KR20210002462A - 광학 및/또는 전자 현미경 검사로 이미징하기 위한 생물학적 샘플의 임베딩 매질 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 현미경 검사, 바람직하게는 전자 현미경 검사의 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 다음을 포함하는 현미경 검사로 생물학적 샘플을 이미징하기 위한 임베딩 매질에 관한 것이다:
- 알킬렌 글리콜 디메타크릴레이트 및/또는 올리고(알킬렌 글리콜) 디메타크릴레이트로부터 선택된 글리콜 디메타크릴레이트 60중량% 내지 99중량%;
- 0중량% 내지 38중량%의 폴리알킬렌 글리콜 디아크릴레이트 또는 폴리알킬렌 글리콜 메타크릴레이트로서, 상기 폴리알킬렌 글리콜 디아크릴레이트 또는 폴리알킬렌 글리콜 메타크릴레이트가 하이드록실, 아미노 또는 옥소 그룹과 같은 적어도 하나의 친수성 그룹에 의해 임의로 치환되는, 폴리알킬렌 글리콜 디아크릴레이트 또는 폴리알킬렌 글리콜 메타크릴레이트;
- 바람직하게는 적어도 하나의 중금속 염 또는 란탄족 염을 포함하는 적어도 하나의 첨가제; 및
- 0.1중량% 내지 2중량%의 라디칼 중합 개시제.
본 발명은 또한 본 발명의 임베딩 매질의 중합으로부터 생성되는 전기-전도성 물질, 및 이의 제조 방법 및 키트에 관한 것이고, 상기 물질은 적어도 하나의 생물학적 샘플을 임베딩한다. 본 발명은 또한 본 발명의 임베딩 매질 및/또는 전기-전도성 물질을 사용하는 단계를 포함하는, 생물학적 샘플을 현미경 검사로 이미징하기 위한 방법에 관한 것이다.
- 알킬렌 글리콜 디메타크릴레이트 및/또는 올리고(알킬렌 글리콜) 디메타크릴레이트로부터 선택된 글리콜 디메타크릴레이트 60중량% 내지 99중량%;
- 0중량% 내지 38중량%의 폴리알킬렌 글리콜 디아크릴레이트 또는 폴리알킬렌 글리콜 메타크릴레이트로서, 상기 폴리알킬렌 글리콜 디아크릴레이트 또는 폴리알킬렌 글리콜 메타크릴레이트가 하이드록실, 아미노 또는 옥소 그룹과 같은 적어도 하나의 친수성 그룹에 의해 임의로 치환되는, 폴리알킬렌 글리콜 디아크릴레이트 또는 폴리알킬렌 글리콜 메타크릴레이트;
- 바람직하게는 적어도 하나의 중금속 염 또는 란탄족 염을 포함하는 적어도 하나의 첨가제; 및
- 0.1중량% 내지 2중량%의 라디칼 중합 개시제.
본 발명은 또한 본 발명의 임베딩 매질의 중합으로부터 생성되는 전기-전도성 물질, 및 이의 제조 방법 및 키트에 관한 것이고, 상기 물질은 적어도 하나의 생물학적 샘플을 임베딩한다. 본 발명은 또한 본 발명의 임베딩 매질 및/또는 전기-전도성 물질을 사용하는 단계를 포함하는, 생물학적 샘플을 현미경 검사로 이미징하기 위한 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 현미경 검사의 분야, 바람직하게는 광학 및/또는 전자 현미경 검사의 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 현미경 검사로 생물학적 샘플을 이미징하기 위한 임베딩 매질(embedding medium)에 관한 것이다. 본 발명의 임베딩 매질은 (i) 글리콜 디메타크릴레이트, (ii) 폴리알킬렌 글리콜 디아크릴레이트 및/또는 폴리알킬렌 글리콜 메타크릴레이트, 및 (iii) 개시제의 혼합물을 포함하거나 이들로 구성되는 조성물을 지칭한다. 본 발명은 또한 본 발명의 임베딩 매질의 중합으로부터 생성되는 전기-전도성 및/또는 생물-보존성 물질, 및 이의 제조 방법 및 키트(kit)를 지칭하고, 상기 물질은 적어도 하나의 생물학적 샘플을 임베딩한다.
본 발명은 또한 본 발명의 임베딩 매질 및/또는 전기-전도성 물질의 사용 단계를 포함하는, 생물학적 샘플을 현미경 검사로 이미징하기 위한 방법에 관한 것이다.
현미경 검사는 육안으로 달성될 수 없는 물체와 물체의 영역을 관찰하는 일련의 기술을 지칭한다. 익히 공지된 현미경 검사 기술 중, 전자 현미경 검사가 생물학적 물질의 관찰에 유용하다. 이 기술은 관찰될 샘플과 직접 상호 작용하는 회절, 전자 빔 또는 전자기 방사선의 반사 또는 굴절 덕분에 진폭 또는 위상 콘스라스트 이미지를 생성한다.
현재까지, 우수한 진폭 콘트라스트를 수득하는 것은 본질적으로 중금속 염과 고정제(예: 알데히드)로 구성되는 조영제(contrast agent)의 첨가에 의해서만 가능했다.
임의의 샘플의 고해상도 전자 현미경 검사 시각화는 또한 고정과 같은 복잡한 제조 단계를 나타내므로 샘플이 전자 현미경의 고진공으로부터 보호되는 동안 현미경 검사 분석 중에 천연에 가장 가깝다.
생물학적 물질의 고정은 화학적으로(알데히드와 같은 고정제의 첨가) 또는 물리적으로(유리화 또는 생물학적 물질의 함수량의 무정형 고정을 달성하기 위한 초고속 동결 접근법) 달성될 수 있다.
특히, 고정 후 천연 생물학적 물질의 관찰을 달성하기 위해, 임베딩 방법이 개발되어 초미세 절제술에 의해 얇은 절편화가 가능하도록 강화하면서 진공으로부터 보호하기 위해 중합체 수지로 고정된 생물학적 샘플의 물을 교체하였다.
그러나, 고정제 및 조영제를 사용하면 1) 샘플 제조 동안 오염된 폐기물 재처리 문제, 2) 생물학적 특성 변경 및 3) 이미징 동안 전자 전하의 불량한 배출을 일으킨다. 사실, 고정제 및 중금속 염은 독성, 돌연변이 유발성, 발암성 및/또는 방사성이다. 그들은 자극시 형광 방출의 생물학적 특성 또는 단백질 활성을 부분적으로 또는 전체적으로 변경하거나 면역 검출을 위한 항원을 차폐한다. 또한, 중금속 염은 단지 이미징 동안 전자를 포획하지만 현미경 클리셰(microscopic cliche)의 실현 동안 샘플 표면에 축적되는 전자 전하를 방출하지 못한다. 결과적으로, 샘플의 표면에 전자 전하가 국소 축적되어 샘플을 둘러싼 후광의 형성을 유도하고 적절한 이미징을 방해한다. 결과적으로, 클리셰의 해석을 어렵게 한다.
예를 들어, 투과 전자 현미경 검사(TEM) 또는 전자 단층 촬영에서 이 과로딩(hyper-loading)은 초점면을 극적으로 변화시키고 이미지는 잘못된 초점에서 수득된다. 주사 전자 현미경 검사(SEM)에서 전자 과부하는 샘플의 표면에 백색 후광을 제공한다.
대안적인 해결책이 개발되었다. 한 가지 해결책은 중금속 염을 과도하게 사용하고 저 전자 이미징 매개 변수를 정제함으로써 생성되는 전하 효과를 줄이는 것이다(참조: Deerinck et al., 2010). 그러나, 이 방법은 매우 공격적이고, 다양한 생물학적 샘플에 적용되지 않고 실온에서 작업하도록 강요되어 극저온 고정에 의해 최상의 초미세 구조 보존이 달성되는 것을 방지한다. 특히, 이 방법은 주로 막 또는 세포벽을 강조할 수 있지만 심한 추출을 유도하게 하여 생물학적 내용물의 나머지와 관련되는 모든 정보를 제외하게 한다.
또 다른 해결책은 중금속 염의 사용을 증발에 의한 얇은 탄소 필름 또는 금속 증착과 연관시키는 것으로 구성되며, 후자는 전자 방전을 제공할 수 있게 한다. 그러나, 이 방법은 샘플을 제조하기 위한 추가 단계가 필요하며 샘플 주변에서만 전하를 배출한다. 또한, 중금속 염의 양은 여전히 폐기물의 후속적 재처리를 유발한다.
따라서, 전자 현미경 검사 이미징을 위한 생물학적 샘플을 제조하기 위한 보다 효율적인 공정을 제공할 필요가 있다. 특히, 가능한 최상의 품질 이미지를 수득하기 위해 전자 현미경 검사에 의한 이미징 동안 샘플의 콘트라스트를 최대화하면서 조영제의 필요성 및/또는 그들의 생물학적 효과를 감소시킬 수 있는 보다 효율적인 생물학적 물질 임베딩 매질을 제공할 필요가 있다.
시판되는 수지 중에서, Lowicryl® 수지가 전자 빔의 작용하에 약간 승화하는 이점을 갖는다. 또한, 이들 수지의 전구체 용액(즉, 중합 전)은 생성물에 따라 -35℃ 또는 -70℃까지의 온도에서 유체로 잔류하여 유리화된 생물학적 샘플의 분석에 사용되는 빠른 동결 및 동결 치환 방법과 호환되도록 한다. 빠른 동결은 지금까지 생물학적 물질의 천연 고정 절차에 가장 근접한 것으로 간주되고, 정성적 및 정량적 분석에 널리 사용된다.
그러나, Lowicryl® 수지는 전기-전도성이 아니고, 특히 너무 적은 양의 조영제가 샘플 제조 동안 사용되는 경우, 전자 현미경 검사에 의한 분석 동안 샘플의 불만족스러운 관찰을 유도한다.
따라서, 실온 또는 극저온에서 임베딩 후 전자 현미경에서 이미징 동안 샘플 및/또는 임베딩 매질의 표면에서 축적된 전자 전하를 효과적으로 배출할 수 있는 생물학적 물질 임베딩 매질을 제공할 필요도 또한 있다. 전자 현미경 이미징 동안 우수한 안정성 및/또는 물리적 완전성을 유지할 수 있는 보다 효율적인 생물학적 물질 임베딩 매질을 제공할 필요도 또한 있다. 사용된 중금속 염 또는 란탄족 염의 양을 극적으로 감소시킬 수 있는 임베딩 매질을 제공할 필요도 또한 있다. 따라서, 현미경 검사 분석에 따라 최상의 초미세 구조를 보존할 수 있는 생물학적 물질 임베딩 매질을 제공할 필요도 또한 있다.
생물학적 연구에서 전자 현미경 검사의 사용을 추가로 최적화하기 위해, 형광 현미경 검사는 생물학적 샘플의 효율적인 표적화를 가능하게 한다. 고정제 및/또는 조영제의 사용은 수지에 임베딩된 단백질의 형광 및 천연 특성을 현저하게 감소시킨다. 에폭시 수지는, 예를 들어, 단백질의 아민 그룹과 상호 작용하여 단백질로서 작용하는 그들 추가의 능력을 방지한다. Lowicryl® 수지 또는 아크릴레이트 수지는 생물학적 물질과 교차 반응하지 않으며 그들의 공명 특성을 보호한다.
따라서, 잠재적인 전자 현미경 검사(EM)에 대한 콘트라스트를 보존하면서 임베딩된 생물학적 샘플의 천연 형광을 효율적으로 보존하는 비-생물 상호작용성 임베딩 매질을 제공할 필요가 있다.
놀랍게도, 본 출원인은 글리콜 디메타크릴레이트, 폴리알킬렌 글리콜 디아크릴레이트 및/또는 폴리알킬렌 글리콜 메타크릴레이트로부터 선택된 단량체 혼합물의 중합으로부터 유도된 친수성 수지가 상기 기재된 종래 기술의 문제를 해결하는 효율적인 임베딩 매질을 제공함을 입증했다.
유리하게는, 본 발명의 임베딩 매질에 포함된 생물학적 샘플의 형광뿐만 아니라 초미세 구조가 보존된다. 유리하게는, 본 발명의 임베딩 매질로 수득된 이미징 콘트라스트는 상업적 수지의 사용으로 달성된 것들보다 더 크다.
