JP7346424B2 - 屈折率整合製剤 - Google Patents
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本出願は、2017年9月11日に出願された米国仮特許出願第62/557,028号からの優先権を主張し、これはあらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
RLL/Vm=(n2-1)/(n2+2)(式1)
マウンタント試料の屈折率を測定する
乾燥試料に関する屈折率測定は、300μLの試料を屈折計プリズム上に慎重に広げた後、マウンタントを最大24時間乾燥させることによって測定した。マウンタント溶液を乾燥させて透明フィルムにした後、屈折率を測定した。
マウント手順
生物学的標本(例えば、30μm未満の厚さを有する培養された単層細胞および組織切片)は、十分な量のマウンタント、典型的には1~3滴(30~100μL)を、完全に覆われるかまたは浸されるまで基材上に配置された標本に適用することによって基材上にマウントされる。生物学的標本は、非染色であり得るか、または当業者に周知の手順を使用して、マウントする前に染色することができる。次いで、標本を18mm×18mmのカバースリップで覆い、余分なマウンタントをカバースリップの端から拭き取るか、ピペットで取り除く。マウントされた標本は、室温で24~96時間乾燥させることができるが、40℃もの高い温度が許容される。マウントされた標本が完全に乾燥した後、標本を、当業者に周知の蛍光顕微鏡法を使用して撮像することができる。あるいは、カバースリップを適用する前に、マウントされた標本を乾燥させることができる。カバースリップなしで乾燥させると、ハードセットマウンタントの乾燥を促進することができる。カバースリップなしでは、乾燥には40℃で約30分、室温で約4時間を要し得る。マウンタントが乾燥した後、水、さらなるマウンタント、エタノール、またはグリセロールなどの接触液を乾燥したマウンタント上に置き、次いでカバースリップを標本上に置くことによって、カバースリップをマウントされた標本上に適用することができる。
ポリビニルピロリドン(PVP)を用いた封入剤の配合
0.50gのグリセロール(Fisher Scientific,Fair Lawn,NJ)、1.00gのPVP(Mw=55,000g/mol、TCI America Portland,OR)、61mgの2-アミノ-2-(ヒドロキシメチル)-1,3,プロパンジオール(TRIS塩基、Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)、および3.8mLの脱イオン水を、20mLの磁気攪拌棒を備えたシンチレーションバイアルに添加することによって、封入剤を配合した。溶液を、60℃の水浴中で500rpmで撹拌し、PVPの完全な溶解が観察されるまで加熱した。ポリマーの溶解後、使用前にバイアルを室温まで冷却させた。RIは、実施例1に記載されるように測定した(表1、試料2を参照)。
ポリビニルアルコール(PVA)を用いた封入剤の配合
0.50gのグリセロール、61mgのTRIS塩基、1.00gのPVA(Mw約23,000g/mol、Sekisui America Corporation,Secaucus,NJ,USA)、および3.8mLの脱イオン水を、20mLの磁気攪拌棒を備えたシンチレーションバイアルに添加することによって、封入剤を配合した。PVAの完全な溶解が観察されるまで、実施例3に記載されるように溶液を撹拌し、加熱した。ポリマーの溶解後、使用前にバイアルを室温まで冷却させた。RIは、実施例1に記載されるように測定した(表1、試料8を参照)。
ポリ(N-メチルメタクリルアミド)(PMMAm)を用いた封入剤の配合
0.50gのグリセロール、61mgのTRIS塩基、1.00gのPMMAm(Mw=100,000g/mol)、および3.8mLの脱イオン水を、20mLの磁気攪拌棒を備えたシンチレーションバイアルに添加することによって、封入剤を配合した。PMMAmの完全な溶解が観察されるまで、実施例3に記載されるように溶液を撹拌し、加熱した。ポリマーの溶解後、使用前にバイアルを室温まで冷却させた。RIは、実施例1に記載されるように測定した(表1、試料14を参照)。
