JP7424644B2 - 光学及び/又は電子顕微鏡による生体試料の画像化のための生体試料の包埋液 - Google Patents
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Description
-60%~99%wt.の、アルキレングリコールジメタクリラート及び/又はオリゴ(アルキレングリコール)ジメタクリラートから選択されるグリコールジメタクリラートと;
-ポリアルキレングリコールジアクリラート又はポリアルキレングリコールメタクリラート(このポリアルキレングリコールジアクリラート又はポリアルキレングリコールメタクリラートは、場合によってはヒドロキシル、アミノ又はオキソ基などの少なくとも1つの親水性基により置換される)と;
-好ましくは少なくとも1つの重金属塩又はランタニド塩を含む、少なくとも1つの添加剤と;
-ラジカル重合開始剤と、
を含む生体試料のための導電性包埋液に関する。
-60%~99%wt.の、アルキレングリコールジメタクリラート及び/又はオリゴ(アルキレングリコール)ジメタクリラートから選択されるグリコールジメタクリラートと;
-0%~38%wt.のポリアルキレングリコールジアクリラート又はポリアルキレングリコールメタクリラート(このポリアルキレングリコールジアクリラート又はポリアルキレングリコールメタクリラートは、場合によってはヒドロキシル、アミノ又はオキソ基などの少なくとも1つの親水性基により置換される)と;
-0.1%~2%wt.のラジカル重合開始剤と、
を含む。
-60%~99%wt.のトリエチレングリコールジメタクリラートと;
-0%超~38%wt.のポリプロピレングリコールジアクリラートと;
-0.1%~2%wt.のラジカル重合開始剤と、
を含む。
-60%~99%wt.のトリエチレングリコールジメタクリラートと;
-0%超~38%wt.のヒドロキシルポリエチレングリコールメタクリラートと;
-0.1%~2%wt.のラジカル重合開始剤と、
を含む。
(i-1)生体試料を固定及び/又は脱水し;
(ii)上記で定められるような導電性包埋液を段階(i-1)の生体試料に浸透させ;
(iii)段階(ii)で得られた混合物を重合化して、導電性イメージング材料を生じさせ;
(iv)光学顕微鏡及び/又は電子顕微鏡により段階(iii)の導電性イメージング材料を画像化すること
を含む、顕微鏡によって生体試料を画像化するための方法にも関する。
-(a)アルキレングリコールジメタクリラート及び/又はオリゴ(アルキレングリコール)ジメタクリラートから選択されるグリコールジメタクリラート;及び(b)ポリアルキレングリコールジアクリラート又はポリアルキレングリコールメタクリラート(このポリアルキレングリコールジアクリラート又はポリアルキレングリコールメタクリラートは、場合によってはヒドロキシル、アミノ又はオキソ基などの少なくとも1つの親水性基により置換される)を含む第1の容器と;
-ラジカル重合開始剤を含む第2の容器と;
を含むか、又は
(a)アルキレングリコールジメタクリラート及び/又はオリゴ(アルキレングリコール)ジメタクリラートから選択されるグリコールジメタクリラート;(b)ポリアルキレングリコールジアクリラート又はポリアルキレングリコールメタクリラート(このポリアルキレングリコールジアクリラート又はポリアルキレングリコールメタクリラートは、場合によってはヒドロキシル、アミノ又はオキソ基などの少なくとも1つの親水性基により置換される)及び;(c)ラジカル重合開始剤を含む容器と;
混合手段と、
を含む、
顕微鏡において画像化しようとする生体試料を調製するためのキットにも関する。
本発明において、次の用語は次の意味を有する:
-「約」:数値の前に付け、その数値の値の±10%を意味する。
-「アクリラート」:少なくとも1つのCH2=CH-COO-基を有するビニル単量体を指す。
