ＲＮＡは「ポリ（Ａ）テール」をさらに含み、ポリ（Ａ）テールはアデニンヌクレオチドからなるホモポリマーの３'尾部を指し、その長さは様々であり得（例えば、少なくとも５アデニンヌクレオチド）、そして、最大で数百アデニンヌクレオチドであり得る）。３'ポリ（Ａ）テールを含むことにより合成修飾型ＲＮＡを細胞内での分解から保護することができ、そして、それはまた核外局在を促進して翻訳効率を向上させる。いくつかの実施形態では、ポリ（Ａ）テールは１と５００の間のアデニンヌクレオチドを含み；他の実施形態では、ポリ（Ａ）テールは少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも１６０、少なくとも１７０、少なくとも１８０、少なくとも１９０、少なくとも２００、少なくとも２２５、少なくとも２５０、少なくとも２７５、少なくとも３００、少なくとも３２５、少なくとも３５０、少なくとも３７５、少なくとも４００、少なくとも４２５、少なくとも４５０、少なくとも４７５、少なくとも５００のアデニンヌクレオチドまたはそれ以上のアデニンヌクレオチドを含む。１つの実施形態では、ポリ（Ａ）テールは１と１５０の間のアデニンヌクレオチドを含む。別の実施形態では、ポリ（Ａ）テールは９０と１２０の間のアデニンヌクレオチドを含む。いくつかのそのような実施形態では、ポリ（Ａ）テールは１つ以上の修飾ヌクレオシドを含む。
本明細書に記載される合成修飾型ＲＮＡに対する１つ以上の修飾によって、細胞または組織における合成修飾型ＲＮＡのインビボでの安定性がより高くなることが意図される。そのような修飾が翻訳を許容し、その修飾を有する合成修飾型ＲＮＡに対する細胞の自然免疫応答またはインターフェロン応答を低下させるか、激化させない限り、そのような修飾が本明細書において使用されることが具体的に企図される。一般に、合成修飾型ＲＮＡの安定性が高いほど、より多くのタンパク質がその合成修飾型ＲＮＡから作製され得る。通常、哺乳類ｍＲＮＡのＡＵに富む領域の存在は、転写物のポリ（Ａ）テールの除去を促進するために細胞内タンパク質がＡＵに富む領域にリクルートされるので、その転写物を不安定化する傾向がある。合成修飾型ＲＮＡのポリ（Ａ）テールの除去はＲＮＡ分解を上昇させることになり得る。したがって、１つの実施形態では、本明細書に記載される合成修飾型ＲＮＡはＡＵに富む領域を含まない。とりわけ、３'ＵＴＲがＡＵＵＵＡ配列エレメントを実質的に持たないことが好ましい。
１つの実施形態では、リガンドは、それが組み込まれている合成修飾型ＲＮＡの細胞取込、細胞内標的化または半減期を変化させる。いくつかの実施形態では、リガンドは、例えば、そのようなリガンドが無い組成物と比較して、選択された標的組織、例えば、組織または細胞種、または細胞内区画、例えば、ミトコンドリア、細胞質、ペルオキシソーム、リソソームへの上昇した親和性を提供する。好ましいリガンドは合成修飾型ＲＮＡからのポリペプチドの発現に干渉することがない。
リガンドには、例えば、タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、またはグロブリン）、炭水化物（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリンまたはヒアルロン酸）、または脂質などの天然物質が含まれ得る。そのリガンドは合成高分子、例えば、合成ポリアミノ酸などの組換え分子または合成分子でもあり得る。ポリアミノ酸の例にはポリリジン（ＰＬＬ）、ポリＬアスパラギン酸、ポリＬ－グルタミン酸、スチレン－マレイン酸無水物共重合体、ポリ（Ｌ－ラクチド－ｃｏ－グリコリード（ｇｌｙｃｏｌｉｅｄ））共重合体、ジビニルエーテル－マレイン酸無水物共重合体、Ｎ－（２－ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド共重合体（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２－エチルアクリル酸）、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド重合体、またはポリホスファジンが挙げられる。ポリアミンの例にはポリエチレンイミン、ポリリジン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、シュードペプチド－ポリアミン、ペプチド模倣性ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、陽イオン性脂質、陽イオン性ポルフィリン、ポリアミンの第４級塩、またはαヘリカルペプチドが挙げられる。
リガンドには標的化基、例えば、線維芽細胞などの特定の細胞種に結合する細胞標的化作用物質もしくは組織標的化作用物質（例えば、レクチン、糖タンパク質、脂質またはタンパク質）、または抗体も含まれ得る。いくつかの実施形態では、標的細胞が内皮細胞である場合、内皮細胞標的化作用物質はｖＷＦタンパク質またはその断片である。いくつかの実施形態では、本明細書において開示される方法において有用である他の標的化基は、中でも、例えば、チロトロピン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、サーファクタントタンパク質Ａ、ムチン糖鎖、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチル－グルコサミン、多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸、ビタミンＢ１２、ビオチン、またはＲＧＤペプチドまたはＲＧＤペプチド模倣物であり得る。
リガンドの他の例には、色素、インターカレート剤（例えば、アクリジン類）、架橋剤（例えば、ソラーレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン類（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サッフィリン（Ｓａｐｐｈｙｒｉｎ））、多環芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えば、ＥＤＴＡ）、親油性分子ｓ、例えば、コレステロール、コール酸、アダマンタン酸、１－ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３－ビス－Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３－プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチル酸、Ｏ３－（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３－（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン）およびペプチド複合化物（例えば、アンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ－４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射性標識マーカー、酵素、ハプテン（例えば、ビオチン）、および輸送／吸収促進剤（例えば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）が挙げられる。
リガンドはタンパク質、例えば、糖タンパク質、またはペプチド、例えば、共リガンドに対して特定の親和性を有する分子、または抗体、例えば、線維芽細胞、またはポリペプチドの産生に有用である他の細胞などの特定の細胞種に結合する抗体であり得る。リガンドにはホルモンおよびホルモン受容体も含まれ得る。それらには、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補因子、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチル－グルコサミン多価マンノース、または多価フコースなどの非ペプチド種も含まれ得る。
前記リガンドは物質、例えば、薬物であり得、その薬物は、例えば、細胞の細胞骨格を破壊することにより、例えば、細胞の微小管、微小フィラメントおよび／または中間径フィラメントを破壊することにより、その細胞への合成修飾型ＲＮＡまたはそれの組成物の取込を増加させることができる。その薬物は、例えば、タキソール、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャプラキノリド（ｊａｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅ）、ラトランクリンＡ、ファロイジン、スウィンホリドＡ、インダノシン（ｉｎｄａｎｏｃｉｎｅ）、またはミオセルビン（ｍｙｏｓｅｒｖｉｎ）であり得る。
１つの例示的なリガンドは脂質または脂質系分子である。脂質または脂質系リガンドは（ａ）分解耐性を上昇させることができ、および／または（ｂ）標的の細胞または細胞膜への標的化または輸送を増大させることができる。脂質系リガンドは、例えば、修飾型ＲＮＡ組成物の標的細胞への結合を調節するために使用することができる。
別の態様では、リガンドは成分、例えば、ビタミンであり、それは宿主細胞によって取り込まれる。例となるビタミンにはビタミンＡ、Ｅ、およびＫが含まれる。他の例となるビタミンにはビタミンＢ、例えば、葉酸、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサール、または例えば、癌細胞によって取り込まれる他のビタミンもしくは栄養素が含まれる。ＨＳＡおよび低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）も含まれる。
別の態様では、前記リガンドは細胞透過作用物質、好ましくはヘリカル細胞透過作用物質である。好ましくは、該作用物質は両親媒性である。例となる作用物質はｔａｔまたはアンテノペディア（ａｎｔｅｎｎｏｐｅｄｉａ）などのペプチドである。該作用物質がペプチドである場合、それは、修飾することができ、ペプチジル模倣物、逆転異性体、非ペプチドまたはシュード－ペプチド結合、およびＤ－アミノ酸の使用を含む。該ヘリカル作用物質はαヘリカル作用物質であることが好ましく、それは親油性と疎油性の相を有することが好ましい。
いくつかの実施形態では、「細胞透過ペプチド」という用語は細胞、例えば、ヒト細胞などの哺乳類細胞に透過することができ、ならびに、血液脳関門を透過するペプチドである。細胞透過ペプチドは当技術分野において周知であり、それには、例えば、αヘリカル直鎖状ペプチド（例えば、ＬＬ－３７またはセロピン（Ｃｅｒｏｐｉｎ）Ｐ１）、ジスルフィド結合含有ペプチド（例えば、α－ディフェンシン、β－ディフェンシンまたはバクテネクチン）、または１種類もしくは２種類の支配的なアミノ酸しか含まないペプチド（例えば、ＰＲ－３９またはインドリシジン）、ならびにＨＩＶ－１のｇｐ４１とＳＶ４０ラージＴ抗原のＮＬＳからなる融合ペプチドドメインに由来するＭＰＧ（Ｓｉｍｅｏｎｉｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３１：２７１７～２７２４， ２００３）などの二連両親媒性ペプチドが含まれるが、これらに限定されない。
合成修飾型ＲＮＡの合成
本明細書に記載される合成修飾型ＲＮＡは、ここで全体の参照により本明細書に組み込まれる"Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ"， Ｂｅａｕｃａｇｅ， Ｓ．Ｌ． ｅｔ ａｌ． （Ｅｄｒｓ．）， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ， ＵＳＡに記載される方法のような当技術分野においてよく確立されている方法によって合成および／または修飾することができる。転写方法は本明細書の実施例においてさらに説明される。
本明細書に記載される態様の１つの実施形態では、合成修飾型ＲＮＡの鋳型は「スプリント介在性ライゲーション」を用いて合成され、スプリント介在性ライゲーションによってＤＮＡコンストラクトの迅速な合成が長鎖オリゴヌクレオチドやｄｓＤＮＡ ＰＣＲ産物の制御されたコンカテマー化により、連結領域に制限部位を導入する必要なく、可能となる。それは、Ｔ７鋳型生成の間に一般的な非翻訳領域（ＵＴＲ）を遺伝子のコード配列に付加するために使用することができる。スプリント介在性ライゲーションは、オープンリーディングフレームに核局在化配列を付加するため、および野生型のオープンリーディングフレームから点突然変異を有するドミナントネガティブなコンストラクトを作製するために使用することもできる。簡単に説明すると、一本鎖ＤＮＡコンポーネントおよび／または変性したｄｓＤＮＡコンポーネントをアニールして、所望の末端を接続しているスプリントオリゴヌクレオチドにし、その末端を耐熱性ＤＮＡリガーゼによりライゲーションし、そして、所望のコンストラクトをＰＣＲにより増幅する。その後、合成修飾型ＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼを使用してその鋳型からインビトロで合成される。合成修飾型ＲＮＡの合成が完了した後、使用前に鋳型ＤＮＡを転写反応から本明細書に記載される方法を用いて除去する。
これらの態様のいくつかの実施形態では、合成修飾型ＲＮＡはアルカリホスファターゼでさらに処理される。
複数の合成修飾型ＲＮＡ
本明細書に記載される態様のいくつかの実施形態では、複数の異なる合成修飾型ＲＮＡがインビボで標的組織、例えば、筋肉組織または心臓組織と接触し、または、それに導入され、そして、所望の標的組織における少なくとも２つのポリペプチド産物の発現が可能となる。いくつかの実施形態では、本明細書において開示される合成修飾型ＲＮＡ組成物は２つ以上の合成修飾型ＲＮＡ、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の合成修飾型ＲＮＡを含むことができる。いくつかの実施形態では、２つ以上の合成修飾型ＲＮＡは所望のポリペプチド産物（例えば、転写因子、細胞表面マーカー、細胞死受容体など）の発現を上昇させることができる。いくつかの実施形態では、組成物が心血管系の疾患または障害の治療のために使用される場合、その組成物はＶＥＧＦをコードするＭＯＤ－ＲＮＡと異なる心臓増強タンパク質をコードする少なくとも１つの他のＭＯＤ－ＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態では、複数の異なる合成修飾型ＲＮＡ、合成修飾型ＲＮＡ組成物、または複数の異なる合成修飾型ＲＮＡを含む培地が所望のセットのポリペプチドの発現を調節するために使用されるとき、その複数の合成修飾型ＲＮＡを同時または連続してインビボで標的組織と接触させる、またはそれに導入することができる。他の実施形態では、その複数の合成修飾型ＲＮＡを別々にインビボで標的組織と接触させる、またはそれに導入することができる。さらに、各合成修飾型ＲＮＡはその特有の投与計画に従ってインビボで標的組織に投与され得る。例えば、１つの実施形態では、組成物は、インビボで標的組織と接触させる複数の合成修飾型ＲＮＡを、該複数の合成修飾型ＲＮＡが同時に投与されるように、様々な相対量で、または等量で含んで調製され得る。あるいは、１回に１つの合成修飾型ＲＮＡをインビボで標的組織に（例えば、連続して）投与することができる。このように、それぞれの目的のポリペプチドにとって望ましいインビボでの発現は、投与する特定の合成修飾型ＲＮＡの投与頻度や量を変えることによって、容易に調整することができる。標的組織をインビボで各合成修飾型ＲＮＡと別々に接触させることにより、インビボタンパク質発現の効率を低下させ得る合成修飾型ＲＮＡ間の相互作用を防ぐこともできる。使いやすさのために、および、汚染混入を防ぐために、インビボで異なる合成修飾型ＲＮＡからなるカクテルを標的組織に投与し、またはそれと標的組織を接触させ、それにより必要な投薬の回数を減少させ、標的組織へのインビボでの汚染混入の導入の機会を最小化することが好ましい。
本明細書に記載される方法および組成物により、１つ以上のポリペプチドのインビボタンパク質発現が、形質移入される各合成修飾型ＲＮＡの量を変えることにより所望のレベルに調整されることが可能となる。当業者は、合成修飾型ＲＮＡよってコードされるタンパク質のインビボ発現のレベルを、例えば、ウェスタンブロッティング技術または免疫細胞化学技術を用いて容易にモニターすることができる。合成修飾型ＲＮＡは、所望のレベルのインビボタンパク質発現を可能とする頻度と用量で標的組織にインビボで投与され得る。本明細書の実施例において開示されるように、インビボで投与されるＭＯＤ－ＲＮＡの量がインビボタンパク質発現の量を決定し、それ故、発現するタンパク質の量は標的組織にインビボ投与されたＭＯＤ－ＲＮＡの量に基づいて制御され得る。したがって、それぞれ異なる合成修飾型ＲＮＡは、インビボでの標的組織での適切な発現を可能にするためにその特有の用量で投与され得る。さらに、インビボで標的組織に投与される合成修飾型ＲＮＡは一時的な性質である（すなわち、時間経過と共に分解する）ので、当業者は、さらなる形質移入を停止し、組織が時間経過と共に合成修飾型ＲＮＡを分解することを許容することにより、合成修飾型ＲＮＡからのインビボタンパク質発現を容易に除去または停止することができる。合成修飾型ＲＮＡは細胞性ｍＲＮＡと同様な方式で分解する。
細胞への合成修飾型ＲＮＡの導入
合成修飾型ＲＮＡは、インビボで標的組織、例えば、筋肉組織または心臓組織へ、例えば、筋原細胞、または心筋細胞への送達のために、合成修飾型ＲＮＡがコードするポリペプチドのインビボ発現が起こるように合成修飾型ＲＮＡの細胞内送達を達成するあらゆる方法で導入することができる。本明細書において使用される場合、「細胞を形質移入すること」という用語は、当業者が理解するように、組織への取込または吸収を促進または達成する手段を用いる、その組織の細胞への核酸の導入の過程を指す。その用語が本明細書において使用される場合、「形質移入」はベクターが介在する遺伝子送達、例えば、ウイルス性またはウイルス粒子に基づく送達方法は包含しない。合成修飾型ＲＮＡのインビボでの組織への吸収または取込は、自発的な拡散過程もしくは能動的細胞過程を介して、または補助剤もしくは補助装置によって起こり得る。さらなるアプローチは本明細書の以下に記載される、または当技術分野において公知である。
いくつかの実施形態では、合成修飾型ＲＮＡは標的組織、例えば、筋肉または心臓、例えば、筋原細胞へ、例えば、形質移入、ヌクレオフェクション、リポフェクション、電気穿孔法（例えば、Ｗｏｎｇ ａｎｄ Ｎｅｕｍａｎｎ， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． １０７：５８４～８７ （１９８２）を参照のこと）、マイクロインジェクション（例えば、合成修飾型ＲＮＡの直接注入）、遺伝子銃、細胞融合などによって導入することができる。
本明細書において、ＭＯＤ－ＲＮＡは組織、例えば、心臓および筋肉組織にＭｅｇａ Ｔｒａｎ１．０形質移入試薬（ＯｒｉＧｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）を使用してインビボで導入された。あるいは、本明細書において、ＭＯＤ－ＲＮＡは組織、例えば、心臓および筋肉組織にリポフェクタミン（ＲＮＡｉ ＭＡＸ）を使用してインビボで導入された。送達するＭＯＤ－ＲＮＡの濃度を最適にすることができるが、１つの実施形態では、発明者らは約１００μｇのＭＯＤ－ＲＮＡの組織へのインビボでの送達のために２５μｇ／μｌの濃度を用いた。
別の実施形態では、合成修飾型ＲＮＡは、ナノ粒子、デンドリマー、ヒドロゲル、バイオポリマー、ポリマー、リポソーム、または陽イオン性送達システムなどの薬物送達系を用いて送達することができる。正に帯電した陽イオン性送達システムは（負に帯電したポリヌクレオチドである）合成修飾型ＲＮＡの結合を促進し、また、負に帯電した細胞膜での相互作用を増強して効率的な細胞取込を可能とする。陽イオン性の脂質、デンドリマー、またはポリマーは修飾型ＲＮＡに結合することができるか、または誘導されて修飾型ＲＮＡを包む小胞もしくはミセルを形成することができる（例えば、Ｋｉｍ ＳＨ．， ｅｔ ａｌ （２００８） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １２９（２）：１０７～１１６を参照のこと）。陽イオン性修飾型ＲＮＡ複合体の作製方法および使用方法は十分に当業者の能力の範囲内である（例えば、Ｓｏｒｅｎｓｅｎ， ＤＲ．， ｅｔ ａｌ （２００３） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ ３２７：７６１～７６６、Ｖｅｒｍａ， ＵＮ．， ｅｔ ａｌ （２００３） Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ９：１２９１～１３００、Ａｒｎｏｌｄ， ＡＳ ｅｔ ａｌ （２００７） Ｊ． Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ． ２５：１９７～２０５を参照のこと。それらは全体の参照により本明細書に組み込まれる）。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＭＯＤ－ＲＮＡは、Ｈｕｂｂｅｌｌらの米国特許第５，４１０，０１６号に記載されるものなどの、生物分解性高分子ヒドロゲルに含まれ得る。これらの高分子ヒドロゲルは、対象に送達さすることができ、その高分子が分解するにつれ、時間経過と共に活性化合物が放出される。市販のヒドロゲルは、適切な量の水性ベヒクル中での分散の後に投与することを意図して、乾燥粉末または部分的に水和したペーストのどちらかで供給され得る。これらの粉末は、米国薬局方（Ｕ．Ｓ．Ｐ．）の吸収性ゼラチンスポンジ（例えば、Ｐｆｉｚｅｒ，Ｉｎｃ．のＧｅｌｆｏａｍ（登録商標）またはＥｔｈｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．のＳｕｒｇｉｆｏａｍ（商標））、または典型的な化学架橋処理もしくは加熱脱水架橋処理の間に形成されるケーク（例えば、米国特許第６，０６３，０６１号、米国特許出願公開第２００３／００６４１０９号を参照のこと）などの架橋マトリックスの機械的破砕により形成される。これらのヒドロゲルはゼラチン、コラーゲン、デキストラン、キトサンに基づくことができる。他の組成物、例えば、アルギン酸（米国特許第５，２９４，４４６号）、ならびにポリホスファラジン、ポリアクリレート、ポリアンヒドリドおよびポリオルトエステルなどの合成ポリマー、ならびにポリエチレンオキシドとポリプロピレングリコールの混合物などの「ブロック共重合体」（米国特許第５，０４１，１３８号、同第５，７０９，８５４号、同第５，７３６，３７２号）もまた使用される。さらに、米国特許第５，７４９，８７４号および同第５，７６９，８９９号（両方ともＳｃｈｗａｒｔｚ ｅｔ ａｌ， １９９８）は二成分移植物を開示しており、ここで第１の要素は定着デバイスであり、硬いが生物分解性である物質（ポリグリコール酸、ポリ乳酸、またはそれらの組合せなど）から作製されており、それはヒドロゲル移植物の固定に役立ち、第２の要素はより多孔性で柔軟なマトリックスを含む。
ヒドロゲルは乾燥、部分水和または完全水和の状態で投与することができる。完全水和状態では、ヒドロゲルは液体をさらに吸収することができず、そして、完全に膨潤した大きさである。対照的に、乾燥ヒドロゲル組成物または部分水和ヒドロゲル組成物は過剰な吸着能を有する。投与されると、乾燥ヒドロゲルまたは部分水和ヒドロゲルは液体を吸収し、インビボでゼラチンマトリックスからなる膨潤になる。乾燥ヒドロゲルまたは部分水和ヒドロゲルの膨潤は投与との関連で考慮されるべきである。好ましい場合は、高分子ヒドロゲルは中で分散している活性化合物を含むミクロ粒子またはリポソームを有することができ、本明細書に記載されるＭＯＤ－ＲＮＡまたはペプチドをコードする核酸の制御放出のための別の機序を提供する。
本明細書に記載される態様のいくつかの実施形態では、前記組成物は、乳剤、リポソーム、陽イオン性脂質、非陽イオン性脂質、陰イオン性脂質、荷電脂質、浸透増強剤など、合成修飾型ＲＮＡの細胞への取込を促進する試薬（形質移入試薬）、または代わりに、合成修飾型ＲＮＡに対する、例えば、リガンド、ペプチド、親油性基、もしくは標的化成分を結合するための修飾をさらに含む。
合成修飾型ＲＮＡの細胞への送達のための処理は必然的に、選択されている形質移入のための特定のアプローチに左右される。１つの好ましいアプローチは、陽イオン性形質移入試薬（以下を参照のこと）と複合体化したＲＮＡを、その細胞用の細胞培養培地へ直接添加することである。
第１合成修飾型ＲＮＡおよび第２合成修飾型ＲＮＡを別々に、異なるタイミングで投与することが本明細書において企図される。したがって、複数の合成修飾型ＲＮＡのそれぞれが異なる時間または異なる頻度間隔で投与されてポリペプチドの所望の発現を達成することができる。通常、陽イオン性脂質介在性形質移入を用いて細胞当たり１００ｆｇ～１００ｐｇの合成修飾型ＲＮＡが投与される。陽イオン性脂質介在性形質移入は合成修飾型ＲＮＡの細胞質への送達に非常に非効率的であるので、他の技術はより少ないＲＮＡを必要とし得る。哺乳類細胞のトランスクリプトーム全体は約１ｐｇのｍＲＮＡを構成し、ポリペプチド（例えば、転写因子）は細胞当たり１ｆｇ未満の量で生理的効果を有することができる。
形質移入試薬
本明細書に記載される態様のある特定の実施形態では、合成修飾型ＲＮＡは形質移入またはリポフェクションにより標的組織へインビボで導入され得る。形質移入またはリポフェクションに適切な作用物質には、例えば、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストラン、リポフェクチン、リポフェクタミン、ＤＩＭＲＩＥ Ｃ（商標）、スーパーフェクト（Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ）（商標）およびエフェクチン（Ｅｆｆｅｃｔｉｎ）（商標）（Ｑｉａｇｅｎ（商標））、ユニフェクチン（ｕｎｉｆｅｃｔｉｎ）（商標）、マキシフェクチン（ｍａｘｉｆｅｃｔｉｎ）（商標）、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＧＳ（商標）（トランスフェクタム（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ）；ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン）、ＤＯＰＥ（１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン）、ＤＯＴＡＰ（１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン）、ＤＤＡＢ（ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド）、ＤＨＤＥＡＢ（Ｎ，Ｎ－ジ－ｎ－ヘキサデシル－Ｎ，Ｎ－ジヒドロキシエチルアンモニウムブロミド）、ＨＤＥＡＢ（Ｎ－ｎ－ヘキサデシル－Ｎ，Ｎ－ジヒドロキシエチルアンモニウムブロミド）、ポリブレン、ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）などが含まれるが、これらに限定されない（例えば、Ｂａｎｅｒｊｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ４２：４２９２～９９ （１９９９）； Ｇｏｄｂｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ６：１３８０～８８ （１９９９）、Ｋｉｃｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ５：８５５～６０ （１９９８）； Ｂｉｒｃｈａａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｈａｒｍ． １８３：１９５～２０７ （１９９９）を参照のこと）。本明細書において開示される実施例では、発明者らはＭｅｇａ Ｔｒａｎ１．０形質移入試薬（ＯｒｉＧｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）を使用してＭＯＤ－ＲＮＡを組織、例えば、心臓および筋肉組織にインビボで導入した。あるいは、いくつかの実施形態では、ＭＯＤ－ＲＮＡは、リポフェクタミン（ＲＮＡｉ ＭＡＸ）を使用して組織、例えば、心臓および筋肉組織にインビボで導入された。送達するＭＯＤ－ＲＮＡの濃度を最適にすることができるが、１つの実施形態では、発明者らは約１００μｇのＭＯＤ－ＲＮＡの組織へのインビボでの送達のために２５μｇ／μｌの濃度を用いた。
合成修飾型ＲＮＡは、本明細書において開示されるように、陽イオン性脂質担体（例えば、オリゴフェクタミン（商標））または非陽イオン性脂質系担体（例えば、Ｔｒａｎｓｉｔ－ＴＫＯＴＭ（商標）、Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ ＬＬＣ、マジソン、ウィスコンシン州）との複合体として標的組織にインビボで形質移入され得る。修飾型ＲＮＡの標的組織へのインビボでの導入の成功は様々な公知の方法を用いてモニターすることができる。例えば、本明細書において、標的組織のインビボでの一過性形質移入は本明細書において示されるように、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの蛍光マーカーなどのレポーターを使用して、または生物発光検出を用いるルシフェラーゼレポーターを使用して、またはβ－ｇａｌレポーターを使用して、ｃｒｅリコンビナーゼをコードするＭＯＤ－ＲＮＡで形質移入されているＣｒｅリコンビナーゼマウスモデルからシグナルとして示される。標的組織の修飾型ＲＮＡによるインビボでの形質移入の成功は目的のポリペプチドのタンパク質発現レベルを、例えば、ウェスタンブロッティングまたは免疫細胞化学により測定することによって、決定することもできる。
本明細書に記載される態様のいくつかの実施形態では、合成修飾型ＲＮＡは、形質移入試薬を使用して標的組織にインビボで導入される。いくつかの例示的な形質移入試薬には、例えば、リポフェクチン（Ｊｕｎｉｃｈｉら、米国特許第５，７０５，１８８号）などの陽イオン性脂質、陽イオン性グリセロール誘導体、およびポリリジン（Ｌｏｌｌｏら、ＰＣＴ出願公開第９７／３０７３１号）などのポリカチオン高分子が含まれる。市販の形質移入試薬の例には、例えば、中でも、リポフェクタミン（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カールスバード、カリフォルニア州）、リポフェクタミン２０００（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カールスバード、カリフォルニア州）、２９３フェクチン（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カールスバード、カリフォルニア州）、セルフェクチン（Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ）（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カールスバード、カリフォルニア州）、ＤＭＲＩＥ－Ｃ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カールスバード、カリフォルニア州）、フリースタイル（ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ）（商標）ＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カールスバード、カリフォルニア州）、リポフェクタミン（商標）２０００ＣＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カールスバード、カリフォルニア州）、リポフェクタミン（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カールスバード、カリフォルニア州）、ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カールスバード、カリフォルニア州）、オリゴフェクタミン（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カールスバード、カリフォルニア州）、オプチフェクト（Ｏｐｔｉｆｅｃｔ）（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カールスバード、カリフォルニア州）、Ｘ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ Ｑ２形質移入試薬（Ｒｏｃｈｅ；グレンザッハーシュトラッセ、スイス）、ＤＯＴＡＰリポソーム性形質移入試薬（グレンザッハーシュトラッセ、スイス）、ＤＯＳＰＥＲリポソーム性形質移入試薬（グレンザッハーシュトラッセ、スイス）、またはＦｕｇｅｎｅ（グレンザッハーシュトラッセ、スイス）、トランスフェクタム（登録商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ；マジソン、ウィスコンシン州）、トランスファースト（ＴｒａｎｓＦａｓｔ）（商標）形質移入試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ；マジソン、ウィスコンシン州）、Ｔｆｘ（商標）－２０試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ；マジソン、ウィスコンシン州）、Ｔｆｘ（商標）－５０試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ；マジソン、ウィスコンシン州）、ドリームフェクト（ＤｒｅａｍＦｅｃｔ）（商標）（ＯＺ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；マルセイユ、フランス）、エコトランスフェクト（ＥｃｏＴｒａｎｓｆｅｃｔ）（ＯＺ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；マルセイユ、フランス）、トランスパスa（ＴｒａｎｓＰａｓｓa）Ｄ１形質移入試薬（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ；イプスウィッチ、マサチューセッツ州、米国）、ＬｙｏＶｅｃ（商標）／ＬｉｐｏＧｅｎ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）、パーフェクチン（ＰｅｒＦｅｃｔｉｎ）形質移入試薬（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）、ニューロポーター（ＮｅｕｒｏＰＯＲＴＥＲ）形質移入試薬（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）、ジーンポーター（ＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲ）形質移入試薬（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）、ジーンポーター２形質移入試薬（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）、サイトフェクチン（Ｃｙｔｏｆｅｃｔｉｎ）形質移入試薬（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）、バキュロポーター（ＢａｃｕｌｏＰＯＲＴＥＲ）形質移入試薬（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）、トロガンポータ（ＴｒｏｇａｎＰＯＲＴＥＲ）（商標）形質移入試薬（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）、リボフェクト（ＲｉｂｏＦｅｃｔ）（Ｂｉｏｌｉｎｅ；トーントン、マサチューセッツ州、米国）、プラストフェクト（ＰｌａｓＦｅｃｔ）（Ｂｉｏｌｉｎｅ；トーントン、マサチューセッツ州、米国）、ユニフェクター（ＵｎｉＦＥＣＴＯＲ）（Ｂ－Ｂｒｉｄｇｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；マウンテンビュー、カリフォルニア州、米国）、シュアフェクター（ＳｕｒｅＦＥＣＴＯＲ）（Ｂ－Ｂｒｉｄｇｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；マウンテンビュー、カリフォルニア州、米国）、またはハイフェクト（ＨｉＦｅｃｔ）（商標）（Ｂ－Ｂｒｉｄｇｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、マウンテンビュー、カリフォルニア州、米国）が挙げられる。
他の実施形態では、「デンドリマー」という名称の高分岐有機化合物は、本明細書に記載される合成修飾型ＲＮＡなどの外来性核酸に結合し、それを標的組織にインビボで導入するために使用することができる。
本明細書に記載される態様の他の実施形態では、非化学的方法の形質移入が企図される。そのような方法には電気穿孔法（放電を受けて細胞の細胞膜にミクロサイズの孔を一時的に作成するために機器を使用する方法）、音波穿孔法（音波力の応用を介した細胞への形質移入）、および光学的形質移入（高度に収束されたレーザーを用いて細胞膜に微小な（直径約１μｍ）孔を一時的に作成するための方法）が含まれるが、これらに限定されない。他の実施形態では、核酸が不活性固形物のナノ粒子（一般的には金）と結合し、次に標的細胞の核に直接「撃ち込む」ための遺伝子銃の使用、磁性ナノ粒子に結合している外来性核酸を標的細胞に送達するために磁力を用いる形質移入方法を指す「磁石移入（ｍａｇｎｅｔｏｆｅｃｔｉｏｎ）」の使用、または外来性核酸が結合しているカーボンナノファイバーまたはシリコンナノワイヤーなどの細長いナノ構造体によって細胞を刺突することにより行われる「刺突移入（ｉｍｐａｌｅｆｅｃｔｉｏｎ）」の使用などの粒子系の形質移入方法が企図される。
投与された核酸の浸透を増強するために、エチレングリコールおよびプロピレングリコールなどのグリコール類、２－ピロールなどのピロール類、アゾン類、ならびにリモネンおよびメントンなどのテルペン類を含む他の作用物質を利用してよい。
送達用製剤および医薬組成物
いくつかの実施形態では、標的組織にインビボで送達するための、本明細書において開示される合成修飾型ＲＮＡ分子はナノ粒子にカプセル化されている。ナノ粒子包装の方法は当技術分野において周知であり、例えば、Ｂｏｓｅ Ｓら（Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｏｌｉｎ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖｉｒｕｓ Ｔｙｐｅ ３ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｌｕｎｇ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌｓ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７８：８１４６． ２００４）、Ｄｏｎｇ Ｙら（Ｐｏｌｙ（ｄ，ｌ－ｌａｃｔｉｄｅ－ｃｏ－ｇｌｙｃｏｌｉｄｅ）／ｍｏｎｔｍｏｒｉｌｌｏｎｉｔｅ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｏｒａｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ｄｒｕｇｓ． Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２６：６０６８． ２００５）、Ｌｏｂｅｎｂｅｒｇ Ｒ．ら（Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｂｏｄｙ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ １４Ｃ－ｌａｂｅｌｌｅｄ ＡＺＴ ｂｏｕｎｄ ｔｏ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｉｎ ｒａｔｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｒａｄｉｏｌｕｍｉｎｏｇｒａｐｈｙ． Ｊ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔ ５：１７１．１９９８）、Ｓａｋｕｍａ Ｓ Ｒら（Ｍｕｃｏａｄｈｅｓｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｈａｖｉｎｇ ｓｕｒｆａｃｅ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ｃｈａｉｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｔｒａｃｔ． Ｉｎｔ Ｊ Ｐｈａｒｍ １７７：１６１． １９９９）、Ｖｉｒｏｖｉｃ Ｌら（Ｎｏｖｅｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｖｉｒａｌ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ： ａｎ ｕｐｄａｔｅ． Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ ２：７０７．２００５）、およびＺｉｍｍｅｒｍａｎｎ Ｅら（Ｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅ－ ａｎｄ ｐＨ－ｓｔａｂｉｌｉｔｉｅｓ ｏｆ ａｑｕｅｏｕｓ ｓｏｌｉｄ ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ （ＳＬＮ） ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎｓ ｉｎ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｍｅｄｉａ． Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｐｈａｒｍ ５２：２０３． ２００１）に記載されている。いくつかの実施形態では、組成物が１つより多くのＭＯＤ－ＲＮＡ分子を含む場合、その特有のナノ粒子製剤および医薬組成物として製剤される各ＭＯＤ－ＲＮＡは複数のＭＯＤ－ＲＮＡナノ粒子製剤を含む。別の実施形態では、ナノ粒子は、異なるタンパク質をコードする複数の異なる合成修飾型ＲＮＡを含むことができる。各方法は本発明の別個の実施形態を表す。
