JP7307026B2

JP7307026B2 - アーバスキュラー菌根菌の共生促進剤及び共生促進方法

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Publication number: JP7307026B2
Application number: JP2020065939A
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Inventors: 聡近藤; 円佳阿部; 直也武田; 明赤松; 佐知新保
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Description

本発明は、植物の根に共生するアーバスキュラー菌根菌に対して作用することで共生能を向上させる共生促進剤及び共生促進方法、並びに植物の栽培方法に関する。

アーバスキュラー菌根菌は、植物の根に共生する菌類であり、陸上植物の約80%に共生していることが知られている。アーバスキュラー菌根菌は、構造的特徴からVA菌根（Vesicular-Arbuscular Mycorrhiza）と呼称される場合もある。アーバスキュラー菌根菌は、グロムス門Glomeromycotaに属する150種程度の特殊な菌類によって形成される。アーバスキュラー菌根菌は、植物の根に共生すると、リン等の栄養性成分の吸収促進、耐病性の向上、水分吸収の促進といった機能を発揮し、その結果、共生した植物に対する生育促進効果を示す。このため、アーバスキュラー菌根菌は、微生物肥料として農業利用が期待されている。

アーバスキュラー菌根菌に関しては、非特許文献１に記載されるように、アブシジン酸がPP2A（プロテインフォスファターゼ2A）と複合体を形成することで菌糸樹枝状体の形成を促進することが知られている。すなわち、非特許文献１に記載されるように、アブシジン酸を植物に作用させることで、アーバスキュラー菌根菌の共生を促進できることが示唆されている。

また、特許文献１には、ジベレリン合成阻害剤を、植物の生長抑制剤として使用する量又はそれよりも少ない量で施用することにより植物に対して菌根菌の共生を促進する方法が開示されている。ジベレリン合成阻害剤は、植物に作用して植物ホルモンの一種であるジベレリンの合成を阻害することで菌根菌の共生を促進することができる。

なお、アーバスキュラー菌根菌は、一般的な培地では培養することができず、植物と共生しないと生育できない性質を有している。ただし、特許文献２に記載されるように、ミリスチン酸やパルミチン酸などの脂肪酸を培地に添加することで、アーバスキュラー菌根菌を培養できる技術が知られている。

Plant Physiology , December 2014, Vol. 166, pp. 2077-2090

特開２０１７－３８５６２号公報特開２０１８－１７０９７３号公報

上述のように、非特許文献１及び特許文献１には、植物に作用させることでアーバスキュラー菌根菌による共生を促進できることが開示されているものの、アーバスキュラー菌根菌に対して作用させる技術は開示されていない。特許文献２には、アーバスキュラー菌根菌に脂肪酸を作用させることを開示するが、アーバスキュラー菌根菌の共生能を向上させる技術ではない。

そこで、本発明は、上述したような実情に鑑み、アーバスキュラー菌根菌に対して作用させることでアーバスキュラー菌根菌における共生能を向上させることができる共生促進剤及び共生促進方法並びに植物の栽培方法を提供することを目的とする。

上述した目的を達成するため、本発明者らが鋭意検討した結果、酸化型グルタチオン又はシスタチオニンをアーバスキュラー菌根菌に対して作用させることで、アーバスキュラー菌根菌における共生能を大幅に向上させることができることを見いだし、本発明を完成するに至った。

本発明は以下を包含する。
（１）酸化型グルタチオン及び/又はシスタチオニンを有効成分とするアーバスキュラー菌根菌に対する共生促進剤。
（２）アーバスキュラー菌根菌に酸化型グルタチオン及び/又はシスタチオニンを接触させることを特徴とする共生促進方法。
（３）上記（１）の共生促進剤とアーバスキュラー菌根菌とを含む微生物資材。
（４）栽培対象の植物の根に、酸化型グルタチオン及び/又はシスタチオニンを作用させたアーバスキュラー菌根菌を共生させる植物の栽培方法。

本発明に係る共生促進剤及び共生促進方法は、アーバスキュラー菌根菌に対して作用し、アーバスキュラー菌根菌における植物に対する共生能を向上させることができる。したがって、本発明に係る共生促進剤及び共生促進方法は、植物の根に対して作用する物質や方法と異なり、アーバスキュラー菌根菌をより簡便且つ高効率で植物に対して共生させることができる。

