KR20240042172A - 굴절률 매칭 제제 - Google Patents
굴절률 매칭 제제 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20240042172A KR20240042172A KR1020247009142A KR20247009142A KR20240042172A KR 20240042172 A KR20240042172 A KR 20240042172A KR 1020247009142 A KR1020247009142 A KR 1020247009142A KR 20247009142 A KR20247009142 A KR 20247009142A KR 20240042172 A KR20240042172 A KR 20240042172A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- water
- rim
- sample
- soluble polymer
- refractive index
- Prior art date
Links
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title description 129
- 238000009472 formulation Methods 0.000 title description 124
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims abstract description 89
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 58
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 116
- 239000008393 encapsulating agent Substances 0.000 claims description 98
- 229920003169 water-soluble polymer Polymers 0.000 claims description 83
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 79
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 69
- -1 poly(N-methyl methacrylamide) Polymers 0.000 claims description 62
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 claims description 58
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 claims description 58
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 58
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 claims description 57
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 25
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 claims description 24
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 claims description 24
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 21
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 15
- GPLRAVKSCUXZTP-UHFFFAOYSA-N diglycerol Chemical compound OCC(O)COCC(O)CO GPLRAVKSCUXZTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L sodium sulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])=O GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 10
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 9
- 238000007654 immersion Methods 0.000 claims description 9
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 claims description 8
- QIGBRXMKCJKVMJ-UHFFFAOYSA-N Hydroquinone Chemical compound OC1=CC=C(O)C=C1 QIGBRXMKCJKVMJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- ZTHYODDOHIVTJV-UHFFFAOYSA-N Propyl gallate Chemical compound CCCOC(=O)C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 ZTHYODDOHIVTJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 claims description 8
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 claims description 8
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 claims description 8
- NWVVVBRKAWDGAB-UHFFFAOYSA-N p-methoxyphenol Chemical compound COC1=CC=C(O)C=C1 NWVVVBRKAWDGAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 8
- QAIPRVGONGVQAS-DUXPYHPUSA-N trans-caffeic acid Chemical compound OC(=O)\C=C\C1=CC=C(O)C(O)=C1 QAIPRVGONGVQAS-DUXPYHPUSA-N 0.000 claims description 8
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 claims description 7
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 claims description 7
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 claims description 7
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 claims description 6
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 claims description 6
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 claims description 6
- FQPSGWSUVKBHSU-UHFFFAOYSA-N methacrylamide Chemical compound CC(=C)C(N)=O FQPSGWSUVKBHSU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000012604 3D cell culture Methods 0.000 claims description 5
- QRWZCJXEAOZAAW-UHFFFAOYSA-N n,n,2-trimethylprop-2-enamide Chemical compound CN(C)C(=O)C(C)=C QRWZCJXEAOZAAW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- JMCVCHBBHPFWBF-UHFFFAOYSA-N n,n-diethyl-2-methylprop-2-enamide Chemical compound CCN(CC)C(=O)C(C)=C JMCVCHBBHPFWBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- OVHHHVAVHBHXAK-UHFFFAOYSA-N n,n-diethylprop-2-enamide Chemical compound CCN(CC)C(=O)C=C OVHHHVAVHBHXAK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229940088644 n,n-dimethylacrylamide Drugs 0.000 claims description 5
- YLGYACDQVQQZSW-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethylprop-2-enamide Chemical compound CN(C)C(=O)C=C YLGYACDQVQQZSW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- OKPYIWASQZGASP-UHFFFAOYSA-N n-(2-hydroxypropyl)-2-methylprop-2-enamide Chemical compound CC(O)CNC(=O)C(C)=C OKPYIWASQZGASP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 235000010265 sodium sulphite Nutrition 0.000 claims description 5
- ACEAELOMUCBPJP-UHFFFAOYSA-N (E)-3,4,5-trihydroxycinnamic acid Natural products OC(=O)C=CC1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 ACEAELOMUCBPJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- CBCKQZAAMUWICA-UHFFFAOYSA-N 1,4-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=C(N)C=C1 CBCKQZAAMUWICA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- GEPIUTWNBHBHIO-UHFFFAOYSA-N 3-carboxy-PROXYL Chemical group CC1(C)CC(C(O)=O)C(C)(C)N1[O] GEPIUTWNBHBHIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 claims description 4
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 claims description 4
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 claims description 4
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 claims description 4
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 claims description 4
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 claims description 4
- 239000005388 borosilicate glass Substances 0.000 claims description 4
- 235000004883 caffeic acid Nutrition 0.000 claims description 4
- 229940074360 caffeic acid Drugs 0.000 claims description 4
- QAIPRVGONGVQAS-UHFFFAOYSA-N cis-caffeic acid Natural products OC(=O)C=CC1=CC=C(O)C(O)=C1 QAIPRVGONGVQAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 claims description 4
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 claims description 4
- 229960003505 mequinol Drugs 0.000 claims description 4
- 229920000223 polyglycerol Polymers 0.000 claims description 4
- 235000010388 propyl gallate Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000000473 propyl gallate Substances 0.000 claims description 4
- 229940075579 propyl gallate Drugs 0.000 claims description 4
- 239000005361 soda-lime glass Substances 0.000 claims description 4
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 claims description 4
- 235000010356 sorbitol Nutrition 0.000 claims description 4
- RLNWRDKVJSXXPP-UHFFFAOYSA-N tert-butyl 2-[(2-bromoanilino)methyl]piperidine-1-carboxylate Chemical group CC(C)(C)OC(=O)N1CCCCC1CNC1=CC=CC=C1Br RLNWRDKVJSXXPP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- YODZTKMDCQEPHD-UHFFFAOYSA-N thiodiglycol Chemical compound OCCSCCO YODZTKMDCQEPHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- IMNIMPAHZVJRPE-UHFFFAOYSA-N triethylenediamine Chemical compound C1CN2CCN1CC2 IMNIMPAHZVJRPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- QRQVZZMTKYXEKC-UHFFFAOYSA-N 3-(3-hydroxypropylsulfanyl)propan-1-ol Chemical compound OCCCSCCCO QRQVZZMTKYXEKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000004386 Erythritol Substances 0.000 claims description 3
- UNXHWFMMPAWVPI-UHFFFAOYSA-N Erythritol Natural products OCC(O)C(O)CO UNXHWFMMPAWVPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 claims description 3
- UNXHWFMMPAWVPI-ZXZARUISSA-N erythritol Chemical compound OC[C@H](O)[C@H](O)CO UNXHWFMMPAWVPI-ZXZARUISSA-N 0.000 claims description 3
- 235000019414 erythritol Nutrition 0.000 claims description 3
- 229940009714 erythritol Drugs 0.000 claims description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims description 3
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 229940026231 erythorbate Drugs 0.000 claims 1
- 235000010350 erythorbic acid Nutrition 0.000 claims 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 63
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 30
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 28
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 20
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 18
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 16
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 15
- ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M thionine Chemical compound [Cl-].C1=CC(N)=CC2=[S+]C3=CC(N)=CC=C3N=C21 ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 15
- WHNWPMSKXPGLAX-UHFFFAOYSA-N N-Vinyl-2-pyrrolidone Chemical compound C=CN1CCCC1=O WHNWPMSKXPGLAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 12
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 11
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 10
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 10
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 10
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 9
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 9
- 239000000463 material Substances 0.000 description 9
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 9
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000005562 fading Methods 0.000 description 7
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 6
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 6
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 6
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N Benzoic acid Natural products OC(=O)C1=CC=CC=C1 WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 241000252212 Danio rerio Species 0.000 description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 4
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 210000002220 organoid Anatomy 0.000 description 4
- BBEAQIROQSPTKN-UHFFFAOYSA-N pyrene Chemical compound C1=CC=C2C=CC3=CC=CC4=CC=C1C2=C43 BBEAQIROQSPTKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000010079 rubber tapping Methods 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-M Acrylate Chemical compound [O-]C(=O)C=C NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000005711 Benzoic acid Substances 0.000 description 3
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920002845 Poly(methacrylic acid) Polymers 0.000 description 3
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 3
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 description 3
- 241000255588 Tephritidae Species 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 229920006187 aquazol Polymers 0.000 description 3
- 235000010233 benzoic acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 238000004624 confocal microscopy Methods 0.000 description 3
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 3
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 3
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 3
- 229920000773 poly(2-methyl-2-oxazoline) polymer Polymers 0.000 description 3
- 229920000083 poly(allylamine) Polymers 0.000 description 3
- 229920000371 poly(diallyldimethylammonium chloride) polymer Polymers 0.000 description 3
- 229920001464 poly(sodium 4-styrenesulfonate) Polymers 0.000 description 3
- 229920002432 poly(vinyl methyl ether) polymer Polymers 0.000 description 3
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 3
- 239000004584 polyacrylic acid Substances 0.000 description 3
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 3
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 3
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 3
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000010352 sodium erythorbate Nutrition 0.000 description 3
- 239000004320 sodium erythorbate Substances 0.000 description 3
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 3
- RBWSWDPRDBEWCR-RKJRWTFHSA-N sodium;(2r)-2-[(2r)-3,4-dihydroxy-5-oxo-2h-furan-2-yl]-2-hydroxyethanolate Chemical compound [Na+].[O-]C[C@@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O RBWSWDPRDBEWCR-RKJRWTFHSA-N 0.000 description 3
- BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M sulfonate Chemical compound [O-]S(=O)=O BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- NLVXSWCKKBEXTG-UHFFFAOYSA-N vinylsulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C=C NLVXSWCKKBEXTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methylpiperazin-1-yl)-2,5'-bibenzimidazole Chemical compound C1=CC(OCC)=CC=C1C1=NC2=CC=C(C=3NC4=CC(=CC=C4N=3)N3CCN(C)CC3)C=C2N1 PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GJCOSYZMQJWQCA-UHFFFAOYSA-N 9H-xanthene Chemical compound C1=CC=C2CC3=CC=CC=C3OC2=C1 GJCOSYZMQJWQCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 9H-xanthine Chemical compound O=C1NC(=O)NC2=C1NC=N2 LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 2
- JLDSMZIBHYTPPR-UHFFFAOYSA-N Alexa Fluor 405 Chemical compound CC[NH+](CC)CC.CC[NH+](CC)CC.CC[NH+](CC)CC.C12=C3C=4C=CC2=C(S([O-])(=O)=O)C=C(S([O-])(=O)=O)C1=CC=C3C(S(=O)(=O)[O-])=CC=4OCC(=O)N(CC1)CCC1C(=O)ON1C(=O)CCC1=O JLDSMZIBHYTPPR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BPYKTIZUTYGOLE-IFADSCNNSA-N Bilirubin Chemical compound N1C(=O)C(C)=C(C=C)\C1=C\C1=C(C)C(CCC(O)=O)=C(CC2=C(C(C)=C(\C=C/3C(=C(C=C)C(=O)N\3)C)N2)CCC(O)=O)N1 BPYKTIZUTYGOLE-IFADSCNNSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012861 aquazol Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000002380 cytological effect Effects 0.000 description 2
- 239000002274 desiccant Substances 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- GVEPBJHOBDJJJI-UHFFFAOYSA-N fluoranthrene Natural products C1=CC(C2=CC=CC=C22)=C3C2=CC=CC3=C1 GVEPBJHOBDJJJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 2
- 230000002489 hematologic effect Effects 0.000 description 2
- MOFVSTNWEDAEEK-UHFFFAOYSA-M indocyanine green Chemical compound [Na+].[O-]S(=O)(=O)CCCCN1C2=CC=C3C=CC=CC3=C2C(C)(C)C1=CC=CC=CC=CC1=[N+](CCCCS([O-])(=O)=O)C2=CC=C(C=CC=C3)C3=C2C1(C)C MOFVSTNWEDAEEK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229960004657 indocyanine green Drugs 0.000 description 2
- QDLAGTHXVHQKRE-UHFFFAOYSA-N lichenxanthone Natural products COC1=CC(O)=C2C(=O)C3=C(C)C=C(OC)C=C3OC2=C1 QDLAGTHXVHQKRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AMXOYNBUYSYVKV-UHFFFAOYSA-M lithium bromide Chemical compound [Li+].[Br-] AMXOYNBUYSYVKV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000000569 multi-angle light scattering Methods 0.000 description 2