様々なポリマー/グリセロール質量比を用いた封入剤の配合
実施例3~5に記載されているように、水溶性ポリマーとしてPVP、PVA、およびPMMAmを使用して、封入剤を配合した。さらに、ポリマー対グリセロールの質量比は、0.5~2.0まで変化した。マウンタントの最終体積を希釈して、DI水で5mLの一定体積にした。ポリマーの完全な溶解が観察されるまで、実施例3に記載されるように溶液を撹拌し、加熱した。ポリマーの溶解後、使用前にバイアルを室温まで冷却させた。RIは、実施例1に記載されるように測定した(PVPについては表1、試料1、2、3および4;PVAについては試料7、8および10;ならびにPMMAmについては試料14、15、17、18および20を参照)。表1の試料1、2、3、4、7、8、10、14、15、17、18、および20のデータを参照すると、乾燥した封入剤のRIは、ポリマー対グリセロールの比が増加するにつれて著しく増加し、これは、文献に報告されている試験したポリマーのRI(すなわち、1.530 PVP、1.50 PVA、および1.540 PMMAm)が純粋なグリセロールのRI(25℃で1.4722)を超えるため予想されていた。しかしながら、ポリマー濃度がある特定の閾値を超えると、乾燥したマウンタントの物理的および光学的特性が大幅に低下し、ポリマーに応じて、顕微鏡用途に使用できなくなるフィルムになることもある(例えば、試料23を参照)。しかしながら、製剤中のポリオールが多すぎると、乾燥した材料が脂性または油性になり、カバースリップが試料に十分に付着しなくなる。ある特定のポリマーの場合、この閾値は、約0.125:1以上(例えば、PVPおよびPVA)であり、ごく少量のポリマーのみが、使用可能な高RIMフィルムを製造するために必要とされる。しかしながら、他のポリマーの場合、製剤中のポリマーが多すぎると、フィルムの品質が低下し、他の欠点が生じる可能性がある。例えば、PMMAmを実装する製剤の場合、製剤中のいくらかのポリオールの存在は、ポリマーを可塑化するのに役立ち、それにより特に低温で保存した場合にポリマーが過度に脆性にならないか、またはひび割れない。したがって、PMMAm系製剤の場合、水溶性ポリマー対ポリオールの質量比は、約4:1以下(例えば、0.125:1~4:1)である。ポリマーの種類に関係なく、ポリオールはまた、乾燥したマウンタントに一定レベルの永続的な体積を与え、生物学的試料(例えば、細胞)が過度に圧縮されるのを防ぐことができる。例えば、ポリオールを含まないPVAフィルムは、典型的に乾燥してもひび割れないが、フィルムは非常に収縮するため、細胞が圧縮される。
様々なポリマー/ジグリセロール質量比での封入剤の配合
ポリオールとしてグリセロールの代わりにジグリセロール(Alfa Aesar,Tewksbury,MA)を使用したことを除いて、実施例6に記載されるように封入剤を配合した。ポリマー対ジグリセロールの質量比は、0.5~2.0まで変化した。マウンタントの最終体積を、DI水で5mLの一定体積にした。ポリマーの完全な溶解が観察されるまで、実施例3に記載されるように溶液を撹拌し、加熱した。ポリマーの溶解後、使用前にバイアルを室温まで冷却させた。RIは、実施例1に記載される手順に従って測定した(PVPについては表1、試料5および6;PVAについては試料9、11および12;ならびにPMMMAmについては試料13、16、および19を参照)。表1を参照すると、試験されたポリマーのRIは、純粋なジグリセロールのRI(20℃で1.4850)を超えるため、ポリマー対ジグリセロールの比が増加するにつれて、乾燥封入剤のRIは増加した。さらに、ジグリセロールで調製した封入剤は、グリセロールを使用して調製した場合よりもわずかに高いRIを有していた。
様々なポリマー分子量を有する封入剤の配合
