TWI808138B - 用於以光及/或電子顯微術使其成像之生物樣本之包埋介質 - Google Patents
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Abstract
本發明涉及顯微術的領域，最好是電子顯微術。特別的，本發明係關於一種用於以顯微術成像生物樣本的包埋介質，其包括：- 佔重量百分比60%到99%的選自烷二醇二甲基丙烯酸酯及/或寡(烷二醇)二甲基丙烯酸酯的二醇二甲基丙烯酸酯；- 佔重量百分比0%到38%的聚烷二醇二丙烯酸酯或聚烷二醇甲基丙烯酸酯；上述的聚烷二醇二丙烯酸酯或聚烷二醇甲基丙烯酸酯視需要地經至少一種親水性基，比如羥基、胺基或酮基，加以取代；- 至少一種添加劑，最好包括至少一種重金屬鹽或鑭化鹽；以及- 佔重量百分比0.1%到2%的自由基聚合起始劑。
本發明亦係指由本發明之包埋介質的聚合產生的導電的材料，及其製備的過程與試劑盒；上述材料包埋至少一種生物樣本。
本發明亦涉及一種以顯微術對生物樣本成像的方法，該生物樣本包括使用本發明的包埋介質及/或本發明的導電材料。
Description
本發明涉及顯微術的領域，最好是光學顯微術及/或電子顯微術的領域。特別的，本發明係關於一種用於以顯微術成像生物樣本的包埋介質。本發明的包埋介質係指一種組合物，該組合物包括或由下述混合物構成：(i)二醇二甲基丙烯酸酯，(ii)聚烷二醇二丙烯酸酯及/或聚烷二醇甲基丙烯酸酯，及(iii)起始劑。本發明亦係指由本發明之包埋介質的聚合產生的導電的及/或生物保鮮的材料，及其製備的過程與試劑盒；上述材料包埋至少一種生物樣本。
本發明亦涉及一種顯微術成像生物樣本的方法，該生物樣本包括使用本發明的包埋介質及/或導電材料。
顯微術指一組用於觀察肉眼不可見的物體及物體特定區域的技術。在皆知的顯微術技法中，電子顯微術係用於觀察生物材料。此技 法藉由電子束或電磁輻射的繞射、反射或折射與被觀察樣本直接交互作用，而產生振幅反差或相位反差的影像。
迄今，欲得到良好的振幅反差只能藉由添加基本上由重金屬鹽與固定劑(比如醛類)組成的造影劑。
任何樣本的高解析度的電子顯微術視像化也意味著複雜的製備步驟，比如固定而使樣本在顯微術分析時最接近天然狀態，同時保留保護免於電子顯微術的高真空環境。
生物材料的固定可以化學性(添加固定劑比如醛類)或物理性(超快冷凍以達到生物材料的水含量的玻璃化或非晶態固定化)達成。
特別是，為了達成固定後的天然生物材料的觀察，已發展出用聚合物樹脂替代已固定生物樣本中的水的包埋方法，以保護該生物樣本免於真空同時強化該生物樣本，使其藉由超薄切片法而薄切片。
然而，使用固定劑和造影劑導致：1)樣本準備時的污染廢料再處理問題，2)生物學特性改變和3)成像時的電子電荷排空較差。實際上，固定劑和重金屬鹽為毒性的、誘導基因突變、致癌及/或有放射性。它們部分地或全部地改變刺激下的螢光發射的生物學特性或蛋白質活性或遮蔽免疫檢測的抗原。並且，重金屬鹽在成像時只捕捉電子，但不容許在顯微影像陳套(cliché)的實體化時累積在樣本表面的電子電荷放電。其結果，得到在樣品表面的電子電荷的局部累積，導致形成圍繞樣本的光暈及妨礙正常的成像。是故解讀影像陳套變得困難。
例如，在穿透式電子顯微術(TEM,transmission electron microscopy)或電子斷層掃描術中，此超負荷大幅地改變焦平面且在錯誤的 焦點得到影像。在掃描式電子顯微術(SEM,scanning electron microscopy)中，該電子過載提供樣本表面的白色光暈。
已有替代解決方案被發展出來。一種解決方案係降低藉由使用大量過剩的重金屬鹽及藉由改良低-電子成像參數所創造的電荷功效(Deerinck等，2010)。
但是，此方法相當激進，不適用於很多種生物樣本，並迫使在室溫操作，因而無法得到低溫固定達成的最佳超微結構保存。特別地，此方法可以突顯多數的膜或細胞壁但引起嚴重的抽提，排除相關於其餘生物內含物的所有資訊。
另一解決方案的組成係結合使用重金屬鹽與薄碳膜，或藉由蒸鍍的金屬沉積，後者可提供電子放電。然而，此方法需額外的步驟製備樣本，且只能排除樣本周邊的電荷。此外，重金屬鹽的用量仍引起後續的廢料再處理。
因此，有需要提供更有效率的製程用以製備用於電子顯微術成像的生物樣本。特別地，需要提供更有效率的生物材料包埋介質，該介質能降低造影劑的需求及/或其生物影響，而在其藉由電子顯微術成像時使樣本的反差最大化而可得到最佳品質的影像。
在市售的樹脂中，Lowicryl®樹脂具有在電子束作用下昇華少的優點。並且，視產品而定，這些樹脂的前體溶液在低至-35℃或-70℃的溫度仍保持流體，因此它們適合用於分析玻璃化的生物樣本的快速冷凍和低溫置換方法。快速冷凍被認為是迄今最接近生物學材料天然狀態的固定方法且被廣泛地使用於定性和定量分析。
然而，Lowicryl®樹脂不導電且導致在藉由電子顯微術分析時不滿意的樣本觀察，特別是在樣本製備時造影劑用量太少的情況。
因此，也需要提供一種生物材料包埋介質，該介質能在室溫包埋或低溫包埋後的電子顯微術成像時有效地排空樣本表面及/或包埋介質表面的累積電荷。也需要提供更有效率的生物材料包埋介質，該介質能在其電子顯微術成像時維持良好的穩定性及/或物理完整性。也需要提供一種包埋介質，該介質能大幅地降低重金屬鹽或鑭化鹽的用量。因此，也需要提供生物材料包埋介質，該介質能在顯微術分析時一直保留最佳的超微結構。
為了進一步最適化電子顯微術在生物學研究中的使用，螢光顯微術允許生物樣本的有效率靶定。固定劑及/或造影劑的使用顯著降低經包埋於樹脂的蛋白質的螢光和天然特性。比如，環氧樹脂與蛋白質的胺基交互作用，妨礙其進一步作為蛋白質的能力。Lowicryl®樹脂或丙烯酸酯樹脂不與生物物質交叉反應且保護它們的共振特性。
因此，需要提供一種無生物交互作用的包埋介質，該介質有效率地保留被包埋的生物樣本的天然螢光，同時保留可能的電子顯微術(EM)反差。
驚奇的是，申請人已經展示親水性樹脂，該樹脂衍生自選自二醇二甲基丙烯酸酯、聚烷二醇二丙烯酸酯及/或聚烷烴二醇甲基丙烯酸酯的單體混合物的聚合，提供解決如上所述先前技術的問題的有效包埋介質。
有利地，被本發明的包埋介質所包含的生物樣本的超微結構與螢光都被保留。有利地，以本發明的包埋介質所得到的影像反差優於使用市售樹脂所達成者。
本發明因而涉及一種用於生物樣本的導電性包埋介質，該介質包括：- 佔重量百分比60%到99%的選自烷二醇二甲基丙烯酸酯及/或寡(烷二醇)二甲基丙烯酸酯的二醇二甲基丙烯酸酯；- 聚烷二醇二丙烯酸酯或聚烷二醇甲基丙烯酸酯；該聚烷二醇二丙烯酸酯或聚烷二醇甲基丙烯酸酯視需要地經至少一個親水性基，比如羥基、胺基或酮基，加以取代；- 至少一種添加劑，較佳地包含至少一種重金屬鹽或鑭化鹽；以及- 自由基聚合起始劑。