-「アミノ」:有機基での1個以上の水素原子の置換によるアンモニアのNH3由来の何らかの化合物を指す。アミノは、好ましくは-NH2、-NHR及び-NRR’を指す(式中、R及びR’は好ましくはアルキル基である)。従って「アミノ」はモノアルキルアミノ及びジアルキルアミノ基を含む。
-「生体試料」:動物又は植物又は生きているヒト身体、例えば細胞抽出物、細胞、組織又は器官など、から回収される何らかの生体物質を指す。生体試料は移植物を指さない。
-「包埋液」は、直接的に、又はミクロトーム若しくはウルトラミクロトームを使用することにより削切した後、得られる材料が顕微鏡により画像化され得るように生体試料を入れる液を指す。包埋液は、移植物として使用される物体又は金属を指さない。
-「グリコール」:少なくとも1つのジオール基を有し、各ヒドロキシル基が異なる炭素原子上に置かれる、何らかの有機化学化合物を指す。一実施形態によれば、グリコール化合物の各ヒドロキシル基は、このグリコール化合物の一方の末端に位置する。一実施形態によれば、グリコールは、少なくとも1つの近接ジオールを有し、即ち2個のヒドロキシル基が隣接する炭素原子に連結される。グリコール化合物としては、アルキレングリコール、例えばエチレングリコール、プロピレングリコール又はブチレングリコールなど;オリゴ(アルキレングリコール)、例えばジエチレングリコール、トリエチレングリコール又はテトラエチレングリコールなど;及びポリアルキレングリコール、例えばポリ(エチレングリコール)、ポリ(プロピレングリコール)又はポリ(ブチレングリコール)などが挙げられる。
-「グリコールアクリラート」:このグリコールの2個のヒドロキシル官能基のうち1個が、ヒドロキシル官能基及びアクリラート基の両方を有する化合物を提供するためのアクリル酸又はアクリロイルハロゲン化物との反応に関与している、何らかのグリコール化合物を指す。「グリコールアクリラート」という用語は、アルキレングリコールアクリラート、オリゴ(アルキレングリコール)アクリラート及びポリアルキレングリコールアクリラートを含む。
-「グリコールジアクリラート」:このグリコールの2個のヒドロキシル官能基が2個のアクリラート基を有する化合物を提供するためのアクリル酸又はアクリロイルハロゲン化物との反応に関与している、何らかのグリコール化合物を指す。「グリコールジアクリラート」という用語は、アルキレングリコールジアクリラート、オリゴ(アルキレングリコール)ジアクリラート及びポリアルキレングリコールジアクリラートを含む。
-「グリコールジメタクリラート」:このグリコールの2個のヒドロキシル官能基が、2個のメタクリラート基を有する化合物を提供するための、メタクリル酸又はメタクリロイルハロゲン化物との反応に関与している何らかのグリコール化合物を指す。「グリコールジメタクリラート」という用語は、アルキレングリコールジメタクリラート、オリゴ(アルキレングリコール)ジメタクリラート及びポリアルキレングリコールジメタクリラートを含む。
-「グリコールメタクリラート」:このグリコールの2個のヒドロキシル官能基のうち1個が、ヒドロキシル官能基及びメタクリラート基の両方を有する化合物を提供するためのメタクリル酸又はメタクリロイルハロゲン化物との反応に関与している、何らかのグリコール化合物を指す。「グリコールメタクリラート」という用語は、アルキレングリコールメタクリラート、オリゴ(アルキレングリコール)メタクリラート及びポリアルキレングリコールメタクリラートを含む。
-「重金属塩」:重金属(即ち比較的高い密度、原子量又は原子番号の金属)を含む何らかの塩を指す。一実施形態によれば、重金属は、鉄、コバルト、亜鉛、ルテニウム、銀、インジウム、カドミウム、水銀、鉛、ウラン、オスミウム及び銅から選択される。
-「親水性」:一般的には電荷極性化しており、水素結合が可能であり、油又は他の溶媒中よりも水中で容易に溶解可能である分子又は分子の一部を定義する。
-「ヒドロキシル」:化学官能基-OHを指す。