따라서, 본 발명은
- 알킬렌 글리콜 디메타크릴레이트 및/또는 올리고(알킬렌 글리콜) 디메타크릴레이트로부터 선택된 글리콜 디메타크릴레이트 60중량% 내지 99중량%;
- 폴리알킬렌 글리콜 디아크릴레이트 또는 폴리알킬렌 글리콜 메타크릴레이트로서, 상기 폴리알킬렌 글리콜 디아크릴레이트 또는 폴리알킬렌 글리콜 메타크릴레이트가 하이드록실, 아미노 또는 옥소 그룹과 같은 적어도 하나의 친수성 그룹으로 임의로 치환되는, 폴리알킬렌 글리콜 디아크릴레이트 또는 폴리알킬렌 글리콜 메타크릴레이트;
- 바람직하게는 적어도 하나의 중금속 염 또는 란탄족 염을 포함하는 적어도 하나의 첨가제; 및
- 라디칼 중합 개시제를 포함하는 생물학적 샘플용 전기-전도성 임베딩 매질(electro-conductive embedding medium)에 관한 것이다.
하나의 구현예에 따라서, 생물학적 샘플용 전기-전도성 임베딩 매질은 다음을 포함한다:
- 알킬렌 글리콜 디메타크릴레이트 및/또는 올리고(알킬렌 글리콜) 디메타크릴레이트로부터 선택된 글리콜 디메타크릴레이트 60중량% 내지 99중량%;
- 0중량% 이상 내지 38중량%의 폴리알킬렌 글리콜 디아크릴레이트 또는 폴리알킬렌 글리콜 메타크릴레이트로서, 상기 폴리알킬렌 글리콜 디아크릴레이트 또는 폴리알킬렌 글리콜 메타크릴레이트가 하이드록실, 아미노 또는 옥소 그룹과 같은 적어도 하나의 친수성 그룹에 의해 임의로 치환되는, 폴리알킬렌 글리콜 디아크릴레이트 또는 폴리알킬렌 글리콜 메타크릴레이트; 및
- 0.1중량% 내지 2중량%의 라디칼 중합 개시제.
하나의 구현예에 따라서, 글리콜 디메타크릴레이트는 에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트, 디에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트, 트리에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트, 프로필렌 글리콜 디메타크릴레이트 및 부틸렌 글리콜 디메타크릴레이트로부터 선택되고; 바람직하게는 글리콜 디메타크릴레이트는 트리에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트이다.
하나의 구현예에 따라서, 폴리알킬렌 글리콜 디아크릴레이트는 폴리에틸렌 글리콜 디아크릴레이트, 폴리프로필렌 글리콜 디아크릴레이트 및 폴리부틸렌 글리콜 디아크릴레이트로부터 선택되고; 바람직하게는 폴리알킬렌 글리콜 디아크릴레이트는 폴리프로필렌 글리콜 디아크릴레이트이다.
하나의 구현예에 따라서, 폴리알킬렌 글리콜 메타크릴레이트는 폴리에틸렌 글리콜 메타크릴레이트, 폴리프로필렌 글리콜 메타크릴레이트 및 폴리부틸렌 글리콜 메타크릴레이트로부터 선택되고; 상기 폴리알킬렌 글리콜 메타크릴레이트는 하이드록실, 아미노, 또는 옥소 그룹과 같은 적어도 하나의 친수성 그룹에 의해 임의로 치환되고; 바람직하게는 폴리알킬렌 글리콜 메타크릴레이트는 하이드록실 폴리에틸렌 글리콜 메타크릴레이트이다.
하나의 구현예에 따라서, 라디칼 중합 개시제는 광개시제 또는 열개시제이고, 바람직하게는 라디칼 중합 개시제는 광개시제이고, 보다 바람직하게는 벤조인 메틸 에테르 또는 2-하이드록시-2-메틸-1-페닐-프로판-1-온이다.
하나의 구현예에 따라서, 전기-전도성 임베딩 매질은
- 60중량% 내지 99중량%의 트리에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트;
- 0중량% 이상 내지 38중량%의 폴리프로필렌 글리콜 디아크릴레이트; 및
- 0.1중량% 내지 2중량%의 라디칼 중합 개시제를 포함한다.
하나의 구현예에 따라서, 전기-전도성 임베딩 매질은
- 60중량% 내지 99중량%의 트리에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트;
- 0중량% 이상 내지 38중량%의 하이드록실 폴리에틸렌 글리콜 메타크릴레이트; 및
- 0.1중량% 내지 2중량%의 라디칼 중합 개시제를 포함한다.
하나의 구현예에 따라서, 전기-전도성 임베딩 매질은 보다 바람직하게는 오스뮴 및/또는 우라닐 아세테이트를 포함하는 적어도 하나의 중금속 염을 포함한다.
하나의 구현예에 따라서, 전기-전도성 임베딩 매질은 적어도 하나의 생물학적 샘플, 바람직하게는 유리화되고/되거나 화학적으로 고정되고/되거나 탈수된 생물학적 샘플을 추가로 포함한다.
본 발명은 또한 상기 정의된 바와 같은 임베딩 매질의 중합으로부터 생성되는 중합체 매트릭스에 임베딩된 적어도 하나의 생물학적 샘플을 포함하는 전기-전도성 이미징 물질(electro-conductive imaging material)에 관한 것이다.
하나의 구현예에 따라서, 전기-전도성 물질은 임베딩된 생물학적 샘플의 내부 형광, 단백질 활성 및/또는 항원 특이성을 보존한다.
본 발명은 또한 다음 단계를 포함하는, 생물학적 샘플을 현미경 검사로 이미징하기 위한 방법에 관한 것이다:
(i-1) 생물학적 샘플을 고정 및/또는 탈수시키는 단계;
(ii) 상기 정의된 바와 같은 전기-전도성 임베딩 매질을 단계 (i-1)의 생물학적 샘플에 침윤시키는 단계;
(iii) 단계 (ii)에서 수득된 혼합물을 중합시켜 전기-전도성 이미징 물질을 생성하는 단계;
(iv) 단계 (iii)의 전기-전도성 이미징 물질을 광학 현미경 검사 및/또는 전자 현미경 검사로 이미징하는 단계.
하나의 구현예에 따라서, 상기 방법은 전기-전도성 이미징 물질 상에서 미세 절제술 또는 초미세 절제술 단계를 추가로 포함한다.
본 발명은 또한 현미경 검사, 바람직하게는 광학 및/또는 전자 현미경 검사로 생물학적 샘플을 이미징하기 위한, 상기 정의된 바와 같은 임베딩 매질 또는 상기 정의된 바와 같은 전기-전도성 이미징 물질의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한
- (a) 알킬렌 글리콜 디메타크릴레이트 및/또는 올리고(알킬렌 글리콜) 디메타크릴레이트로부터 선택된 글리콜 디메타크릴레이트; 및 (b) 폴리알킬렌 글리콜 디아크릴레이트 또는 폴리알킬렌 글리콜 메타크릴레이트로서, 상기 폴리알킬렌 글리콜 디아크릴레이트 또는 폴리알킬렌 글리콜 메타크릴레이트가 하이드록실, 아미노 또는 옥소 그룹과 같은 적어도 하나의 친수성 그룹으로 임의로 치환되는, 폴리알킬렌 글리콜 디아크릴레이트 또는 폴리알킬렌 글리콜 메타크릴레이트를 포함하는 제1 용기;
- 라디칼 중합 개시제를 포함하는 제2 용기를 포함하거나;
(a) 알킬렌 글리콜 디메타크릴레이트 및/또는 올리고(알킬렌 글리콜) 디메타크릴레이트로부터 선택된 글리콜 디메타크릴레이트; (b) 폴리알킬렌 글리콜 디아크릴레이트 또는 폴리알킬렌 글리콜 메타크릴레이트로서, 상기 폴리알킬렌 글리콜 디아크릴레이트 또는 폴리알킬렌 글리콜 메타크릴레이트가 하이드록실, 아미노 또는 옥소 그룹과 같은 적어도 하나의 친수성 그룹으로 임의로 치환되는, 폴리알킬렌 글리콜 디아크릴레이트 또는 폴리알킬렌 글리콜 메타크릴레이트; 및 (c) 라디칼 중합 개시제를 포함하는 용기; 및
혼합 수단을 포함하는, 현미경 검사로 이미징될 생물학적 샘플을 제조하기 위한 키트에 관한 것이다.
정의
본 발명에서 다음 용어는 다음과 같은 의미를 갖는다:
- 숫자 앞의 "약"은 상기 수자 값의 ± 10%를 의미한다.
- "아크릴레이트"는 적어도 하나의 CH2=CH-COO- 그룹을 갖는 비닐 단량체를 지칭한다.
- "아미노"는 하나 이상의 수소 원자를 유기 라디칼로 치환시킴으로써 암모니아 NH3으로부터 유래된 임의의 화합물을 지칭한다. 아미노는 바람직하게는 -NH2, -NHR 및 -NRR'를 지칭하고, 여기서 R 및 R'는 바람직하게는 알킬 그룹이다. 따라서, "아미노"는 모노알킬아미노 및 디알킬아미노 그룹을 포함한다.
- "생물학적 샘플"은 동물 또는 식물 또는 살아있는 인체, 예를 들어, 세포 추출물, 세포, 조직 또는 기관으로부터 수집된 임의의 생물학적 샘플을 지칭한다. 생물학적 샘플은 임플란트를 지칭하지 않는다.
- "임베딩 매질"은 생성되는 물질이 직접 또는 마이크로톰 또는 초-마이크로톰을 사용하여 절단된 후 현미경 검사로 이미징될 수 있도록 생물학적 샘플이 위치된 매질을 지칭한다. 임베딩 매질은 임플란트로서 사용된 물체 또는 금속을 지칭하지 않는다.
- "글리콜"은 적어도 하나의 디올 그룹을 갖고 각 하이드록실 그룹이 상이한 탄소 원자에 위치되는 임의의 유기 화학적 화합물을 지칭한다. 하나의 구현예에 따라서, 글리콜 화합물의 각 하이드록실 그룹은 상기 글리콜 화합물의 한쪽 말단에 위치한다. 하나의 구현예에 따라서, 글리콜은 적어도 하나의 인접 디올, 즉 인접한 탄소 원자에 부착된 2개의 하이드록실 그룹을 갖는다. 글리콜 화합물은, 예를 들어, 알킬렌 글리콜, 예를 들어, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 부틸렌 글리콜; 올리고(알킬렌 글리콜), 예를 들어, 디에틸렌 글리콜, 트리에틸렌 글리콜 또는 테트라에틸렌 글리콜; 및 폴리알킬렌 글리콜, 예를 들어, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(프로필렌 글리콜) 또는 폴리(부틸렌 글리콜)을 포함한다.
- "글리콜 아크릴레이트"는 글리콜의 2개의 하이드록실 작용기 중 하나가 하이드록실 작용기 및 아크릴레이트 그룹 모두를 갖는 화합물을 제공하기 위한 아크릴산 또는 아크릴로일 할라이드와의 반응에 관련되는 임의의 글리콜 화합물을 지칭한다. 용어 "글리콜 아크릴레이트"는 알킬렌 글리콜 아크릴레이트, 올리고(알킬렌 글리콜) 아크릴레이트 및 폴리알킬렌 글리콜 아크릴레이트를 포함한다.
- "글리콜 디아크릴레이트"는 글리콜의 2개의 하이드록실 작용기가 2개의 아크릴레이트 그룹을 갖는 화합물을 제공하기 위한 아크릴산 또는 아크릴로일 할라이드와의 반응에 관련되는 임의의 글리콜 화합물을 지칭한다. 용어 "글리콜 디아크릴레이트"는 알킬렌 글리콜 디아크릴레이트, 올리고(알킬렌 글리콜) 디아크릴레이트 및 폴리알킬렌 글리콜 디아크릴레이트를 포함한다.
- "글리콜 디메타크릴레이트"는 글리콜의 2개의 하이드록실 작용기가 2개의 메타크릴레이트 그룹을 갖는 화합물을 제공하기 위한 메타크릴산 또는 메타크릴로일 할라이드와의 반응에 관련되는 임의의 글리콜 화합물을 지칭한다. 용어 "글리콜 디메타크릴레이트"는 알킬렌 글리콜 디메타크릴레이트, 올리고(알킬렌 글리콜) 디메타크릴레이트 및 폴리알킬렌 글리콜 디메타크릴레이트를 포함한다.
- "글리콜 메타크릴레이트"는 글리콜의 2개의 하이드록실 작용기 중 하나가 하이드록실 작용기 및 메타크릴레이트 그룹을 모두 갖는 화합물을 제공하기 위한 메타크릴산 또는 메타크릴로일 할라이드와의 반응에 관련되는 임의의 글리콜 화합물을 지칭한다. 용어 "글리콜 메타크릴레이트"는 알킬렌 글리콜 메타크릴레이트, 올리고(알킬렌 글리콜) 메타크릴레이트 및 폴리알킬렌 글리콜 메타크릴레이트를 포함한다.
- "중금속 염"은 중금속(즉, 비교적 높은 밀도, 원자량 또는 원자번호를 갖는 금속)을 포함하는 임의의 염을 지칭한다. 하나의 구현예에 따라서, 중금속은 철, 코발트, 아연, 루테늄, 은, 인듐, 카드뮴, 수은, 납, 우라늄, 오스뮴 및 구리로부터 선택된다.