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- ULWHHBHJGPPBCO-UHFFFAOYSA-N propane-1,1-diol Chemical compound CCC(O)O ULWHHBHJGPPBCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000015424 sodium Nutrition 0.000 description 2
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000001018 xanthene dye Substances 0.000 description 2
- JWZZKOKVBUJMES-UHFFFAOYSA-N (+-)-Isoprenaline Chemical group CC(C)NCC(O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 JWZZKOKVBUJMES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SLLFVLKNXABYGI-UHFFFAOYSA-N 1,2,3-benzoxadiazole Chemical compound C1=CC=C2ON=NC2=C1 SLLFVLKNXABYGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DPBJAVGHACCNRL-UHFFFAOYSA-N 2-(dimethylamino)ethyl prop-2-enoate Chemical compound CN(C)CCOC(=O)C=C DPBJAVGHACCNRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UGIJCMNGQCUTPI-UHFFFAOYSA-N 2-aminoethyl prop-2-enoate Chemical compound NCCOC(=O)C=C UGIJCMNGQCUTPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BNBQQYFXBLBYJK-UHFFFAOYSA-N 2-pyridin-2-yl-1,3-oxazole Chemical compound C1=COC(C=2N=CC=CC=2)=N1 BNBQQYFXBLBYJK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GOLORTLGFDVFDW-UHFFFAOYSA-N 3-(1h-benzimidazol-2-yl)-7-(diethylamino)chromen-2-one Chemical compound C1=CC=C2NC(C3=CC4=CC=C(C=C4OC3=O)N(CC)CC)=NC2=C1 GOLORTLGFDVFDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UWAUSMGZOHPBJJ-UHFFFAOYSA-N 4-nitro-1,2,3-benzoxadiazole Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=CC2=C1N=NO2 UWAUSMGZOHPBJJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KWBXQDNGHQLAMB-UHFFFAOYSA-N 4-sulfanyl-3h-1,3-thiazole-2-thione Chemical compound SC1=CSC(=S)N1 KWBXQDNGHQLAMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C11OC(=O)C2=CC=C(C(=O)O)C=C21 BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012103 Alexa Fluor 488 Substances 0.000 description 1
- 239000012110 Alexa Fluor 594 Substances 0.000 description 1
- 239000012112 Alexa Fluor 633 Substances 0.000 description 1
- 239000012114 Alexa Fluor 647 Substances 0.000 description 1
- 239000012117 Alexa Fluor 700 Substances 0.000 description 1
- 239000012099 Alexa Fluor family Substances 0.000 description 1
- 241000269350 Anura Species 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N Boron Chemical compound [B] ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 241000255925 Diptera Species 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 229920000028 Gradient copolymer Polymers 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000010867 Hoechst staining Methods 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- WDVSHHCDHLJJJR-UHFFFAOYSA-N Proflavine Chemical compound C1=CC(N)=CC2=NC3=CC(N)=CC=C3C=C21 WDVSHHCDHLJJJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- ZHAFUINZIZIXFC-UHFFFAOYSA-N [9-(dimethylamino)-10-methylbenzo[a]phenoxazin-5-ylidene]azanium;chloride Chemical compound [Cl-].O1C2=CC(=[NH2+])C3=CC=CC=C3C2=NC2=C1C=C(N(C)C)C(C)=C2 ZHAFUINZIZIXFC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DPKHZNPWBDQZCN-UHFFFAOYSA-N acridine orange free base Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC2=NC3=CC(N(C)C)=CC=C3C=C21 DPKHZNPWBDQZCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BGLGAKMTYHWWKW-UHFFFAOYSA-N acridine yellow Chemical compound [H+].[Cl-].CC1=C(N)C=C2N=C(C=C(C(C)=C3)N)C3=CC2=C1 BGLGAKMTYHWWKW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001251 acridines Chemical class 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 229940027998 antiseptic and disinfectant acridine derivative Drugs 0.000 description 1
- 239000013011 aqueous formulation Substances 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- JPIYZTWMUGTEHX-UHFFFAOYSA-N auramine O free base Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C(=N)C1=CC=C(N(C)C)C=C1 JPIYZTWMUGTEHX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- ZYGHJZDHTFUPRJ-UHFFFAOYSA-N benzo-alpha-pyrone Natural products C1=CC=C2OC(=O)C=CC2=C1 ZYGHJZDHTFUPRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WXBLLCUINBKULX-UHFFFAOYSA-N benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1.OC(=O)C1=CC=CC=C1 WXBLLCUINBKULX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N benzoquinolinylidene Natural products C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 229920001400 block copolymer Polymers 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910052796 boron Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000012459 cleaning agent Substances 0.000 description 1
- 238000001218 confocal laser scanning microscopy Methods 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 235000001671 coumarin Nutrition 0.000 description 1
- 150000004775 coumarins Chemical class 0.000 description 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 230000000093 cytochemical effect Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 229920000578 graft copolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011147 inorganic material Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 229940107698 malachite green Drugs 0.000 description 1
- FDZZZRQASAIRJF-UHFFFAOYSA-M malachite green Chemical compound [Cl-].C1=CC(N(C)C)=CC=C1C(C=1C=CC=CC=1)=C1C=CC(=[N+](C)C)C=C1 FDZZZRQASAIRJF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 1
- DZVCFNFOPIZQKX-LTHRDKTGSA-M merocyanine Chemical compound [Na+].O=C1N(CCCC)C(=O)N(CCCC)C(=O)C1=C\C=C\C=C/1N(CCCS([O-])(=O)=O)C2=CC=CC=C2O\1 DZVCFNFOPIZQKX-LTHRDKTGSA-M 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000007431 microscopic evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- PJUIMOJAAPLTRJ-UHFFFAOYSA-N monothioglycerol Chemical compound OCC(O)CS PJUIMOJAAPLTRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012120 mounting media Substances 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- WFKDPJRCBCBQNT-UHFFFAOYSA-N n,2-dimethylprop-2-enamide Chemical compound CNC(=O)C(C)=C WFKDPJRCBCBQNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- XJCPMUIIBDVFDM-UHFFFAOYSA-M nile blue A Chemical compound [Cl-].C1=CC=C2C3=NC4=CC=C(N(CC)CC)C=C4[O+]=C3C=C(N)C2=C1 XJCPMUIIBDVFDM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- VOFUROIFQGPCGE-UHFFFAOYSA-N nile red Chemical compound C1=CC=C2C3=NC4=CC=C(N(CC)CC)C=C4OC3=CC(=O)C2=C1 VOFUROIFQGPCGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 239000011368 organic material Substances 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 150000004866 oxadiazoles Chemical class 0.000 description 1
- GHTWDWCFRFTBRB-UHFFFAOYSA-M oxazine-170 Chemical compound [O-]Cl(=O)(=O)=O.N1=C2C3=CC=CC=C3C(NCC)=CC2=[O+]C2=C1C=C(C)C(N(C)CC)=C2 GHTWDWCFRFTBRB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 150000004893 oxazines Chemical class 0.000 description 1
- VYNDHICBIRRPFP-UHFFFAOYSA-N pacific blue Chemical compound FC1=C(O)C(F)=C2OC(=O)C(C(=O)O)=CC2=C1 VYNDHICBIRRPFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- IEQIEDJGQAUEQZ-UHFFFAOYSA-N phthalocyanine Chemical compound N1C(N=C2C3=CC=CC=C3C(N=C3C4=CC=CC=C4C(=N4)N3)=N2)=C(C=CC=C2)C2=C1N=C1C2=CC=CC=C2C4=N1 IEQIEDJGQAUEQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000867 polyelectrolyte Polymers 0.000 description 1
- 229920005597 polymer membrane Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 150000004032 porphyrins Chemical class 0.000 description 1
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 229960000286 proflavine Drugs 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 150000003220 pyrenes Chemical class 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 229920005604 random copolymer Polymers 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- WXMKPNITSTVMEF-UHFFFAOYSA-M sodium benzoate Chemical compound [Na+].[O-]C(=O)C1=CC=CC=C1 WXMKPNITSTVMEF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000010234 sodium benzoate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004299 sodium benzoate Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 150000003871 sulfonates Chemical class 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 229940035024 thioglycerol Drugs 0.000 description 1
- 238000000179 transient infrared spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 229940075420 xanthine Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08K—Use of inorganic or non-macromolecular organic substances as compounding ingredients
- C08K3/00—Use of inorganic substances as compounding ingredients
- C08K3/30—Sulfur-, selenium- or tellurium-containing compounds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08K—Use of inorganic or non-macromolecular organic substances as compounding ingredients
- C08K5/00—Use of organic ingredients
- C08K5/04—Oxygen-containing compounds
- C08K5/09—Carboxylic acids; Metal salts thereof; Anhydrides thereof
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/36—Embedding or analogous mounting of samples
-
- G—PHYSICS
- G02—OPTICS
- G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
- G02B21/00—Microscopes
- G02B21/33—Immersion oils, or microscope systems or objectives for use with immersion fluids
-
- G—PHYSICS
- G02—OPTICS
- G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
- G02B21/00—Microscopes
- G02B21/34—Microscope slides, e.g. mounting specimens on microscope slides
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
- G01N2001/302—Stain compositions
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/36—Embedding or analogous mounting of samples
- G01N2001/364—Embedding or analogous mounting of samples using resins, epoxy
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Sampling And Sample Adjustment (AREA)
- Microscoopes, Condenser (AREA)
- Prostheses (AREA)
Abstract
굴절률 매칭(RIM) 제제, 생물학적 시료(예를 들어, 세포 및 조직)를 기질에 봉입하기 위한 이들의 용도, 및 RIM 제제에 포매된 생물학적 시료를 시각화하는 방법이 기재되어 있다.
Description
굴절률 매칭(RIM: refractive index matching) 제제, 생물학적 시료(예를 들어, 세포 및 조직)를 기질에 봉입시키기(mounting) 위한 이들의 용도, 및 RIM 제제에 포매된(embedded) 생물학적 시료를 시각화하는 방법이 기재되어 있다.
생물학적 시료는 광학 현미경에 의한 조사를 위해 광학적으로 투명한 기질, 예컨대 유리 현미경 슬라이드 상에 봉입된다. 통상적으로, 봉입 과정은 또한 "봉입 매체(mounting medium)" 또는 "봉입제(mountant)"로도 알려진 봉입 용액 중에 생물학적 시료(예를 들어, 고정된 세포 또는 조직)를 현탁한 후, 시료를 기질의 표면에 둠으로써, 봉입 용액 중에 시료를 포매시키는 것과 관련된다. 봉입 용액 및 포매된 시료는 선택적으로 조사(interrogation) 전에 통상적으로 커버 슬라이드 하에서 건조된다. 봉입 매체는 시료를 물리적인 손상으로부터 보호하고, 시료의 연장된 저장을 허용한다.
봉입 매체의 선택은 샘플 및 기질의 타입에 의해 지정된다. 봉입 매체는 액체일 수 있고, 또는 영구적인 봉입제로 경화될 수 있다. 또한, 봉입 매체는 시료와 반응하지 않는 것이 이상적이고, 시간이 경과함에 따라 결정화되거나 또는 어두워지지 않는다. 시료를 염료로 염색하는 경우, 봉입제는 또한 염료를 페이딩시키거나 탈색시켜서는 안된다. 형광 염료로 표지되는 생물학적 시료에 대하여, 적합한 봉입제의 선택은 종종 광퇴색(photobleaching)을 최소화하는 이의 능력에 의해 좌우된다. 적합한 봉입제는 초기 형광 강도의 퀀칭은 최소화하면서도, 형광단의 광퇴색을 효과적으로 감소시켜야 한다. 비가역적 광퇴색을 통한 형광의 손실은, 특히 표적 분자가 존재량(abundance)이 낮거나, 또는 여기 광이 고강도 또는 긴 지속시간을 갖는 경우, 감도에서 유의한 감소를 유발할 수 있다. 적당한 봉입제의 선택에서 또 다른 인자는 이의 광학적 투명성이다. 광학적 투명성은 단지 봉입제가 얼마나 투명한지가 아니라, 봉입제, 샘플, 그리고 유리 또는 다른 기질의 굴절률(RI)이 서로 얼마나 잘 매칭되는지에 의하여 영향을 받는다. 생물학적 시료에 대해서는, 수성 봉입 매체가 일반적으로 선택된다. 그러나, 상업적으로 이용가능한 수성 봉입 매체는 시료의 굴절률에 적합하게 매칭되는데 실패한다. 예를 들어, 세포 및 조직은 통상적으로 1.35-1.42의 RI를 갖는다. 이들 봉입 매체의 RI가 현미경 슬라이드 및 커버슬립에 사용되는 유리의 RI(1.50-1.54) 미만으로 떨어지고, 또한 생물학적 시료의 RI와 매칭되지 않기 때문에, 이들 봉입 매체는 최적의 광학적 투명성을 허용하지 않는다. 따라서, 유리 및/또는 조사 중인 생물학적 시료의 RI에 더욱 가깝게 매칭되는 RI를 갖는, 생물학적 시료 봉입을 위한 개선된 제제의 필요성이 있다.
수용성 중합체를 포함하는 굴절률 매칭(RIM) 용액이 제공되는데, 여기에서 상기 중합체는 0.27 내지 0.34의 몰 굴절(RLL) 대 몰 부피(Vm) 비 및 폴리올을 갖는다. 일 측면에서, 수용성 중합체를 포함하는 굴절률 매칭(RIM) 용액이 제공되는데, 여기에서 상기 중합체는 0.27 내지 0.34의 몰 굴절(RLL) 대 몰 부피(Vm) 비; 및 폴리올을 갖고, 상기 수용성 중합체 대 상기 폴리올의 중량비는 0.125:1 내지 4:1이다. 특정 구현예에서, 수용성 중합체 대 폴리올의 중량비는 0.318:1 내지 4:1이다. RIM 용액은 추가로 물 또는 버퍼를 포함할 수 있다. RIM 용액은 1.33 이상(예를 들어, 1.333 내지 1.530; 또는 1.330 내지 1.420)의 굴절률(RI)을 가질 수 있다. 특정 구현예에서, RIM 용액의 RI는 1.36 이상이다. 특정 구현예에서, RIM 용액의 RI는 1.38 이상이다. 또 다른 구현예에서, RIM 용액의 RI는 1.47 이상이다. 통상적으로, RIM 용액의 RI는 1.60 이하이다.
다른 측면에서, 생물학적 시료를 기질 상에 봉입시키는 방법이 제공되는데, 이는 생물학적 시료를 기질 상에 두는 단계; 및 상기 생물학적 시료를 본원에 기재된 RIM 용액과 접촉시켜, 봉입된 샘플을 제공하는 단계를 포함한다. 본원에 기재된 방법, 봉입된 생물학적 시료 또는 키트 중 어느 것에서, 기질은 현미경 슬라이드, 큐벳, 웰, 화상화 챔버 또는 디쉬일 수 있다. 생물학적 시료의 대표적인 예는 세포, 조직, 3D 세포 배양물(예를 들어, 스페로이드(spheroid)/오가노이드(organoid)), 또는 모든 생물체 [예를 들어 초파리, 벌레(worm), 제브라 피쉬(zebra fish)]를 포함한다. 선택적으로, 생물학적 시료는 형광 염료 또는 형광 단백질로 표지된다. 상기 방법은 추가로 봉입된 샘플을 건조시키는 단계를 포함할 수 있는데, 이로 인해 상기 수용성 중합체가 고체화되어 고체화된 중합체를 제공한다. 수용성 중합체는 약 48시간 이하 내에; 또는 24시간 이하 내에 실온에서; 또는 약 4시간 이하 내에 약 40℃의 온도에서 고체화될 수 있다. 고체화된 중합체의 RI는 1.47을 초과할 수 있다. 특정 구현예에서, 고체화된 중합체의 RI는 1.48 내지 1.54이다. 특정 구현예에서, 고체화된 중합체의 RI는 1.50 내지 1.525이다. 상기 방법은 기질 상의 생물학적 시료를 현미경에 의해 시각화하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 수용성 중합체를 포함하는 고체화된 봉입제가 제공되는데, 여기에서 상기 중합체는 0.27 내지 0.34의 몰 굴절(RLL) 대 몰 부피(Vm) 비, 및 폴리올을 갖고, 여기에서 상기 수용성 중합체 대 상기 폴리올의 중량비는 0.125:1 내지 4:1이다. 고체화된 봉입제 중의 수용성 중합체 대 폴리올의 중량비는 0.5:1 이상일 수 있다. 고체화된 봉입제는 1.47 이상의 굴절률을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 고체화된 봉입제의 굴절률은 1.47 초과이다. 특정 구현예에서, 수용성 중합체를 포함하는 고체화된 봉입제가 제공되며, 여기에서 상기 중합체는 0.27 내지 0.34의 몰 굴절(RLL) 대 몰 부피(Vm) 비, 및 폴리올을 갖고, 여기에서 상기 수용성 중합체 대 상기 폴리올의 중량비는 0.318:1 내지 4:1이고, 여기에서 상기 고체화된 봉입제는 1.48 이상의 굴절률을 갖는다. 본원에 기재된 RIM 용액 또는 고체화된 봉입제의 RI는 소다-석회 유리, 붕규산 유리, 또는 액침유(immersion oil)의 굴절률(예를 들어, 1.48-1.50; 또는 1.50 내지 1.52; 또는 1.52 내지 1.54)과 매칭되는게 이상적으로 적합하다.
기재된 제제에 사용된 수용성 중합체는 하전되지 않을 수 있다. 예를 들어, 하전되지 않은, 수용성 중합체는 폴리(아크릴아미드), 폴리(메타크릴아미드), 폴리(메틸 비닐 에테르), 폴리(비닐 피롤리돈)(PVP), 폴리비닐 알콜(PVA), 폴리(2-에틸-2-옥사졸린), 또는 폴리(2-메틸-2-옥사졸린)일 수 있다. 특정 구현예에서, 하전되지 않은, 수용성 중합체는 N-R 아크릴아미드 또는 N-R 메타크릴아미드의 단량체 잔기를 포함하고, 여기에서 R은 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필 또는 H; N,N-디메틸아크릴아미드, N,N-디메틸메타크릴아미드, N,N-디에틸아크릴아미드, N, N 디에틸메타크릴아미드; N-2-히드록시프로필 메타크릴아미드); 또는 이들의 조합이다. 특정 구현예에서, 하전되지 않은, 수용성 중합체는 폴리(N-메틸 메타크릴아미드)(PMMAm)이다. 대안적으로, 기재된 제제에 사용된 수용성 중합체는 하전될 수 있다. 대표적인 하전된, 수용성 중합체는 예를 들어, 폴리아크릴산, 폴리메타크릴산, 폴리(디알릴디메틸암모늄 클로라이드), 폴리(소듐-4-스티렌설포네이트), 폴리(에틸렌이민), 폴리(N,N-디메틸아미노에틸 아크릴레이트), 폴리(N,N-디에틸에틸아미노 아크릴레이트), 폴리(알릴아민), 폴리[비스(2-클로로에틸)에테르-코-1,3-비스[3-(디메틸아미노)프로필]우레아]; 또는 폴리(비닐술폰산, 소듐 염)을 포함한다. 특정 구현예에서, 수용성 중합체는 폴리올이 아니다. 수용성 중합체는 약 1 kDa 내지 약 100 kDa의 중량 평균 분자량을 가질 수 있다. 특정 구현예에서, 중량 평균 분자량은 약 1 kDa 내지 약 20 kDa; 또는 약 20 kDa 내지 약100 kDa; 또는 약 48 kDa 내지 약 80kDa이다. 수용성 중합체는 또한 둘 이상의 본원에 기재된 하전된 또는 하전되지 않은 단량체로부터 형성된 공중합체일 수 있는데, 여기에서 상기 공중합체는 예를 들어, 랜덤, 그라디언트, 블록 또는 그라프트 공중합체일 수 있다.