本発明に係る植物の栽培方法は、共生能が向上したアーバスキュラー菌根菌を使用するため、アーバスキュラー菌根菌による植物生育促進効果が十分に発揮され、生育促進した植物を製造することができる。

酸化型グルタチオンによるアーバスキュラー菌根菌の菌糸伸長促進効果を示す特性図である。酸化型グルタチオンによるアーバスキュラー菌根菌の双子葉植物に対する感染率向上効果を示す特性図である。酸化型グルタチオンによるアーバスキュラー菌根菌の単子葉植物に対する感染率向上効果を示す特性図である。シスタチオニンによるアーバスキュラー菌根菌の植物に対する感染率向上効果を示す特性図である。酸化型グルタチオンによる根粒菌の根粒数、感染糸に対する効果を示す特性図である。還元型グルタチオン及びPhoronによるアーバスキュラー菌根菌の共生能に対する効果を示す特性図である。還元型グルタチオンによるアーバスキュラー菌根菌の菌糸伸長に対する効果を示す特性図である。

以下、本発明を詳細に説明する。

＜共生促進剤＞
本発明に係る共生促進剤（以下、単に「共生促進剤」と称す）は、酸化型グルタチオン及び/又はシスタチオニンを有効成分として含有する。共生促進剤は、アーバスキュラー菌根菌に作用して、アーバスキュラー菌根菌の菌糸伸長を促進する機能を有する。この共生促進剤を接触させたアーバスキュラー菌根菌は、共生促進剤を接触させないアーバスキュラー菌根菌と比較して、植物に対する感染率が有意に向上する。

ここで、酸化型グルタチオン（以下、GSSGと略称する場合もある）とは、2分子の還元型グルタチオン（GSHと略称する場合もある、N-(N-γ-L-グルタミル-L-システイニル)グリシン）がジスルフィド結合を介して結合した構造を有する。また、酸化型グルタチオンは、他の物質（酸、塩基）と結合した塩としても良いし、当該塩の水和物、これらの混合物として含有されていても良い。

GSSG塩としては、特に限定されないが、アンモニウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、ナトリウム塩、リチウム塩等を例示することができる。特に、GSSG塩としては、好ましくはアンモニウム塩、カルシウム塩及びマグネシウム塩からなる群から選ばれる１種以上の塩とすることができる。

共生促進剤にGSSGを含有させる場合、GGSGの濃度に関しては特に限定されないが、例えば1μM～1mMとすることができ、10μM～500μMとすることが好ましく、10μM～300μMとすることが好ましく、10μM～100μMとすることが好ましい。

ここでシスタチオニンは、システイン合成の中間体であり、ホモシステインとセリンより、シスタチオニンβ-シンターゼの触媒によって作られる。シスタチオニンは、化学式：C₇H₁₄N₂O₄Sを有し、2-アミノ-4-(2-アミノ-2-カルボキシ-エチル)チオ-ブタン酸である。また、シスタチオニンには、Ｌ型のシスタチオニン、Ｄ型のシスタチオニン、シスタチオニン塩又は様々な形態のシスタチオニン混合物が含まれる。

共生促進剤にシスタチオニンを含有させる場合、シスタチオニンの濃度に関しては特に限定されないが、例えば100nM～100μMとすることができ、500nM～10μMとすることが好ましく、700nM～5μMとすることが好ましい。

＜アーバスキュラー菌根菌＞
共生促進剤により共生能が向上するアーバスキュラー菌根菌（arbuscularmycorrhizal fungus）は、特に限定されず、グロムス門Glomeromycotaに属する全ての菌根菌とすることができる。特に、アーバスキュラー菌根菌としては、リゾファガス（Rhizophagus）属、ギガスポラ（Giga-spora）属及びグロムス（Glomus）属に属する真菌を挙げることができる。このうち、リゾファガス（Rhizophagus）属真菌の例としては、Rhizophagus arabicus、Rhizophagus clarus、Rhizophagus custos、Rhizophagus diaphanum、Rhizophagus fasciculatus、Rhizophagus intraradices、Rhizophagus iranicus、Rhizophagus irregularis、Rhizophagus manihotis、Rhizophagus proliferus等を挙げることができる。