根據一個具體例，用於生物樣本的導電性包埋介質包括：- 佔重量百分比60%到99%的選自烷二醇二甲基丙烯酸酯及/或寡(烷二醇)二甲基丙烯酸酯的二醇二甲基丙烯酸酯；- 佔重量百分比0%到38%的聚烷二醇二丙烯酸酯或聚烷二醇甲基丙烯酸酯；該聚烷二醇二丙烯酸酯或聚烷二醇甲基丙烯酸酯視需要地經至少一種親水性基，比如羥基、胺基或酮基，加以取代；以及- 佔重量百分比0.1%到2%的自由基聚合起始劑。
根據一個具體例，二醇二甲基丙烯酸酯是選自於乙二醇二甲 基丙烯酸酯、二乙二醇二甲基丙烯酸酯、三乙二醇二甲基丙烯酸酯、丙二醇二甲基丙烯酸酯和丁二醇二甲基丙烯酸酯；較佳地該二醇二甲基丙烯酸酯為三乙二醇二甲基丙烯酸酯。
根據一個具體例，聚烷二醇二丙烯酸酯是選自聚乙二醇二丙烯酸酯、聚丙二醇二丙烯酸酯和聚丁二醇二丙烯酸酯；較佳地該聚烷二醇二丙烯酸酯為聚丙二醇二丙烯酸酯。
根據一個具體例，聚烷二醇甲基丙烯酸酯是選自聚乙二醇甲基丙烯酸酯、聚丙二醇甲基丙烯酸酯和聚丁二醇甲基丙烯酸酯；該聚烷二醇甲基丙烯酸酯視需要地經至少一種親水基，比如羥基、胺基或酮基，加以取代；較佳地該聚烷二醇甲基丙烯酸酯為羥基聚乙二醇甲基丙烯酸酯。
根據一個具體例，自由基聚合起始劑是光起始劑或熱起始劑，較佳地該自由基聚合起始劑為光起始劑，更佳地為安息香甲基醚或2-羥基-2-甲基-1-苯基-丙-1-酮。
根據一個具體例，導電性包埋介質包括：- 佔重量百分比60%到99%的三乙二醇二甲基丙烯酸酯；- 佔重量百分比大於0%到38%的聚丙二醇二丙烯酸酯；以及- 佔重量百分比0.1%到2%的自由基聚合起始劑。
根據一個具體例，導電性包埋介質包括：- 佔重量百分比60%到99%的三乙二醇二甲基丙烯酸酯；- 佔重量百分比大於0%到38%的羥基聚乙二醇甲基丙烯酸酯；以及- 佔重量百分比0.1%到2%的自由基聚合起始劑。
根據一個具體例，導電性包埋介質包括至少一種重金屬鹽， 更佳地包括鋨及/或醋酸鈾。
根據一個具體例，導電性包埋介質進一步地包括至少一種生物樣本，較佳地為玻璃化的及/或化學固定的及/或脫水的生物樣本。
本發明也涉及一種導電性成像材料，該材料包括至少一種被聚合物基質包埋的生物樣本，該聚合物基質是由如上定義的包埋介質的聚合所產生。
根據一個具體例，導電性材料保留了被包埋的生物樣本的自發螢光、蛋白質活性及/或抗原特異性。
本發明也涉及一種以電子顯微術對生物樣本成像的方法，該方法包括以下步驟：(i-1)固定及/或脫水生物樣本；(ii)於步驟(i-1)的生物樣本滲入如上定義的導電性包埋介質；(iii)聚合化步驟(ii)得到的混合物，得到導電性成像材料；(iv)藉由光學顯微術及/或電子顯微術成像步驟(iii)的導電性成像材料。
根據一個具體例，該方法進一步地包括於導電性成像材料的切片或超薄切片的步驟。
本發明也涉及使用如上定義的包埋介質或如上定義的導電性成像材料，藉由顯微術，較佳地藉由光學顯微術及/或電子顯微術，用於成像生物樣本。
本發明也涉及用於製備將於顯微術成像的生物樣本的試劑盒，包括： - 第一容器，包括(a)選自烷二醇二甲基丙烯酸酯及/或寡(烷二醇)二甲基丙烯酸酯的二醇二甲基丙烯酸酯；和(b)聚烷二醇二丙烯酸酯或聚烷二醇甲基丙烯酸酯，該聚烷二醇二丙烯酸酯或聚烷二醇甲基丙烯酸酯可視需要地經至少一種親水性基，比如羥基、胺基或酮基，加以取代；- 第二容器，包括自由基聚合起始劑；或包括：一容器，包括(a)選自烷二醇二甲基丙烯酸酯及/或寡(烷二醇)二甲基丙烯酸酯的二醇二甲基丙烯酸酯；和(b)聚烷二醇二丙烯酸酯或聚烷二醇甲基丙烯酸酯，該聚烷二醇二丙烯酸酯或聚烷二醇甲基丙烯酸酯視需要地經至少一種親水性基，比如羥基、胺基或酮基，加以取代；和(c)自由基聚合起始劑；以及混合手段。
本發明中，以下的術語有如下的意涵：
- “約”：在一個數字前意味著該數字的數值的加或減10%。
- “丙烯酸酯”：指具有至少一個CH2=CH-COO基團的乙烯基單體。
- “胺基”：指衍生自氨NH3藉由一或多個氫原子以有機自由基置換的任何化合物。胺基較佳地指-NH2、-NHR和-NRR’，其中R和R’較佳地是烷基。因此“胺基”包含單烷基胺基和二烷基胺基。
- “生物樣本”：指收集自動物或植物或人體活體的任何生物材料，比如細胞萃取物、細胞、組織或器官。生物樣本不意指植體。
- “包埋介質”：指生物樣本被放置於其內的介質，以使得到的材料可 直接，或藉由使用切片或超薄切片切割後藉由顯微術成像。包埋介質不意指用作植體的物體或金屬。
- “二醇”：指具有至少一個二醇基，且二醇基的每個羥基位於不同的碳原子的任何有機化學化合物。根據一個具體例，該二醇化合物的各羥基係位於該二醇化合物的一末端。根據一個具體例，該二醇有至少一個鄰位二醇，即兩個羥基附接在相鄰的碳原子。二醇化合物包括烷二醇，比如乙二醇、丙二醇或丁二醇；寡(烷二醇)，比如二乙二醇、三乙二醇或四乙二醇；以及聚烷二醇，比如聚(乙二醇)、聚(丙二醇)或聚(丁二醇)。
- “二醇丙烯酸酯”：指任何二醇化合物，其中該二醇之兩個羥基官能基的一個已經涉及與丙烯酸或丙烯醯鹵的化學反應而提供具有羥基官能基與丙烯酸酯基二者的化合物。術語“二醇丙烯酸酯”包括烷二醇丙烯酸酯，寡(烷二醇)丙烯酸酯和聚烷二醇丙烯酸酯。
- “二醇二丙烯酸酯”：指任何二醇化合物，其中該二醇的兩個羥基官能基已經涉及與丙烯酸或丙烯醯鹵的化學反應而提供具有兩個丙烯酸酯基的化合物。術語“二醇二丙烯酸酯”包括烷二醇二丙烯酸酯、寡(烷二醇)二丙烯酸酯和聚烷二醇二丙烯酸酯。
- “二醇二甲基丙烯酸酯”：指任何二醇化合物，其中該二醇的兩個羥基官能基已經涉及與甲基丙烯酸或甲基丙烯醯鹵的化學反應而提供個具有兩個甲基丙烯酸酯基的化合物。術語“二醇二甲基丙烯酸酯”包括烷二醇二甲基丙烯酸酯、寡(烷二醇)二甲基丙烯酸酯和聚烷二醇二甲基丙烯酸酯。
- “二醇甲基丙烯酸酯”：指任何二醇化合物，其中該二醇之兩個羥基官能基的一個已經涉及與甲基丙烯酸或甲基丙烯醯鹵的化學反應而提供具 有羥基官能基與丙烯酸酯基二者的化合物。術語“二醇甲基丙烯酸酯”包括烷二醇甲基丙烯酸酯、寡(烷二醇)甲基丙烯酸酯和聚烷二醇甲基丙烯酸酯。
- “重金屬鹽”指包括重金屬(即具相對高的密度、原子量或原子序的金屬)的任何鹽。根據一個具體例，重金屬選自鐵、鈷、鋅、釕、銀、銦、鎘、汞、鉛、鈾、鋨和銅。
- “親水性”：定義分子或分子的一部分，其典型地電荷-極化且能氫鍵結，使其能夠在水中比起在油中或其他溶劑中更容易溶解。
- “羥基”：指化學官能基-OH。
- “起始劑”：指能啟動聚合反應，較佳地為自由基聚合的任何化學化合物。在本發明中，起始劑提供能與最初的乙烯基單體單元反應的自由基實體，俾使啟動聚合物鏈的生長。
- “Lowicryl ® ”：指基於丙烯酸酯及/或甲基丙烯酸酯樹脂的市售包埋介質。Lowicryl ® HM 20指一種非極性的包埋介質，包括或由以下化合物構成：2-丙烯酸-2-甲基-1,2-乙二基雙(氧基-2,1-乙二基)酯(CAS 106-16-0)；2-丙烯酸-2-甲基乙酯(CAS 97-63-2)；甲基丙烯酸正己酯以及視需要的4-甲氧基苯酚及/或2-甲氧基-2-苯基苯乙酮(CAS 3524-62-7)。根據一個具體例，術語“Lowicryl”包括市售產品Lowicryl ® HM 20，Lowicryl ® HM 21和Lowicryl ® HM 23。