ポリマーの重量を以下のように変化させたことを除いて、実施例3~5に記載されるように封入剤を配合した。PVP(10,000g/mol~55,000g/mol)、PVA(13,000g/mol~31,000g/mol)、およびPMMAm(33,000g/mol~100,000g/mol)。ポリマー対ポリオールの質量比は、0.5~2.0まで変化した。マウンタントの最終体積を希釈して、DI水で5mLの一定体積にした。ポリマーの完全な溶解が観察されるまで、実施例3に記載されるように溶液を撹拌し、加熱した。ポリマーの溶解後、使用前にバイアルを室温まで冷却させた。RIは、実施例1に記載される手順に従って測定した(PVPについては表1、試料1~6;PVAについては試料7~12;ならびにPMMMAmについては試料13~20を参照)。興味深いことに、ポリマーの分子量は、ポリオールの種類およびポリマー対ポリオールの比が一定に保たれた場合、RIに統計的に有意な影響を与えなかった。
ポリマーのみを用いた封入剤の配合
グリセロールまたはジグリセロール添加剤を製剤から省いたことを除いて、実施例3~5に記載されるように封入剤を配合した。マウンタントの最終体積を希釈して、DI水で5mLの体積にした。ポリマーの完全な溶解が観察されるまで、実施例3に記載のように溶液を撹拌および加熱した。ポリマーの溶解後、使用前にバイアルを室温まで冷却させた。RIは、実施例1に記載の手順に従って測定された(表1、試料21~23を参照)。試料23のRIは、乾燥したマウンタントのひび割れのために測定できなかった(NM)。グリセロールまたはジグリセロールを含まない試料のデータは、製剤中のポリオールの存在により、恐らく乾燥したポリマーフィルムが可塑化または軟化するために、フィルムが過度に脆性になるか、または収縮しすぎるのを防ぐことができることを示している。
ポリマーおよび退色防止剤を用いた封入剤の配合
0.55gのグリセロール、1.10gのPMMAm(Mw=60,000g/mol)、122mgの2-アミノ-2-(ヒドロキシメチル)-1,3,プロパンジオール(TRIS塩基)、および5.0mLの脱イオン水を、20mLの磁気攪拌棒を備えたシンチレーションバイアルに添加することによって、封入剤を配合した。PMMAmの完全な溶解が観察されるまで、実施例3に記載されるように溶液を撹拌し、加熱した。ポリマーの完全溶解後、9.7mgの安息香酸(7.94mmol)および19mgの亜硫酸ナトリウム(15mmol)を、それぞれ防腐剤および退色防止剤として添加した。全ての安息香酸が溶解するまで、溶液を60℃でさらに30分間撹拌した。溶解した後、バイアルを室温まで冷却し、体積をDI水で10mLまで希釈した。実施例1に記載される手順に従ってRIを測定した(24時間後、21℃でRI=1.5146)。この製剤のRI値は、表1に提示される試料18または試料13に最も類似している。実施例8は、MWが統計的にRI値に影響を与えないこと、およびジグリセロール対グリセロールの使用がRI値をわずかに増加させることを示している。試料13および試料18と比較して、現在の試料の1.5146のRI値は、退色防止剤および防腐剤の添加が最終的なRI値に与える影響があったとしてもごくわずかであることを示唆している。
経時的な屈折率測定
RIの変化を時間の関数として追跡するために、屈折率を5日間にわたって監視した。実施例1に記載されるように、様々なマウント製剤を評価し、5日間にわたって様々な時点で測定を繰り返した。屈折率は、最初の5時間で劇的に増加し、その後プラトーになり、24時間後も同様のままであった(試料8および13の図1を参照)。
共焦点顕微鏡を使用した軸方向分解能測定のためのサブミクロン蛍光微小球のマウント
本明細書に開示されたマウント製剤の様々な焦点深度での軸方向分解能は、サブ分解能蛍光微小球の点広がり関数を使用して共焦点顕微鏡で検出される。PS-Speck(商標)顕微鏡ポイントソースキット(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)からの1.7μLの175nm緑色蛍光微小球(505/515励起/放射)を、200μLのマウンタント試料に分散させ、次いで20分間超音波処理する。超音波処理の後、100μLの各試料をエタノールで洗浄した18mm×18mmのカバースリップ上にピペットで移し、カバースリップをピンセットで前後に傾けることによって全体に広げる。封入剤試料を、カバースリップ上で40℃で1時間乾燥させた。乾燥した後、10μLのグリセロールをスライド上に置き、次いで各カバースリップをグリセロール液滴上に静かに置くことによって、カバースリップを標準顕微鏡スライド上に固定化した。カバースリップを、室温で約20分間スライド上に固定化させた。
