JP6998470B2 - Ｆｏｌｒ１に特異的に結合する抗体及びその用途 - Google Patents
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Description
本発明は、ＦＯＬＲ１（ｆｏｌａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ）に特異的に結合してＦＯＬＲ１の活性を遮断する抗体に関し、既存抗体の結合能を向上させることによって抗原に対する結合能を著しく増加させた変形抗体に関する。より詳細には、ＦＯＬＲ１に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片、前記抗体又はその抗原結合断片を含む抗体－薬物接合体、これを含む癌の予防又は治療用医学組成物及び疾病の診断用組成物に関する。
ＦＯＬＲ１（ｆｏｌａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ）は、正常上皮細胞では低－中等度の量で発現し、様々な癌腫、特に卵巣癌、乳癌、肺癌、腎臓癌、結腸直膓癌、子宮内膜癌のような特定上皮由来癌で過多発現するタンパク質であり、特に卵巣癌の９０％以上で過発現してそれを標的にする癌の治療に有用である（Ｓｕｄｉｍａｃｋ ａｎｄ Ｌｅｅ，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．２０００，４１，１４７－１６２）。治療用抗体の代表例に、米国特許第２００９／２７４６９７号（国際公開第２００５／０８０４３１号）に記載されたファーレツズマブ（ｆａｒｌｅｔｕｚｕｍａｂ）（ＭＯＲＡｂ－００３）は、ＦＯＬＲ１を標的にするヒト化された（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）単一クローン抗体であり、Ｍｏｒｐｈｏｔｅｋ Ｉｎｃ．で開発され、卵巣癌の潜在的な治療剤として報告されている。ファーレツズマブは略２ｎＭのＫＤ値の結合親和度でＦＯＬＲ１と結合するものと知られている（Ｇｒａｓｓｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎ．２００７，７，６）。
このような治療用抗体は典型的に低い免疫原性（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）、高い親和度及び特異性、最適のエフェクター（ｅｆｆｅｃｔｏｒ）機能、優れた溶解度及び安定性のような生物学的、物理化学的性質を有するように広範囲に操作される。特に、抗体ヒト化（ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ）及び親和性成熟（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）は、治療用抗体候補物質の開発において最も頻繁に適用される工程である。抗体ヒト化方法は、ヒト以外の動物抗体の相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ，ＣＤＲ）をヒト抗体のＣＤＲに置換する方法である。ヒト化抗体の問題点は、非ヒト動物抗体の高い免疫原性、低いエフェクター機能、短い血中半減期などのマウス抗体などが持つ問題である。このような問題を解決して単一クローン抗体を医薬品として開発しており、既に様々なヒト化抗体が治療用抗体として許可され販売されている。これらのヒト化抗体は実際に臨床である程度効果を示してはいるが、より効果の高い抗体医薬品が要求されている実情であり、本来、ヒト抗体に比べて抗原に対する結合能が劣ることも事実である。このような問題は、ヒト受容体配列上にマウスのＣＤＲを直接移植することに起因する親和性の損失によって発生することがあるので、ＣＤＲやＣＤＲループの構造を支持するフレームワーク領域（Ｆｒａｍｅ ｒｅｇｉｏｎ，ＦＲ）残基の突然変異がしばしば必要である。
このような側面で抗体の効能向上のための抗体工学技術の応用が要求される。特に、抗原に対する抗体の親和度を成熟させる親和性成熟（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）方法がある。親和性成熟は、無作為突然変異を抗体遺伝子に導入して抗原に対する抗体の結合親和性を増加させる技術のことを指し、効果的な治療及び診断用抗体新薬の開発に非常に有用に用いることができる。試験管内親和性成熟のために、一般的に３つの接近方法が用いられる。エラーを起こしやすいＰＣＲ（ｅｒｒｏｒ－ｐｒｏｎｅ ＰＣＲ）、退化されたオリゴヌクレオチドを使用する標的残基のランダム化及び鎖シャッフリング（ｃｈａｉｎ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）を含む。標的残基として選択できる部分はＣＤＲであり、特にＣＤＲ－Ｈ３及びＣＤＲ－Ｌ３が抗体－抗原相互作用を支配する傾向があるので、無作為化のための論理的標的となる。標的となる抗体遺伝子ＣＤＲ部位にあるアミノ酸を変化させることによって抗体の結合親和性を高めるわけである。この方法によってＡＫＡ（ｔｕｍｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ７２と結合するヒト化抗体）のＣＤＲ－Ｈ３にあるアミノ酸を変化させて結合親和性を２２倍増加させた報告があり（Ｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００６，２８１，６９８５－６９９２）、Ｂ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ）抗原に対して開発された抗体も結合親和性を６倍まで増加させた報告がある（Ｈｏｎｇ ｅｌ ａｌ．，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００７，４５，５２８－５３３）。
ＣＤＲ部位に無作為に配置されたアミノ酸を持つ配列の集合をライブラリーということができ、ライブラリー内にそれぞれの抗体が存在するので、それらから抗体を選別する作業が必要である。ライブラリーから抗体を選別する方法の最も効果的な技術の一つは、ファージディスプレイ（phage display）技術である。この技術は、ファージ表現型とそれをカプセル化した遺伝子型間の直接的な連関性をベースにしていて、これはファージ表面上に分子ライブラリーの提示を誘導する。ファージディスプレイは、タンパク質－リガンド相互作用、受容体結合部位及びそれらの結合パートナーに対するタンパク質の親和性を改善又は変形させるのに用いられる。
ファージディスプレイは、遺伝子型選択と表現型を連結する遺伝子配列が入っているファージコートタンパク質との融合によって繊維状ファージ表面から選択されたタンパク質の発現を伴う。抗体ライブラリーと結合するとき、ファージディスプレイは抗原特異的抗体の迅速な試験管内選択及び相応する暗号化配列の回収を許容する。大規模非免疫及び合成ヒトライブラリーは、単一個人免疫レパートリーキャプチャーに基づく、より小さい免疫ライブラリーと共に構築された。完全に体外処理過程は、動物免疫によって得られないものだけでなく、免疫原性の低い標的に対する抗体の分離を許容して接近法の有用性をさらに拡大させた。ファージ抗体ディスプレイは、抗体候補物質に対する高い処理量（ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ）スクリーニングのために初期に開発された方法である。最近では、単一Ｂ細胞スクリーニング、次世代ゲノムシークエンシング及びヒト胚幹細胞Ｂ型肝炎遺伝子を持つ形質転換（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ）マウスのような完全ヒト治療用抗体の生成のための他の方法が開発された。これらはそれぞれ特別な利点を有するが、ファージディスプレイはｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる過程という特性上、スクリーニング方法の容易性及び汎用性という側面においてヒト抗体発見のための核心方法として残っている。また、ファージディスプレイを用いて抗体を選別する方法であるパンニングは、免疫チューブに抗原を固定させた後、ファージ表面に発現した抗体ライブラリーを免疫チューブに添加し、洗浄及び溶出過程を経て結合した抗体だけを選別する過程をいう。抗原と結合したり結合しないＦａｂを運搬するファージは洗浄を反復することによって分離される。抗原結合ファージはｐＨ変化又はプロテアーゼ分解によって溶出され、抗原結合クローンが豊富な新しいライブラリーを製造可能な大腸菌に再び感染される。この過程を複数反復した後、抗体ライブラリーは十分に濃縮され、個別クローンを、単一クローンファージとして発現した大腸菌から分離し、試験し、配列化し、特異的抗体を発現させることができる。