- “巨單體”：指具有至少一個末端基能作為單體的聚合物鏈。根據一個具體例，術語
- “基質”：指一種化學網絡，較佳地為有機化學網絡，更佳地為有機聚合物網絡。根據一個具體例，該網絡是共價交聯的。
- “成像材料”：指已包埋生物樣本的固體或半固體且適合用於藉由顯微術的分析。
- “甲基丙烯酸酯”：指具有至少一個CH2=C(CH3)-COO-基的乙烯基單體。
- “顯微術”：指涵蓋使用顯微術成像物體的技法的一般領域。
- “切片”：指為了其顯微術研究而準備物體的方法，該方法包括使用切片機或超薄切片機(即為了藉由顯微術分析樣本而薄切片的適合儀器)。根據一個具體例，術語“切片”涵蓋聚焦離子束研磨技術。
- “電子顯微術”：指使用加速電子束作為樣本的照明源並提供放大影像的顯微術。
- “光學顯微術”：指使用一束可控波長光子束作為樣本的照明源並提供放大影像的顯微術。
- “導電性”：指可以傳導電子的任何材料或化合物。根據一個具體例，術語“導電性”指可以排空累積在其表面的電子的材料或化合物。
- “冷凍置換”：指生物樣本脫水的過程，該過程在低至足以避免冰晶形成的溫度進行和避免同一樣本在環境溫度脫水後觀察到的有害效應。在本發明中，冷凍置換過程指一種過程，其中首先，樣本的冷凍水藉由有機溶劑溶解，溶劑視需要地包括化學固定劑；然後，樣本被包埋在樹脂；及最後為了其藉由顯微術成像，樣本被漸進地回溫。
- “高壓冷凍”：指生物樣本在高壓下的低溫固定方法，較佳地壓力範圍自2000巴至2700巴，更佳地在壓力約2048巴。
- “酮基”：指化學官能基-C(O)-。
- “聚合物”：指由重複的單元(單體)組成的巨分子化合物。根據一個具體例，術語“聚合物”指由重複的單元組成的有機巨單體化合物。
- “光起始劑”：指當曝露於輻射(UV或可見光)時，可以啟動聚合反應，較佳地為自由基聚合的任何化學化合物。在本發明中，光起始劑當曝露於輻射時，提供能與最初的乙烯基單體單元反應的自由基實體，俾使啟動聚合物鏈的生長。
- “自由基聚合”：指任何聚合反應技法，其中聚合鏈的生長以連續添加游離的自由基單體來實施。在本發明中，措辭“自由基聚合”指提供聚合物的過程，該過程包括熟習技藝人士所周知的以下三個步驟：(1)啟動，(2)延伸和(3)終止。
- “熱起始劑”：指當曝露於熱時，可以啟動聚合反應，較佳地為自由基聚合的任何化學化合物。在本發明中，熱起始劑當曝露於熱時，提供能與最初的乙烯基單體單元反應的自由基實體，俾使啟動聚合物鏈的生長。
- “超薄切片法”：指為了其顯微術學研究而製備物體的方法，該方法包括使用超薄切片機(即為了藉由顯微術分析樣本而薄切片的適合儀器，該儀器配備鑽石刀或玻璃刀)。
- “玻璃化”：指生物材料經由該過程轉形成為含有非晶態水的固體的過程，其所有細胞組分保持在接近生命狀態。在本發明中，措辭“玻璃化的生物樣本”指玻璃化後得到的生物樣本。
本發明涉及一種包埋介質，較佳地為用於生物樣本的包埋介 質，更佳地為用於滲入和浸漬生物樣本的包埋介質。根據一個具體例，本發明涉及一種用於成像生物樣本的包埋介質，較佳地藉由顯微術，更佳地藉由電子顯微術。根據一個具體例，該包埋介質是導電性。
根據一個具體例，包埋介質為包括或由有機化合物構成的組成物。
根據一個具體例，包埋介質包括或由聚合物前體調配物構成。根據一個具體例，該包埋介質包括或由單體混合物和視需要的起始劑構成。
根據一個具體例，該包埋介質包括或由單體混合物構成，其中至少一個單體具有式(I)：
其中：R 1 代表H、直鏈或支鏈的烷基，較佳地R 1 代表H或甲基；R 2 代表H、甲基丙烯醯基、丙烯醯基、直鏈或支鏈的烷基，較佳地R 2 代表H、甲基丙烯醯基或丙烯醯基；R a 、R b 、R c 和R d 為各自獨立地選自H、直鏈或支鏈的烷基，較佳地選自H或甲基；以及n為一個正整數。
根據一個具體例，該包埋介質包括或由單體混合物構成，該單體混合物包括： - 式(II-A)的單體：
- 式(II-B)的單體：
及/或- 式(II-C)的單體：
其中：R 1 代表H、直鏈或支鏈的烷基，較佳地R 1 代表H或甲基；R 2 代表H、甲基丙烯醯基、丙烯醯基、直鏈或支鏈的烷基，較佳地R 2 代表H、甲基丙烯醯基或丙烯醯基。
R a 代表H、直鏈或支鏈的烷基；較佳地為H或甲基；以及n1為範圍1到5的正整數，較佳為3；n1和n3各自獨立地代表大於5的正整數，較佳的範圍由10到100，更佳的範圍由10到40。
根據一具體例，單體混合物包括或由至少一單體構成，較低地為至少一自由基聚合單體，更佳地為至少一親水性自由基聚合單體。根據一具體例，單體混合物包括或由至少一親水性單體構成。根據一具體例，單體混合物包括或由二種自由基聚合單體的混合物構成。
根據一個具體例，自由基聚合單體選自丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、二丙烯酸酯及/或二甲基丙烯酸酯的群組，該群組視需要地經至少一個親水基，比如羥基、胺基或酮基，加以取代。
根據一個具體例，包埋介質包括：- 聚烷二醇(二)丙烯酸酯及/或聚烷二醇(二)甲基丙烯酸酯，該聚烷二醇二丙烯酸酯或聚烷二醇甲基丙烯酸酯視需要地經至少一個親水性基，比如羥基、胺基或酮基，加以取代；和- 起始劑。
根據一個具體例，包埋介質包括：- 烷二醇二甲基丙烯酸酯；- 聚烷二醇二丙烯酸酯或聚烷二醇甲基丙烯酸酯，該聚烷二醇二丙烯酸酯或聚烷二醇甲基丙烯酸酯視需要地經至少一個親水性基，比如羥基、胺基或酮基，加以取代；和 - 起始劑。
根據一個具體例，包埋介質不包括甲基丙烯酸二甲基胺基乙酯(DEMA)、甲基丙烯酸羥乙酯(HEMA)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚(乳酸-共-甘醇酸)(PLGA)、聚乳酸(PLA)或聚乙二醇(PEG)。
根據一個具體例，單體混合物包括或由一種二丙烯酸酯和一種二甲基丙烯酸酯構成，較佳為一種二醇二丙烯酸酯和一種二醇二甲基丙烯酸酯；該二醇二丙烯酸酯及/或二醇二甲基丙烯酸酯視需要地經至少一個親水性基，比如羥基、胺基或酮基，加以取代。
根據一個具體例，單體混合物包括或由一種烷二醇二甲基丙烯酸酯和一種聚烷二醇二丙烯酸酯構成，該烷二醇二甲基丙烯酸酯及/或聚烷二醇二丙烯酸酯視需要地經至少一個親水性基，比如羥基、胺基或酮基，加以取代。
根據一個具體例，單體混合物包括或由一種烷二醇二甲基丙烯酸酯和一種聚烷二醇甲基丙烯酸酯構成，該烷二醇二甲基丙烯酸酯及/或聚烷二醇甲基丙烯酸酯視需要地經至少一個親水基，比如羥基、胺基或酮基，加以取代。
根據一個具體例，烷二醇二甲基丙烯酸酯是選自於乙二醇二甲基丙烯酸酯、丙二醇二甲基丙烯酸酯和丁二醇二甲基丙烯酸酯；較佳地烷二醇二甲基丙烯酸酯是乙二醇二甲基丙烯酸酯。