본원에 기재된 봉입 제제는 또한 폴리올, 예컨대 폴리비닐 알콜, 글리세롤, 디글리세롤, 폴리글리세롤, 만니톨, 소르비톨, 에리스리톨, 티오디에탄올, 티오디프로판올, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 선택적으로, 제제는 항산화제(예를 들어, 약 1 중량% 이하), 예컨대, 예를 들어, 6-히드록시-2,5,7,8-테트라메틸크로만-2-카르복실산, 3-카르복시 프록실, 히드로퀴논, 메퀴놀, 소듐 설파이트, 소듐 에리토르베이트, 아스코르브산, 프로필 갈레이트, 카페산, 파라페닐렌디아민, 1,4-디아자비시클로[2.2.2]옥탄, 또는 이들의 조합을 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 기질 상에 놓인 생물학적 시료를 포함하는 봉입된 생물학적 시료가 제공되는데, 여기에서 상기 생물학적 시료는 본원에 기재된 바와 같이 고체화된 봉입제 내에 포매된다.
또 다른 구현예에서, 기질 상의 생물학적 시료를 봉입하기 위한 키트가 제공되는데, 이는 본원에 기재된 굴절률 매칭(RIM) 용액; 및 생물학적 시료를 기질 상에 봉입하기 위한 지침(instruction)을 포함한다.
도 1은 샘플 8 및 13에 대한 굴절률 변화를 시간의 함수로서 나타내는 플롯이다.
도 2은 샘플 8, 10 및 13에 대한 축방향 해상도(axial resolution)를 초점 깊이의 함수로서 나타내는 플롯이다.
도 3은 샘플 8, 10 및 13에 대한 측방향 해상도(lateral resolution)를 초점 깊이의 함수로서 나타내는 플롯이다.
도 2은 샘플 8, 10 및 13에 대한 축방향 해상도(axial resolution)를 초점 깊이의 함수로서 나타내는 플롯이다.
도 3은 샘플 8, 10 및 13에 대한 측방향 해상도(lateral resolution)를 초점 깊이의 함수로서 나타내는 플롯이다.
달리 기재된 바 없는 경우, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 업계의 통상의 숙련자가 공통으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 언급된 모든 특허, 출원, 공개된 출원 및 다른 간행물은 전체가 참고로 포함된다. 만약 이 섹션에서 제시된 정의가 본원에 참고로 포함된 특허, 출원, 공개된 출원 및 다른 간행물에 제시된 정의와 모순되거나 또는 일관되지 않는 경우, 이 섹션에서 열거된 정의가 본원에 참고로 포함된 정의보다 우세하다.
본원에 사용된 "a" 또는 "an"은 "적어도 하나(at least one)" 또는 "하나 이상의(one or more)"를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "약(about)"은, 수치 값을 기재하기 위해 사용되는 경우, 문맥에서 달리 명시된 바 없을 때에는 그 수치값의 최대 ± 15%를 포함한다.
조성물 및 방법은 다양한 요소 또는 단계를 "포함하는(comprising)"["이를 포함하나 이에 제한되지 않는다(including, but not limited to)"를 의미하는 것으로 해석됨]에 관하여 기재되는 경우, 상기 조성물 및 방법은 또한 다양한 요소 및 단계를 "본질적으로 포함하거나(consist essentially of)" 또는 "이로서 이루어질(consist of)" 수 있는데, 이러한 용어는 본질적으로 폐쇄-멤버 그룹을 정의하는 것으로 해석되어야 한다.
본원에 사용된 "굴절률(refractive index)" 또는 "RI"는, 광이 특정 매체를 얼마나 신속하게 이동하는지의 측정치이다. 광이 상이한 RI 값들을 갖는 두 매체, 예컨대 공기와 물 사이를 지나가는 경우, 이들이 지나가는 경로가 굽어져서, 화상을 왜곡시킨다. 굴절률은 또한 복사선의 속도 및 파장이 진공에서의 광의 파장에 비해 얼마나 많이 감소하는지에 대한 측정치이다. RI이 두 속도들의 비이기 때문에, 이는 무차원이다.
본원에 사용된 "수용성(water-soluble)"은 화합물이 수성-계 용액에, 예컨대 물 또는 당업계의 숙련자들에게 알려진 생물학적 또는 분자 검출 시스템에 사용되는 것들을 포함하는 수-계 용액 또는 버퍼 용액에 용해 또는 분산될 수 있는 것을 의미한다. 화합물은 수성 제제에 10 mg/mL 이상의 농도로 용해될 수 있는 경우 수용성으로 간주된다. 수성 시스템에 100 mg/mL 이상의 농도로 용해될 수 있는 화합물은 매우 수용성인 것으로 간주된다. 수성 시스템에 1 mg/mL 이하의 농도로 용해될 수 있는 화합물은 불량한 수용성을 갖는 것으로 간주된다.
본원에 사용된 "생물학적 시료(biological specimen)" 또는 "생물학적 샘플(biological sample)"은, 혈액학적, 세포학적 및 조직학적 시료, 예컨대 세포, 3D 세포 배양물(예를 들어 스페로이드 및 오가노이드), 조직, 모든 생물체(예를 들어 파리, 벌레, 제브라피쉬), 세포-불포함 추출물, 또는 유체 샘플(예를 들어, 혈액 또는 타액)를 포괄한다. 조직 시료는 임의의 타입의 신경, 표피, 근육, 및 결합 조직일 수 있고, 이는 장기 조직을 포함한다. 생물학적 샘플은 식물 또는 동물(예를 들어, 인간, 마우스, 파리, 벌레, 물고기, 개구리, 진균 등) 유래일 수 있다.
기질 상에 시료를 봉입하는데 사용하기 위한 제제가 본원에 기재된다. 기재된 제제는 시료의 보호 및 저장을 위해 단단한(hard-setting) 봉입 매체를 제공하는 수성-계 시스템이다. 제제는 세포 및 조직 샘플에 직접 적용될 수 있고, 이는 선택적으로 기질 상에 형광 표지될 수 있고, 건조시 경화될 수 있다. 제제는 커버슬립 없이 경화될 수 있어서, 커버슬립이 봉입된 시료를 보호하기 위해 사용되어야 한다는 요구 조건을 없앤다. 본원에 기재된 봉입 제제는 기질 대신 시료를 보유함으로서, 추후 조사를 위하여 기질 상의 생물학적 시료를 안정화 및 보존한다. 예를 들어, 일단 봉입되면, 생물학적 시료는 현미경 하에서 화상화될 수 있다. 기재된 제제는 이들 제제가 생물학적 샘플을 위한 봉입 매체로서 이상적이도록 만드는 유리한 광학적 특성을 갖는다. 특히, 기재된 제제는 높은 굴절률을 나타낸다. 시료 및 봉입 매체의 RI는 화상 품질에 상당히 영향을 미칠 수 있다고 알려져 있다. 예를 들어, 시료와 주변 봉입제의 RI 간의 차이는 시료가 현미경 하에서 어떻게 나타나는지에 영향을 미칠 수 있다. 시료와 주변 매체의 RI 간의 차이가 큰 경우, 시료 및 봉입 매체 계면에서 광의 강한 굴절이 발생할 수 있다. RI에서 차이가 크면 광이 굴절될 때 시료의 세부 사항을 흐릴 수 있는 인공체를 유발할 수 있다. 반대로, 시료와 봉입 매체 간의 RI 차이가 작으면 광굴절을 감소시킬 수 있어서, 많은 타입의 시료가 현미경 하에서 더 밝게 및/또는 더욱 투명하게 보일 수 있게 된다.
생물학적 샘플, 뿐만 아니라 기질, 렌즈, 커버슬립, 및 현미경에 통상 사용되는 다른 요소의 굴절률과 매칭될 수 있는 제제가 본원에 제공된다. 따라서, 본원에 기재된 제제는 현미경의 대물렌즈의 유리, 뿐만 아니라 현미경 커버슬립의 유리, 또는 샘플의 현미경 화상화에 통상 사용되는 다른 요소, 예컨대 액침유의 RI와 매칭되는 굴절률(RI)를 갖는다. 높은 RI를 가짐으로서, 기재된 제제는 광굴절로부터 발생하는 현미경 화상의 왜곡을 최소화하여, 이들 제제가 고 배율 하에서 및/또는 액침유와 함께 사용하기에 적합하게 하는데, 이는 예컨대 현미경 화상의 왜곡을 최소화하는데 통상 사용된다. 일단 건조되면, 즉석 제제(instant formulation)는 기존의 단단한 봉입 제제의 RI를 초과하는 RI를 갖고, 반면 샘플 및 (존재하는 경우) 염료의 광퇴색을 감소시킨다. 예를 들어, 본원에 기재된 특정 제제는 1.47 이상의 RI를 가질 수 있는데, 이는 당업계의 숙련자들에게 알려진 표준 단단한-봉입 제제보다 상당히 높다.
본원에 제공된 제제는 광학적으로 투명하고, 심지어 한번 건조된 경우에도, 생물학적 시료와 화학적으로 양립가능하며, 심지어 연장된 저장 동안에도 생물학적 시료를 해하거나 또는 분해하지 않는다. 기재된 제제는 또한 고 배율 및 3D 재구성(Z-스택) 화상의 선명함을 개선시키고, 구면 수차(spherical aberration) 또는 산란광을 감소시킬 수 있으며, 이로 인해 다수의 깊이에서 더 선명한 화상의 포착을 가능하게 한다. 유리한 물리적 및 광학적 특성 때문에, 즉석 제제는 다양한 현미경 기술, 예컨대 시료 내의 심층부에서 형광단을 시각화하는데 사용되는 것들(예를 들어, 공초점 형광 현미경)을 사용하여, 다양한 타입의 생물학적 시료(예를 들어, 조직 및 세포)의 3-차원 화상화에서 실행될 수 있다. 추가로, 기재된 제제는 또한 거품 형성이 덜되고, 다른 상업적으로 이용가능한 단단한 경화성 봉입제보다 건조시 덜 수축되고, 건조 및/또는 동결시 균열이 발생하지 않는다. 봉입제는 경화시 변색 또는 수축되지 않아서, 슬라이드를 봉입한 지 수 주일 또는 심지어 수개월 후에도 고 품질의 화상을 얻을 수 있게 된다. 본원에 기재된 제제는 또한 세포 화상화 적용에서 통상 사용되는 형광 염료의 퀀칭을 최소화할 수 있다. 페이딩 방지 시약을 포함하는 제제는, 예를 들어, 염료의 퀀칭에 대항할 수 있고, 형광 탐침에 의해 염색된 세포 및 조직을 화상화하는데 특히 유용하다. 상기 기재된 특성들의 특유의 조합은, 기재된 제제가 염색된, 생물학적 샘플의 장기 저장에 특히 유용하게 한다.
본원에 제공된 굴절률 매칭(RIM) 제제는 하나 이상의 수용성 요소(예를 들어, 수용성 중합체)를 포함할 수 있다. 본원에 제공된 RIM 제제는 하나 초과의 수용성 요소를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 제제는 적어도 2개의 수용성 요소를 포함한다. 수용성 요소는 수성 매체 중에 함유될 수 있어서, 상기 제제가 생물학적 시료와 함께 사용되기에 적합하게 된다. 생물학적 시료를 함유하는 제제는 직접 화상화되거나, 또는 화상화되기 전에 건조되어, 상기 제제로부터 물을 제거할 수 있다.
본원에 제공된 RIM 제제는 화상화 적용에 통상 사용된 기질(예를 들어, 현미경 슬라이드, 예컨대 소다-석회 유리 또는 붕규산 유리로부터 제조된 것들) 또는 액침유의 굴절률에 매칭되는 굴절률을 나타낸다. 본원에 제공된 제제의 RIM 특성은 화상 품질을 개선하여, 기재된 제제가 화상화 적용에서 사용하기에 이상적이 되도록 한다. 본원에 제공된 RIM 제제는 당업계의 숙련자들에게 알려진 표준 봉입 제제에 비해 드물게 높은 RI를 나타낸다. 통상적으로, 일단 고체화된 기재된 제제의 굴절률은 1.45를 초과한다. 놀랍게도, 기재된 제제는 1.45 초과의 RI를 갖는 광학적으로 투명한 봉입 제제를 제공할 수 있다. 특정 구현예에서, 봉입제의 RI는 1.45 내지 1.47이다. 다른 구현예에서, 1.47 이상(예를 들어, 1.47 내지 1.50; 또는 1.50 내지 1.52; 또는 1.52 내지 1.54)의 RI를 갖는 봉입제가 제공된다. 특정 구현예에서, 제제는 약 1.47 내지 약 1.53이다. 특정 구현예에서, 봉입제의 RI는 약 1.50 내지 약 1.52이다.
약 1.50 내지 1.52 범위의 RI를 나타내는 생물학적 샘플, 예컨대 조직에 대해서는, 동일한 RI 범위를 갖는 경화된 봉입제를 제공할 수 있는 제제를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 기재된 RIM 조성물에 사용하기에 적합한 수용성 요소는, 일단 건조되면, 통상적으로 1.45 이상, 예를 들어, 1.45 내지 1.60의 RI를 갖는다. 일부 구현예에서, RI는 1.45 내지 1.50이다. 다른 구현예에서, RI는 1.50 내지 1.53이다. 다른 구현예에서, RI는 1.53 내지 1.55이다. 또 다른 구현예에서, 수용성 요소의 RI는 1.55 내지 1.60이다. 통상적으로, 봉입제를 제조하는데 사용된 용액의 RI는 경화된 봉입제보다 약간 낮다. 따라서, RIM 용액도 또한 본원에 제공되는데, 여기에서 RIM 용액의 RI은 1.33 이상(예를 들어, 1.333 내지 1.530; 또는 1.330 내지 1.420)의 굴절률을 갖는다.
수용성 요소(들)은 수용성 중합체일 수 있다. 특정 구현예에서, 제제는 추가적으로 폴리올을 포함할 수 있다. 많은 타입의 중합체에 대한 RI 값은 문헌에서 찾아볼 수 있다. RI 데이터를 이용할 수 없는 경우, 특정 중합체에 대한 RI는 수학식 1을 사용하여 로렌쯔-로렌쯔 이론(Lorenz-Lorentz Theory)에 기초하여 측정될 수 있거나 또는 계산될 수 있는데, 여기에서 n은 굴절률이고; RLL 및 Vm은 각각 중합체 반복 단위의 몰 굴절 및 몰 부피이다. 수학식 1로부터 계산된 RI는 파장 의존적이며, 통상적으로 589 nm의 파장(소듐 d-라인)에서 보고된다.