このような技術的背景下で、本発明者らは、ＦＯＬＲ１に対する抗体の効能を向上させるために、結合能に優れた抗体に対する開発が切実に要求されていることを認識し、相補決定領域に変異を導入してＦＯＬＲ１との結合能が改善された抗体を発明した。親和性成熟を用いて親抗体の重鎖及び軽鎖可変領域内のＣＤＲ部位にアミノ酸変異を誘発させた抗体ライブラリーを作製し、ファージディスプレイ技術でＦＯＬＲ１に対する結合親和度を向上させた個別抗体を選別することによって本発明を完成した。
本背景技術の部分に記載された前記情報は単に本発明の背景に対する理解を向上させるためのものであり、したがって、本発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者にとって既に知られた先行技術を形成する情報を含まないことができる。
本発明の目的は、ＦＯＬＲ１に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片、及び前記抗体に対して抗原との結合能がより改善された抗体を提供することにある。
本発明の他の目的は、前記抗体又はその抗原結合断片に、薬物が接合された抗体－薬物接合体を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、前記抗体又はその抗原結合断片又は前記抗体－薬物接合体を含む癌の予防又は治療用医学組成物を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、前記抗体又はその抗原結合断片又は前記抗体－薬物接合体を投与することを特徴とする癌の治療方法を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、癌の治療のための前記抗体又はその抗原結合断片又は前記抗体－薬物接合体の用途、及び癌の治療用薬剤の製造のための前記抗体又はその抗原結合断片又は前記抗体－薬物接合体の使用を提供する。
本発明のさらに他の目的は、前記抗体又はその抗原結合断片を含む疾病の診断用組成物及び診断方法を提供することにある。
前記目的を達成するために、本発明は、ＦＯＬＲ１（ｆｏｌａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－α）に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を提供する。
好ましくは、前記抗体又はその抗原結合断片は６個の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、前記抗体又はその抗原結合断片は配列番号３の重鎖ＣＤＲ１；配列番号４の重鎖ＣＤＲ２；配列番号５又は配列番号２８の重鎖ＣＤＲ３；及び配列番号６又は配列番号２９の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号７又は配列番号３０の軽鎖ＣＤＲ２；配列番号８の軽鎖ＣＤＲ３を含むことを特徴とし得る。
本発明はまた、前記抗体又はその抗原結合断片を含む抗体－薬物接合体を提供する。
本発明はまた、前記抗体又はその抗原結合断片又は前記抗体－薬物接合体を含む癌の予防又は治療用医学組成物を提供する。
本発明はまた、前記抗体又はその抗原結合断片又は前記抗体－薬物接合体を投与することを特徴とする癌の治療方法を提供する。
本発明はまた、癌の治療のための前記抗体又はその抗原結合断片又は前記抗体－薬物接合体の用途及び癌の治療用薬剤の製造のための前記抗体又はその抗原結合断片又は前記抗体－薬物接合体の使用を提供する。
本発明はまた、前記抗体又はその抗原結合断片を含む疾病の診断用組成物及び診断方法を提供する。
特に定義されない限り、本明細書で使われた技術的及び科学的用語はいずれも、本発明が属する技術の分野における熟練した専門家によって通常理解されるのと同じ意味を有する。一般に、本明細書で使われた命名法は、本技術分野でよく知られており、通常使用されるものである。
抗体の抗原結合断片又は抗体断片とは、抗原結合機能を保有している断片を意味し、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖなどを含む。抗体断片のうち、Ｆａｂは、軽鎖及び重鎖可変領域と軽鎖の定常領域及び重鎖の最初の定常領域（ＣＨ１）を有する構造であり、１個の抗原結合部位を有する。Ｆａｂ’は、重鎖ＣＨ１ドメインのＣ末端に一つ以上のシステイン残基を含むヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ ｒｅｇｉｏｎ）を有するという点でＦａｂと異なる。Ｆ（ａｂ’）２抗体は、Ｆａｂ’のヒンジ領域のシステイン残基がジスルフィド結合をなしながら生成される。Ｆｖは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域だけを持っている最小の抗体片であり、Ｆｖ断片を生成する組換え技術はＰＣＴ国際公開特許出願ＷＯ８８／１０６４９、ＷＯ８８／１０６６３０、ＷＯ８８／０７０８５、ＷＯ８８／０７０８６及びＷＯ８８／０９３４４に開示されている。
本発明で使用した抗体の可変領域は、抗体の重鎖部分に３個のＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３）があり、抗体の軽鎖部分に３個のＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、及びＣＤＲ－Ｌ３）を含む。それらはいずれもループを構成しており、抗原と特異的に結合する部位である。
本発明は一つの側面において、ＦＯＬＲ１（Ｆｏｌａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－α）に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片に関する。
本発明において、前記抗体又はその抗原結合断片は、ＦＯＬＲ１の生物学的活性を抑制することを特徴とし得る。また、前記抗体又はその抗原結合断片は、ＦＯＬＲ１を発現する細胞の抗体依存性細胞傷害活性（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）を誘導することを特徴とし得る。また、前記抗体又はその抗原結合断片は、ＦＯＬＲ１に対する結合分離定数（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｃｏｎｓｔａｎｔ）が１×１０－７Ｍ以下であることを特徴とし得る。
本明細書で使われる用語、“親抗体”とは、ＦＯＬＲ１に特異的に結合するＦＯＬＲ１の抗体であり、先行出願特許（ＵＳ２００５／０２３２９１９Ａ１）で出願された抗体を用いた。本明細書の“親抗体”は、前記先行出願特許で明記された抗体のうち、重鎖の配列は下の配列番号１に該当し、軽鎖の配列は下の配列番号２に該当する。
重鎖（配列番号１）
EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCSASGFTFSGYGLSWVRQAPGKGLEWVAM
ISSGGSYTYYADSVKGRFAISRDNAKNTLFLQMDSLRPEDTGVYFCARHG
DDPAWFAYWGQGTPVTVSS
軽鎖（配列番号２）
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSVSSSISSNNLHWYQQKPGKAPKPWIY
GTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQWSSYPYMYT
FGQGTKVEIK
重鎖（配列番号１）
EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCSASGFTFSGYGLSWVRQAPGKGLEWVAM
ISSGGSYTYYADSVKGRFAISRDNAKNTLFLQMDSLRPEDTGVYFCARHG
DDPAWFAYWGQGTPVTVSS
軽鎖（配列番号２）
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSVSSSISSNNLHWYQQKPGKAPKPWIY
GTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQWSSYPYMYT
FGQGTKVEIK
本発明の範囲には、ＦＯＬＲ１に特異的に結合する完全な抗体形態（ｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ ＩｇＧ）だけでなく、前記抗体分子の抗原結合断片（ｆｒａｇｍｅｎｔｅｄ ＩｇＧ）も含まれる。本発明で用いる親抗体は、配列番号３～８の配列で表示されるＣＤＲを含む。