根據一個具體例，聚烷二醇二丙烯酸酯是選自於聚乙二醇二丙烯酸酯、聚丙二醇二丙烯酸酯和聚丁二醇二丙烯酸酯；較佳為該聚烷二醇二丙烯酸酯是聚丙二醇二丙烯酸酯。
根據一個具體例，聚烷二醇甲基丙烯酸酯是選自於聚乙二醇甲基丙烯酸酯、聚丙二醇甲基丙烯酸酯和聚丁二醇甲基丙烯酸酯，上述聚烷二醇甲基丙烯酸酯視需要地經至少一個親水基，比如羥基、胺基或酮基，加以取代；較佳地該聚烷二醇甲基丙烯酸酯是羥基聚乙二醇甲基丙烯酸酯。
根據一個具體例，單體混合物包括或由三乙二醇二甲基丙烯酸酯(TGdMA)和聚丙二醇二丙烯酸酯(PPGdA)構成。根據一個具體例，包埋介質包括或由三乙二醇二甲基丙烯酸酯、聚丙二醇二丙烯酸酯與起始劑構成。
根據一個具體例，起始劑是自由基聚合起始劑。根據一個具體例，起始劑是光起始劑。根據一個具體例，起始劑是一種熱起始劑。
根據一個具體例、光起始劑是選自於2-第三丁基蒽醌、樟腦醌、二苯基(2,4,6-三甲基苯甲醯基)氧化膦、9,10-菲醌、苯基雙(2,4,6-三甲基苯甲醯基)氧化膦、2-苄基-2-(二甲胺基)-4’-(N-嗎啉基)苯基丁酮、3,6-雙(2-甲基-2-(N-嗎啉基)丙醯基)-9-辛基咔唑、4’-第三丁基-2’,6’-二甲基苯乙酮、2,2-二乙氧基苯乙酮、4-乙氧基苯乙酮、3-羥基苯乙酮、4-羥基苯乙酮、1-羥基環己基苯基酮、2-羥基-4’-(2-羥基乙氧基)-2-甲基苯丙酮、2-羥基-2-甲基苯丙酮、2-甲基-4’-(甲硫基)-2-(N-嗎啉基)苯丙酮、4’-苯氧基苯乙酮、安息香、安息香乙醚、安息香甲基醚、4,4’-二甲基安息香、4,4’-二甲基苄基氯、二苯甲酮、苯甲醯基聯苯、4,4’-雙(二乙基胺基)二苯甲酮、4,4’-二羥基二苯甲酮、3,4-二甲基二苯甲酮、3-羥基二苯甲酮、4-羥基二苯甲酮、2-甲基二苯甲酮、3-甲基二苯甲酮、4-甲基二苯甲酮、苯甲醯基甲酸甲酯、 米其勒酮、1-氯-4-丙氧基-9H-硫雜蒽-9-酮、2-氯硫雜蒽-9-酮、2,4-二乙基-9H-硫雜蒽-9-酮、異丙基-9H-硫雜蒽-9-酮、10-甲基吩噻嗪、硫雜蒽-9-酮、二芳基錪鎓六氟磷酸鹽、二芳基錪鎓六氟銻酸鹽、三芳基硫鎓六氟磷酸鹽、六氟磷酸鹽、和三芳基硫鎓六氟銻酸鹽。
根據一個具體例，熱起始劑是選自於偶氮化合物，比如2,2’-偶氮雙(異丁腈)(AIBN)，4,4’-偶氮雙(4-氰基戊酸)，1,1’-偶氮雙(環己烷甲腈)，2,2’-偶氮雙(2-甲基丙脒)二鹽酸鹽，2,2’-偶氮雙(2-甲基丙腈)；以及選自於有機過氧化物，比如過氧化苯甲醯(BPO)。
根據一個具體例，烷二醇二甲基丙烯酸酯或任何其衍生物，就重量佔包埋介質總重量，重量百分比的範圍從60%到99%，較佳地是從65%到99%，從70%到99%，從75%到99%，從80%到99%，從85%到99%，從90%到99%。根據一個具體例，就重量佔包埋介質總重量而言，烷二醇二甲基丙烯酸酯的重量百分比的範圍從60%到99%，較佳地是從60%到90%，從60%到85%，從60%到80%，從60%到75%，從60%到70%。根據一個具體例，就重量佔包埋介質總重量而言，烷二醇二甲基丙烯酸是約60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%。根據一個具體例，就重量佔包埋介質總重量而言，烷二醇二甲基丙烯酸酯或其任何衍生物的範圍從70%到90%，從75%到85%，更佳地是80%。
根據一個具體例，就重量佔包埋介質總重量而言，烷二醇二甲基丙烯酸酯或其任何衍生物的範圍從0.1%到100%；較佳地0.1%到 90%；從1%到90%；從10%到90%；從15%到90%；從20%到90%；從25%到90%；從30%到90%；從35%到90%；從40%到90%；從45%到90%；從50%到90%；從55%到90%；從60%到90%；從65%到90%；從70%到90%；從75%到90%；從80%到90%；或從85%到90%。根據一個具體例，就重量佔包埋介質總重量而言，烷二醇二甲基丙烯酸酯的範圍從0.1%到99%；較佳地從0.1%到95%；從0.1%到90%；從0.1%到85%；從0.1%到80%；從0.1%到75%；從0.1%到70%；從0.1%到65%；從0.1%到60%；從0.1%到55%；從0.1%到50%；從0.1%到45%；從0.1%到40%；從0.1%到35%；從0.1%到30%；從0.1%到25%；從0.1%到20%；從0.1%到15%；從0.1%到10%；或從0.1%到5%。
根據一個具體例，就重量佔包埋介質總重量而言，聚烷二醇二丙烯酸酯或其任何衍生物，重量百分比的範圍從大於0%到38%，較佳地從1%到38%，從5%到38%，從10%到38%，從15%到38%，從20%到38%，從25%到38%，從30%到38%。根據一個具體例，就重量佔包埋介質總重量而言，聚烷二醇二丙烯酸酯或其任何衍生物，重量百分比的範圍從大於0%到38%，較佳地從1%到35%，從1%到30%，1%到25%，從1%到20%，1%到15%，從1%到10%，1%到5%。
根據一個具體例，就重量佔包埋介質總重量而言，聚烷二醇二丙烯酸酯或其任何衍生物，重量百分比的範圍從大於0%到50%，較佳地從0.1%到50%，從5%到50%，從10%到50%，從15%到50%，從20%到50%，從25%到50%，從30%到50%，從35%到50%，從40%到50%，或從45%到50%。根據一個具體例，就重量佔包埋介質總重量而言，聚烷 二醇丙烯酸酯的範圍從大於0%到50%，較佳地從0.1%到45%，從0.1%到40%，0.1%到35%，從0.1%到30%，0.1%到25%，從0.1%到20%，0.1%到15%，從0.1%到10%，0.1%到5%。根據一個具體例，就重量佔包埋介質總重量而言，聚烷二醇二丙烯酸酯的範圍從大於0%到50%，較佳地從1%到40%，從5%到30%，更佳地是從10%到25%，更佳地是20%。
根據一個具體例，就重量佔包埋介質總重量而言，聚烷二醇甲基丙烯酸酯或其任何衍生物，就重量佔包埋介質總重量而言，重量百分比的範圍從大於0%到38%，較佳地1%到38%，從5%到38%，從10%到38%，從15%到38%，從20%到38%，從25%到38%，從30%到38%。根據一個具體例，就重量佔包埋介質總重量而言，聚烷二醇甲基丙烯酸酯或其任何衍生物，重量百分比的範圍從大於0%到38%，較佳地從1%到35%，從1%到30%，從1%到25%，從1%到20%，從1%到15%，從1%到10%，從1%到5%。
根據一個具體例，烷二醇二丙烯酸酯或其任何衍生物，具有莫耳重量的範圍從100到500kDa；較佳地從100到400kDa，從100到300kDa，從100到200kDa。根據一個具體例，烷二醇二丙烯酸酯或其任何衍生物的莫耳質量是150kDa上下，較佳地是150kDa。根據一個具體例，三乙二醇二甲基丙烯酸酯(TGdMA)的莫耳質量是約150kDa上下，較佳地是150kDa。