いくつかの実施形態では、１つのＭＯＤ－ＲＮＡは小胞、例えば、リポソーム内で標的組織にインビボで送達される（Ｌａｎｇｅｒ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７～１５３３ （１９９０）、Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ， Ｌｏｐｅｚ－Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｆｉｄｌｅｒ （ｅｄｓ．）内のＴｒｅａｔら，Ｌｉｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｐ．３５３～３６５ （１９８９）、Ｌｏｐｅｚ－Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ，同書のｐｐ．３１７～３２７を参照のこと；同書を全般的に参照のこと）。いくつかの実施形態では、組成物が１つより多くのＭＯＤ－ＲＮＡ分子を含む場合、各ＭＯＤ－ＲＮＡは、その、それ自体のリポソーム製剤として製剤することができ、そして、医薬組成物は複数のＭＯＤ－ＲＮＡリポソーム製剤を含むことができる。別の実施形態では、リポソームは、異なるタンパク質をコードする複数の異なる合成修飾型ＲＮＡを含むことができる。
いくつかの実施形態では、本明細書において開示される、標的組織にインビボで送達するための、少なくとも１つのＭＯＤ－ＲＮＡを含む組成物は、別の実施形態では、当業者に知られているあらゆる方法、例えば、非経口的、側癌的、筋肉内的、皮内的、皮下的、腹膜内的、心室内的、頭蓋内的、膣内的、または腫瘍内的な方法によって対象に投与され得る。
本発明の方法および組成物の別の実施形態では、本明細書において開示される、標的組織にインビボで送達するための、少なくとも１つのＭＯＤ－ＲＮＡを含む組成物は、注射に適切な形態、すなわち、液体調製物として製剤する。適切な液体製剤には水剤、懸濁剤、分散液剤、乳剤、油剤などが含まれる。本発明の別の実施形態では、有効成分はカプセル、例えば、持続放出性カプセルに製剤される。
他の実施形態では、本明細書において開示される、標的組織にインビボで送達するための、少なくとも１つのＭＯＤ－ＲＮＡを含む医薬組成物は、液体調製物の動脈内注射または筋肉内注射により投与することができる。適切な液体製剤には、水剤、懸濁剤、分散液剤、乳剤、油剤などが含まれる。別の実施形態では、本明細書において開示される、少なくとも１つのＭＯＤ－ＲＮＡを含む医薬組成物は動脈内投与することができ、したがって、動脈内投与に適切な形態に製剤する。
別の実施形態では、標的組織にインビボで送達するための医薬組成物は筋肉内投与することができ、したがって、筋肉内投与に適切な形態に製剤する。筋肉内注射は、本明細書において開示されように、心筋、横隔膜および四肢の筋肉に投与され得る。
別の実施形態では、本明細書において開示される、標的組織にインビボで送達するための、少なくとも１つのＭＯＤ－ＲＮＡを含む医薬組成物は、体表に局所的に投与することができ、したがって、局所投与に適切な形態に製剤する。適切な局所製剤には、ゲル剤、軟膏、クリーム剤、外用水薬、滴剤などが含まれる。局所投与用に、前記組成物またはそれらの生理的に許容される誘導体が調製され、そして、医薬担体を含む、または含まない、生理的に許容可能な希釈剤中の水剤、懸濁剤、または乳剤として適用される。いくつかの実施形態では、眼中でのインビボタンパク質発現が有益である場合、本明細書において開示される、少なくとも１つのＭＯＤ－ＲＮＡを含む医薬組成物は目薬の形態で製剤される。
本明細書において使用される場合、「薬学的に許容可能な担体または希釈剤」は当業者にとって周知である。その担体または希釈剤は、様々な実施形態において、固体の製剤のための固体の担体もしくは希釈剤、液体の製剤のための液体の担体もしくは希釈剤、またはそれらの混合物であり得る。別の実施形態では、固体の担体／希釈剤には、ガム、デンプン（例えば、コーンスターチ、α化デンプン）、糖（例えば、ラクトース、マンニトール、ショ糖、ブドウ糖）、セルロース系物質（例えば、結晶セルロース）、アクリレート（例えば、ポリメチルアクリレート）、炭酸カルシウム、酸化マグネシウム、タルク、またはそれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。他の実施形態では、液体製剤用の薬学的に許容可能な担体は水性または非水性の溶液、懸濁液、乳液または油類であり得る。非水性溶媒の例はプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、およびエチルオレエートなどの注射可能な有機エステルである。水性担体には水、生理食塩水および緩衝培地を含む、アルコール性／水性の溶液、乳液または懸濁液が含まれる。油類の例は石油起源、動物起源、植物起源、または合成起源の油類、例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱物油、オリーブ油、ヒマワリ油および魚肝油である。
非経口ベヒクル（皮下、静脈内、動脈内、または筋肉内の注射用）には、塩化ナトリウム溶液、リンゲルブドウ糖液、ブドウ糖および塩化ナトリウム液、乳酸リンゲル液、および不揮発性油が含まれる。静脈内ベヒクルには、水分および栄養補充液、リンゲルブドウ糖液に基づくもののような電解質補充液などが含まれる。例は、界面活性剤および他の薬学的に許容可能なアジュバントが添加されている、または添加されていない、水および油類などの無菌液体である。一般に、水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液および関連の糖溶液、およびプロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなどのグリコール類は特に注射可能水剤にとって好ましい液体担体である。油類の例は石油起源、動物起源、植物起源、または合成起源の油類、例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱物油、オリーブ油、ヒマワリ油および魚肝油である。
別の実施形態では、標的組織にインビボでＭＯＤ－ＲＮＡを送達するための組成物は、結合剤（例えば、アラビアゴム、トウモロコシデンプン、ゼラチン、カルボマー、エチルセルロース、グアーガム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポビドン）、崩壊剤（例えば、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、アルギン酸、二酸化ケイ素、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、グアーガム、グリコール酸デンプンナトリウム）、様々なｐＨおよびイオン強度の緩衝液（例えば、トリス塩酸緩衝液、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液）、表面への吸収を防ぐためのアルブミンまたはゼラチンなどの添加物、清浄剤（例えば、ツイーン２０、ツイーン８０、プルロニックＦ６８、胆汁酸塩）、プロテアーゼ阻害剤、界面活性剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）、透過促進剤、可溶化剤（例えば、グリセロール、ポリエチレングリセロール）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム、ブチル化ヒドロキシアニソール）、安定化剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース）、増粘剤（例えば、カルボマー、コロイド状二酸化ケイ素、エチルセルロース、グアーガム）、甘味料（例えば、アスパルテーム、クエン酸）、保存剤（例えば、チメロサール、ベンジルアルコール、パラベン類）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム）、流動補助剤（例えば、コロイド状二酸化ケイ素）、可塑剤（例えば、ジエチルフタレート、クエン酸トリエチル）、乳化剤（例えば、カルボマー、ヒドロキシプロピルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム）、高分子塗剤（例えば、ポロキサマー類またはポロキサミン類）、被覆および被膜形成剤（例えば、エチルセルロース、アクリレート、ポリメタクリレート）および／またはアジュバントをさらに含む。上記の賦形剤のそれぞれは本発明の別個の実施形態を表す。
別の実施形態では、標的組織にインビボでＭＯＤ－ＲＮＡを送達するための医薬組成物は制御放出性組成物、すなわち、化合物が投与後に時間経過と共に放出される組成物の中にＭＯＤ－ＲＮＡを含むことができる。制御放出性組成物または持続放出性組成物には親油性デポー（例えば、脂肪酸、蝋、油類）中の製剤が含まれる。別の実施形態では、標的組織にインビボでＭＯＤ－ＲＮＡを送達するための組成物は即放性組成物、すなわち、全化合物が投与後直ぐに放出される組成物である。
別の実施形態では、標的組織にインビボでＭＯＤ－ＲＮＡを送達するために、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンまたはポリプロリンなどの水溶性ポリマーの共有結合により本発明のＭＯＤ－ＲＮＡを修飾することができる。その修飾型化合物は対応する非修飾型化合物よりも長い、静脈内注射後の血中半減期を示すことが知られている（Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， １９８１； Ｎｅｗｍａｒｋ ｅｔ ａｌ．， １９８２、およびＫａｔｒｅ ｅｔ ａｌ．， １９８７）。そのような修飾はまた、別の実施形態では、水性溶液でのその化合物の溶解度を上昇させ、凝集を排除し、その化合物の物理的および化学的安定性を向上させ、ならびにその化合物の免疫原性と反応性を大いに低下させる。結果として、そのような高分子化合物アブダクト（ａｂｄｕｃｔ）の、非修飾型化合物を用いる投与よりも少ない頻度または少ない用量での投与によって、所望のインビボ生物活性が達成され得る。
別の実施形態では、標的組織にインビボでＭＯＤ－ＲＮＡを送達するための組成物は、中和化された薬学的に許容可能な塩形態を含むように製剤化される。薬学的に許容可能な塩には、例えば、塩酸もしくはリン酸などの無機酸または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などのような有機酸と形成される酸付加塩（ポリペプチドまたは抗体分子の遊離アミノ基と形成される）が含まれる。遊離カルボキシル基から形成される塩は、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化第二鉄などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２－エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどのような有機塩基から得ることができる。上記の添加物、賦形剤、製剤および投与方法のそれぞれは本発明の別個の実施形態を表す。
合成修飾型ＲＮＡまたはその組成物の標的組織へのインビボでのインビボ投与に関する本明細書に記載される態様のいくつかの実施形態では、１つ以上の浸透増強剤、界面活性剤やキレート剤と併せて製剤される。適切な界面活性剤には脂肪酸やそれらのエステルまたは塩、胆汁酸やそれらの塩が含まれる。適切な胆汁酸／胆汁酸塩にはケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）およびウルソデオキシケノデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、グルコール酸、グリコール酸、グリコデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、ナトリウムタウロ－２４，２５－ジヒドロ－フシデートおよびナトリウムグリコジヒドロフシデートが含まれる。適切な脂肪酸にはアラキドン酸、ウンデカノイン酸、オレイン酸、ラウリル酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチル酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノレイン酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１－モノカプレート、１－ドデシルアザシクロヘプタン－２－オン、アシルカルニチン、アシルコリン、またはモノグリセリド、ジグリセリド、またはそれらの薬学的に許容可能な塩（例えば、ナトリウム塩）が含まれる。いくつかの実施形態では、浸透増強剤の組合せ、例えば、胆汁酸／胆汁酸塩と組み合わせて脂肪酸／脂肪酸塩が使用される。１つの例となる組合せはラウリル酸、カプリン酸およびＵＤＣＡのナトリウム塩である。さらなる浸透増強剤にはポリオキシエチレン－９－ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン－２０－セチルエーテルが含まれる。
本明細書において開示される、少なくとも１つのＭＯＤ－ＲＮＡを含む組成物は、持続性放出剤形を含む、多数の可能な剤形のうちのいずれかに製剤することができる。前記組成物は、水性培地、非水性培地または混合培地中の懸濁剤として製剤することができる。水性懸濁剤は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールやデキストランを含む、その懸濁剤の粘度を上昇させる物質をさらに含むことができる。その懸濁剤は安定化剤を含むこともできる。
本明細書において開示される、少なくとも１つのＭＯＤ－ＲＮＡを含む組成物は、合成修飾型ＲＮＡの送達のための乳剤として調整および製剤することができる。典型的には乳剤は、通常、直径が０．１μｍを超える液滴の形状で１つの液体が別の液体に分散する不均一系である（例えば、Ａｎｓｅｌ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ａｌｌｅｎ， ＬＶ．， Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．， ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．， ２００４， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ （８ｔｈ ｅｄ．）， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ、Ｉｄｓｏｎ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ （Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ．１９９、Ｒｏｓｏｆｆ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ （Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， Ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ．２４５； Ｂｌｏｃｋ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ （Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｖｏｌｕｍｅ ２， ｐ．３３５； Ｈｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， ｉｎ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐａ．， １９８５， ｐ．３０１を参照のこと）。乳剤は、多くの場合、十分に混合され、そして、互いに分散した２つの非混和性液相を含む二相系である。一般的に、乳剤は油中水型（ｗ／ｏ）か水中油型（ｏ／ｗ）のどちらかであり得る。水相が小さい液滴に細かく分割され、大容量の油相中に分散されるとき、その結果生じる組成物は油中水型（ｗ／ｏ）乳剤と呼ばれる。あるいは、油相が小さい液滴に細かく分割され、大容量の水相中に分散されるとき、その結果生じる組成物は水中油型（ｏ／ｗ）乳剤と呼ばれる。乳剤は分散相に加えてその他の成分、および、水相、油相または別の相としてのそれ自体に溶液として存在し得る活性薬物（すなわち、合成修飾型ＲＮＡ）を含有することができる。乳化剤、安定化剤、顔料および抗酸化剤などの医薬賦形剤も必要に応じて乳剤中に存在することができる。乳剤はまた、例えば、油中水中油型（ｏ／ｗ／ｏ）乳剤および水中油中水型（ｗ／ｏ／ｗ）乳剤の場合のように、２つよりも多い相からなる多重乳剤であり得る。そのような複合型製剤は、多くの場合、単純な二相型乳剤が提供しないある特定の利点を提供する。ｏ／ｗ乳剤の個々の油滴が小さい水滴を取り囲む多重乳剤はｗ／ｏ／ｗ乳剤を構成する。同様に、油の連続相中で安定化された水の小球の中に取り囲まれた油滴の系はｏ／ｗ／ｏ乳剤を提供する。乳化剤は合成界面活性剤、天然乳化剤、吸収基剤、および細分散化固形物の４つの区分に大きく分類され得る（例えば、Ａｎｓｅｌ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ａｌｌｅｎ， ＬＶ．， Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．， ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．， ２００４， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ （８ｔｈ ｅｄ．）， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ、Ｉｄｓｏｎ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ （Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ．１９９を参照のこと）。
乳液製剤に使用される天然乳化剤には、ラノリン、蜜蝋、ホスファチド、レシチンおよびアラビアゴムが含まれる。吸収基剤は、無水ラノリンおよび親水性ワセリンのように、親水性を有するので、水を吸収してｗ／ｏ乳剤を形成し、しかしそれでも、その半固形物の硬度を保持する。細分化された固形物もまた、特に界面活性剤と組み合わせて、および、粘性調合物中において良好な乳化剤として使用されている。これらには、重金属水酸化物などの極性無機固形物、ベントナイト、アタパルファイト、ヘクトライト、カオリン、モンモリロナイト、コロイド状ケイ酸ナトリウムおよびコロイド状ケイ酸アルミニウムマグネシウムのような非膨潤粘土、顔料ならびに炭素またはトリステアリン酸グリセリルなどの非極性固形物が含まれる。
多様な非乳化物質も乳液製剤に含まれ、そして、乳液の特性に寄与する。これらには、脂肪、油類、ワックス、脂肪酸、脂肪族アルコール、脂肪エステル、保湿剤、親水性コロイド、保存剤および抗酸化剤が含まれる（Ｂｌｏｃｋ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ （Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ． ３３５、Ｉｄｓｏｎ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ （Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ． １９９）。