したがって、本発明において、前記抗体又はその抗原結合断片は、配列番号３の重鎖ＣＤＲ１；配列番号４の重鎖ＣＤＲ２；配列番号５の重鎖ＣＤＲ３；及び配列番号６の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号７の軽鎖ＣＤＲ２；配列番号８の軽鎖ＣＤＲ３を含むことを特徴とし得る。
本発明において親抗体に基づくＣＤＲライブラリーは、ＰＣＴ国際公開特許出願ＷＯ１６／１１４５６７ＤＰに記載の通りに作製し、作製されたライブラリー遺伝子を導入したｐＣｏｍｂ３Ｘベクターはファージミドベクターであって、ファージ複製始点（ｐｈａｇｅ ｏｒｉｇｉｎ ｏｆ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）を有するプラスミドＤＮＡであり、またファージ表面タンパク質であるｐＩＩＩが含まれている。ライブラリー遺伝子はｐＩＩＩ遺伝子の５’末端にライゲーションされ、Ｅ．ｃｏｌｉで融合タンパク質として発現される。ＶＣＳＭ１３ヘルパーファージは、ファージミドがファージ粒子に組み立てられるように必要な遺伝情報を提供するファージであり、カナマイシンである抗生剤耐性遺伝子を含み、ヘルパーファージに感染されたＥ．ｃｏｌｉを選択可能にしている。
また、パンニングは、ファージ表面にディスプレイされた抗体などのタンパク質のライブラリーから特定分子に結合するクローンだけを選択的に増幅させる過程のことを指し、表面に固定された標的分子にファージライブラリーを加えて結合を誘導し、結合していないファージクローンを洗浄して除去した後、結合したファージクローンだけを溶出して再びＥ．ｃｏｌｉに感染させ、ヘルパーファージを用いて標的結合ファージクローンを増幅する手順を経る。このような過程を反復して、表面固定された標的分子に対する標的結合ファージクローンの結合力が高いクローンを選別的に増幅させる。
本発明において用語“変形抗体”は、“親抗体”を改変して作った抗体であり、また、本発明は変形抗体を分離及び精製する方法を提供する。前記抗体タンパク質を生産する条件で培養した培養液を遠心分離して不純物を除去し、その結果物を親和クロマトグラフィーを用いて精製できる。
また、本発明の変形抗体は、ＦＯＬＲ１と結合する結合力（ｂｉｎｄｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｙ）を有する。ＦＯＬＲ１結合力は、ＥＬＩＳＡ法、ＳＰＲ（表面プラズモン共鳴法）などを用いて測定できる。具体的には、プレートに固定化されたＦＯＬＲ１に抗体組成物を一定濃度間隔で反応させた後、その抗体を認識する標識抗体をさらに反応させ、ＦＯＬＲ１に結合した抗体組成物の結合可能濃度を計算することによって測定できる。この測定から、単一よりは多重ＣＤＲライブラリーから得た抗体の結合能がより多く改善されたことが確認できた。
本発明の一実施例において、前記変形抗体は、親抗体から変形された配列番号２８の重鎖ＣＤＲ３；配列番号２９の軽鎖ＣＤＲ１；又は配列番号３０の軽鎖ＣＤＲ２を含むことを特徴とし得る。
したがって、本発明において、前記抗体又はその抗原結合断片は、配列番号３の重鎖ＣＤＲ１；配列番号４の重鎖ＣＤＲ２；配列番号５又は配列番号２８の重鎖ＣＤＲ３；及び配列番号６又は配列番号２９の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号７又は配列番号３０の軽鎖ＣＤＲ２；配列番号８の軽鎖ＣＤＲ３を含むことを特徴とし得る。
本発明において、前記抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１又は配列番号３１の重鎖可変領域；及び配列番号２及び配列番号３２～３４からなる群から選ばれる軽鎖可変領域を含むことを特徴とし得る。好ましくは、配列番号１の重鎖可変領域及び配列番号３２の軽鎖可変領域；配列番号１の重鎖可変領域及び配列番号３３の軽鎖可変領域；配列番号１の重鎖可変領域及び配列番号３４の軽鎖可変領域；配列番号３１の重鎖可変領域及び配列番号２の軽鎖可変領域；又は配列番号３１の重鎖可変領域及び配列番号３２の軽鎖可変領域を含むことを特徴とし得る。
本発明は他の観点において、前記抗体又はその抗原結合断片に薬物が接合された抗体－薬物接合体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ，ＡＤＣ）に関する。
抗体－薬物接合体（ＡＤＣ）は、ターゲット癌細胞に抗癌薬物を伝達するまで抗癌薬物が抗体に安定的に結合していなければならない。ターゲットに伝達された薬物は抗体から遊離してターゲット細胞の死滅を誘導する必要がある。そのためには、薬物が抗体に安定的に結合すると同時にターゲット細胞から遊離する時はターゲット細胞の死滅を誘導するに十分な細胞毒性を有する必要がある。
本発明において、前記抗体又はその抗原結合断片と抗癌剤などの薬物を含む細胞毒性物質は互いに結合（例えば、共有結合、ペプチド結合など）して接合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）又は融合タンパク質（細胞毒性物質及び／又は標識物質がタンパク質である場合）の形態で用いられ得る。前記細胞毒性物質は癌細胞、特に固形癌細胞に対して毒性を有する全ての物質であり得、放射線同位元素、細胞毒素化合物（ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）、細胞毒性タンパク質、抗癌剤などからなる群から選ばれる１種以上であり得るが、これに制限されるものではない。前記細胞毒素タンパク質は、リシン（ｒｉｃｉｎ）、サポリン（ｓａｐｏｒｉｎ）、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、モモルジン（ｍｏｍｏｒｄｉｎ）、デブーガニン（ｄｅｂｏｕｇａｎｉｎ）、ジフテリア毒素、緑膿菌毒素（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｔｏｘｉｎ）などからなる群から選ばれる１種以上であり得るが、これに制限されるものではない。前記放射線同位元素は、１３１Ｉ、１８８Ｒｈ、９０Ｙなどからなる群から選ばれる１種以上であり得るが、これに制限されるものではない。前記細胞毒素化合物は、ズオカルマイシン（ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎ）、モノメチルオーリスタチンＥ（ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌ ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｅ；ＭＭＡＥ）、モノメチルオーリスタチンＦ（ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌ ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｆ；ＭＭＡＦ）、Ｎ２’－ジアセチル－Ｎ２’－（３－メルカプト－１－オキソプロピル）メイタンシン（Ｎ２’－ｄｅａｃｅｔｙｌ－Ｎ２’－（３－ｍｅｒｃａｐｔｏ－１－ｏｘｏｐｒｏｐｙｌ）ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ；ＤＭ１）、ＰＢＤ（Ｐｙｒｒｏｌｏｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅ）ダイマーなどからなる群から選ばれる１種以上であり得るが、これに制限されるものではない。
本発明において、前記抗体－薬物接合体は、本発明が属する技術分野によく知られた技術によるものであり得る。
本発明において、前記抗体－薬物接合体は、前記抗体又はその抗原結合断片がリンカーで薬物と結合することを特徴とし得る。
本発明において、前記リンカーは、切断性リンカー又は非切断性リンカーであることを特徴とし得る。
前記リンカーは抗体と薬物とを連結する部位であり、例えば、前記リンカーは細胞内条件で切断可能な形態、すなわち、細胞内環境で抗体から薬物がリンカーの切断によって放出されるようにする。
前記リンカーは、細胞内環境、例えば、リソソーム又はエンドソームに存在する切断剤によって切断されるものであり得、細胞内ペプチダーゼ又はプロテアーゼ酵素、例えばリソソーム又はエンドソームプロテアーゼによって切断されるペプチドリンカーであり得る。一般的に、ペプチドリンカーは少なくとも２個以上のアミノ酸を有する。前記切断剤は、カテプシンＢ及びカテプシンＤ、プラスミンを含むことができ、ペプチドを加水分解して薬物を標的細胞内に放出できるようにする。前記ペプチドリンカーはチオール依存性プロテアーゼカテプシン－Ｂによって切断されることができ、これは癌組織で高発現し、例えばＰｈｅ－Ｌｅｕ又はＧｌｙ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙリンカーが用いられ得る。また、前記ペプチドリンカーは、例えば細胞内プロテアーゼによって切断され得るものであり、Ｖａｌ－Ｃｉｔリンカー又はＰｈｅ－Ｌｙｓリンカーであり得る。