アーバスキュラー菌根菌は、土壌中で共生対象の植物の根に付着すると、細胞間隙を通りながら内生菌糸を伸ばして根の内部へ侵入し、植物の細胞内に樹枝状体とよばれる共生器官を形成する。アーバスキュラー菌根菌は、根の内部に菌糸を張り巡らせることで、土壌から集めたリンや水分などを、樹枝状体を介して植物に供給する一方、植物の光合成産物を受け取り、これを自身のエネルギー源として利用する。

＜微生物資材＞
上述した共生促進剤とアーバスキュラー菌根菌を利用して、植物のバイオマス量を増産させる微生物資材を提供できる。この微生物資材を使用することで、栽培対象の植物に対してバイオマス増産効果を期待することができる。微生物資材は、上述した共生促進剤とアーバスキュラー菌根菌とを含んでいる。また、微生物資材は、これら共生促進剤及びアーバスキュラー菌根菌以外に、これら共生促進剤及びアーバスキュラー菌根菌の担体や、乳化剤、分散剤、消泡剤、補助剤等を含むことができる。

ここで、微生物資材は、共生促進剤及びアーバスキュラー菌根菌を単一の担体に保持させたものでも良いし、共生促進剤を保持した担体と、アーバスキュラー菌根菌を保持した担体とを含むものでもよい。

担体としては、リン酸緩衝液、炭酸緩衝液、生理食塩水等の液体担体が挙げられる。また、担体としては、カオリン、粘土、タルク、ベントナイト、チョーク、石英、アタパルジャイト、モンモリロナイト、ホワイトカーボン、珪藻土等の天然鉱物粉末、ケイ酸、アルミナ、ケイ酸塩等の合成鉱物粉末、チャコール、結晶性セルロース、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸等の固体担体が挙げられる。また、固体担体としては、例えば、バーミキュライト、ケイ砂、雲母、軽石、石こう、炭酸カルシウム、ドロマイト、マグネシウム、消石灰、リン石灰、ゼオライト、硫安などの無機物質を使用しても良い。また、固体担体としては、例えば、コンポスト、ピート、籾殻、糠、大豆粉、タバコ粉、クルミ粉、小麦粉、木粉、でんぷん、結晶セルロースなどの植物性有機物質を使用しても良い。さらに、固体担体としては、クマロン樹脂、石油樹脂、アルキド樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリアルキレングリコール、ケトン樹脂、エステルガム、コーパルガム、ダンマルガムなどの合成または天然の高分子化合物や、カルナバロウ、蜜ロウなどのワックス類及び尿素類等を使用しても良い。

さらに、補助剤としては、例えばアルキル硫酸エステル類、アルキルスルホン酸塩、アルキルアリールスルホン酸塩、ジアルキルスルホコハク酸塩等の陰イオン界面活性剤、高級脂肪族アミンの塩類等の陽イオン界面活性剤、ポリオキシエチレングリコールアルキルエーテル、ポリオキシエチレングリコールアシルエステル、ポリオキシエチレングリコール多価アルコールアシルエステル、セルロース誘導体等の非イオン界面活性剤、ゼラチン，カゼイン、アラビアゴム等の増粘剤、増量剤、結合剤等が挙げられる。

以上のように構成される微生物資材は、例えば、液剤、粉剤、粒剤、乳剤、油剤、懸濁剤、水和剤、水溶剤、ペースト剤、カプセル剤、煙霧剤（エアゾール剤）等の任意の製剤形態とすることができる。

＜植物の栽培方法＞
上述した共生促進剤を使用することで、栽培対象の植物に対してアーバスキュラー菌根菌の感染率を向上させることができ、その結果、当該植物のバイオマスを増産することができる。ここで、「共生促進剤を使用する」とは、上述した共生促進剤を土壌に供給し、当該土壌に含まれるアーバスキュラー菌根菌に対して共生促進剤を作用させる形態、上述した共生促進剤を予め作用させたアーバスキュラー菌根菌を土壌に供給する形態、上述した微生物資材を土壌に供給する形態、上述した共生促進剤とアーバスキュラー菌根菌とを土壌に供給する形態を含む意味である。