親水性コロイドまたはヒドロコロイドには、多糖類（例えば、アラビアゴム、寒天、アルギン酸、カラギナン、グアーガム、カラヤガムおよびトラガカント）、セルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロースおよびカルボキシプロピルセルロース）および合成高分子（例えば、カルボマー、セルロースエーテルおよびカルボキシビニル高分子）などの天然ガム類および合成高分子が含まれる。これらは水中で分散し、または、膨潤し、分散相の液滴の周囲に強力な界面薄膜を形成することにより、そして、外相の粘度を増大させることにより乳剤を安定化させるコロイド溶液を形成する。
上述のように、リポソームはリポソームとそれらの内容物の特定の細胞集団への送達を促進する表面基を含むように調製されてもよい。例えば、リポソームは、抗体または抗体断片、細胞表面受容体との相互作用のための小エフェクター分子、抗原、および他のそのような化合物などの表面基を含むことができる。
表面基は、リポソーム性脂質の中に標的化分子で誘導体化した脂質、または予め形成したリポソームの中において標的化分子で誘導体化することができる極性ヘッド化学基を有する脂質を含むことにより、リポソームに組み入れることができる。あるいは、標的化成分は、予め形成したリポソームをリガンド高分子脂質複合体とインキュベートすることにより、予め形成したリポソームに導入することができる。
核酸を含む多数のリポソームが当技術分野において公知である。国際公開第９６／４００６２号（Ｔｈｉｅｒｒｙら）は、リポソーム中に高分子量核酸をカプセル化する方法を開示している。米国特許第５，２６４，２２１号（Ｔａｇａｗａら）はタンパク質結合性リポソームを開示しており、そして、そのようなリポソームの内容物にはＲＮＡ分子が含まれ得ることを主張している。米国特許第５，６６５，７１０号（Ｒａｈｍａｎら）は、リポソーム中にオリゴデオキシヌクレオチドをカプセル化するある特定の方法を記載している。国際公開第９７／０４７８７号（Ｌｏｖｅら）は、ｒａｆ遺伝子を標的とするＲＮＡｉ分子を含むリポソームを開示している。さらに、核酸を含むリポソーム組成物を調製するための方法は、例えば、米国特許第６，０１１，０２０号、同第６，０７４，６６７号、同第６，１１０，４９０号、同第６，１４７，２０４号、同第６，２７１，２０６号、同第６，３１２，９５６号、同第６，４６５，１８８号、同第６，５０６，５６４号、同第６，７５０，０１６号、および同第７，１１２，３３７号に見出すことができる。これらのアプローチのそれぞれは、本明細書に記載される合成修飾型ＲＮＡの細胞への送達を提供することができる。
本明細書に記載される態様のいくつかの実施形態では、本明細書において開示される、標的組織におけるインビボタンパク質発現のための少なくとも１つのＭＯＤ－ＲＮＡを含む組成物はナノ粒子中にカプセル化することができる。ナノ粒子包装の方法は当技術分野において周知であり、および、例えば、Ｂｏｓｅ Ｓら（Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｏｌｉｎ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖｉｒｕｓ Ｔｙｐｅ ３ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｌｕｎｇ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌｓ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７８：８１４６． ２００４）、Ｄｏｎｇ Ｙら（Ｐｏｌｙ（ｄ，ｌ－ｌａｃｔｉｄｅ－ｃｏ－ｇｌｙｃｏｌｉｄｅ）／ｍｏｎｔｍｏｒｉｌｌｏｎｉｔｅ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｏｒａｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ｄｒｕｇｓ． Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２６：６０６８． ２００５）、Ｌｏｂｅｎｂｅｒｇ Ｒ．ら（Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｂｏｄｙ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ １４Ｃ－ｌａｂｅｌｌｅｄ ＡＺＴ ｂｏｕｎｄ ｔｏ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｉｎ ｒａｔｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｒａｄｉｏｌｕｍｉｎｏｇｒａｐｈｙ． Ｊ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔ ５：１７１．１９９８）、Ｓａｋｕｍａ Ｓ Ｒら（Ｍｕｃｏａｄｈｅｓｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｈａｖｉｎｇ ｓｕｒｆａｃｅ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ｃｈａｉｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｔｒａｃｔ． Ｉｎｔ Ｊ Ｐｈａｒｍ １７７：１６１． １９９９）、Ｖｉｒｏｖｉｃ Ｌら（Ｎｏｖｅｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｖｉｒａｌ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ： ａｎ ｕｐｄａｔｅ． Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ ２：７０７．２００５）、およびＺｉｍｍｅｒｍａｎｎ Ｅら（Ｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅ－ ａｎｄ ｐＨ－ｓｔａｂｉｌｉｔｉｅｓ ｏｆ ａｑｕｅｏｕｓ ｓｏｌｉｄ ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ （ＳＬＮ） ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎｓ ｉｎ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｍｅｄｉａ． Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｐｈａｒｍ ５２：２０３． ２００１）に記載されており、それらの内容は全体が参照により本明細書に組み込まれる。
細胞の自然免疫応答またはインターフェロン応答をさらに避ける方法
いくつかの実施形態では、本明細書において開示される、少なくとも１つのＭＯＤ－ＲＮＡを含む組成物はまた自然免疫介在性応答を低下させるための作用物質を含む。１つの実施形態では、その組成物は、組織の自然免疫応答をさらに低下させるために、インターフェロン除去剤（例えば、可溶性インターフェロン受容体）をコードする修飾型ＲＮＡをさらに含む。
いくつかの実施形態では、クロロキン（ＴＬＲシグナル伝達阻害剤）および２－アミノプリン（ＰＫＲ阻害剤）などの、細胞において自然免疫応答を阻害する小分子は、本明細書において開示される、インビボタンパク質発現のために少なくとも１つのＭＯＤ－ＲＮＡを含む組成物と組み合わせて投与することもできる。市販のＴＬＲシグナル伝達阻害剤のいくつかの非限定的な例にはＢＸ７９５、クロロキン、ＣＬＩ－０９５、ＯｘＰＡＰＣ、ポリミキシンＢ、およびラパマイシン（全てがＩＮＶＩＶＯＧＥＮ（商標）から購入可能である）が挙げられる。さらに、２－アミノプリン、ＢＸ７９５、クロロキンおよびＨ－８９などのパターン認識受容体（ＰＲＲ）（自然免疫シグナル伝達に関与する）の阻害剤は、本明細書において開示される、インビボタンパク質発現のための少なくとも１つのＭＯＤ－ＲＮＡを含む組成物および方法において使用することもできる。さらに、本明細書において開示される、インビボタンパク質発現のために少なくとも１つのＭＯＤ－ＲＮＡを含む組成物は、免疫経路のタンパク質を阻害する細胞透過性ペプチドをさらに含むことができる。市販の細胞透過性ペプチドのいくつかの非限定的な例には、Ｐｅｐｉｎ－ＭＹＤ（ＩＮＶＩＶＯＧＥＮ（商標））またはＰｅｐｉｎｈ－ＴＲＩＦ（ＩＮＶＩＶＯＧＥＮ（商標））が挙げられる。Ｔｏｌｌ様受容体シグナル伝達経路のオリゴデオキシヌクレオチドアンタゴニストを、免疫シグナル伝達を低下させるために、本明細書において開示される、インビボタンパク質発現のための少なくとも１つのＭＯＤ－ＲＮＡを含むことに付け加えることもできる。
本明細書に記載される合成修飾型ＲＮＡで形質移入されている組織の免疫応答を低下させるための別の方法は、ＮＬＲＸ１などの自然免疫の負の調節因子をコードするＭＯＤ－ＲＮＡを共形質移入することである。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書において開示される、インビボタンパク質発現のための少なくとも１つのＭＯＤ－ＲＮＡを含む組成物は、ＮＬＲＸ１、ＮＳ１、ＮＳ３／４ＡまたはＡ４６Ｒのうちの１つ以上、または任意の組合せをコードするＭＯＤ－ＲＮＡを含む。さらに、いくつかの実施形態では、本明細書において開示される、少なくとも１つのＭＯＤ－ＲＮＡを含む組成物は、組織または対象が生起する自然免疫応答を避けるために、自然免疫系の阻害剤をコードする合成修飾型ＲＮＡを含むこともできる。
いくつかの実施形態では、当業者は研究の場で抗ウイルス経路に遺伝的に欠損がある細胞（例えば、ＶＩＳＡノックアウト細胞）を使用することにより、細胞が生起する自然免疫応答を避けることができることも本明細書において企図される。
別の実施形態では、本明細書において開示される、少なくとも１つのＭＯＤ－ＲＮＡを含む組成物は免疫抑制剤をさらに含むことができる。本明細書において使用される場合、「免疫抑制薬または免疫抑制剤」という用語は、正常な免疫機能を阻害またはそれに干渉する医用薬剤を包含することが意図されている。本明細書において開示される方法に適した免疫抑制剤の例には、Ｔ細胞／Ｂ細胞共刺激経路を阻害する薬剤、例えば、米国特許出願公開第２００２０１８２２１１号において開示される、ＣＴＬＡ４経路およびＢ７経路を介するＴ細胞およびＢ細胞の結合に干渉する薬剤が挙げられる。１つの実施形態では、免疫抑制剤はシクロスポリンＡである。他の例にはミオフェニレートモフェチル（ｍｙｏｐｈｅｎｙｌａｔｅ ｍｏｆｅｔｉｌ）、ラパマイシン、および抗胸腺細胞グロブリンが含まれる。１つの実施形態では、免疫抑制薬は、本明細書において開示される、少なくとも１つのＭＯＤ－ＲＮＡを含む組成物に加えられる、または別個の組成物で少なくとも１つのＭＯＤ－ＲＮＡを含む組成物の対象への投与と同時、またはその前もしくは後に投与することができる。免疫抑制薬は投与経路と適合する製剤に加えられ、所望の治療効果を達成するのに十分な投薬量で対象に投与される。別の実施形態では、免疫抑制薬は、本明細書において開示されるＭＯＤ－ＲＮＡに対する寛容性を誘導するのに十分な期間、一時的に投与される。
治療薬の特定のためのアッセイにおけるＭＯＤ－ＲＮＡを使用するインビボタンパク質発現
いくつかの実施形態では、合成修飾型ＲＮＡを使用するインビボタンパク質発現のための本明細書において開示される方法および組成物およびキットは、研究者が単一の遺伝子産物または遺伝子産物群についてのタンパク質発現の器官全体および全身性の効果を調査することができるような、そのための基盤を提供する。特定の指向性タンパク質発現を容易に実行する能力が、（遺伝子導入マウス技術および他の動物全体での遺伝的修飾技術と比較して）器官生理および全身性生理の研究における新境地を開く。そのような強力な基盤は生物学者および臨床科学者の間に広範な関心を喚起しうる。いくつかの実施形態では、本発明は、遺伝子発現を活性化および／または不活化する動物モデル、例えば、誘導性タンパク質発現系の動物モデルに合成修飾型ＲＮＡをインビボ送達するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、前記方法は、特定の組織や細胞種における遺伝子のノックアウトの効果を見るために、Ｃｒｅリコンビナーゼタンパク質をコードする合成修飾型ＲＮＡを動物モデルに送達する。いくつかの実施形態では、動物モデルは大動物モデル、例えば、豚モデルである。
例えば、標的組織における特定のタンパク質のインビボタンパク質発現のためのＭＯＤ－ＲＮＡを、タンパク質発現の上昇の組織の機能に対する効果、および／または動物に対する効果、および／または特定の疾患もしくは障害に対する可能性のある治療薬としての効果を調査するために使用することができる。例えば、病的特徴を有するタンパク質をコードする目的のタンパク質をコードするＭＯＤ－ＲＮＡを使用することができる。例えば、所望の病的特徴には、疾患病状、例えば、本明細書において開示される心血管疾患病状の原因である変異や多型を有する遺伝子から発現されるタンパク質が含まれる。そのような実施形態では、本明細書において開示される方法は、遺伝子内の変異の組織におけるインビボのタンパク質機能に対する効果を調査するアッセイ、ならびに病的状態を軽減する目的のタンパク質を発現するＭＯＤ－ＲＮＡをスクリーニングするためのアッセイに存在し得る。それ故、本明細書において開示される方法は、例えば、標的組織における特定のタンパク質のインビボでの発現の効果を評価するために用いることができ、それ故、薬物開発と疾患分析のためのインビボモデルとして機能し、ＭＯＤ－ＲＮＡから発現されるタンパク質治療薬の臨床評価に有用である。
様々なＭＯＤ－ＲＮＡ濃度を用いて、複数のアッセイを並行して行い、様々な濃度のＭＯＤ－ＲＮＡからの様々なレベルのタンパク質発現に対する示差的応答を得ることができる。当技術分野において公知であるように、有効な濃度のＭＯＤ－ＲＮＡの決定は通常１：１０または他の対数尺度の希釈から生じる範囲の濃度を用いる。その濃度は、必要に応じて、２つ目の希釈系列を用いてさらに精緻化することができる。通常、これらの濃度のうちの１つは負の対照、すなわち濃度ゼロまたはその作用物質の検出レベル未満または検出可能な表現型の変化を生じない作用物質濃度以下として機能する。
したがって、いくつかの実施形態では、標的組織における特定のタンパク質のインビボタンパク質発現のためのＭＯＤ－ＲＮＡを、操作されているＭＯＤ－ＲＮＡ、例えば、遺伝子配列などに目的の変異が導入されているＭＯＤ－ＲＮＡから発現されるタンパク質の効果を調査するために使用することができる。
別の実施形態では、分化経路を研究するためのモデルとして標的組織における目的のタンパク質のインビボ発現のためにＭＯＤ－ＲＮＡを使用することができる。いくつかの実施形態では、目的のＭＯＤ－ＲＮＡは、例えば、複数の心筋細胞系列、例えば、限定されないが、心筋細胞または平滑筋細胞の系列に沿った心筋細胞の分化に対する特定のタンパク質の効果を調査するために、または心臓始原細胞を異なる亜集団、例えば、限定されないが、心房系、心室系、流出管系および導伝系に分化させる様々なタンパク質の効果を調査するために、心臓組織において発現することができる。
したがって、標的組織におけるインビボでの目的のタンパク質のタンパク質発現のためのＭＯＤ－ＲＮＡを含む、本明細書において開示される組成物は臨床治療、研究、開発、および商業目的における様々な使用法を有することができる。治療目的では、例えば、ＭＯＤ－ＲＮＡが心臓の心臓増強タンパク質をインビボでコードする場合、そのような組成物は、代謝機能の先天異常、病気の影響、または重症の外傷の結果など、考えられるあらゆる要求に応えて心筋の組織維持もしくは修復を増強するために投与することができる。いくつかの実施形態では、対象の心臓への心臓増強タンパク質をコードするＭＯＤ－ＲＮＡのインビボでの投与は、損傷を受けた組織、または他の場合では、病気の組織にその機能を回復させるのに役立つばかりか、損傷を受けた組織の再構成を促進することができる。
目的の心臓増強タンパク質をコードする特定のＭＯＤ－ＲＮＡの治療上の投与の適切性を決定するために、まず適切な動物モデルにおいてＭＯＤ－ＲＮＡを試験することができる。複数の実施形態では、目的の心臓増強タンパク質をコードするＭＯＤ－ＲＮＡの適切性は、そのＭＯＤ－ＲＮＡを使用する治療の結果として起こる心臓の回復の程度を評価することにより動物モデルにおいて決定することができる。多数の動物モデルがそのような試験に利用可能である。例えば、心臓は、予め冷やしたアルミニウムの棒を前方左側の心室壁に接触させることにより凍傷で冒すことができる（Ｍｕｒｒｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９８：２２０９， １９９６、Ｒｅｉｎｅｃｋｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １００：１９３， １９９９、米国特許第６，０９９，８３２号）。より大きい動物では、凍傷は、液体窒素で冷やした３０～５０ｍｍの銅の円盤状のプローブを左心室の前方の壁に約２０分間配置することによって与えることができる（Ｃｈｉｕ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ． Ｔｈｏｒａｃ． Ｓｕｒｇ． ６０：１２， １９９５）。梗塞は左主冠動脈を結紮することにより誘導することができる（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １００：１９９１， １９９７）。傷害を受けた部位は本発明の細胞調製物で治療され、損傷を受けた領域中での細胞の存在について心臓組織は組織学によって調査される。心機能は、左心室の拡張終期圧、最大圧、圧力上昇率、および圧力減衰率のようなパラメータを測定することによりモニターすることができる。
いくつかの実施形態では、目的の心臓増強タンパク質をコードするＭＯＤ－ＲＮＡは、あらゆる生理的に許容可能な賦形剤の状態で投与することができる。目的のタンパク質をコードするＭＯＤ－ＲＮＡを含む組成物は標的組織、例えば、心臓に注射、カテーテルなどによって送達することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書において開示される、標的組織でのインビボタンパク質発現のための目的のタンパク質をコードするＭＯＤ－ＲＮＡを含む組成物は、医薬組成物の形状で供給することができ、ヒトへの投与のために十分な無菌状態で調製した等張賦形剤を含む。細胞賦形剤と組成物のあらゆる添加成分の選択は、投与に用いられる経路と装置に応じて適合させる。本明細書において開示される、標的組織でのインビボタンパク質発現のための目的のタンパク質をコードするＭＯＤ－ＲＮＡを含む組成物は、治療効果を促進する１つ以上の他の成分を含むこともできる、または、１つ以上の他の成分を伴うこともでき、そして、スキャフォールドの使用ならびに他の細胞の添加を含むこともできる。適切な成分には添充細胞種、特に内皮細胞が含まれる。別の実施形態では、前記組成物は妥当なマトリックススキャフォールドまたは生物分解性のマトリックススキャフォールドを含んでよい。
本発明の別の態様は、本明細書において開示される、標的組織でのインビボタンパク質発現のための目的のタンパク質をコードするＭＯＤ－ＲＮＡを含む組成物の全身性投与または標的解剖学的部位への投与のどちらかに関する。本明細書において開示される、標的組織でのインビボタンパク質発現のための目的のタンパク質をコードするＭＯＤ－ＲＮＡを含む組成物は、対象の標的組織、例えば、心臓に、もしくはその近傍に導入することができ、例えば、または全身投与、例えば、限定されないが、動脈内投与もしくは静脈内投与することができる。別の実施形態では、本明細書において開示される、標的組織でのインビボタンパク質発現のための目的のタンパク質をコードするＭＯＤ－ＲＮＡを含む組成物は、対象の心血管系への送達に適切であり得る様々な方法で投与することができ、それには、静脈内投与および動脈内投与、髄腔内投与、心室内投与、実質内投与、頭蓋内投与、嚢内投与、線条体内投与、および黒質内投与を含む非経口投与が包含されるが、これらに限定されない。任意に、本明細書において開示される、標的組織でのインビボタンパク質発現のための目的のタンパク質をコードするＭＯＤ－ＲＮＡを含む組成物は免疫抑制剤と併せて投与される。
本明細書において開示される本明細書において開示される、標的組織でのインビボタンパク質発現のための目的のタンパク質をコードするＭＯＤ－ＲＮＡを含む組成物は、適正な医療行為に基づき、個々の患者臨床状態、投与部位および投与方法、投与のスケジューリング、患者の年齢、性別、体重および医師に知られている他の要因を考慮に入れて、投与および投薬することができる。本明細書における目的に適した薬学的「有効量」は定義の節において定義されており、当技術分野において公知であるような留意事項によって判定する。その量は、疾患の進行を停止するのに、ならびに／または、生存率の改善もしくはより急速な回復、もしくは症状および当業者により測定基準として選択される他の指標の改善もしくは除去を含むが、これらに限定されない改善を達成するのに有効でなくてはならない。本明細書において開示される、標的組織でのインビボタンパク質発現のための目的のタンパク質をコードするＭＯＤ－ＲＮＡを含む組成物は対象に投与することができることが行われ得るが、それは次の場所、すなわち病院、診察室、救急診療部、病棟、集中治療室、手術室、カテーテル装着室、および放射線治療質に限定されない。