本発明において、前記切断性リンカーはｐＨに敏感であり、特定ｐＨ値で加水分解に敏感であり得る。一般的に、ｐＨ敏感性リンカーは、酸性条件で加水分解され得るものを示す。例えば、リソソームで加水分解され得る酸性不安定リンカー、例えば、ヒドラゾン、セミカルバゾン、チオセミカルバゾン、シス－アコニットアミド（ｃｉｓ－ａｃｏｎｉｔｉｃ ａｍｉｄｅ）、オルソエステル、アセタール、ケタールなどであり得る。
前記リンカーは還元条件で切断されてもよく、例えば、二硫化リンカーがそれに該当できる。ＳＡＴＡ（Ｎ－ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ－Ｓ－ａｃｅｔｙｌｔｈｉｏａｃｅｔａｔｅ）、ＳＰＤＰ（Ｎ－ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ－３－（２－ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）、ＳＰＤＢ（Ｎ－ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ－３－（２－ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｂｕｔｙｒａｔｅ）及びＳＭＰＴ（Ｎ－ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ－ｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ－ａｌｐｈａ－ｍｅｔｈｙｌ－ａｌｐｈａ－（２－ｐｙｒｉｄｙｌ－ｄｉｔｈｉｏ）ｔｏｌｕｅｎｅ）を用いて様々な二硫化結合を形成できる。
本発明において、前記薬物及び／又は薬物－リンカーは、抗体のリシンを介して無作為に接合されたり、或いは二硫化結合鎖を還元した時に露出されるシステインを介して接合され得る。場合によって、遺伝工学的に作製されたタグ、例えば、ペプチド又はタンパク質に存在するシステインを介してリンカー－薬物が結合してもよい。前記遺伝工学的に作製されたタグ、例えば、ペプチド又はタンパク質は、例えば、イソプレノイドトランスフェラーゼによって認識され得るアミノ酸モチーフを含むことができる。前記ペプチド又はタンパク質は、ペプチド又はタンパク質のカルボキシ末端で欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）を持つか、ペプチド又はタンパク質のカルボキシ（Ｃ）末端にスぺーサーユニットの共有結合による付加を持つ。前記ペプチド又はタンパク質はアミノ酸モチーフと直接共有結合したり、或いはスぺーサーユニットと共有結合してアミノ酸モチーフと連結され得る。前記アミノ酸スぺーサーユニットは１～２０個のアミノ酸で構成され、特にグリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ）ユニットが好ましい。
前記リンカーはリソソームで多数存在したり、或いはいくつかの腫瘍細胞で過発現するベータ－グルクロニダーゼ（β－ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ）によって認識されて加水分解されるベータ－グルクロニドリンカーを含むことができる。ペプチドリンカーとは違い、親水性（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｉｔｙ）が大きいので、疎水性の性質が高い薬物と結合時に抗体－薬物複合体の溶解度を増加させることができるという長所がある。
これに関連して、本発明では、大韓民国特許公開公報第２０１５－０１３７０１５号に開示されたベータ－グルクロニドリンカー、例えば自己犠牲基（ｓｅｌｆ－ｉｍｍｏｌａｔｉｖｅ ｇｒｏｕｐ）を含むベータ－グルクロニドリンカーを用いることができる。
また、前記リンカーは、例えば非切断性リンカーであり得、抗体加水分解の一段階だけによって薬物が放出され、例えばアミノ酸－リンカー－薬物複合体を生産する。このような類型のリンカーは、チオエーテル基又はマレインアミドカプロイル（ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌ）基であり得、血液内安定性を維持できる。
本発明において、前記薬物は、化学療法剤、毒素、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又は放射性同位元素であることを特徴とし得る。前記薬物は薬理学的効果を示す製剤であり、抗体に結合し得る。
前記化学療法剤は細胞毒性製剤又は免疫抑制剤であり得る。具体的に、マイクロチューブリン抑制剤、有糸分裂抑制剤、トポイソメラーゼ抑制剤、又はＤＮＡインターカレーターとして機能が可能な化学療法剤を含むことができる。また、免疫調節化合物、抗癌剤、抗ウイルス剤、抗バクテリア剤、抗真菌剤、駆虫剤又はこれらの組合せを含むことができる。
前記薬物には、例えば、メイタンシノイド、オーリスタチン、アミノプテリン、アクチノマイシン、ブレオマイシン、サリドマイド、カンプトテシン、Ｎ８－アセチルスペルミジン、１－（２クロロエチル）－１，２－ジメチルスルホニルヒドラジド、エスペラマイシン、エトポシド、６－メルカプトプリン、ドラスタチン、トリコテセン、カリケアミシン、タキソール（ｔａｘｏｌ）、タキサン、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、ドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、メトトレキサート、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ドキソルビシン、メルファラン、クロランブシル、ズオカルマイシン、Ｌ－アスパラギナーゼ（Ｌ－ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ）、メルカプトプリン（ｍｅｒｃａｐｔｏｐｕｒｉｎｅ）、チオグアニン（ｔｈｉｏｇｕａｎｉｎｅ）、ヒドロキシウレア（ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ）、シタラビン（ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、イホスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、ニトロソウレア（ｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅａ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、マイトマイシン（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ；マイトマイシンＡ、マイトマイシンＣ）、ダカルバジン（ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ）、プロカルバジン（ｐｒｏｃａｒｂａｚｉｎｅ）、トポテカン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、窒素マスタード（ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｍｕｓｔａｒｄ）、シトキサン（ｃｙｔｏｘａｎ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、５－フルオロウラシル（５－ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、ＣＮＵ（ｂｉｓｃｈｌｏｒｏｅｔｈｙｌｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅａ）、イリノテカン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）、カンプトテシン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）、ブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）、イダルビシン（ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ダクチノマイシン（ｄａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、プリカマイシン（ｐｌｉｃａｍｙｃｉｎ）、アスパラギナーゼ（ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ）、ビノレルビン（ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）、クロランブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、メルファラン（ｍｅｌｐｈａｌａｎ）、カルムスチン（ｃａｒｍｕｓｔｉｎｅ）、ロムスチン（ｌｏｍｕｓｔｉｎｅ）、ブスルファン（ｂｕｓｕＬｆａｎ）、トレオスルファン（ｔｒｅｏｓｕｌｆａｎ）、ダカルバジン（ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、テニポシド（ｔｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）、トポテカン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、９－アミノカンプトテシン（９－ａｍｉｎｏｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）、クリスナトール（ｃｒｉｓｎａｔｏｌ）、トリメトレキサート（ｔｒｉｍｅｔｒｅｘａｔｅ）、ミコフェノール酸（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、チアゾフリン（ｔｉａｚｏｆｕｒｉｎ）、リバビリン（ｒｉｂａｖｉｒｉｎ）、ＥＩＣＡＲ（５－ｅｔｈｙｎｙｌ－１－ｂｅｔａ－Ｄｒｉｂｏｆｕｒａｎｏｓｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ－４－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、ヒドロキシウレア（ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ）、デフェロキサミン（ｄｅｆｅｒｏｘａｍｉｎｅ）、フロキシウリジン（ｆｌｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）、ドキシフルリジン（ｄｏｘｉｆｌｕｒｉｄｉｎｅ）、ラルチトレキセド（ｒａｌｔｉｔｒｅｘｅｄ）、シタラビン（ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ（ａｒａ Ｃ））、シトシンアラビノシド（ｃｙｔｏｓｉｎｅ ａｒａｂｉｎｏｓｉｄｅ）、フルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）、タモキシフェン（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）、ラロキシフェン（ｒａｌｏｘｉｆｅｎｅ）、メゲストロール（ｍｅｇｅｓｔｒｏｌ）、ゴセレリン（ｇｏｓｅｒｅｌｉｎ）、酢酸リュープロリド（ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ ａｃｅｔａｔｅ）、フルタミド（ｆｌｕｔａｍｉｄｅ）、ビカルタミド（ｂｉｃａｌｕｔａｍｉｄｅ）、ＥＢ１０８９、ＣＢ１０９３、ＫＨ１０６０、ベルテポルフィン（ｖｅｒｔｅｐｏｒｆｉｎ）、フタロシアニン（ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ）、光感作剤Ｐｅ４（ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒ Ｐｅ４）、デメトキシ－ヒポクレリンＡ（ｄｅｍｅｔｈｏｘｙ－ｈｙｐｏｃｒｅｌｌｉｎ Ａ）、インターフェロン－α（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－α）、インターフェロン－γ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－γ）、腫瘍壊死因子（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ）、ゲムシタビン（Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、ベルケイド（ｖｅｌｃａｄｅ）、レブリミド（Ｒｅｖｌｉｍｉｄ）、サロミド（ｔｈａｌｏｍｉｄ）、ロバスタチン（ｌｏｖａｓｔａｔｉｎ）、１－メチル－４－フェニルピリジニウムイオン（１－ｍｅｔｈｙｌ－４－ｐｈｅｎｙｌｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍｉｏｎ）、スタウロスポリン（ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ）、アクチノマイシンＤ（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ Ｄ）、ダクチノマイシン（ｄａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、ブレオマイシンＡ２（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ Ａ２）、ブレオマイシンＢ２（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎＢ２）、ペプロマイシン（ｐｅｐｌｏｍｙｃｉｎ）、エピルビシン（ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）、ピラルビシン（ｐｉｒａｒｕｂｉｃｉｎ）、ゾルビシン（ｚｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、ベラパミル（ｖｅｒａｐａｍｉｌ）及びタプシガルギン（ｔｈａｐｓｉｇａｒｇｉｎ）、核酸分解酵素及び細菌や動植物由来の毒素からなる群から選ばれる一つ以上であるが、これに限定されない。
本発明において、前記薬物は、リンカー及びリンカー試薬上の親電子性基と共有結合を形成するために反応可能なアミン、チオール、ヒドロキシル、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート、及びアリールヒドラジド基から構成された群から選ばれる一つ以上の親核基を含むことができる。
本発明はさらに他の観点において、前記抗体又はその抗原結合断片又は前記抗体－薬物接合体を含む癌の予防及び／又は治療用医学組成物に関する。
本発明はさらに他の観点において、前記抗体又はその抗原結合断片又は前記抗体－薬物接合体を予防又は治療が必要な患者に投与することを特徴とする癌の治療方法に関する。
本発明はさらに他の観点において、癌の治療のための前記抗体又はその抗原結合断片又は前記抗体－薬物接合体の用途に関する。
本発明はさらに他の観点において、癌の治療用薬剤の製造のための前記抗体又はその抗原結合断片又は前記抗体－薬物接合体の使用に関する。
本発明において、前記癌は、卵巣癌、乳癌、肺癌、腎臓癌、結腸癌、脳癌、直膓癌、子宮頸癌又は子宮内膜癌であることを特徴とし得るが、これに制限されるものではない。
本発明に係る抗体又はその抗原結合断片又は抗体－薬物接合体を含む医学組成物は有効成分としての前記抗体又はその抗原結合断片又は抗体－薬物接合体だけを含むものであってもよいが、通常、薬理学的に許容される一つ以上の担体と共に混合し、製剤学の技術分野で公知された任意の方法によって製造した医薬製剤として提供することが好ましい。
本発明の医学組成物は単独で使用してもよく、上述した放射性同位元素、低分子の薬剤、高分子の薬剤、タンパク質又は抗体医薬のうち少なくとも一つの治療薬を併用してもよい。また、前記医学組成物は、従来の治療剤と併用する用途に用いることができる。すなわち、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片、及びこれを含む医学的組成物は、既存の抗癌剤などの治療剤と同時に投与されたり、或いは順次に投与される用途に用いられ得る。
投与経路は、治療時に最も効果的なものを用いることが好ましく、経口投与、又は口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内又は静脈内などの非経口投与が挙げられ、好ましくは静脈内投与が挙げられる。
投与形態としては、例えば、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、坐剤、注射剤、軟膏又はテープ剤などが挙げられる。
投与量又は投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢及び体重などによって異なるが、通常、成人１日当たり１０μｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇである。