これら如何なる形態であっても、上述した共生促進剤によりアーバスキュラー菌根菌の共生能が大幅に向上しているため、栽培対象の植物のバイオマスを増産することができる。栽培対象の植物としては、アーバスキュラー菌根菌が根部に共生できる植物であれば何ら限定されない。このような植物は、単子葉植物でも双子葉植物でもよく、食用でも非食用でもよい。このような植物の具体例としては、単子葉植物として、例えば、ネギ、タマネギ、ニンニク、ニラ、アサツキ、ラッキョウ、リーキなどのヒガンバナ科；イネ、コムギ、オオムギ、トウモロコシ、モロコシなどのイネ科等を挙げることができる。また、このような植物の具体例としては、双子葉植物として、例えば、ダイズ、インゲンマメ、アズキ、エンドウ、ソラマメ、ミヤコグサ、ラッカセイ、クローバー、ササゲ、ミヤコグサなどのマメ科；イチゴなどのバラ科；ニンジンなどのセリ科；キュウリ、カボチャ、スイカ、メロンなどのウリ科；ナス、トマト、ピーマン、ジャガイモ、トウガラシ、シシトウ、パプリカなどのナス科；オクラ、ワタなどのアオイ科；サツマイモなどのヒルガオ科等を、それぞれ挙げることができる。これらの中でも、ヒガンバナ科ネギ属、マメ科、イネ科又はバラ科に属する植物が好ましく、ネギ、タマネギ、イチゴ、イネ、コムギ、オオムギ、ミヤコグサ、ダイズ及びトウモロコシがより好ましい。

共生促進剤又は微生物資材を土壌に供給する方法としては、特に限定されないが、例えば、土への散布、混ぜ込み、埋め込み、薬液注入、薬液潅水などの方法により行うことができる。土に供給する際には、植物を栽培する土の一部に行ってもよく、全面に行ってもよい。共生促進剤又は微生物資材を施用する場所の具体例としては、例えば、植穴又はその付近、作条又はその付近、株間、培土全面、土壌全面、育苗箱、育苗トレイ、育苗ポット、苗床などが挙げられる。

また、共生促進剤又は微生物資材は、粒剤等の固形剤として土壌に供給することが好ましい。特に、共生促進剤は粒剤等の固形剤として供給することで、土壌からの流出を防止することができる。

さらに、共生促進剤とともにアーバスキュラー菌根菌を土壌に供給するか、上述した微生物資材を土壌に供給することが好ましい。共生促進剤とともにアーバスキュラー菌根菌を土壌に供給するか、上述した微生物資材を土壌に供給することで、アーバスキュラー菌根菌による植物バイオマス増産効果をより発揮することができる。

共生促進剤又は微生物資材は、播種又は植物の植え付け前に予め土に施用しておいてもよく、播種又は植物の植え付け後の土に施用してもよい。施用時期は、例えば、播種前、播種時、播種後から出芽前までの期間、出芽期、育種期、苗の移植時、挿し木又は挿し芽時、定植後の生育期間（開花前、開花中、開花後、出穂直前又は出穂期など）、果実の着色開始期などが挙げられる。その際、土壌に対して１回のみ施用してもよく、複数回施用してもよい。施用量をできるだけ少なくしつつ、植物の生育促進効果を十分に得る観点から、植物の初期の生育段階（具体的には、出芽から開花又は出穂の前までの期間）又はそれよりも以前に施用することが好ましく、育苗段階又はそれよりも以前に施用することがより好ましい。

一方、共生促進剤を予め作用させたアーバスキュラー菌根菌を土壌に供給する形態では、先ず、アーバスキュラー菌根菌を共生促進剤の存在下で培養する。アーバスキュラー菌根菌の培養は、共生する植物との二者培養法を適用することもできるし、アーバスキュラー菌根菌のみを培養する方法を適用することができる。

アーバスキュラー菌根菌のみを培養する方法は、例えばMMN（Modified Melin-Norkrans）培地を用いて培養する方法が挙げられる。また、当該MMN培地に、トリプトファンダイマーやロイシルプロリンを添加した培地を用いる方法（例えば特開２００９－０９５３３２号公報）、バーミキュライトやパーライトなどの多孔質担体を用いる方法（例えば特開２００５－０２７５４６号公報）も適用することができる。さらに、炭素数が１３～１８である飽和脂肪酸を培地中に添加する方法も適用することができる（例えば特開２０１８－１７０９７３号公報）。