-「開始剤」:重合反応、好ましくはラジカル重合、を開始可能な何らかの化学化合物を指す。本発明において、開始剤は、ポリマー鎖の成長を開始させるための第1のビニル単量体単位と反応可能なラジカル部分を提供する。
-「Lowicryl(登録商標)」:アクリラート及び/又はメタクリラート樹脂に基づく市販の包埋液を指す。Lowicryl(登録商標)HM 20は、2-プロペン酸-2-メチル-1,2-エタンジイルビス(オキシ-2,1-エタンジイル)エステル(CAS106-16-0);2-プロペン酸-2-メチルエチルエステル(CAS97-63-2);n-ヘキシルメタクリラート及び場合によっては4-メトキシフェノール及び/又はアセトフェノン-2-メトキシ-2-フェニル(CAS3524-62-7)を含むか、又はそれにより構成される非極性包埋液を指す。一実施形態によれば、「Lowicryl」という用語は、市販製品Lowicryl(登録商標)HM 20、Lowicryl(登録商標)HM 21及びLowicryl(登録商標)HM 23を含む。
-「マクロ単量体」:単量体として作用可能な少なくとも1つの末端基を有するポリマー鎖を指す。一実施形態によれば、用語。
-「マトリクス」:化学的ネットワーク、好ましくは有機化学ネットワーク、より好ましくは有機ポリマーネットワークを指す。一実施形態によれば、このネットワークは共有結合により架橋される。
-「イメージング材料」:生体試料を包埋する、及び顕微鏡による分析での使用に適切な固体又は半固体を指す。
-「メタクリラート」:少なくとも1つのCH2=C(CH3)-COO-基を有するビニル単量体を指す。
-「顕微鏡」:顕微鏡を使用して物体を画像化するための技術を包含する一般的分野を指す。
-「顕微鏡切片作製法」:その顕微鏡研究のために物体を調製するための方法を指し、この方法は、ミクロトーム又はウルトラミクロトーム(即ち顕微鏡により分析しようとする試料を薄切するために適切な装置)を使用することを含む。一実施形態によれば、「顕微鏡切片作製法」という用語は、集束イオンビーム加工技術を包含する。
-「電子顕微鏡」:試料の光源として加速電子のビームを使用し、拡大画像を提供する顕微鏡を指す。
-「光学顕微鏡」:試料の光源として波長が調節される光子ビームを使用し、拡大画像を提供する顕微鏡を指す。
-「導電性」:電子を伝導可能な何らかの材料又は化合物を指す。一実施形態によれば、「導電性」という用語は、その表面上に蓄積した電子を排出可能な材料又は化合物を指す。
-「凍結置換」:氷晶の形成を回避するのに十分に低い温度で行われ、同試料の周囲温度での脱水後に観察される損傷を与える影響を回避する、生体試料の脱水の工程を指す。本発明において、凍結置換工程は、最初に、試料の凍結水を有機溶媒により溶解させ、場合によっては化学固定液を含む工程を指し;次に、この試料を樹脂中に包埋し;最後に顕微鏡によるその画像化のために徐々に試料を温める。
-「高圧凍結」:高圧下での、好ましくは2000bar~2700barの範囲の圧力での、より好ましくは約2048barの圧力での、生体試料の低温固定法を指す。
-「オキソ」:化学官能基-C(O)-を指す。
-「ポリマー」:反復単位(単量体)からなる巨大分子化合物を指す。一実施形態によれば、「ポリマー」という用語は、反復単位からなる有機巨大分子化合物を指す。
-「光開始剤」:放射線(UV又は可視光線)に曝露した場合に、重合反応、好ましくはラジカル重合を開始可能な何らかの化学化合物を指す。本発明において、放射線に曝露される場合、光開始剤は、ポリマー鎖の成長を開始させるように第1のビニル単量体単位と反応可能なラジカル部分を提供する。
-「ラジカル重合」は、ポリマー鎖の成長は、フリーラジカル単量体の連続的な付加により実行される、何らかの重合反応技術を指す。本発明において、「ラジカル重合」という表現は、当業者にとって周知である3つの次の段階:(1)開始、(2)生長反応及び(3)終結を含むポリマーを提供するための工程を指す。