- "친수성"은 전형적으로 전하 양극화되고, 오일 또는 다른 용매보다 물에 더 쉽게 용해될 수 있도록 하는 수소 결합할 수 있는 분자 또는 분자의 일부를 정의한다.
- "하이드록실"은 화학적 작용기 -OH를 지칭한다.
- "개시제"는 중합 반응, 바람직하게는 라디칼 중합을 개시할 수 있는 임의의 화학적 화합물을 지칭한다. 본 발명에서, 개시제는 중합체 쇄의 성장을 개시할 수 있도록 제1 비닐 단량체 단위와 반응할 수 있는 라디칼 본체를 제공한다.
- "Lowicryl®"은 아크릴레이트 및/또는 메타크릴레이트 수지를 기반으로 하는 시판되는 임베딩된 매질을 지칭한다. Lowicryl® HM 20은 2-프로펜산-2-메틸-1,2-에탄디일비스(옥시-2,1-에탄디일)에스테르(CAS 106-16-0); 2-프로펜산-2-메틸 에틸 에스테르(CAS 97-63-2); n-헥실 메타크릴레이트 및 임의로 4-메톡시페놀 및/또는 아세토페논-2-메톡시-2-페닐(CAS 3524-62-7)을 포함하거나 이들로 구성되는 비극성 임베딩된 매질을 지칭한다. 하나의 구현예에 따라서, 용어 "Lowicryl"은 시판되는 제품 Lowicryl® HM 20, Lowicryl® HM 21 및 Lowicryl® HM 23을 포함한다.
- "거대 단량체"는 단량체로서 작용할 수 있는 적어도 하나의 말단 그룹을 갖는 중합체 쇄를 지칭한다. 하나의 구현예에 따라서, 용어
- "매트릭스"는 화학적 네트워크, 바람직하게는 유기 화학적 네트워크, 더욱 바람직하게는 유기 중합체 네트워크를 지칭한다. 하나의 구현예에 따라서, 네트워크는 공유적으로 가교결합된다.
- "이미징 물질"은 생물학적 샘플을 임베딩하고 현미경 검사에 의한 분석에 사용되기에 적합한 고체 또는 반고체를 지칭한다.
- "메타크릴레이트"는 적어도 하나의 CH2=C(CH3)-COO- 그룹을 갖는 비닐 단량체를 지칭한다.
- "현미경 검사"는 현미경을 사용하여 물체를 이미징하는 기술을 포함하는 일반적인 분야를 지칭한다.
- "미세 절제술"은 현미경 검사 연구를 위한 물체를 제조하는 방법을 지칭하고, 상기 방법은 마이크로톰 또는 초-마이크로톰(즉, 현미경 검사로 분석될 샘플을 얇게 슬라이싱하기에 적합한 장치)을 사용하는 단계를 포함한다. 하나의 구현예에 따라서, 용어 "미세 절제술"은 집속 이온 빔 밀링 기술을 포함한다.
- "전자 현미경 검사"는 샘플의 조명 원으로서 가속된 전자 빔을 사용하고 확대된 이미지를 제공하는 현미경을 지칭한다.
- "광학 현미경 검사"는 샘플의 조명 원으로서 제어된 파장의 광자 빔을 사용하고 확대된 이미지를 제공하는 현미경을 지칭한다.
- "전기-전도성"은 전자를 전도할 수 있는 임의의 물질 또는 화합물을 지칭한다. 하나의 구현예에 따라서, 용어 "전기-전도성"은 표면에 축적된 전자를 배출할 수 물질 또는 화합물을 지칭한다.
- "동결 치환"은 얼음 결정의 형성을 피하고 동일한 샘플의 주위 온도 탈수 후 관찰되는 손상 효과를 피하기에 충분히 낮은 온도에서 수행되는 생물학적 샘플의 탈수 공정을 지칭한다. 본 발명에서, 동결 치환 공정은 먼저 샘플의 동결된 물이 임의로 화학적 고정제를 포함하는 유기 용매에 의해 용해된 다음, 샘플이 수지에 임베딩되고, 최종적으로 샘플이 현미경 검사에 의한 이의 이미징을 위해 점진적으로 예열되는 공정을 지칭한다.
- "고압 동결": 고압하, 바람직하게는 2000bar 내지 2700bar 범위의 압력, 더욱 바람직하게는 약 2048bar의 압력에서 생물학적 샘플의 동결 고정 방법을 지칭한다.
- "옥소"는 화학적 작용기 -C(O)-를 지칭한다.
- "중합체"는 반복 단위(단량체)로 구성되는 거대분자 화합물을 지칭한다. 하나의 구현예에 따라서, 용어 "중합체"는 반복 단위로 구성되는 유기 거대분자 화합물을 지칭한다.
- "광개시제"는 방사선(자외선 또는 가시광선)에 노출될 때 중합 반응, 바람직하게는 라디칼 중합을 개시할 수 있는 임의의 화학적 화합물을 지칭한다. 본 발명에서, 방사선에 노출될 때 광개시제는 중합체 쇄의 성장을 개시하도록 제1 비닐 단량체 단위와 반응할 수 있는 라디칼 본체를 제공한다.
- "라디칼 중합"은 중합체 쇄의 성장이 유리 라디칼 단량체의 연속 첨가로 구현되는 임의의 중합 반응 기술을 지칭한다. 본 발명에서, 표현 "라디칼 중합"은 당업자에게 익히 공지된 3개의 다음 단계: (1) 개시, (2) 전파 및 (3) 종료를 포함하는 중합체를 제공하는 공정을 지칭한다.
- "열-개시제"는 열에 노출될 때 중합 반응, 바람직하게는 라디칼 중합을 개시할 수 있는 임의의 화학적 화합물을 지칭한다. 본 발명에서, 열에 노출될 때 열-개시제는 중합체 쇄의 성장을 개시하도록 제1 비닐 단량체 단위와 반응할 수 있는 라디칼 본체를 제공한다.
- "초미세 절제술"은 현미경 검사 연구를 위한 물체를 제조하는 방법을 지칭하고, 상기 방법은 초-마이크로톰(즉, 현미경 검사로 분석될 샘플을 매우 얇게 슬라이싱하기에 적합한 다이아몬드 나이프 또는 유리 나이프가 장착된 장치)을 사용하는 단계를 포함한다.
- "유리화"는 생물학적 물질이 무정형 물을 함유하는 고체로 변형되는 공정을 지칭하고, 여기서 모든 세포 성분은 실물 상태(close-to-life state)로 유지된다. 본 발명에서, 표현 "유리된 생물학적 샘플"은 유리화 후 수득된 생물학적 샘플을 지칭한다.
상세한 설명
임베딩 매질
본 발명은 임베딩 매질, 바람직하게는 생물학적 샘플용 임베딩 매질, 더욱 더 바람직하게는 생물학적 샘플을 침윤시키고 함침시키기 위한 임베딩 매질에 관한 것이다. 하나의 구현예에 따라서, 본 발명은 생물학적 샘플을 바람직하게는 현미경 검사, 보다 바람직하게는 전자 현미경 검사로 이미징하기 위한 임베딩 매질에 관한 것이다. 하나의 구현예에 따라서, 임베딩 매질은 전기-전도성이다.
하나의 구현예에 따라서, 임베딩 매질은 유기 화합물을 포함하거나 이로 구성된 조성물이다.
하나의 구현예에 따라서, 임베딩 매질은 중합체 전구체 배합물(formulation)을 포함하거나 이로 구성된다. 하나의 구현예에 따라서, 임베딩 매질은 단량체 혼합물 및 임의로 개시제를 포함하거나 이들로 구성된다.
하나의 구현예에 따라서, 임베딩 매질은 단량체 혼합물(mixture)을 포함하거나 이로 구성되고, 여기서 적어도 하나의 단량체는 화학식 I을 갖는다:
[화학식 I]
상기 화학식 I에서,
R 1 은 H, 선형 또는 분지된 알킬을 나타내고, 바람직하게는 R 1 은 H 또는 메틸을 나타내고;
R 2 는 H, 메타크릴로일, 아크릴로일, 선형 또는 분지된 알킬을 나타내고, 바람직하게는 R 1 은 H, 메타크릴로일 또는 아크릴로일 그룹을 나타내고;
R a , R b , R c 및 R d 는 각각 독립적으로 H, 선형 또는 분지된 알킬, 바람직하게는 H 또는 메틸로부터 선택되고;
n은 양의 정수이다.
하나의 구현예에 따라서, 임베딩 매질은 다음을 포함하는 단량체 혼합물을 포함하거나 이로 구성된다:
- 화학식 II-A의 단량체:
[화학식 II-A]
- 화학식 II-B의 단량체:
[화학식 II-B]
및/또는
- 화학식 II-C의 단량체:
[화학식 II-C]
상기 화학식에서,
R 1 은 H, 선형 또는 분지된 알킬을 나타내고, 바람직하게는 R 1 은 H 또는 메틸을 나타내고;
R 2 는 H, 메타크릴로일, 아크릴로일, 선형 또는 분지된 알킬을 나타내고, 바람직하게는 R 1 은 H, 메타크릴로일 또는 아크릴로일 그룹을 나타내고;
R a 는 H, 선형 또는 분지된 알킬을 나타내고; 바람직하게는 H 또는 메틸을 나타내고;
n1은 1 내지 5 범위의 양의 정수, 바람직하게는 3이고;
n2 및 n3은 각각 독립적으로 5보다 큰, 바람직하게는 10 내지 100의 범위, 더욱 바람직하게는 10 내지 40 범위의 양의 정수를 나타낸다.
하나의 구현예에 따라서, 단량체 혼합물은 적어도 하나의 단량체, 바람직하게는 적어도 하나의 라디칼 중합성 단량체, 더욱 바람직하게는 적어도 하나의 친수성 라디칼 중합성 단량체를 포함하거나 이로 구성된다. 하나의 구현예에 따라서, 단량체 혼합물은 적어도 하나의 친수성 단량체를 포함하거나 이로 구성된다. 하나의 구현예에 따라서, 단량체 혼합물은 2개의 라디칼 중합성 단량체의 혼합물을 포함하거나 이로 구성된다.
하나의 구현예에 따라서, 라디칼 중합성 단량체는 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 디아크릴레이트 및/또는 디메타크릴레이트의 그룹으로부터 선택되고, 상기 그룹은 하이드록실, 아미노 또는 옥소 그룹과 같은 적어도 하나의 친수성 그룹에 의해 임의로 치환된다.
하나의 구현예에 따라서, 임베딩 매질은 다음을 포함한다:
- 폴리알킬렌 글리콜 (디)아크릴레이트 및/또는 폴리알킬렌 글리콜 (디)메타크릴레이트로서, 상기 폴리알킬렌 글리콜 디아크릴레이트 또는 폴리알킬렌 글리콜 메타크릴레이트가 하이드록실, 아미노 또는 옥소 그룹과 같은 적어도 하나의 친수성 그룹에 의해 임의로 치환되는, 폴리알킬렌 글리콜 (디)아크릴레이트 및/또는 폴리알킬렌 글리콜 (디)메타크릴레이트; 및
- 개시제.
하나의 구현예에 따라서, 임베딩 매질은 다음을 포함한다:
- 알킬렌 글리콜 디메타크릴레이트;
- 폴리알킬렌 글리콜 디아크릴레이트 또는 폴리알킬렌 글리콜 메타크릴레이트로서, 상기 폴리알킬렌 글리콜 디아크릴레이트 또는 폴리알킬렌 글리콜 메타크릴레이트가 하이드록실, 아미노 또는 옥소 그룹과 같은 적어도 하나의 친수성 그룹으로 임의로 치환되는, 폴리알킬렌 글리콜 디아크릴레이트 또는 폴리알킬렌 글리콜 메타크릴레이트; 및
- 개시제.
하나의 구현예에 따라서, 임베딩 매질은 디메틸아미노에틸 메타크릴레이트(DEMA), 하이드록시에틸 메타크릴레이트(HEMA), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 폴리(락트-코-글리콜산)(PLGA), 폴리락트산(PLA) 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함하지 않는다.
하나의 구현예에 따라서, 단량체 혼합물은 하나의 디아크릴레이트 및 하나의 디메타크릴레이트, 바람직하게는 하나의 글리콜 디아크릴레이트 및 하나의 글리콜 디메타크릴레이트를 포함하거나 이들로 구성되며; 상기 글리콜 디아크릴레이트 및/또는 글리콜 디메타크릴레이트는 하이드록실, 아미노 또는 옥소 그룹과 같은 적어도 하나의 친수성 그룹으로 임의로 치환된다.