本発明に係る前記抗体又はその抗原結合断片は、ＦＯＬＲ１（ｆｏｌａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－α）に特異的に結合するので、これを用いてＦＯＬＲ１を検出又は確認することができ、ＦＯＬＲ１の発現は様々な疾病、例えば癌と関連している。
したがって、本発明は、さらに他の観点において、前記抗体又はその抗原結合断片を含む疾病の診断用組成物に関する。
本発明において、前記疾病はＦＯＬＲ１関連疾病、例えば、癌でありえるが、これに制限されるものではない。
また、本発明は、さらに他の観点において、対象から分離された生物試料に前記抗体又はその抗原結合断片を処理（投与）する段階を含む疾病の診断方法又は診断に情報を提供する方法に関する。
本発明において、前記診断方法は、前記処理する段階以降に、抗原－抗体反応の有無を確認する段階をさらに含むことができる。前記方法において、抗原－抗体反応が探知される場合、前記生物試料又は前記生物試料が由来した患者にＦＯＬＲ１関連疾病、例えば癌が存在すると決定（判断）できる。したがって、前記方法は、前記確認する段階後に、抗原－抗体反応が探知される場合、前記生物試料又は前記患者をＦＯＬＲ１関連疾病患者、例えば癌患者と決定する段階をさらに含むことができる。前記生物試料は、哺乳類、例えばヒト（例えば癌患者）から得た（分離された）細胞、組織、体液、これらの培養物などからなる群から選ばれるものであり得る。
前記抗原－抗体反応の有無を確認する段階は、当業界に公知の様々な方法によって行うことができる。例えば、通常の酵素反応、蛍光、発光及び／又は放射線検出を通じて測定でき、具体的に、免疫クロマトグラフィー（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）、免疫組織化学染色（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、酵素結合免疫吸着分析（ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ：ＥＬＩＳＡ）、放射線免疫測定法（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＲＩＡ）、酵素免疫分析（ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＥＩＡ）、蛍光免疫分析（Ｆｌｏｒｅｓｅｎｃｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＦＩＡ）、発光免疫分析（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＬＩＡ）、ウェスタンブロッティング（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）、マイクロアレイ、免疫沈降分析などからなる群から選ばれる方法によって測定できるが、これに制限されない。
このとき、前記抗体又はその抗原結合断片は標識物質をさらに含むものであり得る。前記標識物質は、放射線同位元素、蛍光物質、クロモゲン（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ）、染色物質などからなる群から選ばれる１種以上であり得る。前記標識物質は、前記抗体又は抗原結合断片に通常の方法（例えば、共有結合、配位結合、イオン結合などの化学結合）で結合（連結）したものであり得る。前記抗体（又は、抗原結合断片）と標識物質との結合は、本発明が属する技術分野によく知られた技術によるものであり得る。
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されると解釈されないことは、当業界で通常の知識を有する者にとって明らかであろう。
実施例１：ライブラリークローン選別
ＦＯＬＲ１に対する結合能改善のための最適配列を確保するために、Ｆａｂ断片を用いて親抗体に基づいてＣＤＲライブラリーを構築した。
ＦＯＬＲ１に対する結合能改善のための最適配列を確保するために、Ｆａｂ断片を用いて親抗体に基づいてＣＤＲライブラリーを構築した。
実施例１－１：親抗体Ｆａｂ鋳型作製
親抗体の軽鎖及び重鎖においてそれぞれ可変領域を合成し、ｐＣｏｍｂ３Ｘ－ＴＴから定常領域を合成した。ＰＣＲ条件は、９４℃で２分間、前変性化（ｐｒｅ－ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）し、９４℃３０秒、５６℃３０秒、７２℃３０秒で２５サイクル反応した後、７２℃で７分間反応した。ＰＣＲ反応の鋳型が一つの場合、１００ｎｇを使用し、二つの場合、それぞれ３μＬずつ混ぜた混合物を使用し、プライマーは２０ｐＭ濃度で３μＬずつ使用し、ｄＮＴＰは０．０５ｍＭ、Ｔａｑ重合酵素は０．５μＬ（２．６ｕｎｉｔ）、反応体積は１００μＬである。反応完了後、増幅の有無は１％アガロースゲル電気泳動で確認し、Ｑｉａｇｅｎゲル抽出キットを用いて精製し、２次及び３次ＰＣＲは、前記増幅された部分を鋳型として次の重複型ＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応産物は、Ｑｉａｇｅｎゲル抽出キットを用いてアガロースゲルでＤＮＡを精製し、ＳｆｉＩ制限酵素で切断した後、再びゲル抽出（ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）を行った。ＳｆｉＩ切断された抗体遺伝子１５３ｎｇとＳｆｉＩ切断されたｐＣｏｍｂ３Ｘベクター１３６ｎｇを混合した後、１０Ｘ Ｔ４ ＤＮＡライゲーションバッファーとリガーゼ１０ｕｎｉｔを添加して室温で３時間反応した後、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αセルに４２℃で４５秒間ヒートショックを与え、３７℃で１．５時間培養する方法で形質転換して得たコロニーから、５０ｋＤａサイズを有するＦａｂ断片からなる抗体ライブラリー作製用鋳型を確保した。
親抗体の軽鎖及び重鎖においてそれぞれ可変領域を合成し、ｐＣｏｍｂ３Ｘ－ＴＴから定常領域を合成した。ＰＣＲ条件は、９４℃で２分間、前変性化（ｐｒｅ－ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）し、９４℃３０秒、５６℃３０秒、７２℃３０秒で２５サイクル反応した後、７２℃で７分間反応した。ＰＣＲ反応の鋳型が一つの場合、１００ｎｇを使用し、二つの場合、それぞれ３μＬずつ混ぜた混合物を使用し、プライマーは２０ｐＭ濃度で３μＬずつ使用し、ｄＮＴＰは０．０５ｍＭ、Ｔａｑ重合酵素は０．５μＬ（２．６ｕｎｉｔ）、反応体積は１００μＬである。反応完了後、増幅の有無は１％アガロースゲル電気泳動で確認し、Ｑｉａｇｅｎゲル抽出キットを用いて精製し、２次及び３次ＰＣＲは、前記増幅された部分を鋳型として次の重複型ＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応産物は、Ｑｉａｇｅｎゲル抽出キットを用いてアガロースゲルでＤＮＡを精製し、ＳｆｉＩ制限酵素で切断した後、再びゲル抽出（ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）を行った。ＳｆｉＩ切断された抗体遺伝子１５３ｎｇとＳｆｉＩ切断されたｐＣｏｍｂ３Ｘベクター１３６ｎｇを混合した後、１０Ｘ Ｔ４ ＤＮＡライゲーションバッファーとリガーゼ１０ｕｎｉｔを添加して室温で３時間反応した後、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αセルに４２℃で４５秒間ヒートショックを与え、３７℃で１．５時間培養する方法で形質転換して得たコロニーから、５０ｋＤａサイズを有するＦａｂ断片からなる抗体ライブラリー作製用鋳型を確保した。
実施例１－２：抗体ライブラリー作製
相補性決定領域に人為的に多様性を導入してライブラリーを作製した。（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／）に記述された 内容から所定の抗体のＣＤＲ及びＦＲが確認できる。
相補性決定領域に人為的に多様性を導入してライブラリーを作製した。（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／）に記述された 内容から所定の抗体のＣＤＲ及びＦＲが確認できる。
実施例１－１で作製された鋳型に基づいて親抗体のＣＤＲ配列をランダム化させたライブラリーを作製したが、親抗体の６個のＣＤＲのうちＣＤＲ－Ｈ２は他のＣＤＲに比べて長さが長いため実験に扱い難く、除外することにした。親抗体のＣＤＲ配列は表１の通りである。