-「熱開始剤」:熱に曝露された場合に、重合反応、好ましくはラジカル重合を開始可能な何らかの化学化合物を指す。本発明において、熱に曝露された場合、熱開始剤は、ポリマー鎖の成長を開始させるように第1のビニル単量体単位と反応可能なラジカル部分を提供する。
-「超薄切片作製法」:その顕微鏡研究のために物体を調製するための方法を指し、この方法は、ウルトラミクロトーム(即ち顕微鏡により分析しようとする試料の非常に薄い切片を作るために適切なダイアモンドナイフ又はガラスナイフの何れかを備える装置)を使用することを含む。
-「ガラス化」:全ての細胞構成成分を生きている状態に近い状態に維持する非晶質水を含有する固体に生体物質を変換する工程を指す。本発明において、「ガラス化生体試料」という表現は、ガラス化後に得られる生体試料を指す。
本発明は、包埋液、好ましくは生体試料用の包埋液、さらにより好ましくは生体試料に浸透し、含浸させるための包埋液に関する。一実施形態によれば、本発明は、好ましくは顕微鏡により、より好ましくは電子顕微鏡により、生体試料を画像化するための包埋液に関する。一実施形態によれば、包埋液は導電性である。
R1は、H、直鎖状又は分岐状アルキルを表し、好ましくは、R1は、H又はメチルを表し;
R2は、H、メタクリロイル、アクリロイル、直鎖状又は分岐状アルキルを表し、好ましくは、R1は、H、メタクリロイル又はアクリロイル基を表し;
Ra、Rb、Rc及びRdは、それぞれ独立に、H、直鎖状又は分岐状アルキル、好ましくはH又はメチルから選択され;
nは正の整数である)を有する。
-式(II-A)の単量体:
-式(II-C)の単量体
R1は、H、直鎖状又は分岐状アルキルを表し、好ましくは、R1は、H又はメチルを表し;
R2は、H、メタクリロイル、アクリロイル、直鎖状又は分岐状アルキルを表し、好ましくは、R1は、H、メタクリロイル又はアクリロイル基を表し;
Raは、H、直鎖状又は分岐状アルキルを表し;好ましくはH又はメチルからであり;
n1は、1~5の範囲の正の整数、好ましくは3であり;
n2及びn3は、それぞれ独立に5より大きい正の整数、好ましくは10~100の範囲、より好ましくは10~40の範囲を表す)
を含む単量体混合物を含むか又はそれから構成される。
-ポリアルキレングリコール(ジ)アクリラート及び/又はポリアルキレングリコール(ジ)メタクリラート(このポリアルキレングリコールジアクリラート又はポリアルキレングリコールメタクリラートは、場合によってはヒドロキシル、アミノ又はオキソ基などの少なくとも1つの親水性基により置換される)と;
-開始剤と、
を含む。
-アルキレングリコールジメタクリラートと;
-ポリアルキレングリコールジアクリラート又はポリアルキレングリコールメタクリラート(このポリアルキレングリコールジアクリラート又はポリアルキレングリコールメタクリラートは場合によってはヒドロキシル、アミノ又はオキソ基などの少なくとも1つの親水性基により置換される)と;
-開始剤と、
を含む。
-79%wt.の1つのアルキレングリコールジメタクリラート、好ましくはトリエチレングリコールジメタクリラートと;
-20%wt.の1つのポリアルキレングリコールジアクリラート、好ましくはポリプロピレングリコールジアクリラートと;
-1%wt.のラジカル重合開始剤、好ましくはラジカル重合光開始剤、より好ましくはベンゾインメチルエーテルと、
を含むか又はそれから構成される。
-60%~99%wt.のトリエチレングリコールジメタクリラートと;
-0%超~38%wt.のポリプロピレングリコールジアクリラートと;
-0.1%~2%wt.のラジカル重合開始剤;好ましくはベンゾインメチルエーテルと、
を含む。
-98%~99.9%wt.のトリエチレングリコールジメタクリラートと;
-0.1%~2%wt.のラジカル重合開始剤;好ましくはベンゾインメチルエーテルと、
を含む。
-60%~99%wt.のトリエチレングリコールジメタクリラートと;
-0%超~38%wt.のヒドロキシルポリエチレングリコールメタクリラートと;