하나의 구현예에 따라서, 단량체 혼합물은 하나의 알킬렌 글리콜 디메타크릴레이트 및 하나의 폴리알킬렌 글리콜 디아크릴레이트를 포함하거나 이들로 구성되며, 상기 알킬렌 글리콜 디메타크릴레이트 및/또는 폴리알킬렌 글리콜 디아크릴레이트는 하이드록실, 아미노 또는 옥소 그룹과 같은 적어도 하나의 친수성 그룹에 의해 임의로 치환된다.
하나의 구현예에 따라서, 단량체 혼합물은 하나의 알킬렌 글리콜 디메타크릴레이트 및 하나의 폴리알킬렌 글리콜 메타크릴레이트를 포함하거나 이들로 구성되며, 상기 알킬렌 글리콜 디메타크릴레이트 및/또는 폴리알킬렌 글리콜 메타크릴레이트는 하이드록실, 아미노, 또는 옥소 그룹과 같은 적어도 하나의 친수성 그룹에 의해 임의로 치환된다.
하나의 구현예에 따라서, 알킬렌 글리콜 디메타크릴레이트는 에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트, 프로필렌 글리콜 디메타크릴레이트 및 부틸렌 글리콜 디메타크릴레이트로부터 선택되고; 바람직하게는 알킬렌 글리콜 디메타크릴레이트는 에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트이다.
하나의 구현예에 따라서, 폴리알킬렌 글리콜 디아크릴레이트는 폴리에틸렌 글리콜 디아크릴레이트, 폴리프로필렌 글리콜 디아크릴레이트 및 폴리부틸렌 글리콜 디아크릴레이트로부터 선택되고; 바람직하게는 폴리알킬렌 글리콜 디아크릴레이트는 폴리프로필렌 글리콜 디아크릴레이트이다.
하나의 구현예에 따라서, 폴리알킬렌 글리콜 메타크릴레이트는 폴리에틸렌 글리콜 메타크릴레이트, 폴리프로필렌 글리콜 메타크릴레이트 및 폴리부틸렌 글리콜 메타크릴레이트로부터 선택되고, 상기 폴리알킬렌 글리콜 메타크릴레이트는 하이드록실, 아미노 또는 옥소 그룹과 같은 적어도 하나의 친수성 그룹에 의해 임의로 치환되고; 바람직하게는 폴리알킬렌 글리콜 메타크릴레이트는 하이드록실 폴리에틸렌 글리콜 메타크릴레이트이다.
하나의 구현예에 따라서, 단량체 혼합물은 트리에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트(TGdMA) 및 폴리프로필렌 글리콜 디아크릴레이트(PPGdA)를 포함하거나 이들로 구성된다. 하나의 구현예에 따라서, 임베딩 매질은 트리에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트, 폴리프로필렌 글리콜 디아크릴레이트 및 개시제를 포함하거나 이들로 구성된다.
하나의 구현예에 따라서, 개시제는 라디칼 중합 개시제이다. 하나의 구현예에 따라서, 개시제는 광개시제이다. 하나의 구현예에 따라서, 개시제는 열개시제이다.
하나의 구현예에 따라서, 광개시제는 2-3급-부틸안트라퀴논, 캄포퀴논, 디페닐(2,4,6-트리메틸벤조일)포스핀 옥사이드, 9,10-펜안트렌퀴논, 페닐비스(2,4,6-트리메틸벤조일)포스핀 옥사이드, 2-벤질-2-(디메틸아미노)-4'-모르폴리노부티로페논, 3,6-비스(2-메틸-2-모르폴리노프로피오닐)-9-옥틸카바졸, 4'-3급-부틸-2',6'-디메틸아세토페논, 2,2-디에톡시아세토페논, 4'-에톡시아세토페논, 3'-하이드록시아세토페논, 4'-하이드록시아세토페논, 1-하이드록시사이클로헥실페닐세톤, 2-하이드록시-4'-(2-하이드록시에톡시)-2-메틸프로피오페논, 2-하이드록시-2-메틸프로피 오페논, 2-메틸-4'-(메틸티오)-2-모르폴리노프로피오페논, 4'-페녹시아세토페논, 벤조인, 벤조인에틸 에테르, 벤조인메틸 에테르, 4,4'-디메틸벤조인, 4,4'-디메틸벤질, 벤조페논, 벤조일 비페닐, 4,4'-비스(디에틸아미노)벤조페논, 4,4'-디하이드록시벤조페논, 3,4-디메틸벤조페논, 3-하이드록시벤조페논, 4-하이드록시벤조페논, 2-메틸벤조페논, 3-메틸벤조페논, 4-메틸벤조페논, 메틸 벤조일포르메이트, 미힐러 케톤(Michler's ketone), 1-클로로-4-프로폭시-9H-티오크산텐-9-온, 2-클로로티오크산텐-9-온, 2,4-디에틸-9H-티오크산텐-9-온, 이소프로필-9H-티오크산텐-9-온, 10-메틸페노티아진, 티오크산텐-9-온, 디아릴요오도늄 헥사플루오로포스페이트 염, 디아릴요오도늄 헥사플루오로안티모네이트 염, 트리아릴설포늄 헥사플루오로포스페이트 염, 헥사플루오로포스페이트 및 트리아릴설포늄 헥사플루오로안티모네이트 염으로부터 선택된다.
하나의 구현예에 따라서, 열-개시제는 아조 화합물, 예를 들어, 2,2'-아조비스(이소부티로니트릴)(AIBN), 4,4'-아조비스(4-시아노발레르산), 1,1'-아조비스( 사이클로헥산 카보니트릴), 2,2'-아조비스(2-메틸프로피온아미딘) 디하이드로클로라이드, 2,2'-아조비스(2-메틸프로피오니트릴); 및 유기 퍼옥사이드, 예를 들어, 벤조일 퍼옥사이드(BPO)로부터 선택된다.
하나의 구현예에 따라서, 알킬렌 글리콜 디메타크릴레이트 또는 이의 임의의 유도체는 임베딩 매질에의 총 중량에 대해 60중량% 내지 99중량%, 바람직하게는 65중량% 내지 99중량%, 70중량% 내지 99중량%, 75중량% 내지 99중량%, 80중량% 내지 99중량%, 85중량% 내지 99중량%, 90중량% 내지 99중량% 범위이다. 하나의 구현예에 따라서, 알킬렌 글리콜 디메타크릴레이트는 임베딩 매질의 총 중량에 대해 60중량% 내지 99중량%, 바람직하게는 60중량% 내지 90중량%, 60중량% 내지 85중량%, 60중량% 내지 80중량%, 60중량% 내지 75중량%, 60중량% 내지 70중량% 범위이다. 하나의 구현예에서, 알킬렌 글리콜 디메타크릴레이트는 임베딩 매질의 총 중량에 대해 약 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 6, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99중량%이다. 하나의 구현예에 따라서, 알킬렌 글리콜 디메타크릴레이트 또는 이의 임의의 유도체는 임베딩 매질의 총 중량에 대해 70중량% 내지 90중량%, 75중량% 내지 85중량% 범위, 보다 바람직하게는 80%이다.
하나의 구현예에 따라서, 알킬렌 글리콜 디메타크릴레이트 또는 이의 임의의 유도체는 임베딩 매질의 총 중량에 대해 0.1중량% 내지 100중량% 범위; 바람직하게는 0.1중량% 내지 90중량%; 1중량% 내지 90중량%; 10중량% 내지 90중량%; 15중량% 내지 90중량%; 20중량% 내지 90중량%; 25중량% 내지 90중량%; 30중량% 내지 90중량%; 35중량% 내지 90중량%; 40중량% 내지 90중량%; 45중량% 내지 90중량%; 50중량% 내지 90중량%; 55중량% 내지 90중량%; 60중량% 내지 90중량%; 65중량% 내지 90중량%; 70중량% 내지 90중량%; 75중량% 내지 90중량%; 80중량% 내지 90중량%; 또는 85중량% 내지 90중량%의 범위이다. 하나의 구현예에 따라서, 알킬렌 글리콜 디메타크릴레이트는 임베딩 매질의 총 중량에 대해 0.1중량% 내지 99중량%; 바람직하게는 0.1중량% 내지 95중량%, 0.1중량% 내지 90중량%, 0.1중량% 내지 85중량%, 0.1중량% 내지 80중량%, 0.1중량% 내지 75중량%, 0.1중량% 내지 70중량%, 0.1중량% 내지 65중량%, 0.1중량% 내지 60중량%, 0.1중량% 내지 55중량%, 0.1중량% 내지 50중량%, 0.1중량% 내지 45중량%, 0.1중량% 내지 40중량%, 0.1중량% 내지 35중량%, 0.1중량% 내지 30중량%, 0.1중량% 내지 25중량%, 0.1중량% 내지 20중량%, 0.1중량% 내지 15중량%, 0.1중량% 내지 10중량%, 또는 0.1중량% 내지 5중량%의 범위이다.
하나의 구현예에서, 폴리알킬렌 글리콜 디아크릴레이트 또는 이의 임의의 유도체는 임베딩 매질의 총 중량에 대해 0중량% 이상 내지 38중량% 범위, 바람직하게는 1중량% 내지 38중량%, 5중량% 내지 38중량%, 10중량% 내지 38중량%, 15중량% 내지 38중량%, 20중량% 내지 38중량%, 25중량% 내지 38중량%, 30중량% 내지 38중량% 범위이다. 하나의 구현예에 따라서, 폴리알킬렌 글리콜 디아크릴레이트 또는 이의 임의의 유도체는 임베딩 매질의 총 중량에 대해 0중량% 이상 내지 38중량%, 바람직하게는 1중량% 내지 35중량%, 1중량% 내지 30중량%, 1중량% 내지 25중량%, 1중량% 내지 20중량%, 1중량% 내지 15중량%, 1중량% 내지 10중량%, 1중량% 내지 5중량% 범위이다.
하나의 구현예에 따라서, 폴리알킬렌 글리콜 디아크릴레이트 또는 이의 임의의 유도체는 임베딩 매질의 총 중량에 대해 0중량% 이상 내지 50중량%, 바람직하게는 0.1중량% 내지 50중량%, 5중량% 내지 50중량%, 10중량% 내지 50중량%, 15중량% 내지 50중량%, 20중량% 내지 50중량%, 25중량% 내지 50중량%, 30중량% 내지 50중량%, 35중량% 내지 50중량%, 40중량% 내지 50중량%, 또는 45중량% 내지 50중량% 범위이다. 하나의 구현예에 따라서, 폴리알킬렌 글리콜 디아크릴레이트는 0중량% 이상 내지 50중량%, 바람직하게는 0.1중량% 내지 45중량%, 0.1중량% 내지 40중량%, 0.1중량% 내지 35중량%, 0.1중량% 내지 30중량%, 0.1중량% 내지 25중량%, 0.1중량% 내지 20중량%, 0.1중량% 내지 15중량%, 0.1중량% 내지 10중량%, 또는 0.1중량% 내지 5중량%의 범위이다. 하나의 구현예에 따라서, 폴리알킬렌 글리콜 디아크릴레이트는 임베딩 매질의 총 중량에 대해 0중량% 이상 내지 50중량%, 바람직하게는 1중량% 내지 40중량%, 5중량% 내지 30중량%, 더욱 바람직하게는 10중량% 내지 25중량%의 범위, 더욱 바람직하게는 20중량%이다.
하나의 구현예에 따라서, 폴리알킬렌 글리콜 메타크릴레이트 또는 이의 임의의 유도체는 임베딩 매질의 총 중량에 대해 0중량% 이상 내지 38중량%, 바람직하게는 1중량% 내지 38중량%, 5중량% 내지 38중량%, 10중량% 내지 38중량%, 15중량% 내지 38중량%, 20중량% 내지 38중량%, 25중량% 내지 38중량%, 30중량% 내지 38중량% 범위이다. 하나의 구현예에 따라서, 폴리알킬렌 글리콜 메타크릴레이트 또는 이의 임의의 유도체는 임베딩 매질의 총 중량에 대해 0중량% 이상 내지 38중량%, 바람직하게는 1중량% 내지 35중량%, 1중량% 내지 30중량%, 1중량% 내지 25중량%, 1중량% 내지 20중량%, 1중량% 내지 15중량%, 1중량% 내지 10중량%, 1중량% 내지 5중량% 범위이다.
하나의 구현예에 따라서, 알킬렌 글리콜 디아크릴레이트 또는 이의 임의의 유도체는 100 내지 500kDa 범위; 바람직하게는 100 내지 400kDa, 100 내지 300kDa, 100 내지 200kDa 범위의 몰 중량을 갖는다. 하나의 구현예에 따라서, 알킬렌 글리콜 디아크릴레이트 또는 이의 임의의 유도체의 몰 중량은 약 150kDa이고, 바람직하게는 150kDa이다. 하나의 구현예에 따라서, 트리에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트(TGdMA)의 몰 중량은 약 150kDa이고, 바람직하게는 150kDa이다.