根據一個具體例，聚烷二醇二丙烯酸酯或其任何衍生物，具有莫耳重量的範圍從500到1500kDa，較佳地從500到1000kDa，從700到900kDa，從750到850kDa。根據一個具體例，聚烷二醇二丙烯酸酯 或其任何衍生物，具有莫耳重量是約800kDa。根據一個具體例，聚烷二醇二丙烯酸酯或其任何衍生物的莫耳重量是800kDa。根據一個具體例，聚烷二醇二丙烯酸酯的莫耳重量是約800kDa，較佳地是800kDa。
根據一個具體例，包埋介質包括或由以下物質構成：- 重量百分比79%的烷二醇二甲基丙烯酸酯，較佳地是三乙二醇二甲基丙烯酸酯；- 重量百分比20%的聚烷二醇二丙烯酸酯，較佳是聚丙二醇二丙烯酸酯；- 重量百分比1%的自由基聚合起始劑，較佳是自由基聚合光起始劑，更佳地是安息香甲基醚。
根據一個實施例，包埋介質包括：- 重量百分比從60%到99%的三乙二醇二甲基丙烯酸酯；- 重量百分比從大於0%到38%的聚丙二醇二丙烯酸酯；以及- 重量百分比從0.1%到2%的一種自由基聚合起始劑；較佳地是安息香甲基醚。
根據一個具體例，包埋介質包括：- 重量百分比從98%到99.9%的三乙二醇二甲基丙烯酸酯；和- 重量百分比0.1%到2%的自由基聚合起始劑；較佳地是安息香甲基醚。
根據一個具體例，包埋介質包括：- 重量百分比從60%到99%的三乙二醇二甲基丙烯酸酯；- 重量百分比從大於0%到38%的羥基聚乙二醇甲基丙烯酸酯；以及 - 重量百分比從0.1%到2%的自由基聚合起始劑；較佳地是安息香甲基醚。
根據一個具體例，包埋介質進一步地包括溶劑，較佳地是揮發性的溶劑，更佳地是醇類比如乙醇。根據一個具體例，包埋介質進一步地包括丙酮。
根據一個具體例，包埋介質進一步地包括至少一種添加劑，選自造影劑及/或有用於冷凍置換的化合物，比如固定劑及/或溶劑，較佳地包括至少一種重金屬鹽，更佳地包括硝酸銀、鋨及/或醋酸鈾。根據一個具體例，包埋介質進一步地包括至少一種添加劑，就重量佔包埋介質總重量而言，範圍從大於0%到5%。根據一個具體例，就重量佔包埋介質總重量而言，包埋介質包括0.5%的添加劑。根據一個具體例，就重量佔包埋介質總重量而言，包埋介質包括0.01%的添加劑。根據一個具體例，有用於冷凍置換的化合物選自丙酮、無水丙酮、醋酸鈾、單寧酸、醛類比如戊二醛或多聚甲醛；以及任何其組合。根據一個具體例，固定劑選自鋨、四氧化鋨、醋酸鈾、戊二醛、多聚甲醛、或任何其組合。根據一個具體例，造影劑選自醋酸鈾、鉛衍生物、銀衍生物、鋨衍生物、鑭化鹽、多酚類較佳地是單寧所含的多酚，沒食子酸和單寧酸。
根據一個具體例，包埋介質進一步地包括親水性化合物。
根據一個具體例，包埋介質進一步地包括至少一種生物樣本，較佳地是玻璃化的生物樣本及/或化學固定的生物樣本及/或脫水的生物樣本。根據一個具體例，生物樣本是細胞萃取物。根據一個具體例，生物樣本是細胞。根據一個具體例，生物樣本是組織。根據一個具體例，生 物樣本是器官。根據一個實施例，生物樣本是HeLa細胞。根據一個具體例，生物樣本是黑色素細胞。
根據一個具體例，包埋介質是液體。根據一個具體例，包埋介質是半固體。根據一個具體例，包埋介質在低溫可聚合，較佳地在低於0℃的溫度，較佳地在從-90℃到-10℃的溫度範圍，更佳地在從-40℃到-20℃的溫度範圍。根據一個具體例，包埋介質在-70℃到-20℃的溫度範圍可聚合，較佳地是在-35℃，在-40℃或在-45℃。根據一個具體例，包埋介質在從-90℃到-10℃的溫度範圍可聚合，較佳地從-80℃到-10℃，從-70℃到-10℃，從-60℃到-10℃，從-50℃到-10℃，從-40℃到-10℃，從-30℃到-10℃，或從-20℃到-10℃。根據一個具體例，包埋介質在從-90℃到-10℃的溫度範圍可聚合，較佳地從-90℃到-20℃，從-90℃到-30℃，從-90℃到-40℃，從-90℃到-50℃，從-90℃到-60℃，從-90℃到-70℃，或從-90℃到-80℃。
根據一個具體例，包埋介質不是或不包括Lowicryl®樹脂。根據一個具體例，包埋介質不包括多酚或其衍生物。根據一個具體例，包埋介質不包括甲氧基苯酚。根據一個具體例，包埋介質不包括甲基丙烯酸烷酯。根據一個具體例，包埋介質不包括甲基丙烯酸己酯。根據一個具體例，包埋介質不包括雙酚A或其衍生物。根據一個具體例，包埋介質不包括乙氧基化雙酚A二甲基丙烯酸酯。
本發明亦涉及顯微術的支撐材料。根據一個具體例，該支撐材料是用於顯微術的材料，較佳地是作為被成像樣品的包埋材料(稱為“成 像材料”)。根據一個具體例，本發明的成像材料產生自如上定義的包埋介質的聚合。
根據一個具體例，本發明的成像材料是導電性。根據一個具體例，成像材料在顯微術分析時不在其表面累積任何電子。根據一個具體例，成像材料是抗靜電的。
根據一個具體例，本發明的成像材料是透明的。根據一個具體例，本發明的成像材料是半固體或固體。根據一個具體例，本發明的成像材料包括或由交聯的聚合物基質和視需要的至少一個生物樣本構成。根據一個具體例，本發明的成像材料保留了所包埋的生物樣本的物理特性，比如其螢光反應及/或其蛋白質的超微結構的保留。根據一個具體例，本發明的成像材料保留了所包埋的生物樣本的蛋白質的超微結構，俾使免疫偵測中對抗體的偵測藉由顯微術是可成像的。
根據一個具體例，成像材料包括至少一個被聚合物基質包埋的生物樣本，而聚合物基質產生自如上所定義的包埋介質的聚合。
根據一個具體例，成像材料不包括環氧樹脂。根據一個具體例，成像材料不包括環氧基。根據一個具體例，成像材料不包括聚伸芳基醚。
本發明亦涉及製造如上定義的包埋介質的過程。
根據一個具體例，該過程包括或由混合如下物質構成：- 至少一種如上定義的單體，較佳地至少一種自由基聚合型單體，更佳地至少一種親水性的自由基聚合型單體；以及 - 如上定義的起始劑。
根據一個具體例，該過程包括或由混合如下物質構成：- 兩種如上定義的單體，較佳地兩種自由基聚合型單體，更佳地兩種親水性自由基聚合型單體，以得到單體混合物；以及- 視需要的如上定義的起始劑。
根據一個具體例，該過程包括或由混合如下物質構成：- 烷基二醇二甲基丙烯酸酯；- 聚烷二醇二丙烯酸酯或聚烷二醇甲基丙烯酸酯；該聚烷二醇二丙烯酸酯或聚烷二醇甲基丙烯酸酯視需要地經至少一個親水性基，比如羥基、胺基或酮基，加以取代；以及- 如上定義的起始劑。
根據一個具體例，該過程進一步包括加入生物樣本，比如細胞萃取物、細胞、組織及/或器官；較佳地加入玻璃化的生物樣本及/或脫水的生物樣本。根據一個具體例，該過程進一步包括加入添加劑比如重金屬鹽。根據一個具體例，該過程進一步包括加入硝酸銀及/或醋酸鈾。
根據一個具體例，準備包埋介質的過程在0℃到40℃的溫度範圍進行；較佳地從5℃到30℃，從10℃到30℃，從15℃到30℃，從20℃到30℃，從25℃到30℃；更佳地，準備包埋介質的過程在約25℃的溫度進行。
本發明亦涉及製造如上定義的成像材料的過程。