-0.1%~2%wt.のラジカル重合開始剤;好ましくはベンゾインメチルエーテルと、
を含む。
本発明はまた、顕微鏡用の支持物質にも関する。一実施形態によれば、本支持物質は、好ましくは画像化しようとする試料のための包埋材料としての、顕微鏡でのその使用のための物質である(「イメージング材料」と呼ばれる)。一実施形態によれば、本発明のイメージング材料は、上記で定義されるような包埋液の重合から生じる。
本発明は、上記で定義されるような包埋液を製造するための工程にも関する。
-上記で定義されるような少なくとも1つの単量体、好ましくは少なくとも1つのラジカル重合可能な単量体、より好ましくは少なくとも1つの親水性のラジカル重合可能な単量体と;
-上記で定義されるような開始剤と、
を混合することを含むか又はそれにより構成される。
-単量体混合物を得るための、上記で定義されるような2つの単量体、好ましくは2つのラジカル重合可能な単量体、より好ましくは2つの親水性のラジカル重合可能な単量体と;
-場合によっては上記で定義されるような開始剤と、
を混合することを含むか又はそれにより構成される。
-アルキレングリコールジメタクリラートと;
-ポリアルキレングリコールジアクリラート又はポリアルキレングリコールメタクリラート(このポリアルキレングリコールジアクリラート又はポリアルキレングリコールメタクリラートは場合によってはヒドロキシル、アミノ又はオキソ基などの少なくとも1つの親水性基により置換される)と;
-上記で定義されるような開始剤と、
を混合することを含むか又はそれにより構成される。
本発明はまた、上記で定義されるようなイメージング材料を製造するための工程にも関する。
(a)上記で定義されるような包埋液を提供し;
(c)本包埋液を重合化すること
を含む。
(a)上記で定義されるような包埋液を提供し;
(b)包埋された生体試料を提供するために生体試料に対して本包埋液を浸透させ;
(c)段階(b)の包埋された生体試料を重合化すること
を含む。
(a-0)ガラス化生体試料を得るために生体試料をガラス化し;
(a)上記で定義されるような包埋液を提供し;
(b)包埋された生体試料を提供するために、段階(a-0)のガラス化生体試料に対して本包埋液を浸透させ;
(c)段階(b)の包埋された生体試料を重合化すること
を含む。
(a-0)ガラス化生体試料を得るために生体試料をガラス化し;
(a-1)段階(a-0)のガラス化生体試料を固定し、脱水し;
(a)上記で定義されるような包埋液を提供し;
(b)包埋された生体試料を提供するために、段階(a-1)の生体試料に対して包埋液を浸透させ;
(c)段階(b)の包埋された生体試料を重合化すること
を含む。
(a-1)生体試料を固定し、脱水し;
(a)上記で定義されるような包埋液を提供し;
(b)包埋された生体試料を提供するために、段階(a-1)の生体試料に対して本包埋液を浸透させ;
(c)段階(b)の包埋された生体試料を重合化すること
を含む。
本発明はまた、顕微鏡により、好ましくは光学及び/又は電子顕微鏡により、生体試料を画像化するための方法にも関する。
-好ましくは上記で定義されるようなイメージング材料を製造するための工程により、上記で定義されるようなイメージング材料を提供し;
-好ましくは顕微鏡によって、より好ましくは光学顕微鏡及び/又は電子顕微鏡によってイメージング材料を画像化すること
を含むか又はそれらから構成される。
(i-0)好ましくは高圧凍結工程、プランジ凍結、ジェット凍結及び/又はスラム凍結(slam freezing)により実行して、生体試料をガラス化し;
(ii)好ましくは凍結置換プロトコールを使用することによって、上記で定義されるような包埋液を段階(i-0)のガラス化生体試料に浸透させ;
(iii)段階(ii)で得られる混合物を重合化し、その結果、導電性イメージング材料を得て;
(iv)段階(iii)の導電性イメージング材料を光学顕微鏡及び/又は電子顕微鏡により画像化すること
を含むか又はそれらから構成される。