하나의 구현예에 따라서, 폴리알킬렌 글리콜 디아크릴레이트 또는 이의 임의의 유도체는 500 내지 1500kDa, 바람직하게는 500 내지 100kDa, 700 내지 900kDa, 750 내지 850kDa 범위의 몰 중량을 갖는다. 하나의 구현예에 따라서, 폴리알킬렌 글리콜 디아크릴레이트 또는 이의 임의의 유도체는 약 800kDa의 몰 중량을 갖는다. 하나의 구현예에 따라서, 폴리알킬렌 글리콜 디아크릴레이트 또는 이의 임의의 유도체의 몰 중량은 800kDa이다. 하나의 구현예에 따라서, 폴리프로필렌 글리콜 디아크릴레이트의 몰 중량은 약 800kDa이고, 바람직하게는 800kDa이다.
하나의 구현예에 따라서, 임베딩 매질은 다음을 포함하거나 이들로 구성된다:
- 하나의 알킬렌 글리콜 디메타크릴레이트, 바람직하게는 트리에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트 79중량%;
- 하나의 폴리알킬렌 글리콜 디아크릴레이트, 바람직하게는 폴리프로필렌 글리콜 디아크릴레이트 20중량%; 및
- 라디칼 중합 개시제, 바람직하게는 라디칼 중합 광개시제, 더욱 바람직하게는 벤조인 메틸 에테르 1중량%.
하나의 구현예에 따라서, 임베딩 매질은 다음을 포함한다:
- 60중량% 내지 99중량%의 트리에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트;
- 0중량% 이상 내지 38중량%의 폴리프로필렌 글리콜 디아크릴레이트; 및
- 0.1중량% 내지 2중량%의 라디칼 중합 개시제; 바람직하게는 벤조인 메틸 에테르.
하나의 구현예에 따라서, 임베딩 매질은 다음을 포함한다:
- 98중량% 내지 99.9중량%의 트리에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트; 및
- 0.1중량% 내지 2중량%의 라디칼 중합 개시제; 바람직하게는 벤조인 메틸 에테르.
하나의 구현예에 따라서, 임베딩 매질은 다음을 포함한다:
- 60중량% 내지 99중량%의 트리에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트;
- 0중량% 이상 내지 38중량%의 하이드록실 폴리에틸렌 글리콜 메타크릴레이트; 및
- 0.1중량% 내지 2중량%의 라디칼 중합 개시제; 바람직하게는 벤조인 메틸 에테르.
하나의 구현예에 따라서, 임베딩 매질은 용매, 바람직하게는 휘발성 용매, 더욱 바람직하게는 에탄올과 같은 알콜을 추가로 포함한다. 하나의 구현예에 따라서, 임베딩 매질은 아세톤을 추가로 포함한다.
하나의 구현예에 따라서, 임베딩 매질은 조영제, 및/또는 동결 치환에 유용한 화합물, 예를 들어, 바람직하게는 적어도 하나의 중금속 염, 보다 바람직하게는 질산은, 오스뮴 및/또는 우라닐 아세테이트를 포함하는 고정제 및/또는 용매로부터 선택된 적어도 하나의 첨가제를 추가로 포함한다. 하나의 구현예에 따라서, 임베딩 매질은 임베딩 매질의 총 중량에 대해 0중량% 이상 내지 5중량% 범위의 적어도 하나의 첨가제를 추가로 포함한다. 하나의 구현예에 따라서, 임베딩 매질은 임베딩 매질의 총 중량에 대해 0.5중량%를 포함한다. 하나의 구현예에 따라서, 임베딩 매질은 임베딩 매질의 총 중량에 대해 0.01중량%를 포함한다. 하나의 구현예에 따라서, 동결 치환에 유용한 화합물은 아세톤, 무수 아세톤, 우라닐 아세테이트, 탄닌산, 알데히드, 예를 들어, 글루타르알데히드 또는 파라포름알데히드; 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된다. 하나의 구현예에 따라서, 고정제는 오스뮴, 사산화오스뮴, 우라닐 아세테이트, 글루타르알데히드, 파라포름알데히드, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택된다. 하나의 구현예에 따라서, 조영제는 우라닐 아세테이트, 납 유도체, 은 유도체, 오스뮴 유도체, 란탄족 염, 폴리페놀, 바람직하게는 탄닌에 함유된 폴리페놀, 갈산 및 탄닌산으로부터 선택된다.
하나의 구현예에 따라서, 임베딩 매질은 친수성 화합물을 추가로 포함한다.
하나의 구현예에 따라서, 임베딩 매질은 적어도 하나의 생물학적 샘플, 바람직하게는 유리화된 생물학적 샘플 및/또는 화학적으로 고정된 생물학적 샘플 및/또는 탈수된 생물학적 샘플을 추가로 포함한다. 하나의 구현예에 따라서, 생물학적 샘플은 세포 추출물이다. 하나의 구현예에 따라서, 생물학적 샘플은 세포이다. 하나의 구현예에 따라서, 생물학적 샘플은 조직이다. 하나의 구현예에 따라서, 생물학적 샘플은 기관이다. 하나의 구현예에 따라서, 생물학적 샘플은 HeLa 세포이다. 하나의 구현예에 따라서, 생물학적 샘플은 멜라닌 세포이다.
하나의 구현예에 따라서, 임베딩 매질은 액체이다. 하나의 구현예에 따라서, 임베딩 매질은 반고체이다. 하나의 구현예에 따라서, 임베딩 매질은 저온, 바람직하게는 0℃ 미만, 바람직하게는 -90℃ 내지 -10℃ 범위의 온도, 더욱 바람직하게는 -40℃ 내지 -20℃ 범위의 온도에서 중합 가능하다. 하나의 구현예에 따라서, 임베딩 매질은 -70℃ 내지 -20℃ 범위의 온도, 바람직하게는 -35℃, -40℃ 또는 -45℃에서 중합 가능하다. 하나의 구현예에 따라서, 임베딩 매질은 -90℃ 내지 -10℃, 바람직하게는 -80℃ 내지 -10℃, -70℃ 내지 -10℃, -70℃ 내지 -10℃, -60℃ 내지 -10℃, -50℃ 내지 -10℃, -40℃ 내지 -10℃, -30℃ 내지 -10℃, 또는 -20℃ 내지 -10℃ 범위의 온도에서 중합 가능하다. 하나의 구현예에 따라서, 임베딩 매질은 -90℃ 내지 -10℃, 바람직하게는 -90℃ 내지 -20℃, -90℃ 내지 -30℃, -90℃ 내지 -40℃, -90℃ 내지 -50℃, -90℃ 내지 -60℃, -90℃ 내지 -70℃, 또는 -90℃ 내지 -80℃ 범위의 온도에서 중합 가능하다.
하나의 구현예에 따라서, 임베딩 매질은 Lowicryl® 수지가 아니거나 이를 포함하지 않는다. 하나의 구현예에 따라서, 임베딩 매질은 페놀 또는 이의 유도체를 포함하지 않는다. 하나의 구현예에 따라서, 임베딩 매질은 메톡시페놀을 포함하지 않는다. 하나의 구현예에 따라서, 임베딩 매질은 알킬 메타크릴레이트를 포함하지 않는다. 하나의 구현예에 따라서, 임베딩 매질은 헥실 메타크릴레이트를 포함하지 않는다. 하나의 구현예에 따라서, 임베딩 배지는 비스페놀 A 또는 이의 유도체를 포함하지 않는다. 하나의 구현예에 따라서, 임베딩 매질은 에톡실화 비스페놀 A 디메타크릴레이트를 포함하지 않는다.
이미징 물질
본 발명은 또한 현미경 검사를 위한 지지 물질에 관한 것이다. 하나의 구현예에 따라서, 지지 물질은 현미경 검사에 사용하기 위한 물질, 바람직하게는 이미징될 샘플용 임베딩 물질("이미징 물질"로서 지칭됨)이다. 하나의 구현예에 따라서, 본 발명의 이미징 물질은 상기 정의된 바와 같은 임베딩 매질의 중합으로부터 생성된다.
하나의 구현예에 따라서, 본 발명의 이미징 물질은 전기-전도성이다. 하나의 구현예에 따라서, 이미징 물질은 현미경 검사 분석 동안 표면에 임의의 전자를 축적하지 않는다. 하나의 구현예에 따라서, 본 발명의 이미징 물질은 대전 방지성이다.
하나의 구현예에 따라서, 본 발명의 이미징 물질은 투명성이다. 하나의 구현예에 따라서, 본 발명의 이미징 물질은 반고체 또는 고체이다. 하나의 구현예에 따라서, 본 발명의 이미징 물질은 가교결합 중합체 매트릭스 및 임의로 적어도 하나의 생물학적 샘플을 포함하거나 이들로 구성된다. 하나의 구현예에 따라서, 본 발명의 이미징 물질은 임베딩된 생물학적 샘플의 물리적 특성, 예를 들어, 이의 형광 및/또는 이의 단백질 초미세구조의 보존을 보존한다. 하나의 구현예에 따라서, 본 발명의 이미징 물질은 면역 검출을 위한 항체의 검출이 현미경 검사로 이미징할 수 있도록 임베딩된 생물학적 샘플의 단백질 초미세구조를 보존한다.
하나의 구현예에 따라서, 이미징 물질은 상기 정의된 바와 같은 임베딩 매질의 중합으로부터 생성되는 중합체 매트릭스에 임베딩된 적어도 하나의 생물학적 샘플을 포함한다.
하나의 구현예에 따라서, 이미징 물질은 에폭시 수지를 포함하지 않는다. 하나의 구현예에 따라서, 이미징 물질은 에폭사이드 그룹을 포함하지 않는다. 하나의 구현예에 따라서, 이미징 물질은 폴리아릴렌 에테르를 포함하지 않는다.
임베딩 매질의 제조 공정
본 발명은 또한 상기 정의된 바와 같은 임베딩 매질의 제조 공정에 관한 것이다.
하나의 구현예에 따라서, 상기 공정은 다음을 포함하거나 다음을 혼합함으로써 구성된다:
- 상기 정의된 바와 같은 적어도 하나의 단량체, 바람직하게는 적어도 하나의 라디칼 중합성 단량체, 더욱 바람직하게는 적어도 하나의 친수성 라디칼 중합성 단량체; 및
- 상기 정의된 바와 같은 개시제.
하나의 구현예에 따라서, 상기 공정은 다음을 포함하거나 다음을 혼합함으로써 구성된다:
- 단량체 혼합물을 수득하기 위해, 상기 정의된 바와 같은 2개의 단량체, 바람직하게는 2개의 라디칼 중합성 단량체, 더욱 바람직하게는 2개의 친수성 라디칼 중합성 단량체; 및
- 임의로 상기 정의된 바와 같은 개시제.
하나의 구현예에 따라서, 상기 공정은 다음을 포함하거나 이들을 혼합함으로써 구성된다:
- 알킬렌 글리콜 디메타크릴레이트;
- 폴리알킬렌 글리콜 디아크릴레이트 또는 폴리알킬렌 글리콜 메타크릴레이트로서, 상기 폴리알킬렌 글리콜 디아크릴레이트 또는 폴리알킬렌 글리콜 메타크릴레이트가 하이드록실, 아미노 또는 옥소 그룹과 같은 적어도 하나의 친수성 그룹으로 임의로 치환되는, 폴리알킬렌 글리콜 디아크릴레이트 또는 폴리알킬렌 글리콜 메타크릴레이트; 및
- 상기 정의된 바와 같은 개시제.
하나의 구현예에 따라서, 상기 공정은 생물학적 샘플, 예를 들어, 세포 추출물, 세포, 조직 및/또는 기관을 첨가하는 단계; 바람직하게는 유리화된 생물학적 샘플 및/또는 탈수된 생물학적 샘플을 첨가하는 단계를 추가로 포함한다. 하나의 구현예에 따라서, 상기 공정은 첨가제, 예를 들어, 중금속 염을 첨가하는 단계를 추가로 포함한다. 하나의 구현예에 따라서, 상기 공정은 질산은 및/또는 우라닐 아세테이트를 첨가하는 단계를 추가로 포함한다.
하나의 구현예에 따라서, 임베딩 매질을 제조하는 공정은 0℃ 내지 40℃; 바람직하게는 5℃ 내지 30℃, 10℃ 내지 30℃, 15℃ 내지 30℃, 20℃ 내지 30℃, 25℃ 내지 30℃ 범위의 온도에서 수행되고; 보다 바람직하게는 임베딩 매질을 제조하는 공정은 약 25℃의 온도에서 수행된다.
이미징 물질의 제조 공정
본 발명은 또한 상기 정의된 바와 같은 이미징 물질의 제조 공정에 관한 것이다.
하나의 구현예에 따라서, 상기 공정은 다음을 포함한다:
(a) 상기 정의된 바와 같은 임베딩 매질을 제공하는 단계; 및
(c) 상기 임베딩 매질을 중합하는 단계.