アーバスキュラー菌根菌の培養に用いられている培地は、必須構成成分として、グルコース、マンノース、キシロース、フルクトース、スクロース、ラクトース、ラフィノースなどの資化性糖とリン酸水素ナトリウムなどの無機塩を含む培地である。また、培地は、その他に必要に応じて、酵母粉末や酵母エキス、チアミンやピリドキシンなどの各種ビタミン類、ペプトンや麦芽エキス、ＮＺアミン（カゼインの酵素加水分解物）等の有機性窒素源、無機酸等のｐＨ調整剤、さらには平板培地作製用の基剤、例えば寒天などを含む。公知である基礎培地として、例えば浜田培地、改変浜田培地、太田培地、ＯＨ培地、ＭＭＮ培地が示される。また、胞子形成の観点から、ペプトンのような有機性窒素源を含む培地が好ましい。これらの成分は水に溶解された後に液体培地又は平板培地として培養に用いられる。また、必要に応じて培地のｐＨが調整される。ｐＨは使用時において酸性側、好ましくは５～７である。平板培地とする場合の基剤の添加量は、概ね１～２０ｍｇ／ｍＬである。培養方法は、菌根菌の一般的な培養方法と特に変わるところはなく、アーバスキュラー菌根菌の胞子を培地（液体培地であるか平板培地であるかを問わず）に植菌し、２５～３５℃、好ましくは２８℃付近の適温にて培養する。培養後には、植菌した胞子から菌糸が成長し、菌糸からは新たに娘胞子が発芽し、十分に大きく成長した娘胞子が多数形成される。

アーバスキュラー菌根菌に共生促進剤を予め作用させるには、アーバスキュラー菌根菌を培養する培地に共生促進剤を添加しておく方法、アーバスキュラー菌根菌を上記培地にて培養した後に菌体懸濁液とし、当該菌体懸濁液に共生促進剤を添加する方法等を適用することができる。何れの方法でも培養後のアーバスキュラー菌根菌に対して共生促進剤を作用させることで、アーバスキュラー菌根菌の共生能を向上させることができる。

以上のように、アーバスキュラー菌根菌の共生能を向上させることで、アーバスキュラー菌根菌の植物に対する感染率を向上させ、その結果、植物のバイオマス増産効果を奏することができる。

ところで、栽培対象の植物に所定の物質を作用させるような場合、当該物質を与えた植物を土壌に植え替える手間がかかる問題や、当該物質を土壌に供給しても目的とする植物の根に作用しない可能性が高いといった問題がある。これに対して、上述のように、酸化型グルタチオン及び/又はシスタチオニンをアーバスキュラー菌根菌に作用させる形態では、栽培対象の植物を植え替える手間が不要で、且つ、アーバスキュラー菌根菌の共生能を非常に簡便に向上させることができる。

以下、実施例を用いて本発明を更に詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。

〔実施例１〕
本実施例では、酸化型グルタチオン（GSSG）によるアーバスキュラー菌根菌の菌糸伸長への影響を検証した。

Modified M培地（0.3% gerlite, Becard and Fortin, 1988 New phytologist, 108, 211-218）に酸化型グルタチオン（10μM又は100μM）を添加し、アーバスキュラー菌根菌（Rhizophagus irregularis DAOM197198）胞子を播種し、30℃で4週間培養した。また、比較のため酸化型グルタチオンを添加しない以外は同様にアーバスキュラー菌根菌を培養した。そして、胞子を播種した培地の中心部より半径7.5mmの円より伸長した菌糸数をカウントし、胞子数当たりの伸長度合いを求めた。

結果を図１に示した。図１から分かるように、コントロール（酸化型グルタチオン無添加）と比較して、酸化型グルタチオンを10μM又は100μM添加した場合には、アーバスキュラー菌根菌で有意（*p<0.05, Dunnett’s test, n=16-19）な菌糸伸長促進効果が見られた。