(ii)好ましくは凍結置換プロトコールを使用することによって上記で定義されるような包埋液を生体試料に浸透させ;
(iii)段階(ii)で得られる混合物を重合化し、その結果、導電性イメージング材料を得て;
(iv)段階(iii)の導電性イメージング材料を光学顕微鏡及び/又は電子顕微鏡により画像化すること
を含むか又はそれらから構成される
本発明はまた、顕微鏡における、好ましくは光学的顕微鏡、蛍光顕微鏡及び/又は電子顕微鏡における;より好ましくは電子顕微鏡における、上記で定義されるような包埋液又はイメージング材料の使用にも関する。一実施形態によれば、上記で定義されるような包埋液又はイメージング材料は相関顕微鏡において有用である。
本発明はまた、好ましくは顕微鏡により画像化しようとする生体試料を調製するためのキットにも関する。
-(a)アルキレングリコールジメタクリラート及び(b)ポリアルキレングリコールジアクリラート又はポリアルキレングリコールメタクリラート(このポリアルキレングリコールジアクリラート又はポリアルキレングリコールメタクリラートは場合によってはヒドロキシル、アミノ又はオキソ基などの少なくとも1つの親水性基により置換される)を含む第1の容器と;
-ラジカル重合開始剤を含む第2の容器と、
を含む。
-(a)トリエチレングリコールジメタクリラート及び(b);ポリ(プロピレングリコール)ジアクリラートを含む第1の容器と;
-ベンゾインメチルエーテル又はヒドロキシル-2-メチルプロプリオフェノン(methylpropriophenone)を含む第2の容器と、
を含む。
-(a)アルキレングリコールジメタクリラート、(b)ポリアルキレングリコールジアクリラート又はポリアルキレングリコールメタクリラート(このポリアルキレングリコールジアクリラート又はポリアルキレングリコールメタクリラートは場合によってはヒドロキシル、アミノ又はオキソ基などの少なくとも1つの親水性基により置換される);及び(c)ラジカル重合開始剤を含む容器と;
-混合手段と、
を含むキットも指す。
次の実施例を参照して、本発明がより良好に理解されよう。これらの実施例は、本発明の具体的な実施形態の代表であるものとし、本発明の範囲を限定するようなものではないものとする。
略語
℃:摂氏度
CDCl3:重水素化クロロホルム
CLEM:光-電子相関顕微鏡
Eq.:当量
PEG:ポリエチレングリコール
PPGdA:ポリ(プロピレングリコール)ジアクリラート
g:グラム
h:時間数
mmol:ミリモル
mol:モル
NMR:核磁気共鳴
TGdMA:トリエチレングリコールジメタクリラート
UV:紫外線
試薬、溶媒及び出発材料は、Sigma Aldrichから購入し、さらに精製することなく使用した。
試料のUV照射は、凍結置換プロトコール(自動凍結置換 自動化)に対して、Fusion UVからのUVランプシステムF300S Heraeus Noblelight(登録商標)又はLeicaからのAFS-1又はAFS-2を使用することにより行う。
実施例1:ポリ(プロピレングリコール)ジアクリラート(PPGdA)の合成
アクリロイル化によりPPGdAを合成した:800g/mol(20g、25mmol)のポリ(プロピレングリコール)及びトリエチルアミン(11.7g、115mmol)を140mLのジクロロメタンとともに丸底フラスコに導入する。この混合物を5℃に冷却し、磁気撹拌下で塩化アクリロイル(9.5g、105mmol)を滴下して添加した。
1H NMR(CDCl3,300MHz):6.43-6.35(2H,d,H-CH=CH-);6.15-3.06(2H,d,H-CH=CH-),5.81-5.78(2H,d,H-CH=CH-),5.18-5.02(2H,m,-C(O)-O-CH-CH2-),3.83-3.18(42H,m,-CH(CH3)-CH2-),3.83-3.18(42H,m,-CH(CH3)-CH2-O-),1.39-0.99(42H,m,-CH(CH3)-CH2-O-).