本発明のいくつかの実施形態は、以下の番号を付した段落のうちのいずれかのように定義され得る。
１． 組織においてタンパク質をインビボ発現させるための方法であって、ポリペプチドをコードする合成修飾型ＲＮＡ分子を含む組成物と該組織を接触させる工程を含み、該組織中の細胞への該合成修飾型ＲＮＡ分子の導入によって、１つ以上の修飾を含まない該ポリペプチドをコードする合成ＲＮＡ分子と接触した該組織中の細胞と比較して自然免疫応答が低下するように、該合成修飾型ＲＮＡ分子が該１つ以上の修飾を含む、前記方法。
２． 前記組織が心臓組織または心臓性組織である、段落１に記載の方法。
３． 前記組織が筋肉組織である、段落１に記載の方法。
４． 前記筋肉組織が骨格筋である、段落３に記載の方法。
５． 前記筋肉組織が心筋である、段落３に記載の方法。
６． 前記筋肉組織が平滑筋である、段落３に記載の方法。
７． 前記組織が膵臓組織である、段落１に記載の方法。
８． 前記合成修飾型ＲＮＡ分子がベクターにおいて発現しない、段落１に記載の方法。
９． 前記合成修飾型ＲＮＡ分子を含む前記組成物が裸の合成修飾型ＲＮＡ分子を含む、段落１に記載の方法。
１０． 前記合成修飾型ＲＮＡ分子を含む前記組成物が、脂質複合体中に存在する少なくとも１つの合成修飾型ＲＮＡ分子を含む、段落１に記載の方法。
１１． 前記組織が哺乳類の組織である、段落１に記載の方法。
１２． 前記哺乳類の組織がヒトの組織である、段落１１に記載の方法。
１３． 前記合成修飾型ＲＮＡ分子が少なくとも２つの修飾ヌクレオシドを含む、段落１に記載の方法。
１４． 前記少なくとも２つの修飾ヌクレオシドが、５－メチルシチジン（５ｍＣ）、Ｎ６－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、３，２'－Ｏ－ジメチルウリジン（ｍ４Ｕ）、２－チオウリジン（ｓ２Ｕ）、２'フルオロウリジン、シュードウリジン、２'－Ｏ－メチルウリジン（Ｕｍ）、２'デオキシウリジン（２'ｄＵ）、４－チオウリジン（ｓ４Ｕ）、５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ）、２'－Ｏ－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、Ｎ６，２'－Ｏ－ジメチルアデノシン（ｍ６Ａｍ）、Ｎ６，Ｎ６，２'－Ｏ－トリメチルアデノシン（ｍ６２Ａｍ）、２'－Ｏ－メチルシチジン（Ｃｍ）、７－メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）、２'－Ｏ－メチルグアノシン（Ｇｍ）、Ｎ２，７－ジメチルグアノシン（ｍ２，７Ｇ）、Ｎ２，Ｎ２，７－トリメチルグアノシン（ｍ２，２，７Ｇ）、およびイノシン（Ｉ）からなる群より選択される、段落１３に記載の方法。
１５． 前記合成修飾型ＲＮＡ分子、その中で前記少なくとも２つの修飾ヌクレオシドが５－メチルシチジン（５ｍＣ）およびシュードウリジンである、段落１３に記載の方法。
１６． 前記合成修飾型ＲＮＡ分子が５'キャップをさらに含む、段落１に記載の方法。
１７． 前記合成修飾型ＲＮＡ分子、その中で前記５'キャップが５'キャップ類似体である、段落１６に記載の方法。
１８． 前記５'キャップ類似体が５'グアノシンキャップである、段落１７に記載の方法。
１９． 前記合成修飾型ＲＮＡ分子が５'三リン酸を含まない、段落１に記載の方法。
２０． 前記合成修飾型ＲＮＡ分子が、ポリ（Ａ）テール、コザック配列、３'非翻訳領域、５'非翻訳領域、またはそれらの任意の組合せをさらに含む、段落１に記載の方法。
２１． 前記ポリ（Ａ）テール、コザック配列、３'非翻訳領域、５'非翻訳領域、またはそれらの任意の組合せが１つ以上の修飾ヌクレオシドを含む、段落２０に記載の方法。
２２． 前記１つ以上の修飾ヌクレオシドが、５－メチルシチジン（５ｍＣ）、Ｎ６－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、３，２'－Ｏ－ジメチルウリジン（ｍ４Ｕ）、２－チオウリジン（ｓ２Ｕ）、２'フルオロウリジン、シュードウリジン、２'－Ｏ－メチルウリジン（Ｕｍ）、２'デオキシウリジン（２'ｄＵ）、４－チオウリジン（ｓ４Ｕ）、５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ）、２'－Ｏ－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、Ｎ６，２'－Ｏ－ジメチルアデノシン（ｍ６Ａｍ）、Ｎ６，Ｎ６，２'－Ｏ－トリメチルアデノシン（ｍ６２Ａｍ）、２'－Ｏ－メチルシチジン（Ｃｍ）、７－メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）、２'－Ｏ－メチルグアノシン（Ｇｍ）、Ｎ２，７－ジメチルグアノシン（ｍ２，７Ｇ）、Ｎ２，Ｎ２，７－トリメチルグアノシン（ｍ２，２，７Ｇ）、およびイノシン（Ｉ）からなる群より選択される、段落２１に記載の方法。
２３． 前記合成修飾型ＲＮＡ分子がアルカリホスファターゼで処理される、段落１に記載の方法。
２４． 前記合成修飾型ＲＮＡ分子がＶＥＧＦポリペプチドをコードする、段落１に記載の方法。
２５． 前記ＶＥＧＦポリペプチドがヒトＶＥＧＦ（ｈＶＥＧＦ）である、段落２３に記載の方法。
２６． 前記合成修飾型ＲＮＡ分子がジストロフィンポリペプチドをコードする、段落１に記載の方法。
２７． 前記合成修飾型ＲＮＡ分子がα１アンチトリプシンポリペプチドをコードする、段落１に記載の方法。
２８． 前記合成修飾型ＲＮＡ分子が機能欠損型疾患のためのポリペプチドをコードする、段落１に記載の方法。
２９． 前記機能欠損型疾患が嚢胞性線維症である、段落２７に記載の方法。
３０． 前記合成修飾型ＲＮＡ分子が嚢胞性線維症膜コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）ポリペプチドをコードする、段落２９に記載の方法。
３１． 前記合成修飾型ＲＮＡ分子が、表１、２、３、４、５、６または７のいずれかに開示されるポリペプチドをコードする、段落１に記載の方法。
３２． 前記合成修飾型ＲＮＡ分子と前記組織を接触させる工程が筋肉への直接注入を含む、段落１に記載の方法。
３３． 前記合成修飾型ＲＮＡ分子と前記組織を接触させる工程が、該合成修飾型ＲＮＡ分子を含むかまたはそれで被覆されている埋め込み型装置と該組織を接触させることを含む、段落１に記載の方法。
３４． 前記埋め込み型装置がステントである、段落３３に記載の方法。
３５． 前記埋め込み型装置が埋め込み型送達ポンプである、段落３３に記載の方法。
３６． 前記合成修飾型ＲＮＡ分子と前記組織を接触させる工程が、カテーテルによって該合成修飾型ＲＮＡ分子を送達することを含む、段落１に記載の方法。
３７． 前記合成修飾型ＲＮＡ分子と前記組織を接触させる工程が、内視鏡を介して該合成修飾型ＲＮＡ分子を送達することを含む、段落１に記載の方法。
３８． 前記組成物が、１００ｎｇ／μｌよりも高い濃度の合成修飾型ＲＮＡ分子を含む、段落１に記載の方法。
３９． 前記組成物が、１～２５μｇ／μｌの間の濃度の合成修飾型ＲＮＡ分子を含む、段落１に記載の方法。
４０． 前記組成物が、２５μｇ／μｌと５０μｇ／μｌの間の濃度の合成修飾型ＲＮＡ分子を含む、段落１に記載の方法。
４１． 対象において心機能を増強するための方法であって、該対象において心機能を増強するポリペプチドをコードする合成修飾型ＲＮＡ分子を含む組成物を該対象に投与する工程を含み、該合成修飾型ＲＮＡ分子の該対象への投与によって、１つ以上の修飾を含まない該ポリペプチドをコードする合成ＲＮＡ分子の投与と比較して自然免疫応答が低下するように、該合成修飾型ＲＮＡ分子が前記１つ以上の修飾を含み、かつ、該合成修飾型ＲＮＡ分子からの該ポリペプチドの発現が該対象において心機能を増強する、前記方法。
４２． 前記合成修飾型ＲＮＡ分子が段落８～２２のいずれか一項に記載のものである、段落４１に記載の方法。
４３． 前記対象が、不十分な心機能を特徴とする疾患または障害を患っている、段落４１に記載の方法。
４４． 前記対象が構造的心疾患を患っている、段落４１に記載の方法。
４５． 前記疾患または障害が、うっ血性心不全、心筋症、心筋梗塞、組織虚血、心臓虚血、血管病、後天性心臓疾患、先天性心臓疾患、アテローム性硬化症、心筋症、刺激伝達系機能不全、冠動脈機能不全、肺性心高血圧症である、段落４１に記載の方法。
４６． 前記疾患が、うっ血性心不全、冠動脈疾患、心筋梗塞、心筋虚血、アテローム性硬化症、心筋症、特発性心筋症、心不整脈、筋ジストロフィー、筋量異常、筋変性、感染性心筋炎、薬物または毒素誘導性の筋異常、過敏性心筋炎、自己免疫性心内膜炎および先天性心臓疾患からなる群より選択される、段落４１に記載の方法。
４７． 前記合成修飾型ＲＮＡ分子がＶＥＧＦポリペプチドをコードする、段落４１に記載の方法。
４８． 前記ＶＥＧＦポリペプチドがヒトＶＥＧＦ（ｈＶＥＧＦ）である、段落４１に記載の方法。
４９． 前記合成修飾型ＲＮＡ分子がジストロフィンポリペプチドをコードする、段落４１に記載の方法。
５０． 前記合成修飾型ＲＮＡ分子がα１アンチトリプシンポリペプチドをコードする、段落４１に記載の方法。
５１． 前記合成修飾型ＲＮＡ分子が機能欠損型疾患のためのポリペプチドをコードする、段落４１に記載の方法。
５２． 前記合成修飾型ＲＮＡ分子が、心臓で発現しないポリペプチド、または心臓での正常な発現と比較して低レベルで発現するポリペプチド、または天然の野生型のポリペプチドと比較して機能獲得型タンパク質もしくは変異型タンパク質として発現するポリペプチドを、前記対象において発現する、段落４１に記載の方法。
５３． 前記合成修飾型ＲＮＡ分子が、表１、２、３、４、５、６または７のいずれかに開示されるポリペプチドをコードする、段落４１に記載の方法。
５４． 前記対象が哺乳類である、段落４１に記載の方法。
５５． 前記哺乳類がヒトである、段落５４に記載の方法。
５６． 前記対象が心筋梗塞を患ったことがある、段落４１に記載の方法。
５７． 前記対象が心不全を有するかまたは心不全のリスクを有する、段落４１に記載の方法。
５８． 前記心不全が後天性心不全である、段落５７に記載の方法。
５９． 前記心不全が、アテローム性硬化症、心筋症、うっ血性心不全、心筋梗塞、虚血性心疾患、心房性不整脈および心室性不整脈、高血圧性血管疾患、末梢血管疾患と関係がある、段落５７に記載の方法。
６０． 前記対象が先天性心臓疾患を有する、段落４１に記載の方法。
６１． 前記対象が、高血圧、血流障害、症候性不整脈、肺性高血圧、関節硬化症、刺激伝達系機能不全、冠動脈機能不全、冠動脈樹機能不全および冠動脈側副血行路形成からなる群より選択される健康状態を有する、段落４１に記載の方法。
６２． 心機能の増強が、心不全を治療または予防するための方法である、段落４１に記載の方法。
６３． 前記組成物が、心内膜心筋投与経路、心筋外投与経路、心室内投与経路、冠内投与経路、後洞投与経路、動脈内投与経路、心膜内投与経路、または静脈内投与経路を経て投与される、段落４１に記載の方法。
６４． 前記組成物が前記対象の血管系に投与される、段落４１に記載の方法。
６５． 前記組成物が心臓への直接注入により前記対象に投与される、段落４１に記載の方法。
６６． 前記組成物が、前記合成修飾型ＲＮＡ分子を含むかまたはそれで被覆されている埋め込み型装置を使用して前記対象に投与される、段落４１に記載の方法。
６７． 前記埋め込み型装置がステントである、段落６６に記載の方法。
６８． 前記埋め込み型装置が埋め込み型送達ポンプである、段落６６に記載の方法。
６９． 前記組成物がカテーテルによって前記対象に投与される、段落４１に記載の方法。
７０． 前記組成物が内視鏡を介して前記対象に投与される、段落４１に記載の方法。
７１． 前記組成物が、１００ｎｇ／μｌよりも高い濃度の合成修飾型ＲＮＡ分子を含む、段落４１に記載の方法。
７２． 前記組成物が、１～２５μｇ／μｌの間の濃度の合成修飾型ＲＮＡ分子を含む、段落４１に記載の方法。
７３． 前記組成物が、２５μｇ／μｌと５０μｇ／μｌの間の濃度の合成修飾型ＲＮＡ分子を含む、段落４１に記載の方法。
７４． 前記合成修飾型ＲＮＡ分子が、心臓で発現しないポリペプチド、または心臓での正常な発現と比較して低レベルで発現するポリペプチド、または天然の野生型のポリペプチドと比較して機能獲得型タンパク質もしくは変異型タンパク質として発現するポリペプチドを、前記対象において発現する、段落４１に記載の方法。
７５． インビボＣｒｅ動物モデルにおける遺伝子をノックアウトするための、Ｃｒｅリコンビナーゼポリペプチドをコードする合成修飾型ＲＮＡ分子の使用。
７６． 心臓始原細胞の動員、増殖、および／または分化を増大させる方法であって、対象における心臓始原細胞の動員、増殖、および／または分化を増大させるポリペプチドをコードする合成修飾型ＲＮＡ分子を含む組成物を該対象に投与する工程を含み、該合成修飾型ＲＮＡ分子の該対象への投与によって、１つ以上の修飾を含まない該ポリペプチドをコードする合成ＲＮＡ分子の投与と比較して自然免疫応答が低下するように、該合成修飾型ＲＮＡ分子が該１つ以上の修飾を含み、かつ、該合成修飾型ＲＮＡ分子からの該ポリペプチドの発現が、該対象における心臓始原細胞の動員、増殖、および／または分化を増大させる、前記方法。
７７． 前記対象における心臓始原細胞の動員、増殖、および／または分化を増大させる前記ポリペプチドがＶＥＧＦポリペプチドを含む、段落７６に記載の方法。
７８． 前記ＶＥＧＦポリペプチドがＶＥＧＦ－Ａを含む、段落７７に記載の方法。
７９． 前記対象が、高血圧、血流障害、症候性不整脈、肺性高血圧、関節硬化症、刺激伝達系機能不全、冠動脈機能不全、冠動脈樹機能不全および冠動脈側副血行路形成からなる群より選択される健康状態を有する、段落７６に記載の方法。
８０． 前記対象がヒトである、段落７６に記載の方法。
８１． 前記対象が心筋梗塞を患ったことがある、段落７９に記載の方法。
８２． 前記心臓始原細胞がＷＴ－１始原細胞を含む、段落７６に記載の方法。
８３． 以下の工程を含む、対象において腫瘍を治療するための方法：
該対象において血管新生を増強するポリペプチドをコードする合成修飾型ＲＮＡ分子を含む組成物を投与する工程であって、該合成修飾型ＲＮＡ分子の該対象への投与によって、１つ以上の修飾を含まない該ポリペプチドをコードする合成ＲＮＡ分子の投与と比較して自然免疫応答が低下するように、該合成修飾型ＲＮＡ分子が前記１つ以上の修飾を含み、かつ、該合成修飾型ＲＮＡ分子からの該ポリペプチドの発現が該腫瘍における血管新生を増強する、工程；および、
化学療法剤を該対象に投与する工程であって、該血管新生が該対象に投与される化学療法剤の効果を増大させ、それによって該腫瘍が治療される、工程。
８４． 前記合成修飾型ＲＮＡ分子がベクターにおいて発現しない、段落８３に記載の方法。
８５． 前記合成修飾型ＲＮＡ分子を含む前記組成物が裸の合成修飾型ＲＮＡ分子を含む、段落８３に記載の方法。
８６． 前記合成修飾型ＲＮＡ分子を含む前記組成物が、脂質複合体中に存在する少なくとも１つの合成修飾型ＲＮＡ分子を含む、段落８３に記載の方法。
８７． 前記合成修飾型ＲＮＡ分子が少なくとも２つの修飾ヌクレオシドを含む、段落８３に記載の方法。
８８． 前記少なくとも２つの修飾ヌクレオシドが、５－メチルシチジン（５ｍＣ）、Ｎ６－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、３，２'－Ｏ－ジメチルウリジン（ｍ４Ｕ）、２－チオウリジン（ｓ２Ｕ）、２'フルオロウリジン、シュードウリジン、２'－Ｏ－メチルウリジン（Ｕｍ）、２'デオキシウリジン（２'ｄＵ）、４－チオウリジン（ｓ４Ｕ）、５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ）、２'－Ｏ－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、Ｎ６，２'－Ｏ－ジメチルアデノシン（ｍ６Ａｍ）、Ｎ６，Ｎ６，２'－Ｏ－トリメチルアデノシン（ｍ６２Ａｍ）、２'－Ｏ－メチルシチジン（Ｃｍ）、７－メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）、２'－Ｏ－メチルグアノシン（Ｇｍ）、Ｎ２，７－ジメチルグアノシン（ｍ２，７Ｇ）、Ｎ２，Ｎ２，７－トリメチルグアノシン（ｍ２，２，７Ｇ）、およびイノシン（Ｉ）からなる群より選択される、段落８７に記載の方法。
８９． 前記合成修飾型ＲＮＡ分子、その中で前記少なくとも２つの修飾ヌクレオシドが５－メチルシチジン（５ｍＣ）およびシュードウリジンである、段落８７に記載の方法。
９０． 前記合成修飾型ＲＮＡ分子が５'キャップをさらに含む、段落８３に記載の方法。
９１． 前記合成修飾型ＲＮＡ分子、その中で前記５'キャップが５'キャップ類似体である、段落９０に記載の方法。
９２． 前記５'キャップ類似体が５'グアノシンキャップである、段落９１に記載の方法。
９３． 前記合成修飾型ＲＮＡ分子が５'三リン酸を含まない、段落８３に記載の方法。
９４． 前記合成修飾型ＲＮＡ分子が、ポリ（Ａ）テール、コザック配列、３'非翻訳領域、５'非翻訳領域、またはそれらの任意の組合せをさらに含む、段落８３に記載の方法。
９５． 前記ポリ（Ａ）テール、コザック配列、３'非翻訳領域、５'非翻訳領域、またはそれらの任意の組合せが１つ以上の修飾ヌクレオシドを含む、段落９４に記載の方法。
９６． 前記１つ以上の修飾ヌクレオシドが、５－メチルシチジン（５ｍＣ）、Ｎ６－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、３，２'－Ｏ－ジメチルウリジン（ｍ４Ｕ）、２－チオウリジン（ｓ２Ｕ）、２'フルオロウリジン、シュードウリジン、２'－Ｏ－メチルウリジン（Ｕｍ）、２'デオキシウリジン（２'ｄＵ）、４－チオウリジン（ｓ４Ｕ）、５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ）、２'－Ｏ－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、Ｎ６，２'－Ｏ－ジメチルアデノシン（ｍ６Ａｍ）、Ｎ６，Ｎ６，２'－Ｏ－トリメチルアデノシン（ｍ６２Ａｍ）、２'－Ｏ－メチルシチジン（Ｃｍ）、７－メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）、２'－Ｏ－メチルグアノシン（Ｇｍ）、Ｎ２，７－ジメチルグアノシン（ｍ２，７Ｇ）、Ｎ２，Ｎ２，７－トリメチルグアノシン（ｍ２，２，７Ｇ）、およびイノシン（Ｉ）からなる群より選択される、段落９５に記載の方法。
９７． 前記合成修飾型ＲＮＡ分子がアルカリホスファターゼで処理される、段落８３に記載の方法。
９８． 前記対象が腺癌を患っている、段落８３に記載の方法。
９９． 前記対象が、線維形成性組織の層を有する腫瘍を含む癌を患っている、段落８３に記載の方法。
１００． 前記癌が膵管腺癌（ＰＤＡＣ）である、段落９８に記載の方法。
１０１． 前記合成修飾型ＲＮＡ分子がＶＥＧＦポリペプチドをコードする、段落８３に記載の方法。
１０２． 前記ＶＥＧＦポリペプチドがヒトＶＥＧＦ（ｈＶＥＧＦ）である、段落８３に記載の方法。
１０３． 前記合成修飾型ＲＮＡ分子が、表３に開示されるポリペプチドをコードする、段落８３に記載の方法。
１０４． 前記対象が哺乳類である、段落８３に記載の方法。
１０５． 前記哺乳類がヒトである、段落１０４に記載の方法。
１０６． 前記組成物が静脈内投与経路または経腫瘍投与経路を介して投与される、段落８３に記載の方法。
１０７． 前記組成物が前記対象の血管系に投与される、段落８３に記載の方法。
１０８． 前記組成物が前記腫瘍への直接注入によって前記対象に投与される、段落８３に記載の方法。
１０９． 前記組成物が、前記合成修飾型ＲＮＡ分子を含むかまたはそれで被覆されている埋め込み型装置を使用して前記対象に投与される、段落８３に記載の方法。
１１０． 前記組成物がカテーテルによって前記対象に投与される、段落８３に記載の方法。
１１１． 前記組成物が内視鏡を介して前記対象に投与される、段落８３に記載の方法。
１１２． 前記組成物が、１００ｎｇ／μｌよりも高い濃度の合成修飾型ＲＮＡ分子を含む、段落８３に記載の方法。
１１３． 前記組成物が、１～２５μｇ／μｌの間の濃度の合成修飾型ＲＮＡ分子を含む、段落８３に記載の方法。
１１４． 前記組成物が、２５μｇ／μｌと５０μｇ／μｌの間の濃度の合成修飾型ＲＮＡ分子を含む、段落８３に記載の方法。