抗原との結合領域内特定位置をランダム化させるために混合塩基コード（Ｍｉｘ ｂａｓｅ ｃｏｄｅ）を用いてプライマーを作製した（表２）。混合塩基コードは縮重プライマーであり、塩基配列上の類似性を考慮して類似の塩基配列に結合可能な１つの位置に２つ以上の塩基が存在するオリゴヌクレオチドをいう。プライマーを作製するに先立ち、ランダム化させる特定位置を決定するために親抗体のＣＤＲ配列分析を通じて保存（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ）残基を確認し、また、この残基を除外した部分のコドンを多様化させるために混合塩基コードを用いたプライマーを作製した。
親抗体ＣＤＲ－Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｈ１、Ｈ２部分のコドンランダム化はＰＣＲで増幅し、これを、同様にＰＣＲ増幅されたＣＤＲ部位ＤＮＡと重複伸長ＰＣＲ（ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ＰＣＲ）を通じて連結することによって、１つのＣＤＲにのみ多様性を有する単一ＣＤＲライブラリーと２つのＣＤＲに多様性を有する多重ライブラリーを作製した。ＰＣＲ条件は、９４℃で２分間、前変性化し、９４℃で３０秒、５６℃で３０秒、７２℃で３０秒で２５サイクル反応した後、７２℃で７分間反応した。ただし、７２℃での延長時間は予測されるＤＮＡ切片結果物の長さによって１分３０秒或いは２分に調整した。具体的に、予測される長さが５００～１，５００ｂｐの場合には１分３０秒、１，５００～２，０００ｂｐの場合には２分の延長時間を使用した。これらの過程に使用した鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）、プライマー及び産物名を表３に整理した。作製された単一或いは多重ＣＤＲライブラリーは１％アガロースゲル電気泳動によって分離精製し、これをＳｆｉＩ制限酵素で５０℃で１２時間以上処理して切断し、同じ方式でｐＣｏｍｂ３ＸファージミドベクターもＳｆｉＩ制限酵素で切断した。
ライゲーションは、ＳｆｉＩ切断されたベクターとインサートを同量混ぜて常温で一晩反応させた。ライゲーション産物体積が形質転換するには多い場合、ＥｔＯＨ沈殿を用いてライゲーション産物体積を減らすことができ、方法は次の通りである。５０μＬのライゲーション産物に５μＬ（１／１０）の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）と１１０μＬ（２倍）の１００％ＥｔＯＨを入れ、－２０℃で２時間以上ＤＮＡを沈殿させた。沈殿したＤＮＡを１２，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離後に１ｍｌの７０％ＥｔＯＨで洗浄し、同じ条件で遠心分離してペレットを乾燥させた後、１０μＬの純水で溶解させた。形質転換は電気穿孔法で行うが、ライゲーション産物１０μＬとＥ．ｃｏｌｉ ＴＧ１コンピテント細胞５０μＬを混合後に冷却させ、準備した０．２ｃｍキュベットに入れて電気穿孔機に位置させた後、２．５ｋＶで４～５ｍｓｅｃ間パルスを与えた。パルスの直後に、３７℃に準備した２ｍＬの回復培地を添加し、３７℃で１時間培養した後、その１μＬをＳＢ培地で１０００倍希釈して１０μＬと１００μＬをＬＢ寒天平板に分注してライブラリーサイズ確認用に用意し、残りは一つの平板に全て分注して３７℃で一晩培養した。翌日、希釈して分注した平板内コロニー数を確認してライブラリーサイズを確認した。また、希釈せずに全て分注した平板に５ｍＬのＳＢ培地を添加し、スプレッダーを用いて細胞を全て集めた後、０．５体積（ｖｏｌｕｍｅ）の５０％グリセロールを添加して冷凍庫（ｄｅｅｐ ｆｒｅｅｚｅｒ）（－７５℃）に保管した。
取得したライブラリーのサイズは変形（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）効率であり、個別クローン（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｃｌｏｎｅ）数を意味する。結果的に、ライブラリーサイズ程度の抗原結合多様性が存在するということができる。すなわち、ＣＤＲ－Ｌ１ライブラリーは１０６、ＣＤＲ－Ｌ２は１０７、ＣＤＲ－Ｌ３は１０７、ＣＤＲ－Ｈ１は１０６、ＣＤＲ－Ｈ３は１０８、ＣＤＲ－Ｌ３Ｈ３は１０７である多様性を持つライブラリーを作製した（表４）。
実施例１－３：ファージディスプレイを用いたパンニング後にＥＬＩＳＡによる選別
ヒトＦＯＬＲ１と結合するライブラリークローンを選別するためにパンニングを行ったが、パンニング回数が増加するほど結合能が向上したクローンが得られた。
ヒトＦＯＬＲ１と結合するライブラリークローンを選別するためにパンニングを行ったが、パンニング回数が増加するほど結合能が向上したクローンが得られた。
ライブラリー増幅及びＦａｂ発現するバクテリオファージを回収するために、１００ｕＬのライブラリーが形質転換されたＴＧ１ストックを２０ｍＬのＳＢ／Ａｍｐ＋２％グルコース培養培地に接種し、３７℃で２２０ｒｐｍで１．５～２時間ライブラリーをＥ．ｃｏｌｉ ＴＧ１細胞に発現させた。培養液を３５００ｒｐｍで１５分間遠心分離して上澄液を除去し、ペレットは２０ｍｌのＳＢ／Ａｍｐ培養培地で再懸濁させた。ここに０．５ｍＬのヘルパーファージＶＣＳＭ１３（約１０１１ｐｆｕ）を添加し、３７℃で１２０ｒｐｍで１時間培養して感染させた後、７０μｇ／ｍＬとなるようにカナマイシン（５０ｍｇ／ｍＬ）を添加して３０℃で２００ｒｐｍで１６時間培養した。培養液を遠心分離してファージが含まれた上層液に５ｍＬの５Ｘ ＰＥＧ濃縮液を添加し、氷で３０分間濃縮した。これを１２，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して上澄液を除去し、ファージペレットを０．３ｍＬのＰＢＳで再懸濁してライブラリーファージを確保した（保管する場合、５０％グリセロールを０．５ｖｏｌｕｍｅ添加して－７５℃に保管）。
確保したライブラリーファージを増幅させるために、Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＧ１細胞ストックを１０ｍＬ ＳＢ培地に接種して３７℃培養器で２２０ｒｐｍで約４～５時間培養し、中期対数期（ｍｉｄ－ｌｏｇ ｐｈａｓｅ）（ＯＤ６００＝０．５～１．０）まで培養してコンピテント細胞を用意し、使用するまで４℃に保管した。次の方法でパンニングを行った。ＦＯＬＲ１を免疫試験管に１μｇ／ｍＬでコーティング後にブロッキング溶液（３％スキムミルク）で１時間３７℃でブロッキングし、ライブラリーファージ０．５ｍＬにブロッキング溶液を１：１比率で０．５ｍＬ添加してブロッキングした後、固定された抗原と反応させた。１時間以上反応させた後、ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ２０バッファーで洗浄段階で結合していないか弱く結合したファージを除去し、強く結合したファージを１ｍＬのＴＥＡ（１００ｍＭ）で１０分間溶出させた後、０．５ｍＬのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（１Ｍ、ｐＨ７．４）で中性化させた。８．５ｍＬのコンピテント細胞に１．５ｍＬの溶出されたファージを入れて３７℃培養器で１２０ｒｐｍで１時間感染させた後、ライブラリーサイズを確認するために２ｍＬ反応液中の１ｕＬを１，０００倍及び１０，０００倍に希釈してプレーティングし、残りは１つの平板に全てプレーティングして３７℃で一晩培養した。
形質転換された大腸菌ライブラリーを培養し、ＶＣＳＭ１３ヘルパーファージで感染させてＦａｂクローンが表面提示された抗体ファージライブラリーを得た。このライブラリーを免疫試験管表面に吸着させたＦＯＬＲ１に対して３～５回パンニングを行って、ＦＯＬＲ１と強く結合するファージクローンだけを選別した。この過程によってＦＯＬＲ１と弱く結合したり合成されたＣＤＲ配列内欠陥が生じてＦＯＬＲ１と結合していないクローンは除去されるため、結果てきに欠陥がなく、既存配列に比べてより最適化されたＣＤＲ配列が選別できた。ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２ライブラリーは５次、ＣＤＲ－Ｌ３、ＣＤＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｌ３Ｈ３ライブラリーは４次、ＣＤＲ－Ｈ１ライブラリーは３次にわたってパンニングを実施し、各パンニング段階ごとにパンニングに使用したファージ（インプットファージ）に対する溶出されたファージ（アウトプットファージ）の比（Ｏ／Ｉ比）を計算して％Ｂｏｕｎｄで表５に示した。パンニング回数が増加しても％Ｂｏｕｎｄが類似の値で示されることは、ＦＯＬＲ１に対する結合能が飽和状態に達したことを意味する（表５）。このような結果が出るとそれ以上パンニングは行わず、溶出されたファージで次の段階を行う。パンニング結果の抗体ファージライブラリーの機能性を検証するために各ＣＤＲライブラリーから９４個のクローンをＥＬＩＳＡでスクリーニングした。背景信号に比して３倍以上の結合信号を示すＥＬＩＳＡ陽性クローンはそれぞれ、ＣＤＲ－Ｌ１は９２個、ＣＤＲ－Ｌ２は６６個、ＣＤＲ－Ｌ３は１９個、ＣＤＲ－Ｈ１は９４個、ＣＤＲ－Ｈ３は４８個、ＣＤＲ－Ｌ３Ｈ３は６３個を確認し、このうち、各８個を配列分析した（表６）。