RLL/Vm = (n2-1)/(n2+2)(수학식 1)
다양한 타입의 중합체들의 RLL 및 Vm 값은 문헌에서 찾아볼 수 있거나, 또는 당업계의 숙련자에게 알려진 방법을 사용하여 집단 기여 효과(group contribution effect)로부터 추정될 수 있다. 본원에 기재된 RIM 제제에서의 사용에 적합한 수용성 중합체에 대한 RLL/Vm 비는, 통상적으로 약 0.27 내지 약0.34의 범위이다. 특정 구현예에서, 수용성 중합체를 포함하는 굴절률 매칭(RIM) 제제가 본원에서 제공되고, 여기에서 상기 중합체는 0.27 내지 0.34의 몰 굴절(RLL) 대 몰 부피(Vm) 비를 가져서, RIM 용액은 1.45-1.60의 굴절률을 갖는다. 특정 구현예에서, 0.284 내지 0.314 범위의 RLL/Vm 비를 갖는 수용성 중합체를 포함하는 제제는 약 1.48 내지 약 1.54의 굴절률을 갖는 RIM 제제를 제공한다.
기재된 RIM 제제에 사용하기 위한 수용성 중합체 및 공중합체는, 중성 또는 하전될 수 있다. 예를 들어, 수용성 중합체는 중성(즉, 하전되지 않은) 중합체일 수 있어서, 이는 샘플에 존재하는 염료 및/또는 세포성 단백질과의 상호작용을 최소화한다. 예시적인 중성, 수용성 중합체는 폴리(아크릴아미드), 폴리(메타크릴아미드), 폴리(메틸 비닐 에테르), 폴리(비닐 피롤리돈)(PVP), 폴리비닐 알콜(PVA), 폴리(2-에틸-2-옥사졸린), 및 폴리(2-메틸-2-옥사졸린)을 포함한다. 예시적인 아크릴아미드 및 메타크릴아미드-계 중합체는 단량체 단위, 예를 들어, N-R 아크릴아미드 또는 N-R 메타크릴아미드의 잔기를 포함할 수 있고, 여기에서 R은 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필 또는 H; N,N-디메틸아크릴아미드, N,N-디메틸메타크릴아미드, N,N-디에틸아크릴아미드, N, N 디에틸메타크릴아미드, N-2-히드록시프로필 메타크릴아미드), 또는 이들 단량체 단위의 조합이다. 특정 구현예에서, 하전되지 않은, 수용성 중합체는 폴리(N-메틸 메타크릴아미드)(PMMAm)이다. 예를 들어, PMMAm와 같은 중성 중합체를 포함하는 제제는, 기존의 상업적인 단단한 봉입 제제에서 발생하는 바와 같이 발포되지 않거나 또는 장기간 공기 거품을 형성하지 않아서, 거품 형성의 위험성이 매우 낮으면서도 샘플에 피펫팅될 수 있다. 중성 중합체를 함유하는 제제는 24시간 미만 내에 경화될 수 있어, 이러한 중합체가 본원에 기재된 RIM 용액의 제조에 특히 유용해진다. 예를 들어, PMMAm를 포함하는 제제는 대략 3시간 내에 고체화되어, 1.52의 RI를 갖는 경화된 봉입제를 제공할 수 있다.
대안적으로, 수용성 중합체는 하전된 중합체(예를 들어, 다가 전해질)일 수 있다. 하전된 중합체는 동등한 MW의 중성 중합체보다 더욱 수용성이며 더욱 점성이 있을 수 있다. 따라서, 하전된 중합체는 이러한 특성이 요구되는 봉입 제제에 사용된 경우 특정 장점들을 가질 수 있다. 하전된 중합체는 양성 및 음성 총 전하를 가질 수 있다. 예시적인 하전된, 수용성 중합체는 폴리아크릴산, 폴리메타크릴산, 폴리(디알릴디메틸암모늄 클로라이드), 폴리(소듐-4-스티렌설포네이트), 폴리(에틸렌이민), 폴리(N,N-디메틸아미노에틸 아크릴레이트), 폴리(N,N-디에틸에틸아미노 아크릴레이트), 폴리(알릴아민), 폴리[비스(2-클로로에틸)에테르-코-1,3-비스[3-(디메틸아미노)프로필]우레아], 또는 폴리(비닐술폰산, 소듐 염)을 포함한다.
수용성 중합체의 분자량은 봉입제의 원하는 특성 및 이의 의도된 용도에 기초하여 선택될 수 있다. 예를 들어, 중합체의 분자량은 제제의 점도에 영향을 미친다. 일반적으로, 분자량은 용이하게 취급되며 충분히 점성이 있는 제제를 달성하여, 이것이 기질 대신에 유지될 수 있도록 선택된다. 기재된 제제에서의 용도를 위한 중합체는 통상적으로 다양한 분자량을 포함한다. 분자량(MW)의 하한은 제제 중의 중합체의 원하는 용해성에 기초하여 선택될 수 있고, MW의 상한은 건조시 경화된 표면을 형성할 수 있는 이들의 능력에 기초하여 선택될 수 있다. 예를 들어, MW가 너무 낮은 경우, 제제는 이후 건조시 단단한 막을 형성할 수 없을 수도 있다. 일반적으로, 수용성 중합체는 약 1 kDa 내지 약 100 kDa, 예를 들어, 1 kDa 내지 15 kDa; 또는 15 kDa 내지 20 kDa; 또는 20 kDa 내지 40 kDa; 또는 40 kDa 내지 80 kDa; 또는 80 kDa 내지 100 kDa의 중량 평균 분자량을 가질 수 있다. 특정 구현예에서, 수용성 중합체의 중량 평균 분자량은 약 48 kDa 내지 약 80 kDa이다. 더 높은 분자량의 중합체(예를 들어, 15 kDa 초과)를 포함하는 제제는, 생물학적 시료의 무결성을 유지하는 온건한 조건 하에서 용이하게 고체화될 수 있다. 일부 구현예에서, RIM 제제는 더욱 낮은 분자량, 수용성 중합체(예를 들어, 20 kDa 미만)을 실행하여, 더 부드럽고 더 점성이 있는 봉입제를 제공할 수 있다. 더욱 부드러운 봉입제는 적용에 따라서, 그리고 특정 타입의 샘플을 봉입하기 위해 특정 장점을 제공할 수 있다. 예를 들어, 연장된 건조 시간을 최소화할 필요가 있는 경우, 또는 제제로부터 샘플의 회수를 원하는 경우, 더욱 부드러운 봉입제는 두께 >200 마이크론의 시료와 함께 사용될 수 있다.
RIM 제제는 하나 이상의 폴리올을 추가로 포함할 수 있다. "폴리올(polyol)"은 둘 이상의 히드록실기를 포함하는 화합물을 지칭한다. 특정 구현예에서, 폴리올은 100개 이상의 히드록실기를 갖는다. 다른 구현예에서, 폴리올은 1000개 이상의 히드록실기를 갖는다. 특정 구현예에서, 폴리올은 2500개 이하의 히드록실기를 갖는다. 폴리올은 RIM 중합체를 가소화시키는 것을 돕기 위해 제제에 포함될 수 있어, 봉입 막이 건조된 경우 이는 너무 약하거나 균열이 생기지 않는다. 증발되지 않은 폴리올은 막에 일부 영구적인 부피를 제공하고, 이로 인해 막이 너무 얇아지는 것을 방지할 수 있다. 이상적으로는, 건조된 막은 비건조된 막과 유사한 부피를 유지한다. 이것은 건조된 물질의 수축 때문에 시료의 변형을 방지할 수 있다. 건조된 막의 구조를 유지하는 것은 또한 다양한 온도(예를 들어, 실온, 4℃ 및 -20 ℃)에서 샘플 보관 및 저장에 중요하다. 폴리올은 또한 봉입된 시스템 내의 생물학적 시료 및/또는 기질 또는 다른 요소와 근접한 RI(예를 들어, 1.46 내지 1.60)를 가져야 한다. 일부 구현예에서, RI는 1.47 내지 1.54이다. 예시적인 폴리올은 글리세롤, 디글리세롤, 폴리글리세롤, 폴리비닐 알콜, 당, 예컨대 만니톨, 소르비톨, 에리스리톨, 티오디에탄올, 티오디프로판올 등을 포함한다. 통상적으로, 폴리올은 수용성 중합체와는 상이하다. 그러나, 특정 제제에서는 중합체 및 폴리올이 동일한 조성을 갖는 것이 고려된다. 중합체 및 폴리올의 분자량은 동일 또는 상이할 수 있다. 대표적인 구현예에서, 예를 들어, PVA는 폴리올 및 수용성 중합체 모두로서 사용될 수 있으나, 두 형태의 PVA의 분자량은 상이하다.
본원에 제공된 RIM 제제는 수용성 중합체 및 폴리올의 조합을 포함할 수 있다. 제제 중의 수용성 중합체 대 폴리올의 비는 가변적일 수 있고, 건조된 단단한 봉입제의 굴절률에 영향을 미칠 수 있다. 통상적으로, 단단한 봉입제의 제조를 위해 의도된 제제는, 0.125 이상의 수용성 중합체 대 폴리올의 중량비를 포함한다. 특정 구현예에서, 수용성 중합체 대 폴리올의 중량비는 0.125:1 내지 4:1의 범위이다. 특정 구현예에서, 수용성 중합체 대 폴리올의 중량비는; 또는 0.125: 1 내지 1:1; 1:1 내지 2:1; 2:1 내지 3:1; 또는 3:1 내지 4:1이다. 특정 제제에서, 수용성 중합체 대 폴리올의 중량비는 1:1 내지 3:1이다. 특정 제제에서, 수용성 중합체 대 폴리올의 중량비는 약 0.5:1이다.
RIM 제제는 추가로 수성 요소 (예를 들어, 물 또는 버퍼)를 포함할 수 있고, 수용성 중합체(들) 및 폴리올(들)은 수성 요소에 용해된다. 수성 요소는 생물학적 시료 및 봉입 제제의 요소를 용해 및/또는 수화시키는 역할을 한다. 당업계의 숙련자들에게 알려진 어느 생물학적으로 양립가능한 버퍼는 본원에 기재된 제제, 예를 들어, 트리스, PBS, 보레이트 등에서 사용될 수 있다. 제제의 pH가 7.4를 초과하여 유지하는 버퍼는 특히 예를 들어, 형광 염료가 존재하는 경우와 같은 특정 제제에서 유용하다.
기재된 제제는 추가적인 세정제의 필요 없이 샘플 투명성을 개선시킬 수 있다. 그러나, 세정제는 조직 샘플을 화상화하여, 화상 품질을 추가로 개선시키기 위해 선택적으로 사용될 수 있다. 따라서, 특정 구현예에서, 본원에 기재된 RIM 제제는 세정제와 함께 사용될 수 있다. 형광 물질을 포함하는 샘플에 대해서는, 많은 형광단 및 형광 단백질, 뿐만 아니라 즉석 RIM 제제와 이들의 양립가능성을 고려하면, 수성 세정제를 실행하는 것이 바람직할 수 있다. 예시적인 세정제는 예를 들어, 유기 용매-계 및 수성 계면활성제-계 시약, 글리세롤 또는 티오글리세롤 용액, 단당류 및 다당류(예를 들어, 과당 및 자당), 우레아 용액, 및 상업적으로 이용가능한 시약을 포함한다.
본원에 제공된 RIM 제제는 2-3일의 짧은 기간 동안 샘플에 침전물을 형성하는 것으로 알려진 통상 사용되는 봉입제와는 반대로, 침전물 형성에 대항한다. 본원에 기재된 RIM 제제는 또한 샘플 및/또는 (존재하는 경우) 형광 표지 물질이 광퇴색되는 것을 방지한다. 형광 염료로 염색된 생물학적 시료를 봉입 및 화상화하는데 적합한 제제는, 저장 또는 조사시 염색된 샘플의 분해 또는 광퇴색을 최소화하기 위해 선택적으로 페이딩 방지(antifade) 시약을 추가로 포함할 수 있다. 따라서, 특정 구현예에서, 본원에 제공된 RIM 제제는 하나 이상의 페이딩 방지 시약을 선택적으로 포함하고, RIM 제제 중에 약 1 wt.% 이하로 포함될 수 있다. 페이딩 방지 시약은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 6-히드록시-2,5,7,8-테트라메틸크로만-2-카르복실산, 3-카르복시 프록실, 히드로퀴논, 메퀴놀, 소듐 설파이트, 소듐 에리토르베이트, 아스코르브산, 프로필 갈레이트, 카페산, 파라페닐렌디아민, 1,4-디아자비시클로[2.2.2]옥탄], 다른 니트록시드, 또는 이들의 조합과 같은 항산화제를 포함한다.
RIM 제제는 추가로 예를 들어, 보존제와 같은 추가적인 요소를 포함하여, 연장된 저장 동안 중합체 및/또는 폴리올의 분해를 방지하거나 및/또는 박테리아 생장을 방지 또는 최소화할 수 있다. 적합한 보존제는 유의한 양의 가시광을 흡수하지 않거나, 또는 제제의 RI를 낮추지 않는 것들을 포함할 수 있다. 대표적인 보존제는 예를 들어, 소듐 벤조에이트, 벤조산 또는 소듐 아지드를 포함하고, 통상적으로 2 중량% 미만의 농도의 제제 중에 존재한다. 추가적인 요소, 예컨대 염료도 또한 본원에 제공된 RIM 제제 중에 포함될 수 있다. 특정 구현예에서, RIM 제제는 세포를 염색하기 위하여 형광 염료를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 예를 들어, 훼스트(Hoechst) 33342 또는 DAPI와 같은 염료는 세포의 핵을 염색할 수 있다.
RIM 봉입 매체 중의 기질 상에 봉입된 샘플도 또한 제공된다. 예를 들어, 생물학적 시료는 기질 상에 봉입되고, 본원에 제공된 바와 같이 RIM 제제 중에 포매될 수 있다. 기질은 RIM 용액을 지지하거나 또는 함유하기에 적합한 표면을 갖는 임의의 물질일 수 있다. 예를 들어, 기질은 매끈하거나 또는 거친 표면을 가질 수 있으며, 평평하거나, 또는 공동 또는 함몰부(예를 들어, 제제를 함유하기 위한 웰)을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 기질은 비교적 매끈하고 비-다공성의 표면을 가져서, RIM 용액이 기질에 흡착되지 않는다. 기질은 광학적으로 투명 또는 불-투명할 수 있고, 궁극적인 최종 용도에 따라서 다양한 물질로 제조될 수 있다. 현미경 적용을 위해서는, 예를 들어, 기질은 광학적으로 투명할 수 있다. 기질은 예를 들어, 유리 또는 중합체를 포함하는 임의의 적당한 물질로 제조될 수 있다. 대표적인 기질은 광학적 및 화상화 적용에서 통상 사용된 것들, 예컨대 예를 들어, 현미경 슬라이드, 큐벳, 웰, 커버슬립 또는 디쉬를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 봉입된 샘플은 투명 기질 (예를 들어, 현미경 슬라이드), 생물학적 시료 (예를 들어, 조직), 및 샘플을 둘러싸고 이를 기질에 부착시키는 고체화된 RIM 제제를 포함할 수 있다. 선택적으로, 커버슬립은 고체화된, 봉입된 샘플 위에 배치될 수 있다. 봉입된 슬라이드 상의 고체화된 제제의 양은 생물학적 시료를 둘러싸고 이를 기질 및/또는 커버슬립에 접착시키기에 충분하다.
본원에 기재된 봉입된 생물학적 샘플은, 실온 이하에서 저장되는 경우 샘플 또는 (존재하는 경우) 형광 염색을 분해시키거나 또는 페이딩시키지 않고, 수개월 동안 (예를 들어, 5 개월 이상) 안정될 수 있다.