根據一個具體例，該過程包括： (a)提供如上定義的包埋介質；以及(c)聚合包埋介質。
根據一個具體例，該過程進一步包括於生物樣本滲入包埋介質。根據一個具體例，該過程包括：(a)提供如上定義的包埋介質；(b)於生物樣本滲入包埋介質，以提供經包埋的生物樣本；以及(c)聚合步驟(b)之經包埋的生物樣本。
根據一個具體例，該過程進一步包括玻璃化生物樣本。根據一個具體例，該過程包括：(a-0)玻璃化生物樣本以得到經玻璃化生物樣本；(a)提供如上定義的包埋介質；(b)於步驟(a-0)之經玻璃化生物樣本滲入包埋介質，以提供經包埋生物樣本；以及(c)聚合步驟(b)的經包埋生物樣本。
根據一個具體例，該過程進一步包括固定及脫水步驟(a-0)之經玻璃化生物樣本。根據一個具體例，該過程包括：(a-0)玻璃化生物樣本以得到經玻璃化生物樣本；(a-1)固定及脫水步驟(a-0)之經玻璃化生物樣本；(a)提供如上定義的包埋介質；(b)於步驟(a-1)之生物樣本滲入包埋介質，以提供經包埋生物樣本；以及(c)聚合步驟(b)的經包埋生物樣本。
根據另一個具體例，該過程進一步包括固定及脫水生物樣本。根據一個具體例，該過程包括：(a-1)固定及脫水生物樣本；(a)提供如上定義的包埋介質；(b)於步驟(a-1)之生物樣本滲入以包埋介質，以提供經包埋生物樣本；以及(c)聚合步驟(b)的經包埋生物樣本。
根據一個具體例，步驟(a-0)以熟習技藝人士所周知的低溫方法進行，較佳地是高壓冷凍過程。
根據一個具體例，步驟(a-1)以熟習技藝人士所周知的任何方法進行，較佳地是冷凍置換過程。
根據一個具體例，步驟(a-1)藉由使用至少一種固定劑進行，較佳地選自鋨、四氧化鋨、醋酸鈾、多聚甲醛和醛類比如戊二醛、或任何其組合。根據一個具體例，步驟(a-1)藉由使用至少一種造影劑進行，較佳地選自重金屬鹽。根據一個具體例，步驟(a-1)藉由使用至少一種造影劑進行，較佳地選自鑭化鹽。根據一個具體例，造影劑選自醋酸鈾、鉛衍生物、銀衍生物、鋨衍生物、鑭化鹽、多酚類較佳地是單寧所含的多酚、沒食子酸和單寧酸。根據一個具體例，步驟(a-1)在從-90℃到-30℃的溫度範圍進行。根據一個具體例，步驟(a-1)在-70℃到-20℃的溫度範圍進行，較佳地是在-35℃，在-40℃或在-45℃。根據一個具體例，步驟(a-1)在從-90℃到-30℃的溫度範圍進行，較佳地從-80℃到-40℃，或從-60℃到-50℃。
根據一個具體例，步驟(a)根據用於製備如上定義的包埋介質的過程進行。
根據一個具體例，聚合在從-90℃到-10℃的溫度範圍進行，較佳地在從-40℃到-20℃的溫度範圍。根據一個具體例，聚合在從-70℃到-20℃的溫度範圍進行，較佳地是在-35℃，在-40℃或在-45℃。根據一個具體例，聚合在從-90℃到-10℃的溫度範圍進行，較佳地從-80℃到-10℃，從-70℃到-10℃，從-60℃到-10℃，從-50℃到-10℃，從-40℃到-10℃，從-30℃到-10℃，或從-20℃到-10℃。根據一個具體例，聚合在從-90℃到-10℃的溫度範圍進行，較佳地從-90℃到-20℃，從-90℃到-30℃，從-90℃到-40℃，從-90℃到-50℃，從-90℃到-60℃，從-90℃到-70℃，或從-90℃到-80℃。
根據一個具體例，聚合藉由熱及/或輻射啟動，較佳地是藉由紫外線或可見光的輻射。
根據一個具體例，就重量佔成像材料總重量而言，造影劑的範圍從0.005到0.1%，較佳地從0.005到0.05%，從0.005到0.015%。根據一個具體例，就重量佔成像材料總重量而言，造影劑為約0.01%。根據一個具體例，就重量佔成像材料總重量而言，造影劑為0.01%。
本發明亦涉及藉由顯微術用於成像生物樣本的方法，較佳地是藉由光學顯微術及/或電子顯微術。
根據一個具體例，本發明的方法包括或由如下步驟構成：- 提供如上定義的成像材料，較佳地藉由用於製造如上定義的成像材料的過程；以及 - 成像該成像材料，較佳地藉由顯微術，更佳地藉由光學顯微術及/或電子顯微術。
根據一個具體例，本發明的該方法包括或由如下步驟構成：(i-0)玻璃化生物樣本，較佳地藉由以高壓冷凍過程實施、投浸式快速冷凍、噴射冷凍及/或快速冷凍；(ii)於步驟(i-0)之經玻璃化的生物樣本滲入如上定義的包埋介質，較佳地藉由使用冷凍置換的方案；(iii)聚合步驟(ii)得到之混合物，結果得到導電性成像材料；(iv)藉由光學顯微術及/或電子顯微術成像步驟(iii)之導電性成像材料。
根據一個具體例，本發明的方法包括或由如下步驟構成：(ii)於生物樣本滲入如上定義的包埋介質，較佳地藉由使用冷凍置換的方案；(iii)聚合步驟(ii)得到之混合物，結果得到導電性成像材料；(iv)藉由光學顯微術及/或電子顯微術成像步驟(iii)之導電性成像材料。
根據一個具體例，本發明的方法進一步包括於導電性成像材料之切片法或超薄切片法的步驟。
根據一個具體例，該方法進一步包括固定及/或脫水生物樣本(步驟1-1)的步驟，較佳地是在步驟(i-0)之後。根據一個具體例，該方法進一步包括固定及/或脫水經玻璃化生物樣本(步驟i-0)的步驟，較佳地是在步驟(i-0)之後。根據一個具體例，步驟(i-1)包括使用溶劑，較佳地是丙酮 及/或乙醇；該溶劑含有固定劑及/或造影劑。根據一個具體例，步驟(i-1)在從-90℃到-30℃的溫度範圍進行。
根據一個具體例，步驟(iv)藉由顯微術實施；較佳地光學顯微術、光顯微術，螢光顯微術及/或電子顯微術；更佳地藉由電子顯微術。根據一個具體例，步驟(iv)藉由聯用顯微術實施。根據一個具體例，步驟(iv)藉由掃描式電子顯微術(SEM)實施。根據一個具體例，步驟(iv)以穿透式電子顯微術(TEM)實施。根據一個具體例，步驟(iv)以光電聯用顯微術法(CLEM)實施。根據一個具體例，步驟(iv)以入射照明螢光顯微術、共焦顯微術、超解析度顯微術或結構化照明顯微術(SIM)實施。
本發明亦關於如上定義的包埋介質或成像材料在顯微術的使用，較佳地是在光顯微術、螢光顯微術及/或電子顯微術；更佳地是在電子顯微術。
根據一個具體例，如上定義的包埋介質或成像材料，有用於聯用顯微術。
根據一個具體例，如上定義的包埋介質及/或成像材料有用於成像生物樣本，比如細胞萃取物、細胞、組織及/或器官；較佳地是經玻璃化的生物樣本。
根據一個具體例，如上定義的包埋介質及/或成像材料有用於特異性靶定細胞結構及/或黑色素。根據一個具體例，如上定義的包埋介質及/或成像材料以及包括銀鹽比如硝酸銀，有用於特異性靶定細胞結構，較佳地是使用金耦合抗體標記特異性靶定細胞結構，及/或黑色素。根據一 個具體例，如上定義的包埋介質及/或成像材料以及包括銀鹽比如硝酸銀，有用於在低溫特異性靶定細胞結構，較佳地是在低於0℃的溫度，更佳地是在從-90℃到-10℃的溫度範圍。