하나의 구현예에 따라서, 상기 공정은 생물학적 샘플 상에 임베딩 매질을 침윤시키는 단계를 추가로 포함한다. 하나의 구현예에 따라서, 상기 공정은 다음을 포함한다:
(a) 상기 정의된 바와 같은 임베딩 매질을 제공하는 단계;
(b) 임베딩된 생물학적 샘플을 제공하기 위해 생물학적 샘플 상에 상기 임베딩 매질을 침윤시키는 단계; 및
(c) 단계 (b)의 임베딩된 생물학적 샘플을 중합하는 단계.
하나의 구현예에 따라서, 상기 공정은 생물학적 샘플을 유리화하는 단계를 추가로 포함한다. 하나의 구현예에 따라서, 상기 공정은 다음을 포함한다:
(a-0) 생물학적 샘플을 유리화하여 유리화된 생물학적 샘플을 수득하는 단계;
(a) 상기 정의된 바와 같은 임베딩 매질을 제공하는 단계;
(b) 임베딩된 생물학적 샘플을 제공하기 위해 단계 (a-0)의 유리화된 생물학적 샘플 상에 상기 임베딩 매질을 침윤시키는 단계; 및
(c) 단계 (b)의 임베딩된 생물학적 샘플을 중합하는 단계.
하나의 구현예에 따라서, 상기 공정은 단계 (a-0)의 유리화된 생물학적 샘플을 고정 및 탈수시키는 단계를 추가로 포함한다. 하나의 구현예에 따라서, 상기 공정은 다음을 포함한다:
(a-0) 생물학적 샘플을 유리화하여 유리화된 생물학적 샘플을 수득하는 단계;
(a-1) 단계 (a-0)의 유리화된 생물학적 샘플을 고정 및 탈수시키는 단계;
(a) 상기 정의된 바와 같은 임베딩 매질을 제공하는 단계;
(b) 임베딩된 생물학적 샘플을 제공하기 위해 단계 (a-1)의 생물학적 샘플 상에 상기 임베딩 매질을 침윤시키는 단계; 및
(c) 단계 (b)의 임베딩된 생물학적 샘플을 중합하는 단계.
또 다른 구현예에 따라서, 상기 공정은 생물학적 샘플을 고정 및 탈수시키는 단계를 추가로 포함한다. 하나의 구현예에 따라서, 상기 공정은 다음을 포함한다:
(a-1) 생물학적 샘플을 고정 및 탈수시키는 단계;
(a) 상기 정의된 바와 같은 임베딩 매질을 제공하는 단계;
(b) 임베딩된 생물학적 샘플을 제공하기 위해 단계 (a-1)의 생물학적 샘플 상에 상기 임베딩 매질을 침윤시키는 단계; 및
(c) 단계 (b)의 임베딩된 생물학적 샘플을 중합하는 단계.
하나의 구현예에 따라서, 단계 (a-0)은 당업자에게 익히 공지된 극저온 방법, 바람직하게는 고압 동결 공정에 의해 수행된다.
하나의 구현예에 따라서, 단계 (a-1)은 당업자에게 익히 공지된 임의의 방법, 바람직하게는 동결 치환 공정에 의해 수행된다. 하나의 구현예에 따라서, 단계 (a-1)은 바람직하게는 오스뮴, 사산화오스뮴, 우라닐 아세테이트, 파라포름알데히드 및 알데히드, 예를 들어, 글루타르알데히드, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 적어도 하나의 고정제를 사용하여 수행된다. 하나의 구현예에 따라서, 단계 (a-1)은 바람직하게는 중금속 염으로부터 선택된 적어도 하나의 조영제를 사용하여 수행된다. 하나의 구현예에 따라서, 단계 (a-1)은 바람직하게는 란탄족 염으로부터 선택된 적어도 하나의 조영제를 사용하여 수행된다. 하나의 구현예에 따라서, 조영제는 우라닐 아세테이트, 납 유도체, 은 유도체, 오스뮴 유도체, 란탄족 염, 폴리페놀, 바람직하게는 탄닌에 함유된 폴리페놀, 갈산 및 탄닌산으로부터 선택된다. 하나의 구현예에 따라서, 단계 (a-1)은 -90℃ 내지 -30℃ 범위의 온도에서 수행된다. 하나의 구현예에 따라서, 단계 (a-1)은 -70℃ 내지 -20℃ 범위의 온도, 바람직하게는 -35℃, -40℃ 또는 -45℃에서 수행된다. 하나의 구현예에 따라서, 상기 단계 (a-1)은 -90℃ 내지 -30℃, 바람직하게는 -80℃ 내지 -40℃ 또는 -60℃ 내지 -50℃ 범위의 온도에서 수행된다.
하나의 구현예에 따라서, 단계 (a)는 상기 정의된 바와 같은 임베딩 매질의 제조 공정에 따라 수행된다.
하나의 구현예에 따라서, 중합은 -90℃ 내지 -10℃ 범위의 온도, 바람직하게는 -40℃ 내지 -20℃ 범위의 온도에서 수행된다. 하나의 구현예에 따라서, 중합은 -70℃ 내지 -20℃ 범위의 온도, 바람직하게는 -35℃, -40℃ 또는 -45℃에서 수행된다. 하나의 구현예에 따라서, 중합은 -90℃ 내지 -10℃, 바람직하게는 -80℃ 내지 -10℃, -70℃ 내지 -10℃, -70℃ 내지 -10℃, -60℃ 내지 -10℃, -50℃ 내지 -10℃, -40℃ 내지 -10℃, -30℃ 내지 -10℃, 또는 -20℃ 내지 -10℃ 범위의 온도에서 수행된다. 하나의 구현예에 따라서, 중합은 -90℃ 내지 -10℃, -90℃ 내지 -20 ℃, -90℃ 내지 -30℃, -90℃ 내지 -40℃, -90℃ 내지 -50℃, -90℃ 내지 -60℃, -90℃ 내지 -70℃, 또는 -90℃ 내지 -80℃ 범위의 온도에서 수행된다.
하나의 구현예에 따라서, 중합은 열 및/또는 조사, 바람직하게는 UV 또는 가시광선 조사에 의해 개시된다.
하나의 구현예에 따라서, 조영제는 이미징 물질 총 중량에 대해 0.005 내지 0.1중량%, 바람직하게는 0.005 내지 0.05중량%, 0.005 내지 0.015중량%의 범위이다. 하나의 구현예에 따라서, 조영제는 이미징 물질의 총 중량에 대해 약 0.01중량%이다. 하나의 구현예에 따라서, 조영제는 이미징 물질의 총 중량에 대해 0.01 중량%이다.
(전자) 현미경 검사로 생물학적 샘플을 이미징하는 방법
본 발명은 또한 현미경 검사, 바람직하게는 광학 및/또는 전자 현미경 검사로 생물학적 샘플을 이미징하는 방법에 관한 것이다.
하나의 구현예에 따라서, 본 발명의 방법은 다음 단계를 포함하거나, 이들로 구성된다:
- 바람직하게는 상기 정의된 바와 같은 이미징 물질의 제조 공정에 의해 상기 정의된 바와 같은 이미징 물질을 제공하는 단계; 및
- 바람직하게는 현미경 검사, 더욱 바람직하게는 광학 현미경 검사 및/또는 전자 현미경 검사로 상기 이미징 물질을 이미징하는 단계.
하나의 구현예에 따라서, 본 발명의 방법은 다음 단계를 포함하거나 이들로 구성된다:
(i-0) 바람직하게는 고압 동결 공정, 플런지 동결, 제트 동결 및/또는 슬램 동결에 의해 구현되는, 생물학적 샘플을 유리화하는 단계;
(ii) 바람직하게는 동결 치환 프로토콜을 사용하여 상기 정의된 바와 같은 임베딩 매질을 단계 (i-0)의 유리화된 생물학적 샘플 상에 침윤시키는 단계;
(iii) 단계 (ii)에서 수득된 혼합물을 중합하여 전기- 전도성 이미징 물질을 생성하는 단계;
(iv) 단계 (iii)의 전기-전도성 이미징 물질을 광학 현미경 검사 및/또는 전자 현미경 검사로 이미징하는 단계.
하나의 구현예에 따라서, 본 발명의 방법은 다음 단계를 포함하거나 이들로 구성된다:
(ii) 바람직하게는 동결 치환 프로토콜을 사용하여 상기 정의된 바와 같은 임베딩 매질을 생물학적 샘플 상에 침윤시키는 단계;
(iii) 단계 (ii)에서 수득된 혼합물을 중합하여 전기-전도성 이미징 물질을 생성하는 단계;
(iv) 단계 (iii)의 전기-전도성 이미징 물질을 광학 현미경 검사 및/또는 전자 현미경 검사로 이미징하는 단계.
하나의 구현예에 따라서, 상기 방법은 전기-전도성 이미징 물질 상의 미세 절제술 또는 초미세 절제술 단계를 추가로 포함한다.
하나의 구현예에 따라서, 상기 방법은 바람직하게는 단계 (i-0) 후에 생물학적 샘플을 고정 및/또는 탈수시키는 단계(단계 i-1)를 추가로 포함한다. 하나의 구현예에 따라서, 상기 방법은 바람직하게는 단계 (i-0) 후 유리화된 생물학적 샘플을 고정 및/또는 탈수시키는 단계(단계 i-1)를 추가로 포함한다. 하나의 구현예에 따라서, 단계 (i-1)은 용매, 바람직하게는 아세톤 및/또는 에탄올을 사용하는 단계를 포함하고; 상기 용매는 고정제 및/또는 조영제를 함유한다. 하나의 구현예에 따라서, 단계 (i-1)은 -90℃ 내지 -30℃ 범위의 온도에서 수행된다.
하나의 구현예에 따라서, 단계 (iv)는 현미경 검사; 바람직하게는 광학 현미경 검사, 광학 현미경 검사, 형광 현미경 검사 및/또는 전자 현미경 검사; 더욱 바람직하게는 전자 현미경 검사로 구현된다. 하나의 구현예에 따라서, 단계 (iv)는 상관 현미경 검사로 구현된다. 하나의 구현예에 따라서, 단계 (iv)는 주사 전자 현미경 검사(SEM)로 구현된다. 하나의 구현예에 따라서, 단계 (iv)는 투과 전자 현미경 검사(TEM)로 구현된다. 하나의 구현예에 따라서, 단계 (iv)는 상관성 광학 및 전자 현미경 검사(CLEM)로 구현된다. 하나의 구현예에 따라서, 단계 (iv)는 에피플루오레션스(epifluorescene), 공초점, 초-해상도 또는 구조화 조명 현미경 검사(SIM)로 구현된다.
용도
본 발명은 또한 현미경 검사, 바람직하게는 광학 현미경 검사, 형광 현미경 검사 및/또는 전자 현미경 검사; 보다 바람직하게는 전자 현미경 검사에서 상기 정의된 바와 같은 임베딩 매질 또는 이미징 물질의 용도에 관한 것이다. 하나의 구현예에 따라서, 상기 정의된 바와 같은 임베딩 매질 또는 이미징 물질은 상관 현미경 검사에 유용하다.
하나의 구현예에서, 상기 정의된 바와 같은 임베딩 매질 및/또는 이미징 물질은 생물학적 샘플, 예를 들어, 세포 추출물, 세포, 조직 및/또는 기관의 이미징; 바람직하게는 유리화된 생물학적 샘플의 이미징에 유용하다.
하나의 구현예에 따라서, 상기 정의된 바와 같은 임베딩 매질 및/또는 이미징 물질은 세포 구조물 및/또는 멜라닌을 특이적으로 표적화하는데 유용하다. 하나의 구현예에 따라서, 상기 정의된 바와 같고 질산은과 같은 은 염을 포함하는 임베딩 매질 및/또는 이미징 물질은 세포 구조물을 특이적으로 표적화하는데, 바람직하게는 금 커플링된 항체 및/또는 멜라닌을 사용하여 표지된 세포 구조물을 특이적으로 표적화하는데 유용하다. 하나의 구현예에 따라서, 상기 정의된 바와 같고 질산은과 같은 은 염을 포함하는 임베딩 매질 및/또는 이미징 물질은 저온에서, 바람직하게는 0℃ 미만의 온도에서, 더욱 바람직하게는 -90℃ 내지 -10℃ 범위의 온도에서 세포 구조물 및/또는 멜라닌을 특이적으로 표적화하는데 유용하다.