샘플은 조직, 세포, 혈액 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 생물학적 물질일 수 있다. 생물학적 샘플은 기질 상에 봉입되기 전에 형광 염료(들) 또는 형광 단백질로 염색될 수 있다. 생물학적 샘플을 염색하는데 적합한 형광 단백질은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, GFP, RFP, mCherry 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 생물학적 시료에 통상 사용되는 형광 염료는 예를 들어, 보론 디피로메텐(4,4-디플루오로-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센), 시아닌, 잔텐, 설포네이트화 피렌, 로다민, 쿠마린, 및 이들의 유도체를 포함한다. 예시적인 유기 염료는 보디피(BODIPY) 염료, 쿠마린[예를 들어, 퍼시픽 블루(PACIFIC BLUE), 퍼시픽 그린(PACIFIC GREEN) 및 퍼시픽 오렌지(PACIFIC ORANGE)(Thermo Fisher Scientific 사; Waltham, MA)), 로다민, 로돌, 플루오레세인, 티오플루오레세인, 아미노플루오레세인, 카르복시플루오레세인, 클로로플루오레세인, 메틸플루오레세인, 술포플루오레세인, 아미노로돌, 카르복시로돌, 클로로로돌, 메틸로돌, 술포로돌; 아미노로다민, 카르복시로다민, 클로로로다민, 메틸로다민, 술포로다민, 실리콘 로다민, 및 티오로다민, 시아닌, 인도카보시아닌, 옥사카보시아닌, 티아카보시아닌, 메로시아닌, 시아닌(예를 들어, 시아닌 2, 시아닌 3, 시아닌 3.5, 시아닌 5, 시아닌 5.5, 시아닌 7), 옥사디아졸 유도체, 피리딜옥사졸, 니트로벤족사디아졸, 벤족사디아졸, 피렌 유도체, 캐스캐이드 블루, 옥사진 유도체, 나일 레드, 나일 블루, 크레실 바이올렛, 옥사진 170, 아크리딘 유도체, 프로플라빈, 아크리딘 오렌지, 아크리딘 옐로우, 아릴메틴 유도체, 잔텐 염료, 설포네이트화 잔텐 염료, 설포네이트화 피렌, 아우라민, 크리스탈 바이올렛, 말라카이트 그린, 테트라피롤 유도체, 포르피린, 프탈로시아닌, 빌리루빈 및 비스-벤즈이미드[훼스트 염색(Hoechst stains)]를 포함한다. 특정 구현예에서, 유기 염료는 근-적외 염료, 예를 들어, Cy5.5 (GE Healthcare Life Sciences 사; Pittsburgh, PA), IRDYE 800 (Li-Cor 사; Lincoln, NE), DyLight 750 (Thermo Fisher Scientific 사) 또는 인도시아닌 그린(ICG), 또는 시아닌 염료, 예컨대, 시아닌 2, 시아닌 3, 시아닌 3.5, 시아닌 5, 시아닌 5.5, 시아닌 7이다. 특정 구현예에서, 유기 염료는 잔텐 또는 설포네이트화 잔텐 염료, 예컨대 알렉사 플루오르(ALEXA FLUOR) 594, 알렉사 플루오르 633, 알렉사 플루오르 647 및 알렉사 플루오르 700(Thermo Fisher Scientific 사)의 상표명 하에 상업적으로 이용가능한 것들이다. 적합한 상업적으로 이용가능한 염료의 추가적인 예는 알렉사 플루오르 405, 알렉사 플루오르 488 및 알렉사 플루오르 플러스 2차 항체(Thermo Fisher Scientific 사)를 포함한다.
봉입된 샘플은 직접 조사될 수 있거나, 또는 본원에 기재된 방법을 사용하여 경화되어, 고체화된 봉입제에 포매되는 생물학적 시료를 제공할 수 있다. 유리하게는, 봉입 및 경화된 샘플의 굴절률은 기질(예를 들어, 현미경 슬라이드) 및 커버슬립의 RI와 매칭되고, 보통 1.47를 초과하고, 통상적으로 1.48 내지 1.54의 범위이다. 예를 들어, 시료를 함유하는 고체화된 봉입제는 1.48 내지 1.54 (예를 들어, 1.48 내지 1.50; 또는 1.50 내지 1.52; 또는 1.52 내지 1.54)의 범위일 수 있는 굴절률을 가질 수 있다.
생물학적 시료를 기질 상에 봉입하는 방법이 추가로 본원에 제공된다. 대표적인 방법은 생물학적 시료를 기질 상에 두는 단계, 및 이후 생물학적 시료를 RIM 용액과 접촉시켜 봉입된 샘플을 제공하는 단계를 포함한다. 일단 봉입되면, 샘플은 직접 조사(예를 들어, 현미경을 사용한 화상화)될 수 있다. 그러나, 샘플은 사용 및 추후 저장 동안 보호하기 위하여 통상 (예를 들어, 커버슬립으로) 덮힌다. 생물학적 시료를 함유하는 제제는 이후 화상화되거나 또는 추후 건조될 수 있다. 샘플 건조(또한, 본원에서 "경화(curing)"라고도 지칭함)는 RIM 제제로부터 물을 제거함으로서, 봉입제를 경화시킨다. 수용성 중합체를 포함하는 제제에 대하여, 물의 제거는 본원에서 "단단한 봉입제(hard mountant)" 또는 "단단한-봉입(hard-mount)" 제제로서 지칭되는 고체화된 제제를 제공한다. 경화된 봉입제가 여전히 특정 수준의 점도 및/또는 탄성을 유지할 수 있어서, 약해지거나 또는 균열이 생기지 않는다는 것은 명백할 것이다.
제제의 타입 및 경화의 원하는 수준에 따라서, 봉입된 샘플에 다양한 상이한 경화 요법들이 실시될 수 있다. 특정 제제를 경화시키는데 요구되는 온도 및 시간은, 예를 들어, 제제 중의 수용성 요소의 타입, 분자량 및 농도, 뿐만 아니라 경화의 원하는 수준을 포함하는 다양한 인자에 따라 달라진다. 또한, 경화를 위한 조건은 샘플이 커버슬립으로 덮여있는지 또는 공기에 개방되어 있는지에 따라 달라진다.
건조는 주위 온도(예를 들어, 실온) 또는 고온에서 수행될 수 있다. 특정 구현예에서, 경화는 약 40℃ 미만의 온도에서 발생하여, 생물학적 시료에 대한 손상 및/또는 제제 중의 수용성 요소의 분해를 방지한다. 수용성 중합체를 함유하는 제제에서, 중합체는 24시간 이하; 또는 일부 경우에 10시간 이하; 또는 심지어 4시간 이하 내에 고체화될 수 있다. 20 kDa 이상의 분자량을 갖는 수용성 중합체를 포함하는 특정 제제에서는, 본원에 기재된 바와 같이, 건조가 약 40℃ 미만의 온도에서 4시간 이하 내에 커버슬립의 부재 하에 달성될 수 있다.
본원에 제공된 봉입 제제는 조직 및 혈액을 포함하는, 혈액학적, 조직학적 및 세포학적 샘플을 현미경 슬라이드 상에 봉입시키는 것을 포함하나 이에 제한되지 않는, 다양한 조직화학, 면역화학 및 세포화학 적용에 사용될 수 있다. 기재된 RIM 제제는 기질 상에 봉입된 시료, 예컨대 혈액, 세포, 조직, 또는 연구 및/또는 진단 목적을 위한 현미경 평가를 용이하게 하기 위해 염색된 물질을 포함하나 이에 제한되지 않는 다른 생물학적 유체 또는 물질의 샘플을 제공하는데 사용될 수 있다. 본원에 기재된 방법에 의해 제조된 봉입된 생물학적 시료는 당업계에 잘-알려진 화상화 기술을 사용하여 시각화될 수 있다. 화상화는 예를 들어, 광학 현미경을 사용하여 수행될 수 있다. 본원에 기재된 봉입 제제의 높은 RI 및 광학적 투명성은 생물학적 샘플이 표준 봉입제를 사용한 경우보다, 더 깊이(예를 들어, 100 m 이하; 예를 들어 1-100 m) 그리고 더 높은 해상도로 화상화될 수 있게 한다. 예를 들어, 형광 표지된 표적은 100 m까지 검출가능하며, 해상도는 유사한 깊이로 유지된다.
샘플은 표준 ICC/IHC 프로토콜을 사용하여 제조될 수 있다. 봉입 이전에 알콜(예를 들어, 메탄올 및 에탄올)에서 추가로 탈수시키면 건조 시간을 단축시킬 수 있다. 샘플 봉입 이후 건조제의 존재 하에 건조시키는 것도, 또한 건조 시간을 줄여줄 수 있다. 샘플은 봉입제로 코팅되어 이를 덮고, 커버슬립 없이 건조될 수 있다. 봉입된 샘플은 이후 커버슬립 없이 직접 화상화되거나, 또는 소량의 글리세롤로 커버되어, 화상화 이전에 커버될 수 있다. 용액- 또는 현탁액-계 샘플 및 조직 샘플을 포함하나 이에 제한되지 않는, 임의의 적합한 생물학적 샘플은 본원에 기재된 방법을 사용하여 평가될 수 있다. 특정 구현예에서, 샘플은 세포 또는 소화된 세포 및 이의 단편을 포함한다. 세포는 사멸되거나(예를 들어, 고정되거나) 또는 살아있을 수 있다. 본원에 기재된 RIM 제제로 처리될 수 있는 생물학적 물질의 추가적인 예는 3D 세포 배양물(스페로이드/오가노이드) 또는 모든 생물체(예를 들어 초파리, 벌레, 제브라 피쉬)를 포함한다.
본원에 기재된 RIM 제제는 목적 구조의 투명성, 선명성(definition) 또는 해상도를 잃지 않고도 식물, 미생물, 동물, 토양, 혈액 및 혈장 샘플을 포함하나 이에 제한되지 않는 상이한 물질, 및 토양 입자 및 지질학적 샘플을 포함하나 이에 제한되지 않는 다른 타입의 비-생존 유기 및 무기 물질의 특성을, 식별하기 위해 사용될 수 있다.
세포에서 상이한 요소들을 식별하기 위하여, 염색제는 이들의 화학적 조성에 기초하여 특정 구조들 간의 대비를 제공하기 위해 사용될 수 있다. 본원에 기재된 RIM 용액은 세포를 염색하는데 통상 사용되는 형광 염료에 의하여 교란되지 않는다. 따라서, 특정 구현예에서, 생물학적 시료는 본원에 기재된 것들을 포함하나 이에 제한되지 않은 형광 염료에 의해 표지될 수 있다. 예를 들어, 샘플은 특이적인 친화성 분자(예를 들어, 항체)에 의해 인식되어 이에 결합할 수 있는 표면 항원(예를 들어, 세포 표면 수용체)을 발현시키는 세포를 포함할 수 있다. 세포는 세포 표면 상에 항원을 결합시키기 위한 조건 하에서, 친화성 분자(예를 들어, 항원)에 부착된 형광단을 포함하는 접합체로 처리되어, 접합체로 표지된 세포를 형성할 수 있다. 대안적으로, 형광단은 세포 내에, 예를 들어, 세포질 내에, 또는 세포소기관 또는 세포막 내에 함유될 수 있다. 추가로, 본원에 제공된 RIM 제제는 염색된 세포 및 조직의 화상화에 사용될 수 있고, 형광 면역조직화학(IHC) 적용에 특히 유용하다.
시료를 제조하는 일반적 방법은 선택적으로 염색될 수 있는 시료를, 충분한 양의 봉입 용액에 담그어, 시료를 용액 내에 완전히 침지시키는 것에 관한 것이다. 시료는 이후 기질(예를 들어, 현미경 슬라이드, 큐벳, 또는 웰)에 적용된다. 선택적으로, 봉입된 시료는 경화될 때까지 (예를 들어 실온내지 최대 약 40℃에서) 건조될 수 있다. 커버슬립은 샘플을 경화하기 이전 또는 이후에 시료 위에 적용될 수 있다. 경화된 봉입 샘플은 무기한 저장될 수 있다. 대안적으로, 봉입된 샘플은 조사될 수 있는데, 예를 들어, 현미경 하에 시각화될 수 있다. 봉입 제제는 형광 현미경 및 대상체, 예컨대 에피-형광, 광대역, 공초점, 자극방출고갈(stimulated emission depletion, STED) 및 구조화 조명 현미경(structured illumination microscope, SIM)과 양립가능하다. RIM 제제의 우수한 광학적 특성 때문에, 시료는 선명하게 보이고, 선명성을 잃지 않고도 세포 및 더 심부층 조직의 시각화가 가능해진다.
기재된 RIM 제제는 또한 기질 상에 조직 샘플을 봉입시키는데 이상적으로 적합하다. 전체 조직 봉입 및 화상화는 최근까지 난제였는데, 이는 샘플 두께, 세포외 물질의 존재, 및 시약 침투가 배경 형광 및 불량한 화상 해상도, 및 화상화 깊이 감소를 야기할 수 있기 때문이다. 기재된 제제는 이것이 커버슬립 및 조직 샘플을 통과할 때 빛의 굴절을 감소시킴으로서, 더 높은 해상도 및 더 깊게 화상화하는 능력을 생성할 수 있다. 기재된 제제가 샘플 투명성을 개선시키기 때문에, 이들은 특히 조직 샘플과 함께 사용하기에 유리하다.
대표적인 방법은 본원에 기재된 바와 같이 RIM 제제를 사용하여, 조직 샘플을 현미경 슬라이드 상에 봉입시키기 위해 제공된다. 조직은 고정되거나 또는 고정되지 않을 수 있는, 단편화되거나 또는 전체 샘플일 수 있다. 일반적으로, 조직 샘플은 현미경 슬라이드의 표면에 놓이고, 본원에 기재된 RIM 제제가 상기 샘플에 적용된다. 봉입된 샘플은 이후 과도한 물을 제거하도록 건조되어, 제제가 고체화된다. 상기 방법에 사용된 봉입 매체의 양은 가변될 수 있으나, 일반적으로 조직의 표면을 습윤시키도록 선택된다. 과도한 봉입 매체는 원하는 경우 공지의 방법을 사용하여 제거될 수 있다. 일단 슬라이드 표면에 봉입되면, 봉입된 샘플은 (예를 들어, 실온에서 또는 고온에서) 가열을 적용하여 또는 가열 없이 건조될 수 있다. 건조는 진공 펌프 및/또는 건조제를 사용함으로서 가속될 수 있다. 일단 건조되면, 조직은 슬라이드에 견고하게 부착되고, 샘플은 봉입제 내에 포매될 것이다. 필요한 경우, 추가적인 양의 제제가 첨가될 수 있고, 건조 과정이 반복될 수 있다.
샘플의 추후 화상화 및/또는 저장을 위하여 생물학적 샘플을 기질에 봉입하기 위한 키트가 본원에 추가로 제공된다. 따라서, 또 다른 구현예에서, 생물학적 시료를 기질 상에 봉입하기 위한 키트가 제공되는데, 이는 본원에 기재된 굴절률 매칭(RIM) 용액; 및 생물학적 시료를 기질 상에 봉입하기 위한 지침을 포함한다. 추가적인 요소는 선택적으로 예를 들어, 공-봉입제(co-mountant), 예컨대 글리세롤을 포함하는 키트 내에 포함될 수 있다.