1.屈折率整合(RIM)溶液であって、
a)水溶性ポリマーであって、ポリマーが、0.27~0.34のモル屈折率(RLL)対モル体積(Vm)比を有する、水溶性ポリマーと、
b)ポリオールであって、水溶性ポリマーのポリオールに対する質量比が0.318:1~4:1である、ポリオールと、
c)水または緩衝液とを含み、
1.36以上の屈折率を有する、RIM溶液。
2.屈折率が、1.60以下である、条項1に記載のRIM溶液。
3.生物学的標本を基材にマウントする方法であって、
基材上に生物学的標本を配置することと、
生物学的標本を条項1または条項2に記載のRIM溶液と接触させて、マウントされた試料を提供することと、を含む、方法。
4.マウントされた試料を乾燥させることをさらに含み、それにより水溶性ポリマーが固化して、固化したポリマーを提供する、条項3に記載の方法。
5.水溶性ポリマーが、室温で約48時間以内、または室温で24時間以内、または約40°Cの温度で約4時間以内に固化する、条項4に記載の方法。
6.固化したポリマーの屈折率が、1.47(例えば、1.48~1.54、または1.50~1.525)を超える、条項4に記載の方法。
7.顕微鏡を用いて基材上の生物学的標本を視覚化することをさらに含む、条項1~6のいずれか1項に記載の方法。
8.水溶性ポリマー及びポリオールを含む、固化したマウンタントであって、ポリマーが、0.27~0.34のモル屈折率(RLL)対モル体積(Vm)比を有し、水溶性ポリマーのポリオールに対する質量比が、0.318:1~4:1であり、固化したマウンタントが、1.48以上の屈折率を有する、固化したマウンタント。
9.水溶性ポリマー対ポリオールの質量比が、0.5:1以上である、条項8に記載の固化したマウンタント。
10.屈折率が、1.47より大きい、条項8または9に記載の固化したマウンタント。
11.水溶性ポリマーが、非荷電性である、条項1~10のいずれか1項に記載のRIM溶液または固化したマウンタント。
12.非荷電性水溶性ポリマーが、ポリ(アクリルアミド)、ポリ(メタクリルアミド)、ポリ(メチルビニルエーテル)、ポリ(ビニルピロリドン)(PVP)、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリ(2-エチル-2-オキサゾリン)、またはポリ(2-メチル-2-オキサゾリン)である、条項11に記載のRIM溶液。
13.非荷電性水溶性ポリマーが、N-RアクリルアミドまたはN-Rメタクリルアミド(ここでRが、メチル、エチル、プロピル、イソプロピルまたはHである);N,N-ジメチルアクリルアミド、N,N-ジメチルメタクリルアミド、N,N-ジエチルアクリルアミド、N,Nジエチルメタクリルアミド;N-2-ヒドロキシプロピルメタクリルアミド);またはそれらの組み合わせ、のモノマー残基を含む、条項11に記載のRIM溶液。
14.非荷電性水溶性ポリマーが、ポリ(N-メチルメタクリルアミド)(PMMAm)である、条項11に記載のRIM溶液または固化したマウンタント。
15.水溶性ポリマーが、荷電性である、条項1~14のいずれか1項に記載のRIM溶液または固化したマウンタント。
16.荷電性水溶性ポリマーが、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリ(ジアリルジメチルアンモニウムクロリド)、ポリ(ナトリウム-4-スチレンスルホネート)、ポリ(エチレンイミン)、ポリ(N,N-ジメチルアミノエチルアクリレート)、ポリ(N,N-ジエチルエチルアミノアクリレート)、ポリ(アリルアミン)、ポリ[ビス(2-クロロエチル)エーテル-co-1,3-ビス[3-(ジメチルアミノ)プロピル]尿素]、またはポリ(ビニルスルホン酸、ナトリウム塩)である、条項15に記載のRIM溶液または固化したマウンタント。