〔実施例２〕
本実施例では、土壌に酸化型グルタチオンを添加し、双子葉植物を栽培したときのアーバスキュラー菌根菌の感染率を検証した。

具体的には、GSSGを添加した土壌中でマメ科植物のミヤコグサ（Lotus japonicus）にアーバスキュラー菌根菌（Rhizophagus irregularis DAOM197198）を感染させ、根内部に侵入した菌根菌の感染率（％）を測定した。

先ず、無肥料の土壌中に培地（1/10量 Hoagland No.2 basal salt mixture (SIGMA）、0.1mM KNO₃）を加え、同時にアーバスキュラー菌根菌胞子（4000胞子あるいは6000胞子）のみを接種したコントロール土壌と、アーバスキュラー菌根菌胞子（4000胞子）とGSSG（10又は100μM）を添加した土壌を用意した。次に、そこに寒天培地上で発芽させたミヤコグサ種子（播種後3日）を移植した。植物は23℃, 16hr light/8 hr darkで4週間生育させた。4週間後にミヤコグサを掘り起こして根内部のアーバスキュラー菌根菌を、インク染色法を用いて染色し、顕微鏡下で観察しながら菌根菌の感染率（根の長さ当たりに存在する菌糸量［％］）を測定した。

結果を図２に示した。図２から分かるように、GSSG非添加のコントロール（4000胞子）の植物に比べ、GSSGを添加した植物では感染率の有意な増加（*p<0.05, **p<0.01, Dunnett’s test, n=8）が見られた。この感染率は、1.5倍量の胞子（6000胞子）を接種したコントロール植物への感染率と比較して、10μMで同等、100μMでそれ以上の上昇効果が見られており、GSSG添加による宿主植物への感染促進効果が観測できた。

実施例１の結果と併せると、GSSG添加による菌根菌菌糸の伸長促進効果によって宿主植物への菌根菌の接触の機会が増し、感染率の向上につながったと考えられた。

〔実施例３〕
本実施例では土壌に酸化型グルタチオンを添加し、単子葉植物を栽培したときのアーバスキュラー菌根菌の感染率を検証した。

具体的には、単子葉植物のネギ科の植物チャイブ（Allium schoenoprasum）にアーバスキュラー菌根菌（Rhizophagus irregularis DAOM197198）を感染させ、根内部に侵入した菌根菌の感染率（％）を測定した。

アーバスキュラー菌根菌の植物への感染法は実施例２と同様に、無肥料の土壌中に培地（1/10量 Hoagland No.2 basal salt mixture (SIGMA）、0.1mM KNO₃）を加え、コントロールとしてアーバスキュラー菌根菌胞子（4000胞子）のみと、胞子に加えてGSSG（10又は100μM）を添加し、滅菌したチャイブ種子をそれぞれの土壌に直播した。植物は23℃, 16hr light/ 8 hr darkで4週間生育させた。4週間後にチャイブを掘り起こして根内部のアーバスキュラー菌根菌を、インク染色法を用いて染色し、顕微鏡下で観察しながら菌根菌の感染率（根の長さ当たりに存在する菌糸量［％］）を測定した。

結果を図３に示した。図３から分かるように、双子葉植物のミヤコグサと同様に単子葉植物であるチャイブにおいても、GSSGの添加によるアーバスキュラー菌根菌の感染率の有意な（**p<0.01, Dunnett’s test, n=8）向上効果が確認できた。

〔実施例４〕
本実施例では、酸化型グルタチオンに代えてシスタチオニン（cystathionine）によるアーバスキュラー菌根菌感染率への影響の検証を行った。

植物はチャイブを用い、無肥料の土壌中に培地（1/10量 Hoagland No.2 basal salt mixture (SIGMA）、0.1mM KNO₃）を加え、コントロールとしてアーバスキュラー菌根菌胞子（500胞子又は1000胞子）のみと、胞子とシスタチオニン（0.1又は1mM）を添加し、その土壌に滅菌したチャイブ種子を直播した。植物は23℃, 16hr light/ 8 hr darkで4週間生育させた。4週間後にチャイブを掘り起こして根内部の菌根を、インク染色を用いて染色し、顕微鏡下で観察しながら菌根菌の感染率（根の長さ当たりに存在する菌糸量［％］）を測定した。