이하의 실시예는 본 발명의 특정 구현예를 입증하기 위해 포함된다. 당업계의 숙련자들에게는, 이하의 본 실시예에 기재된 기술이 본 발명의 실행시 잘 기능한다고 본 발명자(들)에게 발견된 기술을 나타내며, 따라서 이의 실행을 위한 바람직한 모드를 구성하도록 고려될 수 있다는 것이 명백할 것이다. 그러나, 당업계의 숙련자들은 본 기재 내용에 대하여, 많은 변형들이 기재된 특정 구현예에서 이루어질 수 있고, 여전히 본 발명의 범주에서 벗어나지 않고도 동일 또는 유사한 결과를 얻을 수 있다는 사실을 인지해야만 한다.
실시예
본원에 제공된 실시예는 달리 기재된 바 없는 경우 이하의 일반적인 방법을 사용한다. 건조 전 후의 모든 봉입제 제제의 굴절률은 램프 작동 파장 소듐 D 라인(589.3 nm)이 장착된 ABBE-3L 굴절계(Thermo Fisher Scientific 사)에 의해 측정된다. 폴리(N-메틸 메타크릴아미드)(PMMAm)의 분자량은 중량 평균 분자량(Mw)으로 보고되며, 이는 용출액으로서 5 mM LiBr 메탄올/디메틸포름아미드 (50/50 v/v%), Wyatt Technology Corporation 사의 miniDAWN® TREOS® 다-각도 광 산란(MALS) 및 Optilab® T-rEX 차동 굴절계 검출기(Santa Barbara, CA)를 갖는 TSkgel® HHr 유기 크기 배제 컬럼(TOSOH Bioscience LLC 사, King of Prussia, PA)를 사용하여 표준 겔 투과 크로마토그래피(GPC) 방법에 의해 측정된다.
실시예 1
봉입제 샘플의 굴절률 측정
건조된 샘플 상의 굴절률 측정은 300 L의 샘플을 굴절계 프리즘으로 조심스럽게 확산시킨 후, 봉입제를 최대 24시간 동안 건조시킴으로서 측정된다. 굴절률은 일단 봉입제 용액이 투명한 막으로 건조되면 측정된다.
실시예 2
봉입 절차
생물학적 시료(예를 들어, 30 μm 미만의 두께를 갖는 배양된 단층 세포 및 조직 단편)은 충분한 양의 봉입제, 통상적으로 1 내지 3 방울(30 내지 100 L)를 충분히 커버되거나 또는 침지될 때까지 기질 상에 놓인 시료에 적용함으로서 기질에 봉입된다. 생물학적 시료는 염색되지 않을 수 있거나, 또는 당업계에 잘 알려진 절차를 사용하여 봉입 전에 염색될 수 있다. 이후, 시료를 18 mm x 18 mm 커버슬립으로 덮고, 임의의 과도한 봉입제를 커버슬립의 가장자리로부터 닦아내거나 또는 피펫팅한다. 봉입된 시료는 24-96시간 동안 실온에서 건조되지만, 40℃만큼 높은 온도도 허용가능하다. 봉입된 시료가 완전히 건조된 후, 시료는 당업계의 숙련자에게 잘 알려진 형광 현미경 기술을 사용하여 화상화될 수 있다. 대안적으로, 봉입된 시료는 커버슬립을 적용하기 전에 건조될 수 있다. 커버슬립 없이 건조하는 것은 단단한 경화성(hard set) 봉입제의 건조를 가속시킬 수 있다. 커버슬립 없이, 건조는 40℃에서 약 30분, 내지 실온에서 약 4시간이 걸릴 수 있다. 봉입제가 건조된 이후, 커버슬립은 접촉 액체, 예컨대 물, 추가적인 봉입제, 에탄올 또는 글리세롤을 건조된 봉입제 상에 둔 후, 커버슬립을 시료 위에 둠으로서, 봉입된 시료에 대해 적용될 수 있다.
이하의 프로토콜은 30-100 μm 및 더 두꺼운 생물학적 시료를 봉입하는데 사용될 수 있다. 커버슬립을 봉입하기 전에 봉입제를 2시간 동안 실온으로 가온시킨다. 커버슬립 또는 슬라이드의 가장자리를 실험실 물수건(laboratory wipe) 위에서 가볍게 탭핑함으로서, 액체를 샘플로부터 제거한다. 슬라이드-봉입된 시료에 대해서는, 2-3 방울 또는 60-100 μL의 봉입제를 시료에 직접 적용한 후, 커버슬립을 봉입제로 조심스럽게 내려서, 임의의 공기 거품을 포획하는 것을 피한다. 웰 플레이트 또는 배양 디쉬에서 염색된 시료에 대해서는, 샘플을 현미경 슬라이드에 조심스럽게 옮긴다. 10 μL의 봉입제를 슬라이드에 첨가하면, 샘플을 제자리에 맞게 조절하는데 도움을 줄 수 있다. 3-D 배양된 세포 또는 스페로이드에 대해서는, 팁의 말단이 제거된 1mL 피펫을 사용하여 3-D 배양물 또는 스페로이드를 현미경 슬라이드로 옮긴다. 3-D 배양물을 버퍼와 함께 적당한 스페이서를 포함하도록 제조된 현미경 슬라이드 상에 두어, 샘플의 무결성을 보장한다. 스페이서는 필요한 봉입제의 부피를 최소화하면서도 샘플을 위한 충분한 공간을 허용해야 한다. 개방된 가장자리를 허용하는 스페이서는 샘플의 경화 시간을 단축시킨다. 필요한 경우, 커버슬립을 가볍게 탭핑하여 공기 방울을 제거한다. 봉입제가 커버슬립의 가장자리에 충진되지 않는 경우, 피펫을 사용하여 추가적인 봉입제를 커버슬립 하에 적용한다. 가볍게 탭핑하여, 공기 방울을 샘플 주변으로부터 제거한다. 샘플을 충분히 덮는데 실패하게 되면 봉입제 수축을 유도하고, 화상화 영역을 감소시킬 수 있다. 봉입된 샘플을 평평하고, 건조한 표면 상에 놓고, 실온의 어두운 곳에서 이를 경화시킨다. 최적 결과를 위해서는, 샘플을 적어도 48시간 동안 경화시킨다.
30-100 μm 및 더 두꺼운 시료의 경우는 이하의 프로토콜을 사용하여 더욱 신속하게 경화될 수 있다. 커버슬립을 봉입하기 전에 봉입제를 2시간 동안 실온으로 가온시킨다. 실험실 물수건 상에서 커버슬립 또는 슬라이드의 가장자리를 가볍게 탭핑함으로서, 과도한 액체를 샘플로부터 제거한다. 슬라이드-봉입된 시료에 대해서는, 2-3 방울 또는 60-100 μL의 봉입제를 시료에 직접 적용한다. 슬라이드를 조심스럽게 앞뒤로 기울여, 상기 봉입제를 시료에 대해 고르게 분배한다. 2-3 방울 또는 60-100 μL의 봉입제를 18 mm × 18 mm의 영역에 대해 확산시키는 것을 목표로 한다. 피펫 팁의 가장자리를 사용하여, 임의의 방울을 제거하고 봉입제를 확산시키는 것을 조심스럽게 돕는다. 웰 플레이트 또는 배양 디쉬 내의 염색된 시료에 대해서는, 샘플을 현미경 슬라이드로 조심스럽게 옮긴다. 10 μL의 봉입제를 슬라이드에 첨가함으로서, 샘플을 제자리에 맞게 조절하는데 도움을 줄 수 있다. 3-D 배양된 세포 또는 스페로이드에 대해서는, 팁의 말단을 제거한 1-mL 피펫을 사용하여, 3-D 배양물 또는 스페로이드를 현미경 슬라이드로 옮긴다. 3-D 배양물을 버퍼와 함께 적당한 스페이서가 포함되도록 제조된 현미경 슬라이드 상에 두어, 샘플의 무결성을 보장한다. 스페이서는 필요한 봉입제의 부피를 최소화하면서도 샘플을 위한 충분한 공간을 허용하여야 한다. 과도한 버퍼를 배양물로부터 제거한 후, 스페이서 높이 및 표면적에 따라서, 2-3 방울 또는 60-100 μL의 봉입제를 시료에 직접 적용한다. 이 시점에서 커버슬립을 적용하지 않는다. 샘플을 커버슬립 없이 16-24시간 동안 실온에서 경화하고, 광으로부터 보호한다. 16-24시간 이후, 10 μL의 글리세롤을 경화된 봉입제 및 시료의 상부 전체에 적용한다. 커버슬립을 적용하여, 제자리에 맞게 누르고, 탭핑을 하여 (존재하는 경우) 거품을 제거한다. 커버슬립을 1-3시간 동안, 또는 커버슬립이 더 이상 움직이지 않을 때까지, 제자리에 맞게 경화시킨다.
실시예 3
폴리비닐 피롤리돈(PVP)을 갖는 봉입 매체의 제제화
봉입 매체는 0.50 g의 글리세롤(Fisher Scientific 사, Fair Lawn, NJ), 1.00 g의 PVP(Mw = 55,000 g/mol; TCI America Portland 사, OR), 61 mg의 2-아미노-2-(히드록시메틸)-1,3,프로판디올(TIRS 염기; Sigma-Aldrich 사, St. Louis, MO) 및 3.8 mL의 탈이온수를 자석 교반 바가 장착된 20 mL 신틸레이션 바이알에 첨가하여 제제화하였다. PVP의 완전 용해가 관찰될 때까지, 용액을 60℃ 수조에서 500 rpm로 교반하고, 가열하였다. 중합체 용해 이후, 상기 바이알을 사용 전에 실온으로 냉각하였다. RI는 실시예 1에 기재된 바와 같이 측정하였다(표 1, 샘플 2 참고).
실시예 4
폴리비닐 알콜(PVA)를 갖는 봉입 매체의 제제화
봉입 매체는 0.50 g의 글리세롤, 61 mg의 TRIS 염기, 1.00 g의 PVA(Mw ~ 23,000 g/mol; Sekisui America Corporation 사, Secaucus, NJ, USA) 및 3.8 mL의 탈이온수를 자석 교반 바가 장착된 20 mL 신틸레이션 바이알에 첨가하여 제제화하였다. PVA의 완전 용해가 관찰될 때까지, 용액을 실시예 3에 기재된 바와 같이 교반 및 가열하였다. 중합체 용해 후에, 바이알을 사용 전에 실온으로 냉각하였다. RI는 실시예 1에 기재된 바와 같이 측정하였다(표 1, 샘플 8 참고).
실시예 5
폴리(N-메틸 메타크릴아미드)(PMMAm)를 갖는 봉입 매체의 제제화
봉입 매체는 0.50 g의 글리세롤, 61 mg의 TRIS 염기, 1.00 g의 PMMAm(Mw = 100,000 g/mol) 및 3.8 mL의 탈이온수를 자석 교반 바가 장착된 20 mL 신틸레이션 바이알에 첨가하여 제조하였다. PMMAm 완전 용해가 관찰될 때까지, 용액을 실시예 3에 기재된 바와 같이 교반 및 가열하였다. 중합체 용해 후에, 바이알을 사용 전에 실온으로 냉각하였다. RI는 실시예 1에 기재된 바와 같이 측정하였다(표 1, 샘플 14 참고).
실시예 6
다양한 중합체/글리세롤 중량비를 갖는 봉입 매체의 제제화
봉입 매체는 실시예 3-5에 기재된 바와 같이, PVP, PVA 및 PMMAm을 수용성 중합체로서 사용하여 제제화하였다. 또한, 중합체 대 글리세롤의 중량비는 0.5 내지 2.0으로 변화시켰다. 봉입제의 최종 부피는 탈이온수로 5 mL의 일정한 부피까지 희석하였다. 중합체의 완전 용해가 관찰될 때까지, 용액을 실시예 3에 기재된 바와 같이 교반 및 가열하였다. 중합체 용해 이후, 바이알은 사용 전에 실온으로 냉각시켰다. RI는 실시예 1에 기재된 방법에 따라 측정하였다(표 1 참고, PVP에 대해서는 샘플 1, 2, 3 및 4; PVA에 대해서는 샘플 7, 8 및 10; 및 PMMAm에 대해서는 샘플 14, 15, 17, 18 및 20). 표 1에서의 샘플 1, 2, 3, 4, 7, 8, 10, 14, 15, 17, 18 및 20에 대한 데이터를 참고하면, 건조된 봉입 매체의 RI는 중합체 대 글리세롤의 비가 증가함에 따라 상당히 증가하며, 이는 문헌에서 보고된 시험된 중합체의 RI(즉, 1.530 PVP; 1.50 PVA; 및 1.540 PMMAm)가 순수한 글리세롤(1.4722 @ 25℃)의 경우를 초과하기 때문으로 예상되었다. 그러나, 일단 중합체 농도가 특정 역치 값을 초과하면, 건조된 봉입제의 물리적 및 광학적 특성이 상당히 나빠지고, 중합체에 따라서는, 심지어 현미경 적용에 사용할 수 없게 되는 막이 생성될 수 있다는 것이 밝혀졌다(예를 들어, 샘플 23 참고). 그러나, 제제 중의 과다한 폴리올은 기름기 많고 또는 오일성인 건조된 물질을 생성할 수 있고, 커버슬립은 샘플에 잘 부착되지 않을 것이다. 특정 중합체(예를 들어, PVP 및 PVA)에 대하여, 이 역치 값은 약 0.125:1 이상이고, 사용가능한 높은 RIM 막을 생성하기 위해 단지 소량의 중합체만이 필요하다. 그러나, 다른 중합체에 대해서는, 제제 중의 과다한 중합체는 불량한 막 품질을 발생시키고, 다른 단점을 나타낼 수 있다. PMMAm을 구현하는 제제에 대해서는, 예를 들어, 제제 중에 일부 폴리올이 존재하면 중합체를 가소화하는데 도움을 주어, 특히 더 낮은 온도에서 저장되는 경우 이것이 너무 약하거나 또는 균열되지 않게 된다. 따라서, PMMAm-계 제제에 대해서는, 수용성 중합체 대 폴리올의 중량비는 약 4:1 이하이다(예를 들어, 0.125:1 내지 4:1). 중합체 타입과 무관하게, 폴리올은 또한 일부 수준의 영구적인 부피를 건조된 봉입제에 부여할 수 있고, 생물학적 샘플(예를 들어, 세포)이 너무 많이 압축되는 것을 방지할 수 있다. 예를 들어, 비록 폴리올이 없는 PVA 막이 건조시 통상적으로 균열되기는 하지만, 상기 막은 과도하게 수축되어, 세포가 압축된다.
실시예 7
다양한 중합체/디글리세롤 중량비를 갖는 봉입 매체의 제제화
봉입 매체는 디글리세롤(Alfa Aesar 사, Tewksbury, MA)이 글리세롤 대신에 폴리올로서 사용된 점을 제외하고는, 실시예 6에 기재된 바와 같이 제제화하였다. 중합체 대 디글리세롤의 중량비는 0.5 내지 2.0으로 변화시켰다. 봉입제의 최종 부피는 탈이온수로 5 mL의 일정한 부피까지 희석하였다. 용액은 중합체의 완전 용해가 관찰될 때까지, 실시예 3에 기재된 바와 같이 교반 및 가열하였다. 중합체 용해 후에, 바이알은 사용 전에 실온으로 냉각시켰다. RI는 실시예 1에 기재된 방법에 따라 측정하였다(표 1 참고, PVP에 대해서는 샘플 5 및 6; PVA에 대해서는 샘플 9, 11 및 12; 및 PMMMAm에 대해서는 샘플 13, 16, 및 19). 표 1를 참고하면, 건조된 봉입 매체의 RI는 중합체 대 디글리세롤의 비가 증가함에 따라 높아졌으며, 이는 시험된 중합체의 RI가 순수한 디글리세롤(20℃에서 1.4850)에 대해서는 이를 초과하기 때문이다. 또한, 디글리세롤에 의해 제조된 봉입 매체는 글리세롤을 사용하여 제조된 경우보다 약간 더 높은 RI를 갖는다.