2.1.ワンポット溶液
処方1
質量比79/20/1で、フラスコ中に室温でトリエチレングリコールジメタクリラート(TGdMA)、ポリ(プロピレングリコール)ジアクリラート(PPGdA)及び開始剤、好ましくはベンゾインメチルエーテル及び/又はヒドロキシル-2-メチルプロピオフェノンを導入し、撹拌する。光及び/又は熱を避けて最終包埋液1を保管する。
質量比99/1で、フラスコ中に室温で、トリエチレングリコールジメタクリラート(TGdMA)及び開始剤、好ましくはベンゾインメチルエーテル及び/又はヒドロキシル-2-メチルプロピオフェノンを導入し、撹拌する。光及び/又は熱を避けて最終包埋液2を保管する。
質量比74/25/1で、フラスコ中に室温で、トリエチレングリコールジメタクリラート(TGdMA)、ヒドロキシルPEGメタクリラート及び開始剤、好ましくはベンゾインメチルエーテル及び/又はヒドロキシル-2-メチルプロピオフェノンを導入し、撹拌する。光及び/又は熱を避けて最終包埋液3を保管する。
質量比72.4/18.1/9/0.5で、フラスコ中に室温で、トリエチレングリコールジメタクリラート(TGdMA)、ポリ(プロピレングリコール)ジアクリラート(PPGdA)、硝酸銀溶液(1.4mM)及び開始剤、好ましくはベンゾインメチルエーテル及び/又はヒドロキシル-2-メチルプロピオフェノンを導入し、撹拌する。光及び/又は熱を避けて最終包埋液4を保管する。
質量比79/20で、第1の容器に室温でトリエチレングリコールジメタクリラート(TGdMA)及びポリ(プロピレングリコール)ジアクリラート(PPGdA)を導入し、撹拌する。
実施例3:顕微鏡分析用の生体試料を調製するための工程
目的は、電子顕微鏡用の蛍光及び/又は導電性生体イメージング材料を提供するために生体試料を包埋することである。この目的において、出願者は、実施例2のエンベデッドメディウム(embedded medium)1を使用した工程を実施する。
段階1-生体試料のガラス化及び/又は固定/脱水
最初に、当業者にとって周知の何らかの低温法によって生体試料をガラス化し、次いでエタノール、メタノール又はアセトンであり得る溶媒中に-90℃で導入する(溶媒中の生体試料は「凍結置換カクテル」と呼ぶ)。場合によっては、化学固定液及び/又は造影剤を添加し得る。化学固定液の例はオスミウム、四酸化オスミウム、酢酸ウラニル、グルタルアルデヒド及びパラホルムアルデヒドであり得る。造影剤の例は、酢酸ウラニル、鉛誘導体、銀誘導体、オスミウム誘導体又はタンニン酸であり得る。
第2に、混合包埋液/溶媒を、包埋液の溶液のみが浸透するまで、段階1で得た脱水された生体試料に連続的に浸透させる。本発明のマトリクス前駆体溶液中で包埋される脱水された生体試料を含む組成物を得る。
次に、光重合によるか又は熱重合によるかの何れかで、段階2で得た組成物を重合化する。
電子顕微鏡によるその観察前に、導電性イメージング材料を場合によっては顕微鏡切片作製及び/又は超薄切片作製により調製する。
この工程において、電子顕微鏡によるその観察前に、段階1~4の何れか1つにおいて導電性イメージング材料の光学顕微鏡分析を行い得る。
実施例4:顕微鏡分析
本発明のイメージング材料の優越性を示すために、電子顕微鏡で使用する場合、凍結カクテルが0.05%酢酸ウラニル、0.01%グルタルアルデヒド、1%水を含み、-90℃~-45℃の範囲の温度で行われる実施例3に記載のプロトコールに従い、生体試料を調製した。
目的は、同じ凍結置換プロトコール(即ち0.05%酢酸ウラニル、0.01%グルタルアルデヒド及び1%水を含む凍結カクテルを使用して、-60℃~-45℃の範囲の温度)を両方とも使用して、HeLa細胞において、Lowicryl(登録商標)HM 20樹脂と、本発明の包埋液から得られるコントラストの向上を比較することである。
この実験において、MNT1細胞(不死化メラニン細胞株、MNT1株)を試験した。