根據一個具體例，如上定義的包埋介質及/或成像材料有用於特異性靶定抗體，較佳地是與奈米級的金奈米粒子耦合的抗體。根據一個具體例，如上定義的包埋介質及/或成像材料有用於特異性靶定與奈米級的金奈米粒子耦合的抗體，藉由凝集經涵括於該包埋介質及/或成像材料的硝酸銀。根據一個具體例，如上定義的包埋介質及/或成像材料有用於在低溫產生銀增強反應，較佳地是在低於0℃的溫度。
本發明亦涉及一種試劑盒，該試劑盒是用於製備欲成像的生物樣本，較佳地藉由顯微術。
根據一個具體例，該試劑盒包括第一容器，該容器包括至少一種如上定義的單體；以及第二容器，該容器包括起始劑。根據一個具體例，該試劑盒包括第一容器，該容器包括如上定義的親水性單體；以及第二容器，該容器包括起始劑。
根據一個具體例，該試劑盒包括：- 第一容器，包括(a)烷二醇二甲基丙烯酸酯和(b)聚烷二醇二丙烯酸酯或聚烷二醇甲基丙烯酸酯，該聚烷二醇二丙烯酸酯或聚烷二醇甲基丙烯酸酯視需要地經至少一個親水性基，比如羥基、胺基或酮基，加以取代；- 第二容器，包括自由基聚合起始劑。
根據一個具體例，該試劑盒包括： - 第一容器，包括(a)三乙二醇二甲基丙烯酸酯和(b)聚丙二醇二丙烯酸酯；以及- 第二容器，包括安息香甲基醚或羥基-2-甲基丙苯酮。
根據一個具體例，本發明亦係指一種試劑盒，該試劑盒包括容器，該容器包括如上定義的至少一種單體和起始劑；以及混合手段。
根據一個具體例，該試劑盒包括：- 容器，包括(a)烷二醇二甲基丙烯酸酯，(b)聚烷二醇二丙烯酸酯或聚烷二醇甲基丙烯酸酯，該聚烷二醇二丙烯酸酯或聚烷二醇甲基丙烯酸酯視需要地經至少一個親水性基，比如羥基、胺基或酮基，加以取代；和(c)自由基聚合起始劑；以及- 混合手段。
根據一個具體例，該混合手段例如但不限於：容器、膠囊、混合器及/或刮刀。
第1圖為藉由穿透式電子顯微術(TEM)得到的HeLa細胞的影像陳套，細胞包埋在本發明的包埋介質中(第1A圖)，或包埋在Lowicryl®樹脂中(第1B圖)。
第2圖為以聚焦離子束掃描式電子顯微術(FIB-SEM)得到的HeLa細胞的影像陳套，細胞包埋在本發明的包埋介質中。
第3圖為兩個掃描式電子顯微術(SEM 3View)影像陳套的比較，包括秀麗線蟲的本發明的成像材料在冷凍置換時用0.01%醋酸鈾造 影。A包埋在本發明的介質中，B包埋在Lowicryl®樹脂中。第一個影像陳套顯示出鮮明的和均勻的反差。第二個顯示出顯著的電荷累積，即如所見的白色斑點，以及用來聚焦該影像陳套的方形區域。電子累積在樣品塊的表面，阻止鮮明的成像。
第4圖為包埋在本發明的包埋介質中的秀麗線蟲的顯微術影像陳套。影像陳套4A藉由掃描式電子顯微術(SEM)得到；影像陳套4B藉由綠色螢光蛋白(GFP)得到；影像陳套4C藉由紅色螢光蛋白(RFP)得到；影像陳套4D藉由透射光得到；以及影像陳套4E為多通道的影像。
第5圖為第4圖之螢光顯微術法影像陳套的放大。影像陳套5A藉由掃描式電子顯微術(SEM)得到；影像陳套5B藉由綠色螢光蛋白(GFP)得到；影像陳套5C藉由紅色螢光蛋白(RFP)得到；影像陳套5D為多通道的影像。
參考以下的實施方式將有助於更好地理解本發明。這些實施方式意圖代表本發明的特定實施例，而並非意圖限制本發明的範圍。
℃：攝氏度
CDCl3：氘化的三氯甲烷
CLEM：光電聯用顯微術
eq：當量
PEG：聚乙二醇
PPGdA：聚丙二醇二丙烯酸酯
g：克
h：小時
mmol：毫莫耳
mol：莫耳
NMR：核磁共振
TGdMA：三乙二醇二甲基丙烯酸酯
UV：紫外線
試劑、溶劑與起始材料購自Sigma Aldrich，未經進一步純化即使用。
紫外線輻射
樣本的紫外線輻射藉由使用Fusion UV的F300S Heraeus Noblelightl®紫外線燈系統進行，或是用於冷凍替換方案(自動化的冷凍替換自動機)的Leica的AFS-1或AFS-2。
實施例1：聚丙二醇二丙烯酸酯(PPGdA)的合成
PPGdA藉由丙烯醯化合成：800g/mol(20g，25mmol)的聚丙二醇和三乙胺(11.7g，115mmol)，被導入具有140mL的二氯甲烷的圓底燒瓶。
該混合物被冷卻至5℃後，在磁力攪拌下一滴一滴地加入丙烯醯氯(9.5g，105mmol)。
取決於所用的聚丙二醇的分子量，三乙胺與丙烯醯氯的比例必需調整(分別為每個羥基官能性2.3eq.和2.1eq.)。
反應在2小時後完成。藉由過濾去除三乙胺鹽，然後產物以鹼性、酸性與中性的水洗若干次。有機相以無水硫酸鈉乾燥，然後過濾。在減壓下去除溶劑後，得到最終產物(20.7g，產率：91%)。
1H NMR(CDCl3，300MHz)：6.43-6.35(2H，d，H-CH=CH-)；6.15-3.06(2H，d，H-CH=CH-)，5.81-5.78(2H，d，H-CH=CH-)，5.18-5.02(2H，m，-C(O)-O-CH-CH2-)，3.83-3.18(42H，m，-CH(CH3)-CH2-)，3.83-3.18(42H，m，-CH(CH3)-CH2-O-)，1.39-0.99(42H，m，-CH(CH3)-CH2-O-)。
實施方式2：本發明的包埋介質的製備
2.1.一鍋法
配方1
在一個燒瓶中導入並在室溫攪拌三乙二醇二甲基丙烯酸酯(TGdMA)、聚丙二醇二丙烯酸酯(PPGdA)和起始劑，較佳地是安息香甲基醚及/或羥基-2-甲基苯丙酮，以79/20/1的質量比。最後的包埋介質1避光及/或避熱儲存。
配方2
在一個燒瓶中導入並在室溫攪拌三乙二醇二甲基丙烯酸酯(TGdMA)和起始劑，較佳地安息香甲基醚及/或羥基-2-甲基苯丙酮，以99/1的質量比。最後的包埋介質2於避光及/或避熱儲存。
配方3
在一個燒瓶中導入並在室溫攪拌三乙二醇二甲基丙烯酸酯(TGdMA)、羥基-聚乙二醇(PEG)-甲基丙烯酸酯和起始劑，較佳地是安息香甲基醚及/或羥基-2-甲基苯丙酮，以74/25/1的質量比。最後的包埋介質3避光及/或避熱儲存。
配方4
在一個燒瓶中導入並在室溫攪拌三乙二醇二甲基丙烯酸酯(TGdMA)、聚丙二醇二丙烯酸酯(PPGdA)、硝酸銀溶液(1.4mM)和起始劑，較佳地是安息香甲基醚及/或羥基-2-甲基苯丙酮，以72.4/18.1/9/0.5的質量比。最後的包埋介質4避光及/或避熱儲存。
2.1.包括本發明的包埋介質的試劑盒
在第一容器中導入並在室溫攪拌三乙二醇二甲基丙烯酸酯(TGdMA)和聚丙二醇二丙烯酸酯(PPGdA)，以79/20的質量比。
在第二容器儲存起始劑，最好是安息香甲基醚及/或羥基-2-甲基苯丙酮。
基質前體溶液藉由混合第一容器和第二容器的內容物後得到，較佳地混合過程避光及/或避熱進行。
實施例3：用於顯微術分析的生物樣本的製備過程
目的為包埋生物樣本，以提供用於電子顯微術的螢光的及/或導電性生物成像材料。於此目標，申請人制訂使用實施例2的包埋介質1的過程。
一般過程
步驟1-生物樣本的玻璃化及/或固定/脫水
首先，藉由熟習技藝人士所周知的任何低溫方法使生物樣本玻璃化，然後在-90℃導入溶劑中，該溶劑可能是乙醇、甲醇或丙酮(溶劑中的生物樣本被稱為“冷凍置換摻混物”)。視需要地，可能加入化學固定劑及/或造影劑。化學固定劑的例子可為鋨、四氧化鋨、醋酸鈾、戊二醛和多聚甲醛。造影劑的例子可為醋酸鈾醯、鉛衍生物、銀衍生物、鋨衍生物或單寧酸。