１１５． 前記化学療法剤が、ゲムシタビン、フルオロウラシル、カペシタビン、シプラスチン（ｃｉｐｌａｓｔｉｎ）、イリノテカン、オキサリプラチン、５－フルオロウラシル、フォリン酸、およびエルロチニブからなる群より選択される、段落８３に記載の方法。
１１６． 以下の工程を含む、対象において腫瘍を治療するための方法：
該腫瘍においてヘッジホッグ（Ｈｅｄｇｅｈｏｇ）シグナル伝達を増強するポリペプチドの発現を阻害する合成修飾型ＲＮＡ分子を含む組成物を投与する工程であって、該合成修飾型ＲＮＡ分子の該対象への投与によって、１つ以上の修飾を含まない該ポリペプチドをコードする合成ＲＮＡ分子の投与と比較して自然免疫応答が低下するように、該合成修飾型ＲＮＡ分子が該１つ以上の修飾を含み、かつ、ヘッジホッグシグナル伝達を増強する該ポリペプチドの発現の該合成修飾型ＲＮＡ分子による阻害が該腫瘍と関連する線維形成性組織の量または増殖を低下させる、工程；および、
化学療法剤を該対象に投与する工程であって、該線維形成性組織の量または増殖の低下が該対象に投与される化学療法剤の効果を増大させ、それによって該腫瘍が治療される、工程。
１１７． 前記合成修飾型ＲＮＡ分子がベクターにおいて発現しない、段落１１６に記載の方法。
１１８． 前記合成修飾型ＲＮＡ分子を含む前記組成物が裸の合成修飾型ＲＮＡ分子を含む、段落１１６に記載の方法。
１１９． 前記合成修飾型ＲＮＡ分子を含む前記組成物が、脂質複合体中に存在する少なくとも１つの合成修飾型ＲＮＡ分子を含む、段落１１６に記載の方法。
１２０． 前記合成修飾型ＲＮＡ分子が少なくとも２つの修飾ヌクレオシドを含む、段落１１６に記載の方法。
１２１． 前記少なくとも２つの修飾ヌクレオシドが、５－メチルシチジン（５ｍＣ）、Ｎ６－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、３，２'－Ｏ－ジメチルウリジン（ｍ４Ｕ）、２－チオウリジン（ｓ２Ｕ）、２'フルオロウリジン、シュードウリジン、２'－Ｏ－メチルウリジン（Ｕｍ）、２'デオキシウリジン（２'ｄＵ）、４－チオウリジン（ｓ４Ｕ）、５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ）、２'－Ｏ－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、Ｎ６，２'－Ｏ－ジメチルアデノシン（ｍ６Ａｍ）、Ｎ６，Ｎ６，２'－Ｏ－トリメチルアデノシン（ｍ６２Ａｍ）、２'－Ｏ－メチルシチジン（Ｃｍ）、７－メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）、２'－Ｏ－メチルグアノシン（Ｇｍ）、Ｎ２，７－ジメチルグアノシン（ｍ２，７Ｇ）、Ｎ２，Ｎ２，７－トリメチルグアノシン（ｍ２，２，７Ｇ）、およびイノシン（Ｉ）からなる群より選択される、段落１２０に記載の方法。
１２２． 前記合成修飾型ＲＮＡ分子、その中で前記少なくとも２つの修飾ヌクレオシドが５－メチルシチジン（５ｍＣ）およびシュードウリジンである、段落１２０に記載の方法。
１２３． 前記合成修飾型ＲＮＡ分子が５'キャップをさらに含む、段落１１６に記載の方法。
１２４． 前記合成修飾型ＲＮＡ分子、その中で前記５'キャップが５'キャップ類似体である、段落１２３に記載の方法。
１２５． 前記５'キャップ類似体が５'グアノシンキャップである、段落１２３に記載の方法。
１２６． 前記合成修飾型ＲＮＡ分子が５'三リン酸を含まない、段落１１６に記載の方法。
１２７． 前記合成修飾型ＲＮＡ分子が、ポリ（Ａ）テール、コザック配列、３'非翻訳領域、５'非翻訳領域、またはそれらの任意の組合せをさらに含む、段落１１６に記載の方法。
１２８． 前記ポリ（Ａ）テール、コザック配列、３'非翻訳領域、５'非翻訳領域、またはそれらの任意の組合せが１つ以上の修飾ヌクレオシドを含む、段落１２７に記載の方法。
１２９． 前記１つ以上の修飾ヌクレオシドが、５－メチルシチジン（５ｍＣ）、Ｎ６－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、３，２'－Ｏ－ジメチルウリジン（ｍ４Ｕ）、２－チオウリジン（ｓ２Ｕ）、２'フルオロウリジン、シュードウリジン、２'－Ｏ－メチルウリジン（Ｕｍ）、２'デオキシウリジン（２'ｄＵ）、４－チオウリジン（ｓ４Ｕ）、５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ）、２'－Ｏ－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、Ｎ６，２'－Ｏ－ジメチルアデノシン（ｍ６Ａｍ）、Ｎ６，Ｎ６，２'－Ｏ－トリメチルアデノシン（ｍ６２Ａｍ）、２'－Ｏ－メチルシチジン（Ｃｍ）、７－メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）、２'－Ｏ－メチルグアノシン（Ｇｍ）、Ｎ２，７－ジメチルグアノシン（ｍ２，７Ｇ）、Ｎ２，Ｎ２，７－トリメチルグアノシン（ｍ２，２，７Ｇ）、およびイノシン（Ｉ）からなる群より選択される、段落１２８に記載の方法。
１３０． 前記合成修飾型ＲＮＡ分子がアルカリホスファターゼで処理される、段落１１６に記載の方法。
１３１． 前記対象が腺癌を患っている、段落１１６に記載の方法。
１３２． 前記対象が、線維形成性組織の層を有する腫瘍を含む癌を患っている、段落１１６に記載の方法。
１３３． 前記癌が膵管腺癌（ＰＤＡＣ）である、段落１３１に記載の方法。
１３４． 前記合成修飾型ＲＮＡ分子が、ヘッジホッグ（Ｈｈ）、スムーズンド（Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ；Ｓｍｏ）、パッチド１（Ｐａｔｃｈｅｄ １；Ｐｔｃ１）、およびＧｌｉからなる群より選択されるタンパク質をコードするｍＲＮＡのアンチセンス阻害剤である、段落１１６に記載の方法。
１３５． ヘッジホッグシグナル伝達を増強する前記ポリペプチドがヒトポリペプチドである、段落１１６に記載の方法。
１３６． 前記対象が哺乳類である、段落１１６に記載の方法。
１３７． 前記哺乳類がヒトである、段落１３６に記載の方法。
１３８． 前記組成物が静脈内投与経路または経腫瘍投与経路を介して投与される、段落１１６に記載の方法。
１３９． 前記組成物が前記対象の血管系に投与される、段落１１６に記載の方法。
１４０． 前記組成物が、前記腫瘍への直接注入によって前記対象に投与される、段落１１６に記載の方法。
１４１． 前記組成物が、前記合成修飾型ＲＮＡ分子を含むかまたはそれで被覆されている埋め込み型装置を使用して前記対象に投与される、段落１１６に記載の方法。
１４２． 前記組成物がカテーテルによって前記対象に投与される、段落１１６に記載の方法。
１４３． 前記組成物が内視鏡を介して前記対象に投与される、段落１１６に記載の方法。
１４４． 前記組成物が、１００ｎｇ／μｌよりも高い濃度の合成修飾型ＲＮＡ分子を含む、段落１１６に記載の方法。
１４５． 前記組成物が、１～２５μｇ／μｌの間の濃度の合成修飾型ＲＮＡ分子を含む、段落１１６に記載の方法。
１４６． 前記組成物が、２５μｇ／μｌと５０μｇ／μｌの間の濃度の合成修飾型ＲＮＡ分子を含む、段落１１６に記載の方法。
１４７． 前記化学療法剤が、ゲムシタビン、フルオロウラシル、カペシタビン、シプラスチン（ｃｉｐｌａｓｔｉｎ）、イリノテカン、オキサリプラチン、５－フルオロウラシル、フォリン酸、およびエルロチニブからなる群より選択される、段落１１６に記載の方法。
本発明は以下の実施例によってさらに例証されるが、それらの実施例は本発明をさらに限定するものと決して解釈されてはならない。本願を通して引用される参照文献、特許公報、特許出願公開、および同時係属中の特許出願を含む全ての引用文献の内容はここに参照により明示的に組み込まれる。
本発明は、本明細書に見いだされる特定の実施形態または本発明者が提唱する特定の実施形態に関して、本発明の実施にとって好ましいモードを含むと説明されている。当業者は、本開示を考慮すれば、多数の修飾と改変を、本発明の意図されている範囲から逸脱することなく、例示されている特定の実施形態において行うことができることを理解する。例えば、コドンの重複性のため、タンパク質配列に影響することなく根底にあるＤＮＡ配列に改変を行うことができる。さらに、生物学的な機能上の等価性についての考慮すべき事柄から、生物学的作用の種類または量に影響することなくタンパク質構造に改変を行うことができる。あらゆるそのような修飾は別記の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが意図される。
本明細書に示す実施例は、組織におけるインビボの効率的なタンパク質発現のための方法および組成物に関し、対象となるタンパク質を発現する合成修飾型ＲＮＡ（ＭＯＤ－ＲＮＡ）を含む組成物を組織に接触させることを含む。本願を通して様々な出版物が参照される。本発明が関する技術水準をより完全に記載するために、全出版物およびそれら出版物中に引用される参照文献の開示はその全容をここに参照として組み込まれる。以下の実施例は、請求の範囲を本発明に制限する意図はなく、むしろ特定の実施形態の例示を企図する。当業者が想到する例示的方法のあらゆる変形は、本発明の範囲内であると企図される。
材料および方法
ヒト胎児心筋細胞の単離
心臓を、３００Ｕ／ｍｌのコラゲナーゼＩＩ型および０．６５ｍｇ／ｍｌの細菌ＸＸＩＶ型プロテイナーゼを用いて５～１０分間のみ３７℃で（１５０ｒｐｍで振盪しながら）消化した。次いで、心臓を３００Ｕ／ｍｌのコラゲナーゼＩＩ型を用いて９０分間３７℃で（１５０ｒｐｍで振盪しながら）さらに消化し、１５分の消化ごとに上清を回収してウシ新生児血清と混合し、その後４℃で２分間、３０×ｇで遠心分離した。遠心分離後、上清を回収したが、これが「心臓線維芽細胞（Ｆｂ）」画分であり、ペレットが「心筋細胞（ＣＭ）」画分であった。
両方の画分は、示差的プレーティング（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｐｌａｔｉｎｇ）ステップのためにさらに培養することができる。ＣＭのペレットとＦｂのうち、ＣＭはダーク培地において、Ｆｂは線維芽細胞培地において再懸濁した。ＣＭをゼラチン被覆ウェルに蒔き、一晩培養する。Ｆｂを非ゼラチン化組織培養プレートに蒔き、３７℃で一晩培養する。翌朝、プレート内で接着した間葉系細胞を見ることができる。浮遊細胞であればスローな間葉系細胞とＣＭを含有している。次いで、上清を回収して新しいプレートにさらに３時間置くことで、別の示差的プレーティングステップを実施することができる。この後、多くの場合、上清にはＣＭしか含まれないので、それをゼラチン被覆プレート上に一晩蒔くことでさらに回収可能である。第２プレート上にも間葉系細胞が存在する。各インキュベーション時間の経過後、Ｃａ２＋を含むＰＢＳでプレートを少なくとも５回は必ず洗って結合が緩い細胞を剥がすこと。次いで、適当な培地を入れ替える。
インビボでの使用のための修飾合成ＲＮＡ（ＲＮＡ－ＭＯＤ）の濃縮
ＭＯＤ－ＲＮＡを用いてインビボで標的組織中にタンパク質を発現させるため、発明者らはＭＯＤ－ＲＮＡを少なくとも２５μｇ／μｌまで濃縮した。ＭＯＤ－ＲＮＡを濃縮するため、ＭＯＤ－ＲＮＡを以下のとおり沈殿させた。
１：１０倍量の５Ｍの酢酸アンモニウム（ＮＨ４Ａｃ）を精製したＭＯＤ－ＲＮＡに加え、２．７５倍量の１００％エタノールを加えて十分撹拌し、－２０℃で３０分インキュベートした。次に該液体をＲＮＡａｓｅフリーの１．７ｍｌチューブに分注し、４℃で１５分、１３０００で微量遠心分離した。上清を除去廃棄した後、ペレットを５００μＬの７０％低温エタノールで洗浄し、次いで４℃で１５分、１３０００で２度目の遠心分離を行った。遠心分離後、７０％エタノール上清を除去し、ペレットを５００μｌの７０％冷エタノールで２度目の洗浄に供し、４℃で１５分、１３０００で３度目の遠心分離を行う。遠心分離後、２度目の洗浄の７０％エタノール上清を除去し、ペレットを２時間空気乾燥する。ペレットを、ＴＥ緩衝液を用いて濃度２５μｇ／μｌになるまで再懸濁する。
修飾型ＲＮＡのインビボ注射
心臓への注射のため開心術を行い、筋肉と心臓の両方の注射のために、約１００μｌのＭＯＤ－ＲＮＡを各マウスの骨格筋内および／または心臓に注射した。ＭＯＤ－ＲＮＡは送達ベヒクルとしてのリポフェクタミン（商標）と共に使用され、心臓内および骨格筋内に直接注入された。
実施例１
筋肉細胞で発現するタンパク質をコードするＭＯＤ－ＲＮＡ
図１Ａ～３Ｂに示すように、発明者らは、マウス胎仔心筋細胞とヒト胎児心筋細胞におけるインビトロでの合成修飾型ＲＮＡ（ＭＯＤ－ＲＮＡ）からのｅＧＦＰタンパク質の効率的な発現を実証する。発明者らは、心筋細胞が、形質移入された同一細胞内で、形質移入ＭＯＤ－ＲＮＡから２つ以上のタンパク質を発現し得ることを実証する（データ不掲載）。
実施例２
心臓および筋肉組織におけるインビボのＭＯＤ－ＲＮＡからのタンパク質発現
ルシフェラーゼタンパク質を発現するＭＯＤ－ＲＮＡをマウスの脚筋または心臓内に直接注入した少なくとも３時間後、マウスの筋肉と心臓で高レベルのインビボタンパク質発現が生物発光画像法により検出さた（データ不掲載）。インビボのタンパク質発現は約４～５日続いた（図５Ａ）。
ｃｒｅを発現するＭＯＤ－ＲＮＡからのｃｒｅリコンビナーゼのインビボタンパク質発現は、心臓および脚の筋肉においてβガラクトシダーゼの発現をインビボで誘導するために使用することができたが（データ不掲載）、それは、心臓表面の全ての細胞種がＭＯＤ－ＲＮＡを吸収し、コードされるタンパク質を発現することを実証している（データ不掲載）。ＭＯＤ－ＲＮＡからのインビボタンパク質発現のレベルは、非修飾型ＲＮＡからのタンパク質発現レベルより少なくとも２倍高く（図６）、また、自然免疫応答を誘発しなかった（図７）。
ｈＶＥＧＦをコードするＭＯＤ－ＲＮＡをマウスの筋肉に１０日間注射したとき（１μｇ／日を毎日注射）、ＶＥＧＦタンパク質のインビボ発現が機能し、筋組織における形態的変化が誘導された（データ不掲載）。さらに、ｈＶＥＧＦをコードするＭＯＤ－ＲＮＡは、心筋梗塞のマウスモデルにおいて心臓に対する損傷を修復および予防することができた（図８）。特に、発明者らは、ｈＶＥＧＦポリペプチドをコードする合成修飾型ＲＮＡを心筋梗塞のマウスモデルの心臓にインビボ送達することにより心筋梗塞巣の発生が予防され、虚血発作後に心臓が受ける損傷が有意に予防されることを本明細書において実証した。いくつかの実施形態では、ｈＶＥＧＦポリペプチドをコードする合成修飾型ＲＮＡのインビボ送達は、虚血からの心臓の回復も促進した。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦをコードする合成修飾型ＲＮＡは、心筋内に直接注入することで心筋に送達され得る。
実施例３
化学修飾型ｍＲＮＡを介するインビボでの心臓始原細胞の細胞運命と再生の推進
背景
万能性心臓始原細胞のファミリーは、心発生の間、明白な心筋系列、血管平滑筋系列および内皮細胞系列の多様化および増殖を担う。細胞ベースの再生治療のためにこれら始原細胞の潜在能力を解明することは、規模の拡張可能性、移植、生存、拒絶反応および電気的結合に関わる難しさにより妨げられてきた。最近の研究により、ごく少数の出生後心臓始原細胞が、それらの再生、細胞運命および機能を制御する発生上の合図と共に、多能性幹細胞におけるインビトロ心発生およびクローン検定の間に特定されている。本物のインビボパラクリン因子が特定され、効率的、局所的かつ一過的な態様で送達され得るならば、パラクリン因子のインビボの心臓送達は、特定の血液細胞系列を選択的に増大させるエリスロポエチンとＧＭ－ＣＳＦの既知の臨床用途に類似の、実行可能である代替的な治療ストラテジーとなり得る。
この考えを支持して、最近の研究により、心臓損傷後これらの始原細胞をインビボで増殖させ得る内在性パラクリンシグナルの存在が示唆されているが、ただし始原細胞の正確な部分集合およびパラクリンシグナルの詳細の大部分は不明白である。本明細書で発明者らは、ＥＳ細胞の心発生の間に万能性ヒト心臓始原細胞ファミリーの中で血管始原細胞のプールを増大させる、ヒト胎児心臓における主要な細胞運命切り替えタンパク質因子としてＶＥＧＦ－Ａを特定し、化学修飾型ｍＲＮＡを用いて対応するタンパク質を高レベルでヒトおよびマウスの心筋細胞においてインビトロで、ならびに損傷を受けた後の成体のマウスの心臓において一過的および効率的に発現させた。独立した３種の遺伝子操作されたマウスモデル系の細胞系列追跡とＦＡＣＳ分析を組み合わせることにより、ＶＥＧＦ－Ａが心筋梗塞後に希少な既存のＷＴ－１心外膜始原細胞を増殖し、それを以前に説明されていた間質線維芽細胞様の状態から心臓および血管細胞運命へと駆出させることが記述される。治療効果には、ＷＴ１＋心外膜始原細胞とそれらの血管細胞系列の顕著な増加、毛細血管密度の増加、心臓線維症の顕著な軽減、全体的な心機能の増強および新規の心筋細胞島の産生があげられる。まとめると、ｍｏｄＲＮＡにより、心臓損傷後の内在性心臓始原細胞の増殖と細胞運命を推進し得る既知または新規のパラクリンタンパク質因子の高速のインビボアッセイが可能になる。さらに、ＶＥＧＦ－Ａ ｍｏｄＲＮＡは、損傷後の新規の心臓始原細胞運命スイッチとなり、心血管再生のために内在性心臓始原細胞をインビボで集め、その後に分化させる新規の無細胞治療パラダイムを意味する。
結果
万能心臓始原細胞の細胞運命スイッチとして働き得るパラクリンシグナル候補を特定するため、発明者らは、ヒト胎児心臓においてパラクリン因子の一団を特定し、その後、それをＷＴ－１＋始原細胞プールを含む始原ＩＳＬ１＋始原細胞から血管系列への追跡を可能にする遺伝子操作されたヒトＥＳ細胞ベースのアッセイ系で試験した。ＶＥＧＦ－Ａは、ヒト胎児心臓における最も豊富なアンジクリン（ａｎｇｉｃｒｉｎｅ）因子であり（図９Ａ）、独立した研究により、ＷＴ－１始原細胞の数を顕著に増加させ、次いでそれらを血管内皮系列に変換させるその能力が記述された。ＶＥＧＦ－Ａ１６５を心臓にインビボ送達しての心血管形成誘発は当分野では既知であるが、裸のＤＮＡプラスミド、組み換えタンパク質またはウイルスなどの異なる送達系を使用する多くの研究が、定常的なタンパク質発現および心筋細胞への低効率な形質移入、タンパク質の短い半減期、タンパク質に対する中和性抗体または抗ウイルス免疫応答の発生によってそれぞれ妨害されている。化学修飾型ｍＲＮＡ（ｍｏｄＲＮＡ）は、自然免疫シグナルおよびその結果としての顕著なインターフェロンとサイトカインの放出を回避することにより、体細胞における再プログラム化因子の発現に有効に使用され得る。現在まで、マウス新生児心筋細胞の最も効果的な非ウイルス性形質移入では約８％の形質移入効率が得られている。
発明者らは、非ウイルス性ｍｏｄＲＮＡ法が心筋細胞において利点があるかどうか調査した。マウスとヒトの両方に由来する心筋細胞は、それぞれおよそ８９％または７２％の効率および最小限の毒性で、効率よくｍｏｄＲＮＡによって形質移入され得る（図９Ｂ）。ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）発現（図９Ｄ）またはｈＶＥＧＦ－Ａ発現（図９Ｅ）の経時変化を、生物発光アッセイまたはＥＬＩＳＡアッセイを用いて１００時間まで追った。フィブロネクチン上での管形成アッセイでは、ｈＶＥＧＦ－Ａが心臓細胞を内皮細胞運命への分化をインビトロで推進し得ることが観察された（データ不掲載）。
さらに、ヒト胎児心筋細胞に２種の異なるｍｏｄＲＮＡを形質移入すると、両方のｍｏｄＲＮＡが同時形質移入されるか、どちらも形質移入されず、細胞は異なるｍｏｄＲＮＡを区別できないことが示された（データ不掲載）。非ウイルス性ＤＮＡプラスミドのインビボ送達の結果、心筋細胞への形質移入は低効率（約１％）であった。したがって、ｍｏｄＲＮＡによる心筋細胞の形質移入効率はインビボで調査した。ｍｏｄＲＮＡは、成体マウスの心臓心外膜への１度の注射のみで、時間および用量依存性のＬｕｃリポーターの発現を駆動する（データ不掲載）。発現は３時間ごとに検出でき、２４時間目で５０倍増加のピークが生じ、７２時間までにベースラインレベルに戻った（図５Ｂ）。
ＣｒｅリコンビナーゼｍｏｄＲＮＡをＲＯＳＡ２６－ＬａｃＺマウスに注射すると（データ不掲載）、１度の心外膜注射で約１５％という非常に高効率な左心室での吸収が明らかになったが、これは裸の核酸を用いた先行研究より数桁高く、心筋細胞内注射後の異種タンパク質の発現も低かった。さらに、心筋細胞を含む注射部位のほとんどの細胞（約８０％）（データ不掲載）は成功裏にｍｏｄＲＮＡを形質移入された。インビトロおよびインビボの形質移入後、ｍｏｄＲＮＡの免疫原性レベルを調査し、非修飾ｍＲＮＡ（非ｍｏｄＲＮＡ）と比較した。図１２Ａ～１２Ｆに示すように、ｍｏｄＲＮＡはインビトロおよびインビボで非ｍｏｄＲＮＡより免疫原性が低く、このため形質移入後のタンパク質分泌量と細胞生存率がより高かった。実際、ｍｏｄＲＮＡではなく非ｍｏｄ ＲＮＡが免疫応答を誘発し、インターフェロン（ＩＦＮ）例えばＩＦＮ－ａおよびＩＦＮ－ｂなどの分泌を介しアポトーシスを誘導した（図１２Ｃおよび１２Ｅ）。これらの結果をまとめると、ＶＥＧＦ－Ａ ｍｏｄＲＮＡのインビボ心外膜送達が、心筋梗塞（ＭＩ）後、希少な心臓始原細胞の動員、増殖および／または分化につながり得ることが示される。