17.水溶性ポリマーが、約1kDa~約100kDaの重量平均分子量を有する、条項1~16のいずれか1項に記載のRIM溶液または固化したマウンタント。
18.水溶性ポリマーが、約1kDa~約20kDaの重量平均分子量を有する、条項1~17のいずれか1項に記載のRIM溶液または固化したマウンタント。
19.水溶性ポリマーが、約20kDa~約100kDaの重量平均分子量を有する、条項1~18のいずれか1項に記載のRIM溶液または固化したマウンタント。
20.水溶性ポリマーが、約48kDa~約80kDaの重量平均分子量を有する、条項1~19のいずれか1項に記載のRIM溶液または固化したマウンタント。
21.屈折率が、1.48~1.50、または1.50~1.52、または1.52~1.54である、条項1~20のいずれか1項に記載のRIM溶液または固化したマウンタント。
22.RIM溶液または固化したマウンタントの屈折率が、ソーダ石灰ガラス、ホウケイ酸ガラス、またはイマージョンオイルの屈折率と整合する、条項1~21のいずれか1項に記載のRIM溶液または固化したマウンタント。
23.水溶性ポリマーが、ポリオールではない、条項1~22のいずれか1項に記載のRIM溶液または固化したマウンタント。
24.ポリオールが、ポリビニルアルコール、グリセロール、ジグリセロール、ポリグリセロール、マンニトール、ソルビトール、チオジエタノール、チオジプロパノール、またはそれらの組み合わせである、条項1~23のいずれか1項に記載のRIM溶液または固化したマウンタント。
25.酸化防止剤をさらに含む、条項1~24のいずれか1項に記載のRIM溶液または固化したマウンタント。
26.1質量%以下の酸化防止剤を含む、条項25に記載のRIM溶液または固化したマウンタント。
27.酸化防止剤が、6-ヒドロキシ-2,5,7,8-テトラメチルクロマン-2-カルボン酸、3-カルボキシプロキシル、ヒドロキノン、メキノール、亜硫酸ナトリウム、エリソルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸、没食子酸プロピル、カフェ酸、パラフェニレンジアミン、1,4-ジアザビシクロ[2.2.2]オクタン、またはそれらの組み合わせである、条項26に記載のRIM溶液。
28.基材上に配置された生物学的標本を含む、マウントされた生物学的標本であって、生物学的標本が、条項1~27のいずれか1項に記載の固化したマウンタントに組み込まれている、マウントされた生物学的標本。
29.生物学的標本を基材にマウントするためのキットであって、
a)条項1~28のいずれか1項に記載の屈折率整合(RIM)溶液と、
b)生物学的標本を基材にマウントするための指示書と、を含む、キット。
30.基材が、顕微鏡スライド、キュベット、ウェル、またはディッシュである、条項1~29のいずれか1項に記載の方法、マウントされた生物学的標本、またはキット。
31.生物学的標本が、細胞、組織、3D細胞培養(例えば、スフェロイド/オルガノイド)、または生物全体(例えば、ミバエ、虫、ゼブラフィッシュ)である、条項1~30のいずれか1項に記載の方法、マウントされた生物学的標本、またはキット。
32.生物学的標本が、蛍光染料または蛍光タンパク質で標識されている、条項1~31のいずれか1項に記載の方法、マウントされた生物学的標本、またはキット。
Claims (22)
- 生物学的標本を基材にマウントするための屈折率整合(RIM)溶液であって、
a)0.27~0.34の、モル屈折率(RLL)の対モル体積(Vm)比を有する水溶性ポリマーであって、
(i)N-Rアクリルアミド(ここでRが、メチル、エチル、プロピル、またはイソプロピルである);N,N-ジメチルアクリルアミド;N,N-ジエチルアクリルアミド;もしくはそれらの組み合わせ、のモノマー残基を含むポリ(アクリルアミド)、またはN-Rメタクリルアミド(ここでRが、メチル、エチル、プロピル、イソプロピルまたはHである);N,N-ジメチルメタクリルアミド;N,N-ジエチルメタクリルアミド;N-2-ヒドロキシプロピルメタクリルアミド;もしくはそれらの組み合わせ、のモノマー残基を含むポリ(メタクリルアミド)である非荷電性水溶性ポリマー、または