生物樣本在-90℃保存，保存的時間範圍從1分鐘到若干天。然後，緩慢升溫至-40℃，再用純的溶劑連續清洗以去除冷凍置換摻混物。得到了脫水的生物樣本。
步驟2-包埋介質1的滲入
其次，對步驟1得到的脫水生物樣本用包埋介質/溶劑的混合物連續滲入，直到僅用包埋介質溶液對其滲入。得到包括被本發明之基質前體所包埋的脫水生物樣本的組合物。
步驟3-聚合作用-導電的生物學成像材料的製備
步驟2得到的組合物接著被藉由光聚合或熱聚合作用予以聚合。
如果是光聚合，該組合物在-40℃藉由紫外光輻射從24h到48h的期間範圍被起始。接著，一直在紫外光輻射，緩慢升溫至室溫。應用額外的24h室溫的紫外光輻射，以達成生物樣本內部的完全聚合。
得到導電性且保留螢光的成像材料。
步驟4b(視需要的)-切片法或超薄切片法
在其藉由電子顯微術的觀察前，導電性材料視需要地藉由切片法及/或超薄切片法準備。
視需要的進一步步驟-光學顯微術
在此過程中，導電性成像材料的光學顯微術分析可在其藉由電子顯微術的觀察之前，在步驟1-4之任一步驟進行。
實施例4：顯微術分析
為了展示本發明的成像材料在用於電子顯微術時的優越性，生物樣本根據實施例3所描述之方案製備，其中的冷凍置換摻混物包括0.05%的醋酸鈾、0.01%的戊二醛、1%的水，且在從-90℃到-45℃的溫度範圍進行。
反差
目的為比較從本發明的包埋介質，與從Lowicryl® HM 20樹脂相比，在HeLa細胞上得到的反差的增強，兩者使用相同的冷凍置換方案(即，所用的冷凍置換摻混物包括0.05%的醋酸鈾、0.01%的戊二醛、1%的水，且在從-60℃到-45℃的溫度範圍進行)。
對HeLa細胞的觀察是藉由穿透式電子顯微術(TEM)進行。
第1圖顯示，相較於由Lowicryl® HM 20樹脂獲得者(第1B圖)，以本發明的材料(見第1A圖)達成較佳的反差。
包埋在本發明材料中的HeLa細胞的分析也藉由掃描式電子顯微術(SEM)觀察。第2圖顯示，本發明的材料使被包埋於該材料內部的細胞結構可精細地可視化。
黑色素靶定
在此實驗中，研究MNT1細胞(不朽化的黑色素細胞株)。
包括黑色素體與銀鹽聚集體的本發明的成像材料的觀察藉由電子顯微術進行。
驚奇的是，對應的影像陳套(第3A圖)顯示，銀鹽特異性地累積在生物結構。
不願受任何理論束縛，申請人主張，在顯微術法研究時，結合在本發明成像材料中的銀鹽和聚集在黑色素體類澱粉蛋白纖維的黑色素之間，發生特異性的反應。
為了佐證此種特異性的反應，藉由不表達黑色素的HeLa細胞置換黑色素體進行相同的實驗。
對應的影像陳套(第3B圖)顯示，銀鹽散佈在材料中，但沒有特異性定位在生物樣本。
因此，本發明的成像材料，特別是包埋介質，當包括銀鹽時，允許特異性地靶定含有黑色素的生物樣本。
螢光保留
成像材料中的MNT1細胞的保留螢光的分析也藉由結構化照明顯微術(SIM)(光學顯微術)進行。
第4圖和第5圖顯示來自本發明成像材料的HeLa細胞的自發螢光之有效偵測。
Claims (16)
- 一種用於生物樣本的導電性包埋介質，包括：-佔重量百分比60%到99%的選自烷二醇二甲基丙烯酸酯及/或寡(烷二醇)二甲基丙烯酸酯的二醇二甲基丙烯酸酯；-聚烷二醇二丙烯酸酯或聚烷二醇甲基丙烯酸酯；該聚烷二醇二丙烯酸酯或聚烷二醇甲基丙烯酸酯視需要地經至少一個親水性基加以取代；以及-自由基聚合起始劑。
- 如申請專利範圍第1項所述之導電性包埋介質，復包括至少一種添加劑。
- 如申請專利範圍第1或2項所述之導電性包埋介質，其中，該二醇二甲基丙烯酸酯是選自乙二醇二甲基丙烯酸酯、二乙二醇二甲基丙烯酸酯、三乙二醇二甲基丙烯酸酯、丙二醇二甲基丙烯酸酯和丁二醇二甲基丙烯酸酯。
- 如申請專利範圍第1或2項所述之導電性包埋介質，其中，該聚烷二醇二丙烯酸酯是選自聚乙二醇二丙烯酸酯、聚丙二醇二丙烯酸酯和聚丁二醇二丙烯酸酯。
- 如申請專利範圍第1或2中所述之導電性包埋介質，其中，該聚烷二醇甲基丙烯酸酯是選自聚乙二醇甲基丙烯酸酯、聚丙二醇甲基丙烯酸酯和聚丁二醇甲基丙烯酸酯；該聚烷二醇甲基丙烯酸酯視需要地經至少一個親水性基加以取代。
- 如申請專利範圍第1或2項所述之導電性包埋介質，其包括： -重量百分比60%到99%的三乙二醇二甲基丙烯酸酯；-重量百分比大於0%到38%的聚丙二醇二丙烯酸酯；以及-重量百分比0.1%到2%的自由基聚合起始劑。
- 如申請專利範圍第1或2項所述之導電性包埋介質，其包括：-重量百分比60%到99%的三乙二醇二甲基丙烯酸酯；-重量百分比大於0%到38%的羥基聚乙二醇甲基丙烯酸酯；以及-重量百分比0.1%到2%的自由基聚合起始劑。
- 如申請專利範圍第1或2項所述之導電性包埋介質，其包括：-重量百分比79%的三乙二醇二甲基丙烯酸酯；-重量百分比20%的聚丙二醇二丙烯酸酯；-重量百分比1%的安息香甲基醚。
- 如申請專利範圍第2項所述之導電性包埋介質，其中，該至少一種重金屬鹽包括鋨及/或醋酸鈾。
- 如申請專利範圍第1或2項所述之導電性包埋介質，進一步地包括至少一種生物樣本。
- 一種導電性成像材料，包括至少一種被聚合物基質包埋的生物樣本，該聚合物基質是產生自如申請專利範圍第1至10項中任一項所述之包埋介質的聚合。
- 如申請專利範圍第11項所述之導電性成像材料，保留被包埋的生物樣本的自發螢光、蛋白質活性及/或抗原特異性。
- 一種藉由顯微術成像生物樣本的方法，該方法包括以下步驟： (i-1)進行固定及/或脫水生物樣本；(ii)於步驟(i-1)的生物樣本滲入如申請專利範圍第1至10項中任一項所述的導電性包埋介質；(iii)聚合步驟(ii)得到的混合物，結果得到導電性成像材料；(iv)藉由光學顯微術及/或電子顯微術成像步驟(iii)的導電性成像材料。
- 如申請專利範圍第13項所述之方法，進一步地包括於導電性成像材料切片或超薄切片的步驟。
- 一種申請專利範圍第1至10項中任一項所述之導電性包埋介質或申請專利範圍第11或12項所述之導電性成像材料的用途，係藉由顯微術用於成像生物樣本。
- 一種用於製備於顯微術成像的生物樣本的試劑盒，包括：-第一容器，包括(a)選自烷二醇二甲基丙烯酸酯及/或寡(烷二醇)二甲基丙烯酸酯的二醇二甲基丙烯酸酯；和(b)聚烷二醇二丙烯酸酯或聚烷二醇甲基丙烯酸酯，該聚烷二醇二丙烯酸酯或聚烷二醇甲基丙烯酸酯視需要地經至少一種親水性基加以取代；-第二容器，包括自由基聚合起始劑；或包括：一容器，包括(a)選自烷二醇二甲基丙烯酸酯及/或寡聚(烷二醇)二甲基丙烯酸酯的二醇二甲基丙烯酸酯；和(b)聚烷二醇二丙烯酸酯或聚烷二醇甲基丙烯酸酯，該聚烷二醇二丙烯酸酯或聚烷二醇甲基丙烯酸酯視需要地經至少一種親水性基加以取代；和(c)自由基聚合起始劑； 以及混合手段工具。
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