JP5058676B2 - 生体標本の作製方法 - Google Patents
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Description
本発明の生体標本の作製方法は、従来、顕微鏡観察用に用いられているいずれの作製方法も適用することができ、例えば、検体の薄切片を用いる包埋法や凍結法に適用することができる。
検体からの採取は、固定液の滲透を良くするために、薄くかつ小さく、例えば、厚さ1mm、大きさ1mm3程度に細切りして行う。固定は、組織や細胞を生体に近い状態に保存するために行うもので、ホルムアルデヒドやグルタールアルデヒド等の還元剤を用いて行う。次に、組織中の水分を除くために脱水剤を用いて脱水する。次に、パラフィンで包埋するに先立って、パラフィンと脱水剤との親和性を有する置換剤、例えばキシレンを用い、組織内を置換する。次に、パラフィンを組織内に滲透させて固めてパラフィン包埋体を作製する。そのパラフィン包埋体をミクロトームにより薄切りして厚さ2〜10μm程度の切片とする。その切片をスライドガラス上に載せ、温水に浸け切片のしわをとって支持基材上に固定する。次に、脱パラフィン処理を行って、切片からパラフィンを除去する。次に、蛍光色素を用いて切片を標識する。さらに、マイアーヘマトキシリン液等を用い対比染色を行う。その後、脱水剤による脱水、キシレン等による透徹を行い、非水溶性封入剤を滴下しカバーガラスを載せて封入し、顕微鏡観察に供する。この生体標本は、顕微鏡観察後は、凍結保存する。
試料を試料籠に入れた状態で、2%パラフォルムアルデヒド+0.1%グルタールアルデヒド+0.02%サポニンによる灌流固定を行う。その後、試料をナイフで分割する、あるいは凍結割断する。次いで、脱水剤濃度を段階的に高くして脱水を行う。例えば、30-50-75-85-95-100%を各8分行う。次いで、臨界点乾燥を行って生体標本とする。
この生体標本の観察は、オスミウムプラズマコーターにてオスミウムコーティングを行い、実体蛍光顕微鏡やハイブリッドSEMを用いて観察することができる。
試料を試料籠に入れた状態で、2%パラフォルムアルデヒド+0.1%グルタールアルデヒドによる灌流固定を行う。試料をナイフで分割する、あるいは凍結割断する。試料を十分に洗浄する。例えば、PBSで液交換しながら3日間ほどかけて余分の固定剤を除去する。次いで、一次抗体と反応させる。例えば、4℃で1日反応させる。次いで、試料を洗浄する。例えば、PBSによる液交換、15-30分程度を3回程度行う。次いで、蛍光色素で標識した二次抗体と反応させる。例えば、4℃で2〜3日行う。次いで、試料を洗浄する。次いで、脱水剤濃度を段階的に高くして脱水を行う。例えば、30-50-75-85-95-100%を各8分行う。次いで、臨界点乾燥を行って生体標本とする。
この生体標本の観察は、オスミウムプラズマコーターにてオスミウムコーティングを行い、実体蛍光顕微鏡やハイブリッドSEMを用いて観察することができる。
合成例1.
(1, 2, 5,-オキサジアゾロ-[3, 4-c]ピリジンの活性エステル体の合成)
以下、合成スキームを示す。
(1)ジケトン誘導体(2)の合成
500mL三口フラスコに4-メトキシアセトフェノン(1)37.5 g (0.25 mol)、亜硝酸ナトリウム0.15 gを酢酸100 mLに溶解した。水浴中、HNO3 100 mLを酢酸100 mLに溶解したものを2時間かけて滴下した。その後、室温で2日間撹拌した。反応混合物を500mLの水にゆっくりと入れ、沈殿を生成させた。沈殿物は濾過し、クロロホルムに溶解した。クロロホルム相を飽和重曹水で洗浄し、10% NaCl 水溶液で2回洗浄した。MgSO4で脱水した後、減圧下、クロロホルムを留去し、オキサジアゾール-N-オキサイド(2)を34.5 g (収率78%)で得た。
500mL三口フラスコにオキサジアゾール-N-オキサイド(2)17.7 g (0.05 mol)をアセトニトリル400 mLに溶解した。それにZn 12.0 g、AcOH 7 mL、Ac2O 20mLを添加した。水浴中で反応温度が30℃を超えないように冷却した。12時間撹拌して反応終点とした。反応混合物を濾過し、不溶分を除去した。アセトニトリルを減圧下留去して残渣を得た。残渣をクロロホルムで再結晶し、オキサジアゾール-N-オキサイド(3)を10.2 g (収率60%)で得た。