실시예 8
다양한 중합체 분자량을 갖는 봉입 매체의 제제화
봉입 매체는 중합체의 중량이 다음과 같이 변화시킨 점을 제외하고는, 실시예 3-5에 기재된 바와 같이 제제화하였다: PVP(10,000 g/mol 내지 55,000 g/mol); PVA(13,000 g/mol 내지 31 000 g/mol); 및 PMMAm(33,000 g/mol 내지 100,000 g/mol). 중합체 대 폴리올의 중량비는 0.5 내지 2.0으로 변화시켰. 봉입제의 최종 부피는 탈이온수로 5 mL의 일정한 부피까지 희석하였다. 용액을 중합체의 완전 용해가 관찰될 때까지, 실시예 3에 기재된 바와 같이 교반 및 가열하였다. 중합체 용해 후, 바이알은 사용 전에 실온으로 냉각시켰다. RI는 실시예 1에 기재된 방법에 따라 측정하였다(표 1 참고, PVP에 대해서는 샘플 1-6; PVA에 대해서는 샘플 7-12; 및 PMMMAm에 대해서는 샘플 13-20). 흥미롭게도, 중합체의 분자량은 폴리올 타입 및 중합체 대 폴리올 비가 일정하게 유지되는 경우, RI에 대해 통계적으로 유의한 효과를 갖지 않았다.
실시예 9
단지 중합체 만을 갖는 봉입 매체의 제제화
봉입 매체는 글리세롤 또는 디글리세롤 첨가제가 제제에서 생략된 점을 제외하고는, 실시예 3-5에 기재된 것과 같이 제조하였다. 봉입제의 최종 부피는 탈이온수로 5 mL의 부피까지 희석하였다. 용액은 중합체의 완전 용해가 관찰될 때까지, 실시예 3에 기재된 바와 같이 교반 및 가열하였다. 중합체의 용해 이후, 사용 전에 바이알을 실온으로 냉각시켰다. RI는 실시예 1에 기재된 방법에 따라 측정하였다(표 1, 샘플 21-23 참고). 샘플 23의 RI는 건조된 봉입제의 균열 때문에 측정할 수 없었다(NM). 글리세롤 또는 디글리세롤이 없는 샘플에 대한 데이터는, 제제 중의 폴리올의 존재가 막이 너무 약하거나 또는 과도하게 수축되는 것을 방지할 수 있다는 것을 나타내는데, 이는 폴리올이 건조된 중합체 막을 가소화시키거나 또는 연화시키기 때문일 가능성이 크다.
실시예 10
중합체 및 페이딩 방지 시약을 갖는 봉입 매체의 제제화
봉입 매체는 0.55 g의 디글리세롤, 1.10 g의 PMMAm(Mw = 60,000 g/mol), 122 mg의 2-아미노-2-(히드록시메틸)-1,3,프로판디올(TRIS 염기) 및 5.0 mL의 탈이온수를, 자석 교반 바가 장착된 20 mL 신틸레이션 바이알에 첨가함으로서 제제화하였다. PMMAm의 완전 용해이 관찰될 때까지, 실시예 3에 기재된 바와 같이, 용액을 교반 및 가열하였다. 중합체의 완전 용해 이후, 9.7 mg의 벤조산(7.94 mmol) 및 19 mg의 소듐 설파이트(15 mmol)를 각각 보존용 및 페이딩 방지 시약으로서 첨가하였다. 용액을 추가 30분 동안 60℃에서 모든 벤조산이 용해될 때까지 교반하였다. 일단 용해되면, 바이알을 실온까지 냉각시키고, 부피가 10 mL까지 되도록 탈이온수로 희석하였다. RI는 실시예 1에 기재된 방법에 따라 측정하였다(24h 이후, 21℃에서 RI = 1.5146). 이 제제에 대한 RI 값은 표 1에 제시된 샘플 18 또는 샘플 13과 가장 유사하다. 실시예 8은 MW가 통계적으로 RI 값에 영향을 미치지 않고, 디글리세롤 대 글리세롤의 사용이 RI 값을 약간 증가시킨다는 것을 나타낸다. 샘플 13과 샘플 18을 비교하면, 최근 샘플에 대한 1.5146의 값은 페이딩 방지 및 보존용 시약의 첨가가 최종적인 RI 값에 대해 (존재하는 경우) 무시할만한 효과를 나타낸다는 것을 암시한다.
실시예 11
시간의 경과에 따른 굴절률 측정
굴절률은 RI에서의 변화를 시간의 함수로서 추적하기 위하여 5일의 기간에 걸쳐 모니터링하였다. 다양한 봉입 제제는 실시예 1에 기재된 바와 같이 평가하였고, 측정은 다양한 시점에서 5일의 기간에 걸쳐 반복하였다. 굴절률은 첫 5 h 동안 극적으로 증가한 후, 편평화되어(plateaued) 24h 이후 유사하게 유지되었다(샘플 8 및 13은 도 1 참고).
실시예 12
공초점 현미경을 사용한, 축방향 해상도의 측정을 위한 서브-마이크론 형광 미소구체의 봉입
본원에 기재된 제제를 봉입하기 위하여, 다양한 초점 깊이에서의 축방향 해상도는, 반-해상도 형광 미소구체의 점상 강도 분포 함수(point spread function)를 사용하여, 공초점 현미경에 의해 검출하였다. PS-SpeckTM Microscope Point Source 키트(Thermo Fisher Scientific 사, Waltham, MA)로부터의 1.7 μL의 175 nm 그린 형광 미소구체(505/515 여기/방출)를, 200 μL의 봉입제 샘플에 분산시킨 후, 20분 동안 초음파 처리하였다. 초음파 처리 이후, 100 μL의 각각의 샘플을 에탄올로 세정한 18 mm x 18 mm 커버슬립에 피펫팅하고, 핀셋으로 커버슬립을 앞뒤로 기울임으로서 이를 전 면적에 확산시켰다. 봉입 매체 샘플은 커버슬립 상에서 1 h 동안 40℃에서 건조하였다. 일단 건조되면, 10 μL의 글리세롤을 슬라이드에 둔 후, 각각의 커버슬립을 글리세롤 방울에 조심스럽게 놓아 둠으로서, 커버슬립을 표준 현미경 슬라이드에 고정시켰다. 커버슬립을 실온에서 ~ 20분 동안 슬라이드 상에 고정화시켰다.
각각의 샘플에 대한 축방향 및 측방향 해상도는 공초점 현미경에 의해 결정하였다. 개별적인 미소구체의 Z-스택은 차이스™ LSM 710 공초점 현미경 상에서 Plan-Apochromat 63x/1.4 NA 오일 대물렌즈를 사용하여 수집하였고, x, y 차원에서 42 nm, 그리고 z 차원에서 100 nm의 속도로 샘플링하였다. 각각의 샘플을 화상화 하기 전에, 대물 렌즈는 1.518(23℃에서 e-라인으로 측정될 때(546 nm))의 RI를 갖는 칼 차이스 이머솔(Carl Zeiss Immersol)TM 518F 액침유(Carl Zeiss, Inc. 사, Thornwood, NY)에 의해 먼저 커버하였다. 각각의 샘플에 대하여, 포매된 미소구체는 커버슬립으로부터 100 μm까지의 범위의 초점 깊이에서 화상화하였다. 3개의 미소구체는 매 초점 깊이에서 각각의 샘플에 대하여 상이한 위치에서 봉입된 샘플의 전면(즉, 좌측, 중앙 및 우측)에 걸쳐 화상화하였다. 각각의 샘플에 대한 축방향(z) 및 측방향(x, y) 해상도는 ImageJ MetroloJ plugin을 사용하여 산출하였다. 플롯팅된 데이터(도 2 및 도 3)는 축방향 및 측방향의 해상도를 샘플 8, 10 및 13에 대한 초점 깊이의 함수로서 나타낸다. 도 2에서 볼 수 있는 바와 같이, 축방향 해상도가 개선되고(즉, 더 낮은 값을 갖고), RI는 액침유의 RI에 더 근접한다. 개선된 축방향 해상도는 샘플 13(1.5172) > 샘플 8(1.4927) > 샘플 10(1.4687)의 순서이고, 여기에서 샘플 13은 100 μm 초점 깊이에서 샘플 10 대비 1.54 배 개선된 축방향 해상도를 갖는다. 기대한 바와 같이, 각각의 초점 깊이에서 각각의 샘플 간의 측 방향 해상도 차이는 거의 없거나 전혀 없다(도 3). 중합체 타입 및 중합체/폴리올 비를 액침유의 RI의 경우에 매칭되도록 조절함으로서, 건조된 봉입 매체의 무결성을 유지하면서도 최대 축방향 해상도를 달성하도록 RI를 조절하는 것이, 본 실시예에 입증되었다.
본 명세서에 언급된 모든 미국 특허, 미국 특허 출원 공보, 미국 특허 출원, 해외 특허, 해외 특허 출원 및 비-특허 간행물은 전체가 본원에 참고로서 포함된다. 구현예의 양태들은 더욱 추가적인 구현예를 제공하기 위한 다양한 특허, 출원 및 간행물을 이용하는데 필요한 경우, 변형될 수 있다.
상기에서 상세하게 기재된 설명의 관점에서 구현예에 대한 이들 및 다른 변화가 이루어질 수 있다. 일반적으로, 이하의 항목 및 청구항에서, 사용된 용어는 본 명세서 및 청구항에 기재된 특정 구현예에 대한 항목 및 청구항을 제한하는 것으로 해석되어서는 안되고, 이러한 항목 및 청구항에 대한 균등물의 전체 범주와 함께 모든 가능한 구현예를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 따라서, 항목 및 항은 기재 내용에 의해 제한되지 않는다. 구현예는 이하의 번호가 붙은 항목에 의할 수 있다:
1. 굴절률 매칭(RIM) 용액으로서:
a) 수용성 중합체(여기에서, 상기 중합체는 0.27 내지 0.34의 몰 굴절(RLL) 대 몰 부피(Vm) 비를 가짐);
b) 폴리올(여기에서, 상기 수용성 중합체 대 상기 폴리올의 중량비는 0.318:1 내지 4:1임); 및
c) 물 또는 버퍼를 포함하되, 여기에서 상기 RIM 용액은 1.36 이상의 굴절률을 갖는, 굴절률 매칭(RIM) 용액.
2. 제1 항목에 있어서, 상기 굴절률은 1.60 이하인, RIM 용액.
3. 생물학적 시료를 기질 상에 봉입시키는 방법으로서:
상기 생물학적 시료를 기질 상에 두는 단계; 및
상기 생물학적 시료를 제1 항목 또는 제2 항목의 RIM 용액과 접촉시켜, 봉입된 샘플을 제공하는 단계를 포함하는, 방법.
4. 제3 항목에 있어서, 상기 봉입된 샘플을 건조시키는 단계를 추가로 포함하되, 이로 인해 상기 수용성 중합체는 고체화되어 고체화된 중합체를 제공하는, 방법.
5. 제4 항목에 있어서, 상기 수용성 중합체는 약 48시간 이하 내에 실온에서; 또는 24시간 이하 내에 실온에서; 또는 약 4시간 이하 내에 약 40℃의 온도에서 고체화되는, 방법.
6. 제4 항목에 있어서, 상기 고체화된 중합체의 굴절률은 1.47를 초과하는(예를 들어, 1.48 내지 1.54; 또는 1.50 내지 1.525), 방법.
7. 선행하는 항목 중 어느 한 항목에 있어서, 기질 상의 생물학적 시료를 현미경에 의해 시각화시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
8. 수용성 중합체를 포함하는 고체화된 봉입제로서, 상기 중합체는 0.27 내지 0.34의 몰 굴절(RLL) 대 몰 부피(Vm) 비, 및 폴리올을 갖고, 여기에서 상기 수용성 중합체 대 상기 폴리올의 중량비는 0.318:1 내지 4:1이고, 상기 고체화된 봉입제는 1.48 이상의 굴절률을 갖는, 고체화된 봉입제.
9. 제8 항목에 있어서, 상기 수용성 중합체 대 상기 폴리올의 중량비는 0.5:1 이상인, 고체화된 봉입제.
10. 제8 항목 또는 제9 항목에 있어서, 상기 굴절률은 1.47 초과인, 고체화된 봉입제.
11. 선행하는 항목 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 수용성 중합체는 하전되지 않은, RIM 용액 또는 고체화된 봉입제.
12. 제11 항목에 있어서, 상기 하전되지 않은, 수용성 중합체는 폴리(아크릴아미드), 폴리(메타크릴아미드), 폴리(메틸 비닐 에테르), 폴리(비닐 피롤리돈)(PVP), 폴리비닐 알콜(PVA), 폴리(2-에틸-2-옥사졸린), 또는 폴리(2-메틸-2-옥사졸린)인, RIM 용액.
13. 제11 항목에 있어서, 상기 하전되지 않은, 수용성 중합체는 N-R 아크릴아미드 또는 N-R 메타크릴아미드(R은 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필 또는 H임); N,N-디메틸아크릴아미드, N,N-디메틸메타크릴아미드, N,N-디에틸아크릴아미드, N, N 디에틸메타크릴아미드; N-2-히드록시프로필 메타크릴아미드)의 단량체 잔기; 또는 이들의 조합을 포함하는, RIM 용액.
14. 제11 항목에 있어서, 상기 하전되지 않은, 수용성 중합체는 폴리(N-메틸 메타크릴아미드)(PMMAm)인, RIM 용액 또는 고체화된 봉입제.
15. 선행하는 항목 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 수용성 중합체는 하전된, RIM 용액 또는 고체화된 봉입제.
16. 제15 항목에 있어서, 상기 하전된, 수용성 중합체는 폴리아크릴산, 폴리메타크릴산, 폴리(디알릴디메틸암모늄 클로라이드), 폴리(소듐-4-스티렌설포네이트), 폴리(에틸렌이민), 폴리(N,N-디메틸아미노에틸 아크릴레이트), 폴리(N,N-디에틸에틸아미노 아크릴레이트), 폴리(알릴아민), 폴리[비스(2-클로로에틸)에테르-코-1,3-비스[3-(디메틸아미노)프로필]우레아], 또는 폴리(비닐술폰산, 소듐 염)인, RIM 용액 또는 고체화된 봉입제.
17. 선행하는 항목 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 수용성 중합체는 약 1 kDa 내지 약 100 kDa의 중량 평균 분자량을 갖는, RIM 용액 또는 고체화된 봉입제.
18. 선행하는 항목 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 수용성 중합체는 약 1 kDa 내지 약 20 kDa의 중량 평균 분자량을 갖는, RIM 용액 또는 고체화된 봉입제.
19. 선행하는 항목 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 수용성 중합체는 약 20 kDa 내지 약 100 kDa의 중량 평균 분자량을 갖는, RIM 용액 또는 고체화된 봉입제.
20. 선행하는 항목 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 수용성 중합체는 약 48 kDa 내지 약 80 kDa의 중량 평균 분자량을 갖는, RIM 용액 또는 고체화된 봉입제.
21. 선행하는 항목 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 굴절률은 1.48-1.50; 또는 1.50 내지 1.52; 또는 1.52 내지 1.54인, RIM 용액 또는 고체화된 봉입제.