構造化照明顕微鏡(SIM)(光学顕微鏡)によりイメージング材料におけるMNT1細胞の蛍光保持の分析も実行した。
Claims (14)
- 生体試料のための導電性包埋液であって、
-60%~99%wt.の、エチレングリコールジメタクリラート、ジエチレングリコールジメタクリラート、トリエチレングリコールジメタクリラート、プロピレングリコールジメタクリラート及びブチレングリコールジメタクリラートから選択されるグリコールジメタクリラートと;
-ポリアルキレングリコールジアクリラートと;
-ラジカル重合開始剤と、
を含む、導電性包埋液。 - 前記導電性包埋液が、少なくとも1つの重金属塩又はランタニド塩を更に含む、請求項1に記載の導電性包埋液。
- 前記グリコールジメタクリラートが、トリエチレングリコールジメタクリラートである、請求項1または請求項2に記載の導電性包埋液。
- 前記ポリアルキレングリコールジアクリラートが、ポリエチレングリコールジアクリラート、ポリプロピレングリコールジアクリラート及びポリブチレングリコールジアクリラートから選択される、請求項1~3のいずれか一項に記載の導電性包埋液。
- -60%~99%wt.のトリエチレングリコールジメタクリラートと;
-0%超~38%wt.のポリプロピレングリコールジアクリラートと;
-0.1%~2%wt.のラジカル重合開始剤と、
を含む、請求項1、および4のいずれか一項に記載の導電性包埋液。 - -79%wt.のトリエチレングリコールジメタクリラートと;
-20%wt.のポリプロピレングリコールジアクリラートと;
-1%wt.のベンゾインメチルエーテルと、
を含む、請求項1、および4のいずれか一項に記載の導電性包埋液。 - 前記少なくとも1つの重金属塩が、オスミウム及び/又は酢酸ウラニルを含む、請求項2~4のいずれか一項に記載の導電性包埋液。
- 少なくとも1つの生体試料をさらに含む、請求項1~7のいずれか一項に記載の導電性包埋液。
- 前記少なくとも1つの生体試料はガラス化、化学的固定化、又は脱水した生体試料である、請求項8に記載の導電性包埋液。
- 請求項1~9のいずれか一項に記載の包埋液の重合から生じるポリマーマトリクスに包埋される少なくとも1つの生体試料を含む、導電性イメージング材料。
- 包埋された生体試料の内部蛍光、タンパク質活性及び/又は抗原特異性を保持する、請求項10に記載の導電性材料。
- 顕微鏡によって生体試料を画像化するための方法であって、次の段階:
(i-1)前記生体試料を固定及び/又は脱水し;
(ii)請求項1~9の何れか1項に記載の導電性包埋液を段階(i-1)の前記生体試料に浸透させ;
(iii)段階(ii)で得られた混合物を重合化して、導電性イメージング材料を生じさせ;
(iv)光学顕微鏡及び/又は電子顕微鏡により段階(iii)の導電性イメージング材料を画像化すること
を含む方法。 - 前記導電性イメージング材料における顕微鏡切片作製又は超薄切片作製の段階をさらに含む、請求項12に記載の方法。
- 顕微鏡において画像化しようとする生体試料を調製するためのキットであって、
-(a)エチレングリコールジメタクリラート、ジエチレングリコールジメタクリラート、トリエチレングリコールジメタクリラート、プロピレングリコールジメタクリラート及びブチレングリコールジメタクリラートから選択されるグリコールジメタクリラート;及び(b)ポリアルキレングリコールジアクリラートを含む第1の容器と;
-ラジカル重合開始剤を含む第2の容器と、
を含むか、又は
(a)エチレングリコールジメタクリラート、ジエチレングリコールジメタクリラート、トリエチレングリコールジメタクリラート、プロピレングリコールジメタクリラート及びブチレングリコールジメタクリラートから選択されるグリコールジメタクリラート;(b)ポリアルキレングリコールジアクリラート;及び(c)ラジカル重合開始剤を含む容器と;
混合手段と、
を含む、キット。
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