500mL三口フラスコでオキサジアゾール-N-オキサイド(3)15.6 g (0.046 mol)をブタノール300 mLに溶解した。そこへグリシンエチルエステル塩酸塩 32.0 g (0.23 mol)を添加した。24時間加熱還流を行った。ブタノールを減圧下留去し、残渣を得た。残渣を200mLのクロロホルムに溶解し、10% HCl、飽和NaHCO3、10%NaClで洗浄した。MgSO4で乾燥し、溶媒を留去した。得られた残渣をクロロホルムで再結晶し、オキサジアゾロピリジンエチルエステル(4)を13.0 g (収率 70%)で得た。
500mL三口フラスコでオキサジアゾロピリジンエチルエステル(4)3.0 g (0.007 mol)を200 mLのエタノールに溶解した。そこへKOH 0.62 g (0.01 mol)を添加した。5時間加熱環流を行った後、反応混合物を200 mLの水へ添加した。この水溶液に濃塩酸を滴下してpH 1に調整したところ沈殿が生じた。沈殿物を濾過し、クロロホルムに溶解した。クロロホルム相を10% NaHCO3水溶液、水で洗浄した。クロロホルムを留去して残渣を得た。残渣を水-エタノール (1:1)で再結晶し、2.1 g (収率 81%)のオキサジアゾロピリジンカルボン酸(5)を得た。
50 mL 三口フラスコでオキサジアゾロピリジンカルボン酸(5)1.0 g (0.0026 mol)とN-ヒドロキシスクシンイミド0.30 g (0.0026 mol)をDMF 20mLに溶解した。これにN, N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド 0.54 g (0.0026 mol)を30分かけて滴下した。滴下後、室温で30時間撹拌した。減圧下、DMFを留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム)で単離精製し、オキサジアゾロピリジン活性エステル体(6)を0.76 g (収率62%)得た。
(GFPを発現させた標本の検討)
試料には、GFP陽性幹細胞を移植したマウスの腎臓を用いた。すなわち、全身が緑色に光る岡部マウスの骨髄から幹細胞を取り出し、RI照射によって自らの骨髄細胞が機能しなくなったマウスに移植した。移植されたマウスでは、GFP陽性の骨髄細胞が全身で分化し、各臓器でGFPを持った細胞が発現した。マウスには、予めローダミン−デキストランを投与した。
脱水剤にアセトンを用い、アセトンによる脱水後、酢酸イソアミルによる段階的な置換(50-100%を各1分)を行った以外は、実施例1と同様の方法により生体標本を作製した。
(免疫組織化学染色した標本の検討)
免疫組織化学染色法で作製され、スライドガラスに封入された嗅球切片のプレパラートを試料に用いた。一次抗体には、1系統にnestin・OMPを用い、2系統目には、GFAPを用いた。染色用二次抗体には、nestin-TexasRed、OMP-FITC(フルオレセインイソチアシネート)、そしてGFAP-TexasRedを用いた。プレパラートのカバーガラスを外し、ガラス切りで切片を切り出した。PBSによる洗浄、そしてエトキシプロパノールによる脱水を行った。次いで、試料籠に入れた状態で、試料を直接CPDにより乾燥した。その試料をオスミウムプラズマコーターにより厚さ3nm程度のオスミウムコーティングを行った。
脱水剤にアセトンを用い、アセトンによる脱水後、酢酸イソアミルによる段階的な置換(50-100%を各1分)を行った以外は、実施例2と同様の方法により生体標本を作製した。
図1の(a)と(c)に実施例1の結果、図1の(b)と(d)に比較例1の結果を示す。(c) と(d) は、それぞれ(a) と(b)を拡大したものである。(b)と(d)に示すように、脱水剤にアセトンを用いた場合、乾燥すると切片は収縮し、画像も暗いものであった。暗い画像は蛍光色素のローダミンの溶出によるものである。これに対し、エトキプロパノールを用いると、(a)と(c)に示すように試料は乾燥によっても収縮することはなかった。また、蛍光色素による高輝度の蛍光が認められた。
(多重標識標本観察の検討)
GFP抗体を活性エステル体(6)(オレンジ)およびその誘導体2種(グリーン及びイエロー)を用いて標識し、3種を混合し切片を浸して標識した。蛍光色素に、活性エステル体(6)(オレンジ)と、その誘導体2種(グリーン及びイエロー)を用い、それぞれDMSO溶液を調製した。用いた3種の蛍光色素は、グリーンは励起波長が383nmで蛍光波長が520nm、イエローは励起波長が415nmで蛍光波長が535nm、オレンジは励起波長が460nmで蛍光波長が594nmである。