結果を図４に示した。図４から分かるように、非添加のコントロールと比較して、1mMのシスタチオニン添加により有意な感染率の上昇効果が見られた。この結果から酸化型グルタチオンと同様に、グルタチオン合成の中間体であるシスタチオニンの添加によっても感染促進効果が確認できた。

〔比較例１〕
本比較例では、アーバスキュラー菌根菌に代えて根粒菌を使用し、酸化型グルタチオンによる根粒菌の感染に対する影響を検証した。

本比較例では根粒菌として、ミヤコグサ根粒菌（Mesorhizobium loti、蛍光タンパク質DsRED導入形質転換体）を使用した。バーミキュライトにB&D培地（Broughton and Dilworth, 1971）に終濃度0.1mM KNO₃と根粒菌を混合し、さらに酸化型グルタチオンを0、10、100μM加えた培地を用意した。その培地50mlをポットに入れた無肥料の土（バーミキュライト）300mlに加え、そこに播種後3日目のミヤコグサ幼植物体を植えた。ミヤコグサの根毛細胞に形成された根粒菌の感染経路となる感染糸、根に形成された共生器官である根粒を、生育1週間及び2週間後にそれぞれ計測した。結果を図５に示した。図５から分かるように、生育後1週間で根粒、感染糸形成ともに有意な抑制効果が見られたが、2週間後にはその効果が見られなくなった。この結果から、酸化型グルタチオンは、根粒菌の感染には効果がないか、あるいは根粒形成を抑制することが明らかとなった。

〔比較例２〕
本比較例では、酸化型グルタチオン及びシスタチオニンに代えて還元型グルタチオン（GSH）及びグルタチオン枯渇剤フォロン（Phoron）を使用し、還元型グルタチオン（GSH）及びグルタチオン枯渇剤フォロン（Phoron）によるアーバスキュラー菌根菌の感染に対する影響を検証した。

実施例３と同様の方法で、無肥料の土壌中に培地（1/10量 Hoagland No.2 basal salt mixture (SIGMA）、1mM KNO₃）を加え、コントロールとしてアーバスキュラー菌根菌胞子（500胞子、1000胞子）のみと、500胞子の接種に加えてシスタチオニン（0.1又は1mM）、GSH（0.1又は1mM）とフォロン（0.1又は1mM）を添加し、滅菌したチャイブ種子をそれぞれの土壌に直播した。植物は23℃, 16hr light/ 8 hr darkで1か月生育させた。1か月後にチャイブを掘り起こして根内部のアーバスキュラー菌根菌を、インク染色法を用いて染色し、顕微鏡下で観察しながら菌根菌の感染率（根の長さ当たりに存在する菌糸量［％］）を測定した。

結果を図６に示した。図６から分かるように、シスタチオニン添加では500胞子接種のコントロールより感染率が向上し、1mM 添加では1000胞子接種と同程度の感染がみられるが、還元型グルタチオンGSHの添加では、菌根菌の感染は抑制された。グルタチオン枯渇剤であるPhoronを添加した場合も、菌根菌の感染は抑制された。

〔比較例３〕
本比較例では、酸化型グルタチオン及びシスタチオニンに代えて還元型グルタチオン（GSH）を使用し、還元型グルタチオン（GSH）によるアーバスキュラー菌根菌の菌糸伸長への影響を検証した。

実施例１と同様の方法で、Modified M培地（0.3% gerlite）に還元型グルタチオン（10mM）を添加し、アーバスキュラー菌根菌（Rhizophagus irregularis DAOM197198）胞子を播種し、30℃で1週間培養した。また、比較のため酸化型グルタチオンを添加しない以外は同様にアーバスキュラー菌根菌を培養した。結果を図７に示した。図７から分かるように、還元型グルタチオンGSHを添加した培地では添加では、アーバスキュラー菌根菌の菌糸伸長の低下など生育が阻害され、高濃度（10mM）では菌糸が全く伸長せず胞子が死滅することが明らかとなった。

Claims

酸化型グルタチオン及び/又はシスタチオニンを有効成分とするアーバスキュラー菌根菌に対する共生促進剤。
アーバスキュラー菌根菌に酸化型グルタチオン及び/又はシスタチオニンを接触させることを特徴とする共生促進方法。
請求項１記載の共生促進剤とアーバスキュラー菌根菌とを含む微生物資材。