３種の独立したマウスモデル系を、ＶＥＧＦ－Ａ ｍｏｄＲＮＡが希少な心臓始原細胞を増殖させ分化系列へと駆動し結果として心血管を再生させる能力についての効果を決定するのに用いた。Ｒｏｓａ２６－ＬａｃＺマウスでは、ｈＶＥＧＦ－Ａ ｍｏｄＲＮＡの心臓再生における役割をＭＩ後インビボで調査した。ＭＩ後のｈＶＥＧＦ－Ａ ｍｏｄＲＮＡの送達の結果は以下のとおりであった：高毛細血管密度（ｄ．、ｈＶＥＧＦ－Ａ ｍｏｄＲＮＡ注射後、ベヒクル処置対照の２．７と比較して、１００細胞当たり９．６の管腔構造が計測された）；線維性の低い部位（ｄ．１、ｈＶＥＧＦ－Ａ ｍｏｄＲＮＡでは１．２％の線維性部位対対照では１１％）；内皮細胞の増殖上昇（ｈＶＥＧＦ－Ａ ｍｏｄＲＮＡでは３．７％のＶＥカドヘリン＋、Ｋｉ６７＋細胞対対照では０．９％）、心筋細胞（ｈＶＥＧＦ－Ａ ｍｏｄＲＮＡでは２．３％のｃＴｒｏｐＴ＋、Ｋｉ６７＋細胞対対照では１．０％）およびＷｔ１＋心外膜細胞（ｈＶＥＧＦ－Ａ ｍｏｄＲＮＡでは２３．６％のＷＴ１＋およびＫｉ６７＋細胞対対照では４．９％）（ｄ．２）；心臓細胞の生存率向上昇（ｄ．３、ｈＶＥＧＦ－Ａ ｍｏｄＲＮＡでは１．７％のＴＵＮＥＬ＋細胞対対照では４．８％）（データ不掲載）。
さらに、ＭＲＩの結果は、偽処置対照（心膜は開いたがＬＡＤは結紮しなかった）では６５．５％、ベヒクル処置の心臓では４５％、ｈＶＥＧＦ－Ａ ｍｏｄＲＮＡ処置の心臓では５２％であり、駆出率において有意な改善が認められた（ｅ，ｐ＝０．００５）。また、ｈＶＥＧＦ ｍｏｄＲＮＡ処置後、心臓収縮運動が改善された（データ不掲載）。さらに、ｑＰＣＲにより、ＷＴ－１の選択的発現が１５倍増えたがＩｓｌｅｔ－１およびＮＫＸ２．５などの他の心臓始原細胞マーカーには変化はないことが明らかにされ、ＷＴ－１＋心外膜始原細胞が選択的に活性化され得ることが示された（補足図４ａ）。また、ＰＥＣＡＭ（図４ｃ）、ビメンチン（図４ｃ）およびコラーゲンＩ型（図３ｃ）の免疫染色ではＶＥＧＦ－Ａ ｍｏｄ ＲＮＡ処置した心臓が、ベヒクル処置の心臓と比べてより多くの内皮様細胞とより少ない線維性部位を有することが（補足図４ｂでも）示された。ｈＶＥＧＦ－Ａ ｍｏｄＲＮＡ注射は、ＭＩが不存在の場合ＷＴ－１＋心外膜始原細胞プールにほとんど影響を与えないか全く与えず、このことはＷＴ－１心外膜始原細胞をそれらが自然発生する心臓適所から動員するには、損傷そのものが主要な要件であることを示している（データ不掲載）。
ｈＶＥＧＦ－Ａ ｍｏｄＲＮＡがＷＴ－１＋細胞数を増大させる能力を直接記述するために、発明者らは内在性のＷＴ－１座にｅＧＦＰがノックインされたマウスを用いた。ＭＩ後、ＷＴ１＋細胞数は偽処置群の２倍になった（図１１Ｃ．１、４．４％対２．１％）。さらに、ＭＩとｈＶＥＧＦ－Ａ ｍｏｄＲＮＡの送達後、ＷＴ１＋細胞数は１３．３％まで上昇した（偽処置群と比べて約７倍の増加）。分別したｅＧＦＰ＋細胞はｑＰＣＲでも調査され、ｈＶＥＧＦ－Ａ ｍｏｄＲＮＡ処置したＷＴ１＋細胞において、ベヒクル処置心臓と比較してＰＥＣＡＭおよびＦｌｋ－１の発現が増加しビメンチンが減少していることが示された（図１４Ｃ）。さらに、ＷＴ１＋細胞上のＦｌｋ－１免疫染色では、ｈＶＥＧＦ ｍｏｄＲＮＡの送達後、ＷＴ１＋細胞はＶＥＧＦ２受容体にも陽性であることが判明した（図１４Ｅ、ＭＩ後ベヒクル処置心臓で６倍対ＭＩ後ｈＶＥＧＦ－Ａ ｍｏｄＲＮＡ処置心臓で３３倍）。
類似の方法を用いて、発明者らは、ＷＴ１系列追跡トランスジェニックマウス（Ｗｔ１／ＣｒｅＥＲＴ２／＋：：Ｒ２６ ｍＴｍＧ）を使用してｍｏｄＲＮＡのインビボ送達後ＷＴ１＋心外膜始原細胞から分化した細胞の細胞運命を調査した。ＭＩ後、ＷＴ１由来細胞数は偽処置対照の２倍であった（図４ｂ．１、２．７％対５．５％）。さらに、ＭＩおよびｈＶＥＧＦ－Ａ ｍｏｄＲＮＡの送達後、ＷＴ１由来細胞数は１７．４％まで上昇した（偽処置対照と比べて約６倍の増加）。分別したｅＧＦＰ＋細胞は、ｑＰＣＲを用いた調査でも、ベヒクル処置の心臓と比較して、ｈＶＥＧＦ－Ａ ｍｏｄＲＮＡ処置した心臓におけるＷＴ１細胞のＰＥＣＡＭおよびｃＴｒｏｐＴの発現の増加と、ビメンチン発現の減少を示した（図１４Ｄ）。ｈＶＥＧＦ－Ａは、インビトロのヒト心発生モデル系においてＷＴ－１＋心臓始原細胞の増殖とそれらの血管内皮細胞への変換を直接もたらすことができ、これは始原細胞運命スイッチとしての直接的な効果と一致する。実に、ＷＴ１由来細胞の免疫染色では、ＷＴ１由来細胞数がｈＶＥＧＦ－Ａ ｍｏｄＲＮＡ送達後３倍増加したことが示された（データ不掲載）。この増加は心外膜上（２倍増）および心筋（約５倍増、図１１Ｅ）でも見いだされた。異なるマーカーでのＷＴ１由来細胞の二重免疫染色は、ｈＶＥＧＦ－Ａ ｍｏｄＲＮＡ送達後、ＷＴ１＋細胞が異なる心臓細胞種に分化したかもしれないことを示した。
先行研究では、心外膜始原細胞が虚血後の心臓に見いだされ得ることと、心外膜表面を維持する線維芽細胞と間質細胞に主として寄与することを示唆している。本明細書は、ｈＶＥＧＦ－Ａ ｍｏｄＲＮＡはこれらの始原細胞を動員し、それらの細胞運命を心血管のエンドポイントへと変化させ得ることを示す。これらの効果は、ＷＴ－１の、主要な３種の心血管細胞種すべて（内皮および血管平滑筋）および心筋細胞への変換増加と関連があるが、前者が主な反応である（図１１）。ＷＴ１系列追跡トランスジェニックマウスモデル（Ｗｔ１／ＣｒｅＥＲＴ２／＋：：Ｒ２６ ｍＴｍＧ）を用いて得た生存性の情報により、系における漏れやすさも調査した。漏れは、この系にあったとしても、僅かに０．０２５％であり得たことが見いだされた（データ不掲載）。
まとめると、ｈＶＥＧＦ－Ａ ｍｏｄＲＮＡは、心筋梗塞後、ＷＴ－１＋心外膜心臓始原細胞のプールを増殖させ、その運命を間質線維芽細胞応答から分化した心血管細胞系列、例えば心臓細胞、内皮細胞および平滑筋細胞へと切り替える直接的効果があるようである（図１１Ｆ）。したがって、ｍｏｄＲＮＡは内在性パラクリン治療剤を特定することができ、経皮カテーテル技術によりヒト心外膜表面を診断するルーチンな能力の観点から、希少な心臓始原細胞を再生治療に対する応答へと駆動する無細胞な方法を示している。これらの研究により他の実質臓器および変性疾患の再生を駆動する並行的パラクリン治療法が可能になることも意図される。
方法の概要
インビトロ転写の鋳型の構築およびＭＯＤＲＮＡの合成は先述されており、当業者には既知である。簡単に説明すると、ＯＲＦ ＰＣＲはｅＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ルシフェラーゼ、ＣｒｅおよびｈＶＥＧＦＡを有するプラスミドを鋳型とした。インビボの実験では、Ｘｇａｌまたはβガラクトシダーゼの免疫染色後、ＣｒｅをＲ２６ｌａｃＺマウスのｈＶＥＧＦ注射部位の標識に用いた。ＭＯＤＲＮＡを、３'－Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇ（５'）ｐｐｐ（５'）Ｇ ＡＲＣＡキャップ類似体、アデノシントリプトファンおよびグアノシトリホスフェート、５－メチルシチジントリホスフェートおよびプソイドウリジントリホスフェートの特注混合物とＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ Ｔ７キット（Ａｍｂｉｏｎ（商標））を用いて合成し、Ａｎｔａｒｃｔｉｃホスファターゼで処理して残基の５'三リン酸を除去した。ＭＬＣ２ｖ－ＹＦＰマウスおよびヒト胎児の心臓から単離した心筋細胞を単離してｅＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ルシフェラーゼまたはｈＶＥＧＦＡ ＭＯＤＲＮＡをインビトロで形質移入した。ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））とＯｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）培地を含有するベヒクルを用いてＭＯＤＲＮＡの形質移入を行った。
Ｗｔ１ｅＧＦＰＣｒｅ／＋マウスが先述されている。誘導型Ｗｔ１／ＣｒｅＥＲＴ２／＋：：Ｒ２６ ｍＴｍＧマウスを、Ｒｏｓａ２６Ｒ－ｍＴｍＧマウスとＷｔ１ＣｒｅＥＲＴ２／＋マウスを交配させて作製した。成体心外膜におけるＷｔ１発現を、心筋梗塞（ＭＩ）の２～３週間前から４ｍｇのタモキシフェンを腹腔内に毎日注射することにより得た。ＭＩを成体のＲ２６ｌａｃＺ、Ｗｔ１ｅＧＦＰＣｒｅ／＋またはＷｔ１／ＣｒｅＥＲＴ２／＋：：Ｒ２６ ｍＴｍＧマウスにおける恒久的な左下行前動脈（ＬＡＤ）の結紮により誘導し、ＭＩ後同時にベヒクルまたはｈＶＥＧＦ－Ａ ｍｏｄＲＮＡが投与された。心臓をコラゲナーゼＩＩで消化し、ＧＦＰ＋細胞を定量化し（ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩ）、Ｆｌｋ－１発現が決定された（ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩ）。ベヒクルまたはｈＶＥＧＦＡで処置した心臓をＭＩ後７日目、１４日目または２８日目に摘出し、免疫蛍光のために処理した。ＩｍａｇｅＪ（商標）を用いてＭＩ後の心臓の凍結切片の免疫蛍光定量化を行った。注射部位のＭＩ後の心臓から単離した、Ｗｔ１ｅＧＦＰＣｒｅ／＋マウスまたはＷｔ１／ＣｒｅＥＲＴ２／＋：：Ｒ２６ ｍＴｍＧマウス由来のＦＡＣＳ分別したＧＦＰ＋細胞の全ＲＮＡを逆転写し、ＳＹＢＲグリーン（商標）と内在性対照としてＧａｐｄｈとｂＡｃｔｉｎを用いて、リアルタイムｑＰＣＲを行った。２２ＤＤＣＴ法により倍率変化が決定され、ベヒクル処置の心臓と比較して提示された。ＭＲＩ分析をベヒクルまたはｈＶＥＧＦＡ ｍｏｄＲＮＡのいずれかを注射したＭＩ後７日目および２１日目のＲ２６ｌａｃＺマウスについて行い、梗塞巣のサイズと心機能の経時的変化を決定した。
方法
ＩＶＴ鋳型の構築とｍｏｄＲＮＡの合成
インビトロ転写（ＩＶＴ）鋳型構築物の生産およびその後のＲＮＡ合成が先述されている。オリゴヌクレオチド配列をＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標）（コーラルヴィル）により合成した。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）ＰＣＲはＡｄｄｇｅｎｅ（商標）のｅＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ（商標）、ルシフェラーゼ、ＣｒｅおよびヒトＶＥＧＦ－Ａを有するプラスミドを鋳型とした。ＰＣＲ反応を、ＨｉＦｉ Ｈｏｔｓｔａｒｔ（商標）（ＫＡＰＡ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（商標））を製造者の指示に従い用いて行った。スプリント介在性ライゲーションをＡｍｐｌｉｇａｓｅ（商標）耐熱性ＤＮＡリガーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標））を用いて実施した。ＵＴＲ連結は２００ｎＭのＵＴＲオリゴと１００ｎＭのスプリントオリゴの存在下で行った。全中間ＰＣＲ産物および連結産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ（商標）スピンカラム（Ｑｉａｇｅｎ（商標））で精製してからさらに処理した。鋳型ＰＣＲ単位複製配列をｐｃＤＮＡ ３．３－ＴＯＰＯ ＴＡクローニングキット（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））を用いてサブクローニングした。プラスミド挿入断片は制限切断により切り出され、ＳｉｚｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））を用いて回収された後にｔａｉｌ ＰＣＲの鋳型として使用された。ＲＮＡを、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（商標）Ｔ７キット（Ａｍｂｉｏｎ（商標））と４０ｍＬの反応ごとに１．６ｍｇの精製ｔａｉｌ ＰＣＲ産物を鋳型として用いて合成した。３０－Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇ（５０）ｐｐｐ（５０）Ｇ ＡＲＣＡキャップ類似体（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（商標））、アデノシントリホスフェートおよびグアノシントリホスフェート（ＵＳＢ）、５－メチルシチジントリホスフェートおよびプソイドウリジントリホスフェート（ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標））を含む特注のリボヌクレオシド混合物が使用された。ヌクレオチド反応の最終濃度は、キャップ類似体は６ｍＭ、グアノシントリホスフェートは１．５ｍＭ、他のヌクレオチドは７．５ｍＭであった。ＲＮＡはＡｍｂｉｏｎ（商標）ＭＥＧＡｃｌｅａｒ（商標）スピンカラムを用いて精製し、次いでＡｎｔａｒｃｔｉｃホスファターゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（商標））を用いて３０分間３７℃で処理して残基の５０トリホスフェートを除去した。処理したＲＮＡを再度精製し、Ｎａｎｏｄｒｏｐ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標））で定量化した。
ｍｏｄＲＮＡ形質移入
ｍｏｄＲＮＡ形質移入をＲＮＡｉＭＡＸ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））を用いて行った。初めに、ｍｏｄＲＮＡと試薬をＯｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）基本培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））で希釈した。１００ｎｇ／ｍＬのｍｏｄＲＮＡを希釈し、ＭＯＤＲＮＡ １マイクログラム当たり５ｍＬのＲＮＡｉＭＡＸ（商標）を希釈し、これらの構成要素をプールしてから室温で１５分インキュベートし、培地に分配した。ＭＯＤＲＮＡ形質移入は、全てのインビトロの実験でＯｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）に２％ＦＢＳを加えた中で行い、全てのインビボの実験でＯｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）のみの中で行った。
マウスおよびヒト初代細胞の単離と培養
ＭＬＣ２ｖ－ＹＦＰマウスが先述されている。マウス新生児およびヒト胎児の心臓を先述したようにコラゲナーゼＩＩ（Ｓｉｇｍａ（商標））により個々の細胞に分解した。心臓細胞は５％ＦＢＳ、１０％ウマ血清および１μｇ／ｍｌのインスリンを含有するＤＭＥＭ中で培養した。マウス成体の心臓はコラゲナーゼＩＶ（Ｓｉｇｍａ（商標））を用いて消化し、心臓細胞を、１０％ＦＢＳを含有する間葉系幹細胞成長培地（Ｌｏｎｚａ（商標））で培養した。これらの心臓細胞へのｅＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ（商標）、ｌｕｃまたはｈＶＥＧＦ－Ａ ＭＯＤＲＮＡの形質移入は、ＲＮＡｉＭＡＸ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））とＯｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）基本培地の混合物を含有するベヒクルを用いて実施した。翻訳されたｈＶＥＧＦ－Ａタンパク質の分泌は、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ（商標））を用いて定量化した。ｈＶＥＧＦ－Ａ ｍｏｄＲＮＡ（１μｇ）を形質移入した全ての心臓細胞は内皮細胞と類似していたが、ベヒクル処置の心臓は内皮の運命を適用できなかった（データ不掲載）。心臓内皮遺伝子プロファイリングの対照として使用される心臓内皮増殖活性の高いヒト内皮細胞（ＯＥＣ）（図９ａ）を先述のように生成した。
ＩＶＩＳシステムを用いてのルシフェラーゼ＋細胞のインビボ検出
ベヒクル（ＲＮＡｉＭＡＸ（商標）とｏｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）基本培地の混合物）またはｌｕｃ ＭＯＤＲＮＡ（１００μｇ／心臓）を野生型Ｂａｌｂ／ｃマウス心臓の左心室に投与した。異なる時点（３～２４０時間）において注射マウスの生物発光画像を撮影した。Ｌｕｃ＋細胞を可視化するため、ルシフェリン（１５０ｌｇ／ｇ体重；Ｓｉｇｍａ（商標））を腹腔内注射（ｉ．ｐ．）した。１０～２０分後、マウスをキシラジン（２０ｍｇ／ｍｌ）とケタミン（１００ｍｇ／ｍｌ）で麻酔し、ＩＶＩＳ１００（商標）電荷結合素子画像システムを用いて２分間撮像した。画像データを分析し、Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（商標）で定量化した。シグナル強度（細胞数を表す）が異なる色のスペクトルにより示された。予想どおり、Ｌｕｃ＋細胞は、濃度および時間依存性の態様でｌｕｃ ＭＯＤＲＮＡを注射した心臓で観察されたが（データ不掲載）、ベヒクルのみを注射した心臓ではシグナルは一切認められなかった（データ不掲載）。
心外膜追跡マウスの作製
Ｗｔ１ｅＧＦＰＣｒｅ／＋マウスが先述されている。誘導型Ｗｔ１ＣｒｅＥＲＴ２／＋：：Ｒ２６ｍＴｍＧマウスは、先に示したように、Ｗｔ１ＣｒｅＥＲＴ２／＋系とＲｏｓａ２６ｍＴｍＧリポーターマウスとの交配およびジェノタイピングにより作製した。成体マウスを、２～３週間の間、週２回タモキシフェン（Ｔａｍ）４ｍｇを腹腔内注射（ｉ．ｐ．）する処置をしてＣｒｅを誘導した。Ｔａｍ投与完了の１週間後、以下に記述のように左下行前動脈（ＬＡＤ）冠動脈の結紮により心筋梗塞（ＭＩ）を誘導した。その後心臓は、ＦＡＣＳ、免疫蛍光およびリアルタイムｑＰＣＲ分析を組み合わせて７日後にｅＧＦＰ発現と心筋マーカーを評価した。心外膜始原細胞の細胞運命切り替えの監視については、誘導型Ｗｔ１ＣｒｅＥＲＴ２／＋：：Ｒ２６ｍＴｍＧモデルに焦点を当て、Ｗｔ１－ｅＧＦＰ＋誘導体の特異的時間的標識化を確認した。ＭＩの存在または非存在下タモキシフェンでベヒクル処置されたマウスを対照として用いたが、重大なことに、ｅＧＦＰ＋心筋細胞様細胞はこれらの心臓では一度も観察されなかった。
心筋梗塞の誘導
マウスを用いた外科的実験的手法は全てマサチューセッツ総合病院動物管理使用委員会が承認したプロトコルに従い実施した。イソフルランで麻酔した野生型Ｃ５７Ｂｌ／６、Ｒｏｓａ２６－ＬａｃＺ、Ｗｔ１ｅＧＦＰＣｒｅ／＋またはＷｔ１ＣｒｅＥＲＴ２／＋：：Ｒ２６ｍＴｍＧマウス（６～８週齢）において恒久的ＬＡＤ結紮によりＭＩを誘導した。心血管再生におけるｈＶＥＧＦ－Ａ ＭＯＤＲＮＡの効果を決定するため、ベヒクルまたはｈＶＥＧＦ－Ａ ＭＯＤＲＮＡ（１００μｇ／心臓）をＬＡＤ結紮直後の梗塞部に注射した。各実験には偽処置対照（心外膜は開いたが、ＬＡＤは結紮しなかった）も含めた。心臓は結紮後７日目に回収した。心尖部付近の梗塞部は、新鮮凍結してＲＮＡを単離してからリアルタイムｑＰＣＲ試験に供したか、または４％ＰＦＡ中に固定して凍結切片化し免疫染色分析に供した。
Ｗｔ１－ｅＧＦＰ＋細胞の単離および特徴づけ
ＭＩ後ベヒクルまたはｈＶＥＧＦ－Ａ ＭＯＤＲＮＡで処置したＷｔ１ｅＧＦＰＣｒｅ／＋またはＷｔ１ＣｒｅＥＲＴ２／＋：：Ｒ２６ｍＴｍＧマウスから回収した心臓の尖部が前述したようにＬＡＤ結紮の７日後に回収され、コラゲナーゼＩＩ（Ｓｉｇｍａ（商標））を用いての酵素消化により処理され、単細胞浮遊液を得た。生存ｅＧＦＰ＋細胞を、ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩ（商標）セルソーターを用いて４８８ｎｍのレーザー光でｅＧＦＰ（５２０／３０ｎｍチャネルで回収）を励起し、５３６ｎｍのレーザー光でＰＩ（６１０／６２０ｎｍチャネルで回収）を励起して全心臓細胞集団から単離した。対照として、ベヒクルまたはｈＶＥＧＦ－Ａ ＭＯＤＲＮＡで処置した無損傷のＷｔ１ｅＧＦＰＣｒｅ／＋またはＷｔ１ＣｒｅＥＲＴ２／＋：：Ｒ２６ｍＴｍＧマウス由来の心臓も７日後に分析した。細胞をＡＰＣが結合されたＦｌｋ－１抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（商標））と共に４℃で３０分インキュベートした後、ＰＢＳ／２％ＦＢＳで３度洗ってハンクス液中に再懸濁した。細胞分別とフローサイトメトリー分析をＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩ（商標）セルソーターとＦｌｏｗＪｏ（商標）ソフトウェアを用いて行った。後述するように、ｅＧＦＰ＋線維芽細胞、心筋細胞、平滑筋および内皮細胞を免疫染色および細胞数により評価した。
ＲＮＡ単離および遺伝子発現プロファイリング