22. 선행하는 항목 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 RIM 용액 또는 상기 고체화된 봉입제의 굴절률은 소다-석회 유리, 붕규산 유리, 또는 액침유의 굴절률과 매칭되는, RIM 용액 또는 고체화된 봉입제.
23. 선행하는 항목 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 수용성 중합체는 폴리올이 아닌, RIM 용액 또는 고체화된 봉입제.
24. 선행하는 항목 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 폴리올은 폴리비닐 알콜, 글리세롤, 디글리세롤, 폴리글리세롤, 만니톨, 소르비톨, 티오디에탄올, 티오디프로판, 또는 이들의 조합인, RIM 용액 또는 고체화된 봉입제.
25. 선행하는 항목 중 어느 한 항목에 있어서, 항산화제를 추가로 포함하는, RIM 용액 또는 고체화된 봉입제.
26. 제25 항목에 있어서, 1 중량% 이하의 항산화제를 포함하는, RIM 용액 또는 고체화된 봉입제.
27. 제26 항목에 있어서, 상기 항산화제는 6-히드록시-2,5,7,8-테트라메틸크로만-2-카르복실산, 3-카르복시 프록실, 히드로퀴논, 메퀴놀, 소듐 설파이트, 소듐 에리토르베이트, 아스코르브산, 프로필 갈레이트, 카페산, 파라페닐렌디아민, 1,4-디아자비시클로[2.2.2]옥탄, 또는 이들의 조합인, RIM 용액.
28. 기질 상에 놓인 생물학적 시료를 포함하는 봉입된 생물학적 시료로서, 상기 생물학적 시료는 선행하는 항목 중 어느 한 항목의 고체화된 봉입제 중에 포매된, 봉입된 생물학적 시료.
29. 생물학적 시료를 기질 상에 봉입하기 위한 키트로서:
a) 선행하는 항목 중 어느 한 항목의 굴절률 매칭(RIM) 용액; 및
b) 기질 상에 생물학적 시료를 봉입하기 위한 지침을 포함하는, 키트.
30. 선행하는 항목 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 기질이 현미경 슬라이드, 큐벳, 웰 또는 디쉬인, 방법, 봉입된 생물학적 시료 또는 키트.
31. 선행하는 항목 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 생물학적 시료는 세포, 조직, 3D 세포 배양물(예를 들어, 스페로이드/오가노이드), 또는 모든 생물체[예를 들어 초파리, 벌레(worm), 제브라 피쉬]인, 방법, 봉입된 생물학적 시료 또는 키트.
32. 선행하는 항목 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 생물학적 시료는 형광 염료 또는 형광 단백질로 표지되는, 방법, 봉입된 생물학적 시료 또는 키트.
Claims (25)
- 굴절률 매칭(RIM: refractive index matching) 용액으로서,
a) 수용성 중합체,
b) 폴리올, 및
c) 물 또는 버퍼를 포함하고,
여기에서, 상기 중합체는 0.27 내지 0.34의 몰 굴절(RLL) 대 몰 부피(Vm) 비를 갖고,
상기 수용성 중합체는
N-R 아크릴아미드(여기에서 R은 메틸, 에틸, 프로필 또는 이소프로필임); N-R 메타크릴아미드(여기에서 R은 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필 또는 H임); N,N-디메틸아크릴아미드, N,N-디메틸메타크릴아미드, N,N-디에틸아크릴아미드, N, N 디에틸메타크릴아미드; N-2-히드록시프로필 메타크릴아미드의 단량체 잔기; 또는 이들의 조합을 포함하는, 하전되지 않은 수용성 중합체이고,
상기 수용성 중합체 대 상기 폴리올의 중량비는 0.5:1 내지 4:1이고,
상기 RIM 용액은 1.36 이상의 굴절률을 갖는, 굴절률 매칭(RIM) 용액. - 제1항에 있어서, 상기 굴절률은 1.60 이하인, RIM 용액.
- 생물학적 시료를 기질 상에 봉입시키는(mounting) 방법으로서:
상기 생물학적 시료를 기질 상에 두는 단계; 및
상기 생물학적 시료를 제1항 또는 제2항의 RIM 용액과 접촉시켜, 봉입된 샘플을 제공하는 단계를 포함하는, 방법. - 제3항에 있어서, 상기 봉입된 샘플을 건조시키는 단계를 추가로 포함하되, 이로 인해 상기 수용성 중합체가 고체화되어 고체화된 중합체를 제공하는, 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 수용성 중합체는 48시간 이하 내에 실온에서; 24시간 이하 내에 실온에서, 또는 4시간 이하 내에 40℃의 온도에서 고체화되는, 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 고체화된 중합체의 굴절률은 1.47을 초과하는, 방법.
- 제3항에 있어서, 현미경에 의해 상기 기질 상의 생물학적 시료를 시각화하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 고체화된 봉입제로서,
수용성 중합체 및 폴리올을 포함하고,
여기에서 상기 중합체는 0.27 내지 0.34의 몰 굴절(RLL) 대 몰 부피(Vm) 비를 갖고,
상기 수용성 중합체는
N-R 아크릴아미드(여기에서 R은 메틸, 에틸, 프로필 또는 이소프로필임); N-R 메타크릴아미드(여기에서 R은 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필 또는 H임); N,N-디메틸아크릴아미드, N,N-디메틸메타크릴아미드, N,N-디에틸아크릴아미드, N, N 디에틸메타크릴아미드; N-2-히드록시프로필 메타크릴아미드의 단량체 잔기; 또는 이들의 조합을 포함하는, 하전되지 않은 수용성 중합체이고,
상기 수용성 중합체 대 상기 폴리올의 중량비는 0.5:1 내지 4:1이고,
상기 고체화된 봉입제는 1.48 이상의 굴절률을 갖는, 고체화된 봉입제. - 제1항에 있어서, 상기 하전되지 않은 수용성 중합체는 폴리(N-메틸 메타크릴아미드)(PMMAm)인, RIM 용액.
- 제1항에 있어서, 상기 수용성 중합체는 1 kDa 내지 100 kDa의 중량 평균 분자량을 갖는, RIM 용액.
- 제1항에 있어서, 상기 수용성 중합체는 1 kDa 내지 20 kDa의 중량 평균 분자량을 갖는, RIM 용액.
- 제1항에 있어서, 상기 수용성 중합체는 20 kDa 내지 100 kDa의 중량 평균 분자량을 갖는, RIM 용액.
- 제1항에 있어서, 상기 수용성 중합체는 48 kDa 내지 80 kDa의 중량 평균 분자량을 갖는, RIM 용액.
- 제8항에 있어서, 상기 굴절률은 1.48 내지 1.50; 또는 1.50 내지 1.52; 또는 1.52 내지 1.54인, 고체화된 봉입제.
- 제8항에 있어서, 상기 고체화된 봉입제의 굴절률은 소다-석회 유리, 붕규산 유리, 또는 액침유의 굴절률과 매칭되는, 고체화된 봉입제.
- 제1항에 있어서, 상기 수용성 중합체는 폴리올이 아닌, RIM 용액.
- 제16항에 있어서, 상기 폴리올은 폴리비닐 알콜, 글리세롤, 디글리세롤, 폴리글리세롤, 만니톨, 소르비톨, 에리스리톨, 티오디에탄올, 티오디프로판올, 또는 이들의 조합인, RIM 용액.
- 제1항에 있어서, 항산화제를 추가로 포함하는, RIM 용액.
- 제18항에 있어서, 1 중량% 이하의 항산화제를 포함하는, RIM 용액.
- 제18항에 있어서, 상기 항산화제는 6-히드록시-2,5,7,8-테트라메틸크로만-2-카르복실산, 3-카르복시 프록실, 히드로퀴논, 메퀴놀, 소듐 설파이트, 소듐 에리토르베이트, 아스코르브산, 프로필 갈레이트, 카페산, 파라페닐렌디아민, 1,4-디아자비시클로[2.2.2]옥탄, 또는 이들의 조합인, RIM 용액.
- 기질 상에 놓인 생물학적 시료를 포함하는 봉입된 생물학적 시료로서, 상기 생물학적 시료는 제8항의 고체화된 봉입제 중에 포매된, 봉입된 생물학적 시료.
- 생물학적 시료를 기질 상에 봉입하기 위한 키트로서,
c) 제1항의 굴절률 매칭(RIM) 용액; 및
d) 상기 기질 상에 생물학적 시료의 봉입을 위한 지침을 포함하는 키트. - 제3항에 있어서, 상기 기질은 현미경 슬라이드, 큐벳, 웰 또는 디쉬인, 방법.
- 제3항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 세포, 조직, 3D 세포 배양물, 또는 모든 생물체인, 방법.
- 제3항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 형광 염료 또는 형광 단백질로 표지화된, 방법.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201762557028P | 2017-09-11 | 2017-09-11 | |
| US62/557,028 | 2017-09-11 | ||
| KR1020207008022A KR20200052894A (ko) | 2017-09-11 | 2018-09-11 | 굴절률 매칭 제제 |
| PCT/US2018/050392 WO2019051466A1 (en) | 2017-09-11 | 2018-09-11 | REFRACTION INDEX ADAPTATION FORMULATIONS |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020207008022A Division KR20200052894A (ko) | 2017-09-11 | 2018-09-11 | 굴절률 매칭 제제 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20240042172A true KR20240042172A (ko) | 2024-04-01 |
Family
ID=63966061
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020207008022A KR20200052894A (ko) | 2017-09-11 | 2018-09-11 | 굴절률 매칭 제제 |
| KR1020247009142A KR20240042172A (ko) | 2017-09-11 | 2018-09-11 | 굴절률 매칭 제제 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020207008022A KR20200052894A (ko) | 2017-09-11 | 2018-09-11 | 굴절률 매칭 제제 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US11988585B2 (ko) |
| EP (1) | EP3682222A1 (ko) |
| JP (1) | JP7346424B2 (ko) |
| KR (2) | KR20200052894A (ko) |
| CN (1) | CN111247415A (ko) |
| AU (1) | AU2018328819B2 (ko) |
| WO (1) | WO2019051466A1 (ko) |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5822486B2 (ja) | 1974-11-15 | 1983-05-09 | 富士写真フイルム株式会社 | ヒカリコウカセイソセイブツ |
| JPS55104311A (en) | 1979-02-01 | 1980-08-09 | Mitsubishi Rayon Co Ltd | Novel resin composition for embedding and fixing of living organism tissue |
| US4493821A (en) | 1982-02-04 | 1985-01-15 | Harrison James S | Preservative and fixative preparations for biological systems |
| WO1996030738A1 (en) | 1995-03-28 | 1996-10-03 | Innovex Biosciences | Compositions and methods for permanently mounting biological specimens |
| JP2001125006A (ja) | 1999-10-27 | 2001-05-11 | Muto Kagaku Kk | 封入剤を印刷したカバーガラス及びその製造方法 |
| GB2419425A (en) | 2004-10-19 | 2006-04-26 | Robert Stephen Davidson | Mountant solution for a microscope |
| JP2009031688A (ja) | 2007-07-30 | 2009-02-12 | Muto Kagaku Kk | 顕微鏡スライドグラス用コーティング組成物、顕微鏡スライドグラス、ｐａｍ染色用前処理液、及びｐａｍ染色用メセナミン銀染色液 |
| WO2009086487A2 (en) * | 2007-12-28 | 2009-07-09 | Spring Bioscience Corporation | Liquid coverslip and method and device for applying and removing coverslips |
| US8420711B2 (en) | 2009-07-09 | 2013-04-16 | Bausch & Lomb Incorporated | Mono ethylenically unsaturated polymerizable group containing polycarbosiloxane monomers |
| US10018540B2 (en) | 2012-04-10 | 2018-07-10 | Rutgers, The State University Of New Jersey | Clearing agent and mounting media for microscopy |
| WO2013155064A1 (en) | 2012-04-10 | 2013-10-17 | Rutgers, The State University Of New Jersey | Clearing agent and mounting medium for microscopy |
| JP6181845B2 (ja) | 2013-03-15 | 2017-08-16 | ザ プロクター アンド ギャンブル カンパニー | パーソナルケア物品の形成方法 |
| US10495553B2 (en) | 2015-12-15 | 2019-12-03 | Diagnostic Biosystems | Sealing fluid for microfluidic analyses |
-
2018
- 2018-09-11 KR KR1020207008022A patent/KR20200052894A/ko not_active IP Right Cessation
- 2018-09-11 JP JP2020536723A patent/JP7346424B2/ja active Active
- 2018-09-11 CN CN201880058692.1A patent/CN111247415A/zh active Pending
- 2018-09-11 WO PCT/US2018/050392 patent/WO2019051466A1/en unknown
- 2018-09-11 AU AU2018328819A patent/AU2018328819B2/en active Active
- 2018-09-11 US US16/641,193 patent/US11988585B2/en active Active
- 2018-09-11 EP EP18793049.0A patent/EP3682222A1/en active Pending
- 2018-09-11 KR KR1020247009142A patent/KR20240042172A/ko unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP7346424B2 (ja) | 2023-09-19 |
| US11988585B2 (en) | 2024-05-21 |
| WO2019051466A1 (en) | 2019-03-14 |
| US20210033502A1 (en) | 2021-02-04 |
| AU2018328819A1 (en) | 2020-03-19 |
| KR20200052894A (ko) | 2020-05-15 |
| AU2018328819B2 (en) | 2023-09-14 |
| EP3682222A1 (en) | 2020-07-22 |
| JP2020533652A (ja) | 2020-11-19 |
| CN111247415A (zh) | 2020-06-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Heimer et al. | Improved mountant for immunofluorescence preparations. | |
| US7790825B2 (en) | High refractive index ophthalmic device materials | |
| CN107300496B (zh) | 生物材料用透明化试剂、及其利用 | |
| US7790824B2 (en) | High refractive index ophthalmic device materials | |
| AU2016220438B2 (en) | Wet-pack intraocular lens materials with high refractive index | |
| Hale et al. | Resolution of subcellular detail in thick tissue sections: immunohistochemical preparation and fluorescence confocal microscopy | |
| US10495553B2 (en) | Sealing fluid for microfluidic analyses | |
| AU2018328819B2 (en) | Refractive index matching formulations | |
| Dong et al. | Performances of high numerical aperture water and oil immersion objective in deep‐tissue, multi‐photon microscopic imaging of excised human skin | |
| CA2965742C (en) | Low-water content acrylate-acrylamide copolymers for ophthalmic devices | |
| Jerome et al. | Specimen preparation | |
| TW202111305A (zh) | 生物材料染色組成物及方法 | |
| Gray et al. | Super-resolution microscopy of Vaccinia virus particles | |
| US20230280579A1 (en) | Microscope slide | |
| WO2020153463A1 (ja) | 顕微鏡の液浸液体、及び該液浸液体を用いた試料の観察方法 | |
| Model | Studying cell volume beyond cell volume | |
| Yeo et al. | The Applications of Responsive Fluorescent Sensors to Biological Systems | |
| Tashlieva | Visualization of surface antigens by correlative microscopy | |
| Cody et al. | Optimizing confocal microscopy for thick biological specimens | |
| Butterworth et al. | Human Pancreas PACT Optical Clearing and High Resolution 3D Microscopy | |
| WO1996030738A1 (en) | Compositions and methods for permanently mounting biological specimens | |
| Brenna | Optimization of Optical Tissue Clearing Protocols | |
| Hu | Dual-View Inverted Selective Plane Illumination Microscopy (diSPIM) Imaging for Accurate 3D Digital Pathology | |
| Thorn et al. | Optimal clearing and mounting media for confocal microscopy of thick specimens | |
| GB2419425A (en) | Mountant solution for a microscope |