図3はその結果を示す蛍光電子顕微鏡写真である。(a)は、蛍光電子顕微鏡による観察画像、(b)は通常の電子顕微鏡画像、(c)は蛍光観察による画像である。これにより、1種の励起波長(473nm)を用い、かつ検出側に1種のフィルター(515nm)を用いることにより、3種の蛍光を同時観察することができた。標本を多重標識した場合であっても、1種の励起波長を用い、かつ検出側に1種のフィルターを用いることにより、3種の蛍光を同時観察することができると可能と考えられる。また、1週間冷蔵保存しても、蛍光の褪色や脱色は認められなかった。
なお、比較のため、脱水剤にアセトンを用いて生体標本を作製したが、脱水、乾燥により切片が収縮した。また、1週間冷蔵保存後、蛍光の褪色が認められた。
(蛍光顕微鏡による薄切片の観察)
マウスに蛍光色素として活性エステル体(6)を溶解したDMSO溶液0.5 mLを筋肉注射し、3日間放置後、灌流固定前にそのDMSO溶液0.9 mLを血管より注入した。その後、摘出したリンパ節をグルタール+パラフォルム灌流固定し、エトキシプロパノールで脱水し、減圧乾燥し、テクノビット包埋し、ミクロトームにより薄切りして切片を得た。その切片をスライドガラスに固定後、封入剤を用いカバーガラスで封入して生体標本を得た。なお、脱水、乾燥後に切片の収縮は認められなかった。
作製した生体標本に紫外線の励起光を照射し、蛍光顕微鏡下(オリンパス製)で観察した。さらに、この生体標本を1週間冷蔵保存した後、再度蛍光実体顕微鏡下で観察した。図4に、標本作製直後の観察像を示す。矢印で示した、蛍光色素を取り込んだマクロファージが集積された部分からは蛍光色素による高輝度のオレンジの蛍光が認められた。1週間冷蔵保存した後も、蛍光色素による高輝度のオレンジの蛍光が認められた。また、比較のため脱水剤にアセトンを用いて切片を作製したが、脱水、乾燥により切片が収縮した。また、1週間冷蔵保存した後、蛍光の褪色が認められた。
(自発蛍光抑制の検討)
4%パラフォルムによる後固定を行ったビオチン標識抗マウス抗体(1: 400; Jackson Lab)を、 PBSTBF(室温, 90分)と0.1M PBで洗浄(5分X3回)した。活性エステル体(6)で標識したstreptavidinを、10m M HEPES, 0.15M NaCl (pH7.3)中に室温で90分保持した。その後、エトキシプロパノールを用いて脱水を行った。次いで、試料籠に入れた状態で、試料をCPDにより乾燥した。その試料をオスミウムプラズマコーターにより厚さ3nm程度のオスミウムコーティングを行った。一方、比較のため、グリセリン:PBS(3:1)で封入した生体標本も作製した。
図5の(a)にグリセリン:PBSで封入した生体標本の結果、(b)エトキシプロパノールを用いて脱水した生体標本の結果を示す。(a)では自発蛍光が観測されたが、エトキシプロパノールを用いて脱水した(b)では自発蛍光が消失し、染色されたアストロサイトのみが蛍光観察できた。
Claims (2)
- 検体から採取された組織又は細胞からなる試料を固定剤を用いて固定し、その固定した試料を一次抗体と反応させ、蛍光色素で標識した二次抗体と反応させ、その試料内部をエーテルアルコール類又はグリシジルエーテル類からなる脱水剤を用いて脱水し、置換剤を用いて試料内部の脱水剤を置換し、乾燥を行って生体標本を作製する、生体標本の作製方法。
- 上記蛍光色素に、以下の一般式で表されるジアゾール誘導体を用いる請求項1記載の作製方法。
(ここで、式中、R 1 、R 2 、R 3 、R 4 は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、アルキルエステル基、リン酸エステル基、硫酸エステル基、ニトリル基、ヒドロキシル基、シアノ基、スルホニル基、芳香族炭化水素基、または複素環基からなる置換基を有してもよい芳香族炭化水素基又は炭化水素基又は複素環基を示し、Xは置換基を有していてもよい窒素原子又は硫黄原子又は酸素原子又はセレン原子、ボロン原子を示し、R'は芳香環を含んでも良いアルキル基又はアルケニル基からなる脂肪族炭化水素基あるいは芳香族炭化水素基、An - は、Cl - 、Br - 、I - 、CF 3 SO 3 - 、BF 4 - 、PF 6 - を示す。)
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