하나의 구현예에 따라서, 상기 정의된 바와 같은 임베딩 매질 및/또는 이미징 물질은 항체, 바람직하게는 나노 규모 금 나노입자에 커플링된 항체를 특이적으로 표적화하는데 유용하다. 하나의 구현예에 따라서, 상기 정의된 바와 같은 임베딩 매질 및/또는 이미징 물질은 상기 임베딩 매질 및/또는 이미징 물질에 포함된 질산염을 응집시킴으로써 나노 규모 금 나노입자에 커플링된 항체를 특이적으로 표적화하는데 유용하다. 하나의 구현예에서, 상기 정의된 바와 같은 임베딩 매질 및/또는 이미징 물질은 저온에서, 바람직하게는 0℃ 미만의 온도에서 은 강화 반응을 생성하는데 유용하다.
키트
본 발명은 또한 바람직하게는 현미경 검사로 이미징될 생물학적 샘플을 제조하기 위한 키트에 관한 것이다.
하나의 구현예에 따라서, 상기 키트는 상기 정의된 바와 같은 적어도 하나의 단량체를 포함하는 제1 용기; 및 개시제를 포함하는 제2 용기를 포함한다. 하나의 구현예에 따라서, 키트는 상기 정의된 바와 같은 친수성 단량체 혼합물을 포함하는 제1 용기; 및 개시제를 포함하는 제2 용기를 포함한다.
하나의 구현예에 따라서, 상기 키트는 다음을 포함한다:
- (a) 알킬렌 글리콜 디메타크릴레이트 및 (b) 폴리알킬렌 글리콜 디아크릴레이트 또는 폴리알킬렌 글리콜 메타크릴레이트로서, 상기 폴리알킬렌 글리콜 디아크릴레이트 또는 폴리알킬렌 글리콜 메타크릴레이트가 하이드록실, 아미노 또는 옥소 그룹과 같은 적어도 하나의 친수성 그룹으로 임의로 치환되는, 폴리알킬렌 글리콜 디아크릴레이트 또는 폴리알킬렌 글리콜 메타크릴레이트를 포함하는 제1 용기;
- 라디칼 중합 개시제를 포함하는 제2 용기.
하나의 구현예에 따라서, 키트는 다음을 포함한다:
- (a) 트리에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트 및 (b) 폴리(프로필렌 글리콜) 디아크릴레이트를 포함하는 제1 용기; 및
- 벤조인 메틸 에테르 또는 하이드록실-2-메틸프로피오페논을 포함하는 제2 용기.
하나의 구현예에 따라서, 본 발명은 또한 상기 정의된 바와 같은 적어도 하나의 단량체 및 개시제를 포함하는 용기 및 혼합 수단을 포함하는 키트를 지칭한다.
하나의 구현예에 따라서, 본 발명은 또한 다음을 포함하는 키트를 지칭한다:
- (a) 알킬렌 글리콜 디메타크릴레이트, (b) 폴리알킬렌 글리콜 디아크릴레이트 또는 폴리알킬렌 글리콜 메타크릴레이트로서, 상기 폴리알킬렌 글리콜 디아크릴레이트 또는 폴리알킬렌 글리콜 메타크릴레이트가 하이드록실, 아미노 또는 옥소 그룹과 같은 적어도 하나의 친수성 그룹에 의해 임의로 치환되는, 폴리알킬렌 글리콜 디아크릴레이트 또는 폴리알킬렌 글리콜 메타크릴레이트; 및 (c) 라디칼 중합 개시제를 포함하는 용기; 및
- 혼합 수단.
하나의 구현예에 따라서, 혼합 수단은, 예를 들어, 용기, 캡슐, 혼합기 및/또는 주걱이지만, 이에 제한되지 않는다.
도 1은 투과 전자 현미경 검사(TEM)로 수득된, 본 발명의 임베딩 매질(도 1A), 또는 Lowicryl® 수지(도 1B)에 임베딩된 HeLa 세포의 클리셰이다.
도 2는 집속 이온 빔 주사 전자 현미경 검사(FIB-SEM)로 수득된, 본 발명의 임베딩 매질에 임베딩된 HeLa 세포의 클리셰이다.
도 3은 동결 치환 동안 0.01%의 우라닐 아세테이트와 대조되는 예쁜 꼬마 선충(Caenorhabditis elegans)을 포함하는 본 발명의 이미징 물질의 2개의 주사 전자 현미경 검사(SEM 3View) 클리셰의 비교이다. A는 본 발명의 매질에 임베딩되고, B는 Lowicryl® 수지에 임베딩된다. 제1 클리셰는 선명하고 균일한 콘트라스트를 보여준다. 제2 클리셰는 클리셰에 초점을 맞추는데 사용되는 백색 반점 및 사각형 영역으로서 보이는 유의한 충전을 보여준다. 전자는 블록의 표면에 축적되어 선명한 이미징을 방해한다.
도 4는 본 발명의 임베딩 매질에 임베딩된 예쁜 꼬마 선충의 현미경 검사 클리셰이다. 클리셰 4A는 주사 전자 현미경 검사(SEM)로 수득되었고; 클리셰 4B는 녹색 형광 단백질(GFP)로 수득되었고; 클리셰 4C는 적색 형광 단백질(RFP)로 수득되었고; 클리셰 4D는 투과광에 의해 수득되었고; 클리셰 4E는 다중 채널 이미지이다.
도 5는 도 4의 형광 현미경 검사 클리셰의 줌이다. 클리셰 5A는 주사 전자 현미경 검사(SEM)로 수득되었고; 클리셰 5B는 녹색 형광 단백질(GFP)로 수득되었고; 클리셰 5C는 적색 형광 단백질(RFP)로 수득되었고; 클리셰 5D는 다중 채널 이미지이다.
도 2는 집속 이온 빔 주사 전자 현미경 검사(FIB-SEM)로 수득된, 본 발명의 임베딩 매질에 임베딩된 HeLa 세포의 클리셰이다.
도 3은 동결 치환 동안 0.01%의 우라닐 아세테이트와 대조되는 예쁜 꼬마 선충(Caenorhabditis elegans)을 포함하는 본 발명의 이미징 물질의 2개의 주사 전자 현미경 검사(SEM 3View) 클리셰의 비교이다. A는 본 발명의 매질에 임베딩되고, B는 Lowicryl® 수지에 임베딩된다. 제1 클리셰는 선명하고 균일한 콘트라스트를 보여준다. 제2 클리셰는 클리셰에 초점을 맞추는데 사용되는 백색 반점 및 사각형 영역으로서 보이는 유의한 충전을 보여준다. 전자는 블록의 표면에 축적되어 선명한 이미징을 방해한다.
도 4는 본 발명의 임베딩 매질에 임베딩된 예쁜 꼬마 선충의 현미경 검사 클리셰이다. 클리셰 4A는 주사 전자 현미경 검사(SEM)로 수득되었고; 클리셰 4B는 녹색 형광 단백질(GFP)로 수득되었고; 클리셰 4C는 적색 형광 단백질(RFP)로 수득되었고; 클리셰 4D는 투과광에 의해 수득되었고; 클리셰 4E는 다중 채널 이미지이다.
도 5는 도 4의 형광 현미경 검사 클리셰의 줌이다. 클리셰 5A는 주사 전자 현미경 검사(SEM)로 수득되었고; 클리셰 5B는 녹색 형광 단백질(GFP)로 수득되었고; 클리셰 5C는 적색 형광 단백질(RFP)로 수득되었고; 클리셰 5D는 다중 채널 이미지이다.
실시예
본 발명은 하기 실시예를 참조하여 더 잘 이해될 것이다. 이들 실시예는 본 발명의 특정 구현예를 대표하는 것으로 의도되고, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
약어
℃: 섭씨 온도
CDCl3: 중수소화 클로로포름
CLEM: 상관성 광학 및 전자 현미경 검사
Eq.: 당량
PEG: 폴리에틸렌 글리콜
PPGdA: 폴리(프로필렌 글리콜) 디아크릴레이트
g: 그램(들)
h: 시간(들)
mmol: 밀리몰(들)
mol: 몰(들)
NMR: 핵 공명 자기
TGdMA: 트리에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트
UV: 자외선
물질 및 방법
시약, 용매 및 출발 물질은 시그마 알드리치(Sigma Aldrich)로부터 구입되었으며, 추가 정제 없이 사용되었다.
UV 조사
샘플의 UV 조사는 퓨젼 UV의 UV 램프 시스템 F300S 헤라우스 Noblelight® 또는 동결 치환 프로토콜(자동화된 동결 치환 자동화)을 위한 레이카(Leica)의 AFS-1 또는 AFS-2를 사용하여 수행된다 .
파트 I - 임베딩 매질의 제조
실시예 1: 폴리(프로필렌 글리콜) 디아크릴레이트(PPGdA)의 합성
PPGdA는 아크릴화에 의해 합성되었다: 800g/mol(20g, 25mmol)의 폴리(프로필렌 글리콜) 및 트리에틸아민(11.7g, 115mmol)을 140mL의 디클로로메탄과 함께 환저 플라스크에 도입했다. 혼합물을 5℃로 냉각시키고, 아크릴로일 클로라이드(9.5g, 105mmol)를 자기 교반하에 적가하였다.
사용된 폴리(프로필렌 글리콜)의 분자량에 따라, 트리메틸아민 및 아크릴로일 클로라이드의 비율은 조정되어야 한다(하이드록실 작용기당 각각 2.3당량 및 2.1당량).
반응은 2시간 후에 완료되었다. 트리에틸아민 염을 여과로 제거하고, 생성물을 염기성, 산성 및 중성 수로 여러 번 세척하였다. 유기상을 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 여과시켰다. 감압하에 용매 제거 후 최종 생성물(20.7g, 수율: 91%)을 수득했다.
1H NMR (CDCl3, 300MHz): 6.43-6.35 (2H, d, H-CH=CH-); 6.15-3.06 (2H, d, H-CH=CH-), 5.81-5.78 (2H, d, H-CH=CH-), 5.18-5.02 (2H, m, -C(O)-O-CH-CH2-), 3.83-3.18 (42H, m, -CH(CH3)-CH2-), 3.83-3.18 (42H, m, -CH(CH3)-CH2-O-), 1.39-0.99 (42H, m, -CH(CH3)-CH2-O-).
실시예 2: 본 발명의 임베딩 매질의 제조
2.1. 원-팟(one-pot) 용액
배합물 1
플라스크에 도입하고, 실온에서 트리에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트(TGdMA), 폴리(프로필렌 글리콜) 디아크릴레이트(PPGdA) 및 개시제, 바람직하게는 벤조인 메틸 에테르 및/또는 하이드록실-2-메틸프로피오페논을 질량비 79/20/1로 교반했다. 최종 임베딩 매질 1을 빛 및/또는 열로부터 멀리 저장한다.
배합물 2
플라스크에 도입하고, 실온에서 트리에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트(TGdMA) 및 개시제, 바람직하게는 벤조인 메틸 에테르 및/또는 하이드록실-2-메틸프로피오페논을 질량비 99/1로 교반했다. 최종 임베딩 매질 2를 빛 및/또는 열로부터 멀리 저장한다.
배합물 3
플라스크에 도입하고, 실온에서 트리에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트(TGdMA), 하이드록실 PEG 메타크릴레이트 및 개시제, 바람직하게는 벤조인 메틸 에테르 및/또는 하이드록실-2-메틸프로피오페논을 질량비 74/25/1로 교반했다. 최종 임베딩 매질 3을 빛 및/또는 열로부터 멀리 저장한다.
배합물 4
플라스크에 도입하고, 실온에서 트리에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트(TGdMA), 폴리(프로필렌 글리콜) 디아크릴레이트(PPGdA), 질산은(1.4mM)의 용액 및 개시제, 바람직하게는 벤조인 메틸 에테르 및/또는 하이드록실-2-메틸프로피오페논을 질량비 72.4/18.1/9/0.5로 교반했다. 최종 임베딩 매질 4를 빛 및/또는 열로부터 멀리 저장한다.
2.2. 본 발명의 임베딩 매질을 포함하는 키트
제1 용기에 도입하고, 실온에서 트리에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트(TGdMA) 및 폴리(프로필렌 글리콜) 디아크릴레이트(PPGdA)를 질량비 79/20으로 교반했다.
제2 용기에 개시제, 바람직하게는 벤조인 메틸 에테르 및/또는 하이드록실 -2-메틸프로피오페논을 저장한다.
매트릭스 전구체 용액은 제1 및 제2 용기의 내용물을 혼합한 후에 수득되고, 바람직하게는 혼합물은 빛 및/또는 열로부터 떨어져 수행된다.
파트 II - 전자 현미경에 의한 전기-전도성 이미징 물질의 제조 및 이의 이미징
실시예 3 : 현미경 검사 분석용 생물학적 샘플의 제조 공정
목표는 전자 현미경 검사용 형광성 및/또는 전기-전도성 생물학적 이미징 물질을 제공하기 위해 생물학적 샘플을 임베딩하는 것이다. 이 목표에서, 본 출원인은 실시예 2의 임베딩된 매질 1을 사용하는 공정을 수행한다.