(ii)ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリ(ジアリルジメチルアンモニウムクロリド)、ポリ(ナトリウム-4-スチレンスルホネート)、ポリ(エチレンイミン)、ポリ(N,N-ジメチルアミノエチルアクリレート)、ポリ(N,N-ジエチルエチルアミノアクリレート)、ポリ(アリルアミン)、ポリ[ビス(2-クロロエチル)エーテル-co-1,3-ビス[3-(ジメチルアミノ)プロピル]尿素]、およびポリ(ビニルスルホン酸、ナトリウム塩)から選択される荷電性水溶性ポリマー
である、水溶性ポリマーと、
b)ポリオールと、
c)水または緩衝液と
を含み、
前記水溶性ポリマー対前記ポリオールの質量比が0.318:1~4:1であり、
1.36以上の屈折率を有する、前記RIM溶液。 - 前記屈折率が、1.60以下である、請求項1に記載のRIM溶液。
- 生物学的標本を基材にマウントする方法であって、
前記基材上に前記生物学的標本を配置することと、
前記生物学的標本を請求項1または請求項2に記載のRIM溶液と接触させて、マウントされた試料を提供することとを含む、方法。 - 前記マウントされた試料を乾燥させることをさらに含み、それにより前記水溶性ポリマーが固化して、固化したポリマーを提供する、請求項3に記載の方法。
- 前記水溶性ポリマーが、室温で約48時間以内、室温で24時間以内、または約40℃の温度で約4時間以内に固化する、請求項4に記載の方法。
- 前記固化したポリマーの前記屈折率が、1.47を超える、請求項4に記載の方法。
- 顕微鏡で前記基材上の前記生物学的標本を視覚化することをさらに含む、請求項3に記載の方法。
- 前記水溶性ポリマーが、前記非荷電性水溶性ポリマーである、請求項1に記載のRIM溶液。
- 前記非荷電性水溶性ポリマーが、ポリ(N-メチルメタクリルアミド)(PMMAm)である、請求項8に記載のRIM溶液。
- 前記水溶性ポリマーが、前記荷電性水溶性ポリマーである、請求項1に記載のRIM溶液。
- 前記水溶性ポリマーが、約1kDa~約100kDaの重量平均分子量を有する、請求項1に記載のRIM溶液。
- 前記水溶性ポリマーが、約1kDa~約20kDaの重量平均分子量を有する、請求項1に記載のRIM溶液。
- 前記水溶性ポリマーが、約20kDa~約100kDaの重量平均分子量を有する、請求項1に記載のRIM溶液。
- 前記水溶性ポリマーが、約48kDa~約80kDaの重量平均分子量を有する、請求項1に記載のRIM溶液。
- 前記ポリオールが、ポリビニルアルコール、グリセロール、ジグリセロール、ポリグリセロール、マンニトール、ソルビトール、エリスリトール、チオジエタノール、チオジプロパノール、またはそれらの組み合わせである、請求項1に記載のRIM溶液。
- 酸化防止剤をさらに含む、請求項1に記載のRIM溶液。
- 1質量%以下の前記酸化防止剤を含む、請求項16に記載のRIM溶液。
- 前記酸化防止剤が、6-ヒドロキシ-2,5,7,8-テトラメチルクロマン-2-カルボン酸、3-カルボキシプロキシル、ヒドロキノン、メキノール、亜硫酸ナトリウム、エリソルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸、没食子酸プロピル、カフェ酸、パラフェニレンジアミン、1,4-ジアザビシクロ[2.2.2]オクタン、またはそれらの組み合わせである、請求項16に記載のRIM溶液。
- 生物学的標本を基材にマウントするためのキットであって、
a)請求項1に記載の屈折率整合(RIM)溶液と、
b)前記生物学的標本を前記基材にマウントするための指示書と
を含む、キット。 - 前記基材が、顕微鏡スライド、キュベット、ウェルまたはディッシュである、請求項3に記載の方法または請求項19に記載のキット。
- 前記生物学的標本が、細胞、組織、3D細胞培養物、または生物全体である、請求項3に記載の方法または請求項19に記載のキット。
- 前記生物学的標本が、蛍光染料または蛍光タンパク質で標識されている、請求項3に記載の方法または請求項19記載のキット。
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