回収した心臓の尖部から、製造者の指示に従い、ＲＮｅａｓｙ（商標）ミニキット（Ｑｉａｇｅｎ（商標））を使用して全ＲＮＡを単離し、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ（商標）ＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））を使用して逆転写した。リアルタイムｑＰＣＲ分析をＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（商標）（Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｔ（商標） ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｋｉｔ（商標）、Ｑｉａｇｅｎ（商標））を用いてＭａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ ｒｅａｌｐｌｅｘ ４ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（商標）（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆｆ（商標））で行った。データはＧａｐｄｈとβアクチン発現に対し適宜正規化した（内在性対照）。遺伝子発現の倍率変化は２２ＤＤＣＴ法により決定し、ベヒクル処置の心臓に対して提示した。相補的ＤＮＡのＰＣＲプライマー配列を本明細書の表２に示す。ｅＧＦＰ＋始原細胞を特徴づけるため、ＬＡＤ結紮７日後にＷｔ１ｅＧＦＰＣｒｅ／＋またはＷｔ１ＣｒｅＥＲＴ２／＋：：Ｒ２６ｍＴｍＧマウス由来のｈＶＥＧＦ－Ａ ＭＯＤＲＮＡ処置またはベヒクル処置の心臓をコラゲナーゼ消化した後ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩ（商標）セルソーターを用いてＦＡＣＳで分別したｅＧＦＰ＋細胞から、全ＲＮＡを得た。
免疫検出法
免疫染色を、マウス新生児および成体の心臓細胞培養物、ヒト胎児心臓細胞培養物、ならびに偽処置心臓、ＭＩ後ベヒクルまたはｈＶＥＧＦ ＭＯＤＲＮＡで処置された心臓の凍結切片に対し、以下の抗体を用いての標準プロトコルを使用して行った：心筋ｃＴｎＴ（ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ（商標））、心筋ＭＨＣ、ビメンチン（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ（商標））、βガラクトシダーゼ、コラーゲンＩ、心筋ｃＴＮＩ、ＣＤ３１、ＣＤ１４４、ｖＷＦ、ＳＭＭＨＣ、Ｗｔ１およびＫｉ６７（Ａｂｃａｍ（商標））ならびにＦｌｋ１（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（商標））。抗ｅＧＦＰ抗体の特異性は、存在するとしてもほんの少数のｅＧＦＰ＋細胞を心外膜領域に有する偽処置心臓の免疫染色により確認された（これは系の「漏れやすさ」であり得る）。凍結切片は、毛細血管密度を決定するためイソレクチンＢ４（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂ（商標））で免疫染色し、アポトーシスを検出するためＴＵＮＥＬ染色（Ｒｏｃｈｅ（商標））を、それぞれ製造者の指示に従い行った。線維症の度合いを調査するため、コラーゲン原繊維に特異結合するピクロシリウスレッド（ｐｉｃｒｏｓｉｒｉｕｓ ｒｅｄ）を用いて凍結切片を染色した。免疫染色画像の定量化をＩｍａｇｅＪ（商標）ソフトウェアで実施した。
核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）
野生型Ｃ５７Ｂｌ／６、Ｒｏｓａ２６－ＬａｃＺ、Ｗｔ１ｅＧＦＰＣｒｅ／＋またはＷｔ１ＣｒｅＥＲＴ２／＋：：Ｒ２６ｍＴｍＧマウス（６～８週齢）をベヒクルまたはｈＶＥＧＦ－Ａ ＭＯＤＲＮＡで処置し、ＬＡＤ結紮後１日目と２１日目にＭＲＩ評価に供した。梗塞巣のサイズは１５～４０％の範囲内であり、フォローアップＭＲＩ分析を同一マウスに対しＭＩの２１日後に行い梗塞巣のサイズと心機能の経時的変化を決定した。マウスは１～２％のイソフルラン／空気の混合物で麻酔した。心電図（ＥＫＧ）プローブ、呼吸プローブおよび体温プローブを加温パッド上で保温されているマウスに載置した。画像は４．７Ｔ Ｂｒｕｋｅｒ Ｂｉｏｓｐｅｃ（商標）で得た。心臓尖部から底部までに及ぶ短軸断層のスタックおよび直交長軸断層を心電図（ＥＣＧ）トリガー呼吸同期Ｆｌａｓｈ－ＣＩＮＥシーケンスで、以下のパラメータを用いて得た：繰り返し時間（ＴＲ）２５ミリ秒、エコー時間（ＴＥ）２．８ミリ秒、積算回数４、スライス厚１ｍｍ、マトリックスサイズ１９２×１９２（２．５６×２．５６ｃｍ）、５～７フレーム／シーケンス（ＲＲインターバルによる）。その結果、１スライス当たりの収集時間は約５分であった。左心室心尖部から心底部にわたり５枚の短軸スライスが得られた。左心室（ＬＶ）駆出率は、拡張期ＬＶ体積で除算した、心臓拡張期ＬＶ体積と心臓収縮期ＬＶ体積の差として求めた。ＣＩＮＥ－ＭＲＩの獲得と分析は処置群を盲検化して行った。
統計学的分析
特に断らない限り、統計学的有意差はスチューデントｔ検定でｐ＜０．０５を有意とし決定した。数値は平均値±平均値の標準誤差として報告された。箱ひげ図においては、箱とバーは２５、５０および７５パーセンタイルを、ひげは極値をそれぞれ表す。
実施例４
ウサギにおけるｈＶＥＧＦ－Ａ ｍｏｄＲＮＡに基づいた心臓再生治療ストラテジーの臨床前試験
ウサギを用いる実験によって、臨床前試験を容易にするためのＭｏｄＲＮＡの中間動物モデル（ウサギ）を構築し得る。ＭｏｄＲＮＡ導入の安全性を最適化し、心外膜表面にＭｏｄＲＮＡを送達する代替法（心筋への注射を必要としないヒドロゲルまたは他の生体高分子であり、それ故、ＭｏｄＲＮＡの全身的導入のリスクを軽減する）を評価するための実験も実施され得る。実験では、ｈＶＥＧＦ－Ａ ＭｏｄＲＮＡが急性ＭＩ同様、慢性ＭＩの治療にも使用可能かどうか評価することができる。
ＭｏｄＲＮＡ駆動性遺伝子発現を、未処置のウサギ心臓において調査することができ、マウスにおいて機能する系はウサギにおいても機能することが立証される。ウサギ心臓におけるＬａｃＺ ＭｏｄＲＮＡ（１００ｕｇ、５００ｕｇ、１ｍｇ）の用量反応は心外膜注射を用いて決定することができ、１：１の用量比でアルギン酸カルシウムゲルまたは他の生体高分子を介して注射により送達した場合のウサギにおけるＬａｃＺ ＭｏｄＲＮＡ用量反応と比較することができる。両送達法で、ＭｏｄＲＮＡに誘導されたＬａｃＺ発現は、表層画像および断面画像を用いて視覚化して、その２つの方法により発現面積対発現深度を評価することができる。両送達法で、βガラクトシダーゼ対トロポニン、ＰＥＣＡＭ、ビメンチンおよびｓｍＭＨＣを同時染色する断面染色計画により、全細胞種が形質移入されていることを確認することができる。さらに、ＭｏｄＲＮＡ導入の両方法で、該作用物質の全身的導入に対する安全性を判定するために末梢血管腫形成の相対評価を行うことができる。
ウサギにおける急性ＭＩの背景で注射されるｈＶＥＧＦ－Ａ ＭｏｄＲＮＡ
ＭＩは、前室間動脈の中間部の結紮により実施され得る。ｈＶＥＧＦ－ＡとＬａｃＺの同時形質移入を、ＭＩが計画されたときに実行され得る。持続性のＬａｃＺ発現により標識される細胞は、こうしてＶＥＧＦ ＭｏｄＲＮＡが注射された細胞（注射またはゲルの表面添加の両方が使用可能）を標識することができる。ＭＩ後、処置した（ｍｏｄＲＮＡの注射およびゲルによる導入の両方についての）心臓組織の以下の遺伝子のＲＴ－ＰＣＲを行った（ＭＩなしの開胸術／心膜切除対照と比較）：Ｗｔ１、Ｔｂｘｌ８、Ｎｋｘ２．５、Ｉｓｌ１、ＴｎＴ、ＰＥＣＡＭ、ビメンチン、ｓｍＭＨＣおよびＦｌｋ１。心筋断面染色により、分化して心外膜表面から心筋へと移動する心外膜Ｗｔ１細胞の間接的な運命マッピングとしてＷｔ１／ＬａｃＺ／Ｋｉ６７の同時局在を評価できる。心筋断面染色により、毛細血管密度（ＰＥＣＡＭ）、線維芽細胞密度（ビメンチン）、心筋細胞、および細胞死（ＴＵＮＥＬ）を評価することができる。トリクローム染色した処置心臓および未処置心臓の短軸断面画像により、処置心臓（２つの処置法）対未処置心臓の瘢痕量を評価することができる。心臓ＭＲ画像法は、ＭＩ後の心臓の収縮機能に対するＭｏｄＲＮＡ処置の効果を評価するために処置および未処置の動物において実施することもできる。
心筋梗塞後のＷｔ１"細胞の上方調整期間の決定
プログラムされた心筋梗塞は、Ｗｔ１遺伝子座の対立遺伝子の１つにＧＦＰが存在する遺伝子改変マウスにおいて引き起こすことができる。梗塞を起こさせた動物は、Ｗｔ１細胞活性化の経時変化を決定するために（ＦＡＣＳ）、８週間まで毎週安楽死させることができる。同じマウス系列の第２組に梗塞を引き起こし、（先述のとおり、ＭＩと同時の処置に対し）ＭＩ後に一連のインターバルでｈＶＥＧＦ－Ａ ＭｏｄＲＮＡ処置を行うことができる。ＶＥＧＦ ＭｏｄＲＮＡ処置は、ＭＩ後１週間の間隔で８週間まで、または本明細書において先述したように瘢痕量の免疫組織化学的評価で評価した場合に影響が認められなくなるまで、異なる動物において実施することができる。左心室駆出率も、心臓の核磁気共鳴画像法により評価することができる。ｍｏｄ－ＲＮＡを投与されていない負の対照は、現在未知のパラメータであるが、Ｗｔ１発現細胞のＭＩ後の増殖持続期間の評価を提供することができる。これらの分析により、ＭＩの１週間後に観察された結果がどの程度持続性があるか、何らかの退行が生じるか否かを評価できる。理論により制限されることを望むものではないが、複数の処置が必要であり得る。亜急性梗塞巣または慢性の梗塞巣がｈＶＥＧＦ－Ａ ｍｏｄ－ＲＮＡで有効に治療されるかどうかを決定するために、ｈＶＥＧＦ－Ａ ｍｏｄ－ＲＮＡをＭＩの後に（１～８週間まで、１週間ごとの増分）投与することができる。Ｗｔ１＋細胞刺激とその後の瘢痕サイズに及ぼす効果の大きさは本明細書において上述したように評価することができる。マウスで治療機会域が定義されると、同じ実験をウサギで繰り返すことができる。
実施例５
ｈＶＥＧＦ－Ａの化学修飾型ｍＲＮＡの局所的送達による膵臓腺癌薬治療の強化および腫瘍増殖にかかわる他の要因
膵管腺癌（ＰＤＡＣ）関連の致死率は初診から５年以内で９５％である。ゲムシタビンなどの細胞傷害性化学療法剤はインビトロでは腺癌に非常に有効であるが、臨床現場ではその効果は限定的である。この最適以下の応答は、多くの腫瘍において腺癌細胞を取り囲む間質細胞からなる線維形成層をこのような作用物質が通過不能であることに付随して起こる疑いがある１，２。この間質細胞塊は腫瘍により増殖し個体の腫瘍塊の８０％を構成し得るのだが、その存在は化学療法に対する臨床反応不良と相関がある３。進行型ＰＤＡＣの代替的な治療ストラテジー、特に腫瘍への血液供給量を減らすＶＥＧＦ阻害剤の使用も臨床現場では成功しなかった４～７。したがって、細胞傷害性化学療法剤の効果を増強するこの線維形成層の透過性上昇および／または縮小が膵臓腺癌治療の新規補助となり得る１，２。ＶＥＧＦ阻害に成功していないので、ＶＥＧＦの局所的送達が、単独または既存の細胞傷害性化学療法剤との併用で、ＰＤＡＣの増殖阻害の新規パラダイムになることがあり得る。他のいくつかの分子標的、特にヘッジホッグ（Ｈｈ）をＰＤＡＣ線維形成の低下のために活用することができるが、そのヘッジホッグは、ＰＤＡＣ腫瘍と関連のある線維形成組織の増殖の中心であることが示されている８。Ｈｈリガンド依存性シグナル伝達の阻害は、膵管癌の増殖を阻害する有望なストラテジーである１，９。いくつかのＨｈリガンドが標的とされており、これにはＨｇの結合パートナーであるスムーズンド（Ｓｍｏ）とパッチド１（Ｐｔｃ１）が含まれる８，１０。下流エフェクター、特にＧｌｉも標的とされている１１，１２。機序としては有望であるが、全身送達薬剤を用いるＶＥＧＦおよびＨｈ関連因子の標的化は、有害な副作用が懸念され困難である。
ＰＤＡＣ腫瘍を取り囲む線維形成組織の存在は、化学療法剤の侵入を阻み、腺癌細胞を標的とする細胞傷害性化学療法剤の臨床的失敗をもたらす。ＶＥＧＦ－Ａの化学修飾型ｍＲＮＡをＰＤＡＣ腫瘍内および周囲に局所的に送達することで、この線維形成性被膜をバイパスし、腺癌組織への薬剤送達を改善することができる血管新生をもたらすことができ、そうして応答不全が低下し得る１３。この局所的送達ストラテジーは、全身的ＶＥＧＦ発現に関連する転移性播種のリスク回避に役立ち得る。化学修飾型ＲＮＡの局所的送達はヘッジホッグ関連シグナル伝達の阻害にも有用であり得るが、そのヘッジホッグ関連シグナル伝達は腫瘍増殖およびこの線維形成組織の増殖に関与することが示されている８。本明細書では、ＰＤＡＣ線維形成腫瘍間質の特性を同様に改変し治療への臨床的反応を改善する、Ｈｈリガンド（ＳｍｏやＰｔｃ１など）および下流エフェクター（Ｇｌｉなど）に対する化学修飾型アンチセンスＲＮＡの使用に関する組成物および方法を説明する９～１２。
本明細書では、化学修飾型ＲＮＡを膵臓に導入しタンパク質の局所的発現を推進するためのインビボ方法の開発を説明する１３。このタンパク質発現系は、ＰＤＡＣの既存の化学療法剤の代替として評価され得る。
野生型マウス膵臓における修飾型ＲＮＡの実質細胞への直接注入によるルシフェラーゼの発現
化学修飾型ＲＮＡを用いてＬａｃＺおよびルシフェラーゼをマウス膵臓においてインビボで発現させることができる。この手法は外転および修飾型ＲＮＡの組織への直接注入と共に膵臓の外科的露出を含み得る。発現を達成する最適用量が評価され得る。
マウス膵臓におけるルシフェラーゼのインビボの発現は前段落に記載の手法により達成され得る。用量はＬａｃＺ実験から知り得る。この実験を行う目的は、注射後のタンパク質発現の経時変化を決定することである。ＩＶＩＳイメージングを発現追跡に使用することができる。
野生型マウス膵臓における修飾型ＲＮＡの実質細胞への直接注入によるＶＥＧＦ－Ａの発現
実行可能性は、ＶＥＧＦ－Ａ修飾型ＲＮＡのインビボ注射により決定され得る。用量は、この実施例で上述した実験結果により決定され得る。タンパク質発現は、注射から４８時間以内に免疫組織化学法を使用して測定され得る。
ＶＥＧＦ－Ａ修飾型ＲＮＡのインビボ注射は、タンパク質発現の生理学的「読み出し」を決定するために分析され得る。処置動物対偽処置動物の血管新生は、注射の３週間後に行われる肉眼による観察と塩基性のヘマトキシリン・エオシン染色を使用して比較することができる。
ＰＤＡＣマウスモデル（ＬＳＬ－ＫｒａｓＧ１２Ｄ；ｐ５３ Ｌ／＋）１４の膵臓腺癌腫瘍におけるＶＥＧＦ－Ａの発現と腫瘍血管新生の評価およびかかる処置腫瘍内のゲムシタビンレベルに及ぼす推定効果
膵臓腫瘍および周辺組織へのＶＥＧＦ－Ａインビボ注射の影響は、注射後の複数時点（１、２および３週間）で組織学的分析による腫瘍組織診断（血管新生、腫瘍サイズ、線維形成性被膜）により決定され得る。
ＶＥＧＦ－Ａは膵臓腫瘍および周辺組織に注射され得る。ゲムシタビンは標準的態様で複数時点に投与され得る（同時に、ならびに修飾型ＲＮＡ注射の１、２および３週間後に）。腫瘍組織学上の影響（血管新生、腫瘍サイズ、線維形成性被膜）は注射後の複数時点（１、２および３週間）での組織学的分析により評価され得る。処置腫瘍対未処置腫瘍のゲムシタビンレベルの直接的アッセイは、ＶＥＧＦが腫瘍内で作用物質レベルを上昇させるかどうか評価するために実施されよう１，２。この一連の実験により、ＶＥＧＦ－Ａとゲムシタビンの投与の間の最適なタイミングを決定できる。これらの実験は、ＨｈのリガンドであるＳｍｏ、Ｐｔｃ１、ならびにＨｈの下流エフェクターであるＧｌｉに対する化学修飾型アンチセンスＲＮＡを用いて反復可能である。膵臓腺癌のマウスモデルを用いて、Ｓｍｏ、Ｐｔｃ１およびＧｌｉに対する化学修飾型アンチセンスＲＮＡが注射され得る。注射部位におけるタンパク質発現の低下は免疫組織化学的に確認され得る。組織塊はウエスタンブロット法で評価することもできる。化学修飾型アンチセンスＲＮＡがタンパク質発現のレベルを低下させ得ることが一旦確認されると、このような腫瘍縮小効果の試験を本明細書において上述のように前述のモデル系において実施することができる。
参照文献：
Figure 0007439019000008
Figure 0007439019000009
（表８）抗体の供給元
Figure 0007439019000010
（表９）ＰＣＲプライマー
Figure 0007439019000011
参照文献
参照文献は、ここに、それらの全体の参照によりそれぞれ本明細書に組み込まれる。

Claims (12)

  1. 心臓虚血の状態を有する対象における、心臓性組織における心臓線維症の軽減における使用のための、VEGFポリペプチドをコードする合成修飾型ＲＮＡ分子であって、VEGFポリペプチドがヒトVEGF-Aポリペプチド（hVEGF-A）であり、少なくとも５－メチルシチジン（５ｍＣ）およびシュードウリジンを含む、前記合成修飾型ＲＮＡ分子。
  2. VEGFポリペプチドをコードする合成修飾型ＲＮＡ分子の対象への投与によって、VEGFポリペプチドをコードする非修飾型合成ＲＮＡ分子の投与と比較して自然免疫応答が低下する、請求項１記載の使用のための合成修飾型ＲＮＡ分子。
  3. 虚血の状態が、うっ血性心不全、心筋症、心筋梗塞、組織虚血、アテローム性硬化症、構造的心疾患、冠動脈疾患、心筋虚血、感染性心筋炎、薬物または毒素誘導性の筋異常、先天性心臓疾患、冠動脈機能不全、冠動脈樹機能不全および冠動脈側副血行路形成から選択される疾患または障害によって引き起こされる、請求項１又は２記載の使用のための合成修飾型ＲＮＡ分子。
  4. i) 合成修飾型ＲＮＡ分子が、ベクターにおいて発現しない、および／または、
    ii) 合成修飾型ＲＮＡ分子が、裸の合成修飾型ＲＮＡ分子を含む、および／または、
    iii) 合成修飾型ＲＮＡ分子が、脂質複合体中に存在する、
    請求項１～３のいずれか一項記載の使用のための合成修飾型ＲＮＡ分子。
  5. 合成修飾型ＲＮＡ分子が５'キャップをさらに含み、好ましくは該５'キャップは５'キャップ類似体であり、好ましくは該５'キャップ類似体は５'ジグアノシンキャップである、請求項１～４のいずれか一項記載の使用のための合成修飾型ＲＮＡ分子。
  6. 合成修飾型ＲＮＡ分子が５'三リン酸を含まない、請求項１～５のいずれか一項記載の使用のための合成修飾型ＲＮＡ分子。
  7. 合成修飾型ＲＮＡ分子が、ポリ（Ａ）テール、コザック配列、３'非翻訳領域、５'非翻訳領域、またはそれらの任意の組合せをさらに含み、好ましくは該ポリ（Ａ）テール、該コザック配列、該３'非翻訳領域、該５'非翻訳領域、または該それらの任意の組合せが、５－メチルシチジン（５ｍＣ）、Ｎ６－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、３，２'－Ｏ－ジメチルウリジン（ｍ４Ｕ）、２－チオウリジン（ｓ２Ｕ）、２'フルオロウリジン、シュードウリジン、２'－Ｏ－メチルウリジン（Ｕｍ）、２'デオキシウリジン（２'ｄＵ）、４－チオウリジン（ｓ４Ｕ）、５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ）、２'－Ｏ－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、Ｎ６，２'－Ｏ－ジメチルアデノシン（ｍ６Ａｍ）、Ｎ６，Ｎ６，２'－Ｏ－トリメチルアデノシン（ｍ６２Ａｍ）、２'－Ｏ－メチルシチジン（Ｃｍ）、７－メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）、２'－Ｏ－メチルグアノシン（Ｇｍ）、Ｎ２，７－ジメチルグアノシン（ｍ２、７Ｇ）、Ｎ２，Ｎ２，７－トリメチルグアノシン（ｍ２，２，７Ｇ）、およびイノシン（Ｉ）からなる群より選択される１つまたは複数の修飾ヌクレオシドを含む、請求項１～６のいずれか一項記載の使用のための合成修飾型ＲＮＡ分子。
  8. 合成修飾型ＲＮＡ分子が標的化タンパク質にＶＥＧＦが融合されている融合タンパク質をコードし、好ましくは合成修飾型RNA分子はＶＥＧＦ－ｖＷＦ融合タンパク質をコードする、請求項１～７のいずれか一項記載の使用のための合成修飾型ＲＮＡ分子。
  9. 合成修飾型ＲＮＡ分子が、被験体に、合成修飾型RNA分子を含むまたは合成修飾型RNA分子で被覆される埋め込み型装置、カテーテルまたは内視鏡を介して心臓への直接注入によって投与される、請求項１～８のいずれか一項記載の使用のための合成修飾型ＲＮＡ分子。
  10. 埋め込み型装置がステントまたは移植可能薬物送達ポンプである、請求項９記載の使用のための合成修飾型ＲＮＡ分子。
  11. 請求項１～１０のいずれか一項記載の合成修飾型ＲＮＡ分子を含む、心臓虚血の状態を有する対象における、心臓性組織における心臓線維症の軽減における使用のための組成物。
  12. 組成物が、
    i)１００ｎｇ／μｌよりも高い、又は
    ii) １～２５μｇ／μｌの間、又は
    iii) ２５μｇ／μｌと５０μｇ／μｌの間
    の濃度の合成修飾型ＲＮＡ分子を含む、請求項１１記載の使用のための組成物。
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