일반적인 공정
단계 1 - 생물학적 샘플의 유리화 및/또는 고정/탈수
먼저, 생물학적 샘플을 당업자에게 익히 공지된 임의의 극저온 방법에 의해 유리화한 다음, -90℃에서 에탄올, 메탄올 또는 아세톤일 수 있는 용매에 도입한다(용매 중 생물학적 샘플은 "동결 치환 칵테일"로서 지칭된다). 임의로, 화학적 고정제 및/또는 조영제를 첨가할 수 있다. 화학적 고정제의 예는 오스뮴, 사산화오스뮴, 우라닐 아세테이트, 글루타르알데히드 및 파라포름알데히드일 수 있다. 조영제의 예는 우라닐 아세테이트, 납 유도체, 은 유도체, 오스뮴 유도체 또는 탄닌산일 수 있다.
생물학적 샘플은 -90℃에서 1분 내지 수 일 범위의 기간 동안 유지된다. 이어서, 온도를 -40℃까지 서서히 상승시키고, 동결 치환 칵테일을 순수한 용매로 연속 세척하여 제거한다. 탈수된 생물학적 샘플이 수득된다.
단계 2- 임베딩된 매질 1의 침윤
둘째로, 단계 1에서 수득된 탈수된 생물학적 샘플을 임베딩된 매질 용액만으로 침윤될 때까지 임베딩된 매질/용매 혼합물로 연속적으로 침윤시킨다. 본 발명의 매트릭스 전구체 용액에 임베딩된 탈수된 생물학적 샘플을 포함하는 조성물이 수득된다.
단계 3 - 중합 - 전기-전도성 생물학적 이미징 물질의 제조
이어서, 단계 2에서 수득된 조성물은 광중합 또는 열중합에 의해 중합시킨다.
광중합의 경우, 조성물은 24시간 내지 48시간 범위의 기간 동안 UV 조사에 의해 -40℃에서 개시된다. 이어서, 온도를 항상 UV 조사하에서 실온으로 상승시킨다. 생물학적 샘플 내부에서 완전한 중합을 달성하기 위해 실온에서 추가로 24시간의 UV 조사가 적용된다.
전기-전도성 및 형광 보존성 이미징 물질이 수득된다.
단계 4b (임의적) - 미세 절제술 또는 초미세 절제술
전기-전도성 이미징 물질은 임의로 전자 현미경 검사로 관찰하기 전에 미세 절제술 및/또는 초미세 절제술로 제조된다.
임의의 추가 단계 - 광학 현미경 검사
이 공정에서, 전자-전도성 이미징 물질의 광학 현미경 검사 분석은 전자 현미경 검사로 관찰하기 전에 단계 1-4 중 임의의 한 단계에서 수행될 수 있다.
파트 III - 전자 현미경 검사에 의한 관찰
실시예 4: 현미경 검사 분석
전자 현미경 검사에 사용될 때 본 발명의 이미징 물질의 우월성을 입증하기 위해, 생물학적 샘플은 동결 칵테일이 0.05%의 우라닐 아세테이트, 0.01%의 글루타르알데히드, 1%의 물을 포함하는 실시예 3에서 기재된 프로토콜에 따라 제조되었고, -90℃ 내지 -45℃ 범위의 온도에서 수행된다.
콘트라스트
목표는 동일한 동결 치환 프로토콜을 모두 사용하여(즉, -60℃ 내지 -45℃ 범위의 온도에서 0.05%의 우라닐 아세테이트, 0.01% 글루타르알데히드 및 1% 물을 포함하는 동결 칵테일을 사용하여) HeLa 세포 상에서 Lowicryl® HM 20 수지와 비교하여 본 발명의 임베딩 매질로부터 수득된 콘트라스트의 증가를 비교하는 것이다.
HeLa 세포의 관찰은 투과 전자 현미경 검사(TEM)로 수행되었다.
도 1은 더 우수한 콘트라스트가 Lowicryl® HM 20 수지(도 1B)로부터 수득된 것보다 본 발명의 물질(도 A 참조)로 달성된다는 것을 보여준다.
본 발명의 물질에 임베딩된 HeLa 세포의 분석은 또한 주사 전자 현미경 검사(SEM)로 관찰되었다. 도 2는 본 발명의 물질이 상기 물질의 내부에 임베딩된 세포의 구조를 미세하게 가시화할 수 있다는 것을 보여준다.
멜라닌 표적화
이 실험에서, MNT1 세포(불멸화된 멜라닌 세포주, MNT1 라인)가 연구되었다.
멜라노솜 및 은 염 응집체를 포함하는 본 발명의 이미징 물질의 관찰은 전자 현미경 검사로 수행되었다.
놀랍게도, 상응하는 클리셰(도 3A)는 은 염이 생물학적 구조물에 특이적으로 축적된다는 것을 보여준다.
임의의 이론에 결부시키지 않고, 본 출원인은 특정 반응이 본 발명의 이미징 물질에 도입된 은 염과 멜라노솜의 아밀로이드 섬유에 응집된 멜라닌 사이의 현미경 검사 연구 동안 일어난다는 것을 제출한다.
이러한 특정 반응을 입증하기 위해, 멜라닌을 발현하지 않는 HeLa 세포로 멜라노솜을 대체하여 동일한 실험을 수행했다.
상응하는 클리셰(도 3B)는 은 염이 물질에 분산되어 있지만, 생물학적 샘플에 특이적으로 위치하지 않는다는 것을 보여준다.
결과적으로, 본 발명의 이미징 물질, 특히 임베딩 매질은, 은 염을 포함하는 경우, 멜라닌을 함유하는 생물학적 샘플을 특이적으로 표적화할 수 있게 한다.
형광 보존
이미징 물질에서 MNT1 세포의 보존된 형광의 분석은 또한 구조화된 조명 현미경 검사(SIM)(광학 현미경 검사)로 수행되었다.
도 4 및 도 5는 본 발명의 이미징 물질로부터 HeLa 세포의 내부 형광의 효율적인 검출을 보여준다.
Claims (15)
- - 알킬렌 글리콜 디메타크릴레이트 및/또는 올리고(알킬렌 글리콜) 디메타크릴레이트로부터 선택된 글리콜 디메타크릴레이트 60중량% 내지 99중량%;
- 폴리알킬렌 글리콜 디아크릴레이트 또는 폴리알킬렌 글리콜 메타크릴레이트로서, 상기 폴리알킬렌 글리콜 디아크릴레이트 또는 폴리알킬렌 글리콜 메타크릴레이트가 하이드록실, 아미노 또는 옥소 그룹과 같은 적어도 하나의 친수성 그룹으로 임의로 치환되는, 폴리알킬렌 글리콜 디아크릴레이트 또는 폴리알킬렌 글리콜 메타크릴레이트;
- 바람직하게는 적어도 하나의 중금속 염 또는 란탄족 염을 포함하는 적어도 하나의 첨가제; 및
- 라디칼 중합 개시제를 포함하는 생물학적 샘플용 전기-전도성 임베딩 매질(electro-conductive embedding medium) - 제1항에 있어서, 글리콜 디메타크릴레이트가 에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트, 디에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트, 트리에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트, 프로필렌 글리콜 디메타크릴레이트 및 부틸렌 글리콜 디메타크릴레이트로부터 선택되고; 바람직하게는 글리콜 디메타크릴레이트가 트리에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트인, 전기-전도성 임베딩 매질.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 폴리알킬렌 글리콜 디아크릴레이트가 폴리에틸렌 글리콜 디아크릴레이트, 폴리프로필렌 글리콜 디아크릴레이트 및 폴리부틸렌 글리콜 디아크릴레이트로부터 선택되고; 바람직하게는 폴리알킬렌 글리콜 디아크릴레이트가 폴리프로필렌 글리콜 디아크릴레이트인, 전기-전도성 임베딩 매질.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리알킬렌 글리콜 메타크릴레이트가 폴리에틸렌 글리콜 메타크릴레이트, 폴리프로필렌 글리콜 메타크릴레이트 및 폴리부틸렌 글리콜 메타크릴레이트로부터 선택되고; 폴리알킬렌 글리콜 메타크릴레이트가 하이드록실, 아미노, 또는 옥소 그룹과 같은 적어도 하나의 친수성 그룹에 의해 임의로 치환되고; 바람직하게는 폴리알킬렌 글리콜 메타크릴레이트가 하이드록실 폴리에틸렌 글리콜 메타크릴레이트인, 전기-전도성 임베딩 매질.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
- 60중량% 내지 99중량%의 트리에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트;
- 0중량% 이상 내지 38중량%의 폴리프로필렌 글리콜 디아크릴레이트; 및
- 0.1중량% 내지 2중량%의 라디칼 중합 개시제를 포함하는, 전기-전도성 임베딩 매질. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
- 60중량% 내지 99중량%의 트리에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트;
- 0중량% 이상 내지 38중량%의 하이드록실 폴리에틸렌 글리콜 메타크릴레이트; 및
- 0.1중량% 내지 2중량%의 라디칼 중합 개시제를 포함하는, 전기-전도성 임베딩 매질. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
- 79중량%의 트리에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트;
- 20중량%의 폴리프로필렌 글리콜 디아크릴레이트; 및
- 1중량%의 벤조인 메틸 에테르를 포함하는, 전기-전도성 임베딩 매질. - 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 첨가제가 보다 바람직하게는 오스뮴 및/또는 우라닐 아세테이트를 포함하는 적어도 하나의 중금속 염인, 전기-전도성 임베딩 매질.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 생물학적 샘플, 바람직하게는 유리화되고/되거나 화학적으로 고정되고/되거나 탈수된 생물학적 샘플을 추가로 포함하는, 전기-전도성 임베딩 매질.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따르는 임베딩 매질의 중합으로부터 생성되는 중합체 매트릭스에 임베딩된 적어도 하나의 생물학적 샘플을 포함하는 전기-전도성 이미징 물질(electro-conductive imaging material).
- 제10항에 있어서, 임베딩된 생물학적 샘플의 내부 형광, 단백질 활성 및/또는 항원 특이성을 보존하는, 전기-전도성 물질.
- 다음 단계를 포함하는, 생물학적 샘플을 현미경 검사로 이미징하기 위한 방법:
(i-1) 생물학적 샘플을 고정 및/또는 탈수시키는 단계;
(ii) 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따르는 전기-전도성 임베딩 매질을 단계 (i-1)의 생물학적 샘플 상에 침윤시키는 단계;
(iii) 단계 (ii)에서 수득된 혼합물을 중합시켜 전기-전도성 이미징 물질을 생성하는 단계;
(iv) 단계 (iii)의 전기-전도성 이미징 물질을 광학 현미경 검사 및/또는 전자 현미경 검사로 이미징하는 단계. - 제12항에 있어서, 상기 전기-전도성 이미징 물질 상에서 미세 절제술 또는 초미세 절제술 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 현미경 검사, 바람직하게는 광학 및/또는 전자 현미경 검사로 생물학적 샘플을 이미징하기 위한, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따르는 전기-전도성 임베딩 매질 또는 제10항 또는 제11항에 따르는 전기-전도성 이미징 물질의 용도.
- - (a) 알킬렌 글리콜 디메타크릴레이트 및/또는 올리고(알킬렌 글리콜) 디메타크릴레이트로부터 선택된 글리콜 디메타크릴레이트; 및 (b) 폴리알킬렌 글리콜 디아크릴레이트 또는 폴리알킬렌 글리콜 메타크릴레이트로서, 상기 폴리알킬렌 글리콜 디아크릴레이트 또는 폴리알킬렌 글리콜 메타크릴레이트가 하이드록실, 아미노 또는 옥소 그룹과 같은 적어도 하나의 친수성 그룹으로 임의로 치환되는, 폴리알킬렌 글리콜 디아크릴레이트 또는 폴리알킬렌 글리콜 메타크릴레이트를 포함하는 제1 용기;
- 라디칼 중합 개시제를 포함하는 제2 용기를 포함하거나;
(a) 알킬렌 글리콜 디메타크릴레이트 및/또는 올리고(알킬렌 글리콜) 디메타크릴레이트로부터 선택된 글리콜 디메타크릴레이트; (b) 폴리알킬렌 글리콜 디아크릴레이트 또는 폴리알킬렌 글리콜 메타크릴레이트로서, 상기 폴리알킬렌 글리콜 디아크릴레이트 또는 폴리알킬렌 글리콜 메타크릴레이트가 하이드록실, 아미노 또는 옥소 그룹과 같은 적어도 하나의 친수성 그룹으로 임의로 치환되는, 폴리알킬렌 글리콜 디아크릴레이트 또는 폴리알킬렌 글리콜 메타크릴레이트; 및 (c) 라디칼 중합 개시제를 포함하는 용기; 및
혼합 수단을 포함하는, 현미경 검사로 이미징될 생물학적 샘플을 제조하기 위한 키트(kit).
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