実施例１－４：タンパク質発現菌株ＴＯＰ１０Ｆ’を用いたＦａｂ生産及び精製
選別したクローンのＦＯＬＲ１に対する結合能を比較するためにそれぞれ精製を行った。精製を行うに先立ち、Ｆａｂ部分だけを発現させるために宿主株をＴＧ１からＴＯＰ１０Ｆ’細胞に変えた。
選別したクローンのＦＯＬＲ１に対する結合能を比較するためにそれぞれ精製を行った。精製を行うに先立ち、Ｆａｂ部分だけを発現させるために宿主株をＴＧ１からＴＯＰ１０Ｆ’細胞に変えた。
４ｍＬ ＳＢ／アンピシリン培養培地に選別したクローンに該当するコロニーを接種して３７℃で一晩培養した。翌日、４００ｍＬ ＳＢ／アンピシリン培養培地にＯ／Ｎ培養した培養液４ｍｌを接種してＯＤ６００が０．５～１．０となる時点まで３７℃培養器で約３～４時間培養し、クローンの発現のために最終濃度１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを処理して３０℃で一晩培養した。ただし、発現確認だけをする場合は、ＳＢ／アンピシリン培養培地２０ｍＬだけを培養した。
培養液４００ｍＬからペリプラズムを回収するために培養液を遠心分離して上層液を除去後、４℃に維持した１６ｍＬの１Ｘ ＴＥＳ溶液を処理し、４℃で１時間静置をすることによって細胞を溶解させた。さらに２４ｍＬの０．２Ｘ ＴＥＳ溶液を処理して１時間静置をした後、遠心分離して上層液を回収し、ＥＤＴＡを除去するために５ｍＭ ＭｇＣｌ２を添加した。試料をロードする前に、Ｎｉ－ＮＴＡ Ｈｉｓ－Ｂｉｎｄ(R)レジン０．５ｍＬをパッキングしたカラムを溶出緩衝液（３００ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ ｉｎ ＰＢＳ、ｐＨ７．４）２０ＣＶで洗浄後、ＰＢＳを２０ＣＶ流した。試料をカラムにロードして通過画分（ｆｌｏｗ－ｔｈｒｏｕｇｈ）を集め、ロードを終えると、洗浄緩衝液（２０ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ ｉｎ ＰＢＳ、ｐＨ７．４）２０ＣＶで流して洗浄分画（ｗａｓｈｉｎｇ ｔｈｒｏｕｇｈ）を集めた後、溶出緩衝液１０ＣＶで流して溶離液（ｅｌｕｅｎｔ）を集めた。精製過程中に段階別に集めた試料を１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥにウェル当たり１５μＬずつロードして電気泳動（１５０Ｖ、１時間）した。クマシーブルー染色を通じてバンド（ｂａｎｄ）を確認した。
実施例１－５：ＦＯＬＲ１に選別したクローンの濃度別直接結合様相の確認
１次選別したクローンの結合能を相対的に比較する目的でＥＬＩＳＡをクローン濃度別に行った。方法は次の通りである。ＦＯＬＲ１を１μｇ／ｍＬで２５μＬずつ９６ウェルプレートに分注してＲＴで１時間コーティングした後、３％スキムミルク１８０μＬでＲＴで１時間ブロッキングさせた。ブロッキングする間に１次抗体として使用する試料を準備した。１次抗体としてはスクリーニングで選別した試料を使用したが、０．１～１００ｎＭ（０、０．１、０．３、１、３、１０、３０、１００ｎＭ）に希釈して準備し、使用するまで冷蔵保管した。ブロッキング後に３％スキムミルクを除去し、１次抗体を２５μＬずつ添加してＲＴで１時間以上反応させた。反応が終わった後、ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ２０（０．１％）バッファーで３回洗浄し、２次抗体でＨＡ－ＨＲＰを３％スキムミルクで３，０００倍希釈して２５μＬずつ添加し、ＲＴで１時間以上反応させた。反応が終わった後、ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ２０（０．１％）バッファーで３回洗浄し、基質ＴＭＢを２５μＬずつ添加して発色を確認した。約５分経過後、１Ｍ Ｈ２ＳＯ４を２５μＬずつ添加して反応を止め、４５０ｎｍの波長で吸光度を測定した。測定結果は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ７プログラムを通じてＥＣ（Ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）値を求めた。
１次選別したクローンの結合能を相対的に比較する目的でＥＬＩＳＡをクローン濃度別に行った。方法は次の通りである。ＦＯＬＲ１を１μｇ／ｍＬで２５μＬずつ９６ウェルプレートに分注してＲＴで１時間コーティングした後、３％スキムミルク１８０μＬでＲＴで１時間ブロッキングさせた。ブロッキングする間に１次抗体として使用する試料を準備した。１次抗体としてはスクリーニングで選別した試料を使用したが、０．１～１００ｎＭ（０、０．１、０．３、１、３、１０、３０、１００ｎＭ）に希釈して準備し、使用するまで冷蔵保管した。ブロッキング後に３％スキムミルクを除去し、１次抗体を２５μＬずつ添加してＲＴで１時間以上反応させた。反応が終わった後、ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ２０（０．１％）バッファーで３回洗浄し、２次抗体でＨＡ－ＨＲＰを３％スキムミルクで３，０００倍希釈して２５μＬずつ添加し、ＲＴで１時間以上反応させた。反応が終わった後、ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ２０（０．１％）バッファーで３回洗浄し、基質ＴＭＢを２５μＬずつ添加して発色を確認した。約５分経過後、１Ｍ Ｈ２ＳＯ４を２５μＬずつ添加して反応を止め、４５０ｎｍの波長で吸光度を測定した。測定結果は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ７プログラムを通じてＥＣ（Ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）値を求めた。
選別したクローンとＦＯＬＲ１との結合親和度を測定するために、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００を用いてＳＰＲ測定を行った。試料を注入する前にＣＭ５センサーチップを０．１Ｍ ＮＨＳ／０．４Ｍ ＥＤＣで活性化（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）させ、ＦＯＬＲ１（２０μｇ／ｍＬ ｉｎ １０ｍＭ ａｃｅｔａｔｅ ｐＨ５．０）で固定化させた後、反応していないＮＨＳは１Ｍエタノールアミンで非活性化させた。試料は、１、２、５、１０、２０、４０ｎＭで２５０μＬずつ用意して３０μｌ／ｍｉｎで流しながら結合と解離センサグラムを確認し、１０ｍＭグリシン（ｐＨ２．１）でセンサーチップを再生した。得られたセンサグラムはＢＩＡ評価用ソフトウェアで分析してＫＤ値を計算した。
実施例１－６：抗体ライブラリー配列分析
ファージライブラリーのＥＬＩＳＡを通じて選別したクローンのランダム化させた相補性決定領域の配列を糾明した。９６ウェルプレートに培養したクローンから選別した各クローンの培養液１ｕＬを鋳型としてｐＣ３Ｘ－ｆ及びｐＣ３Ｘ－ｂプライマーを用いて９４℃で２分間前変性化し、９４℃で３０秒、５６℃で３０秒、７２℃で２分で２５サイクル反応した後、７２℃で７分間反応した。増幅の有無は、１％アガロ－スゲル電気泳動で確認し、増幅されたＰＣＲ産物をＱＩＡｖａｃ ９６を用いてＤＷで精製して配列分析を依頼した。ベクター内リーダー配列を用いて相補性決定領域の配列を糾明した。
ファージライブラリーのＥＬＩＳＡを通じて選別したクローンのランダム化させた相補性決定領域の配列を糾明した。９６ウェルプレートに培養したクローンから選別した各クローンの培養液１ｕＬを鋳型としてｐＣ３Ｘ－ｆ及びｐＣ３Ｘ－ｂプライマーを用いて９４℃で２分間前変性化し、９４℃で３０秒、５６℃で３０秒、７２℃で２分で２５サイクル反応した後、７２℃で７分間反応した。増幅の有無は、１％アガロ－スゲル電気泳動で確認し、増幅されたＰＣＲ産物をＱＩＡｖａｃ ９６を用いてＤＷで精製して配列分析を依頼した。ベクター内リーダー配列を用いて相補性決定領域の配列を糾明した。
実施例２：変形抗体（ｖＡｂ）の作製
抗体ライブラリー作製方法と同一にして最終クローンｐｖＡｂを作製し、使用した鋳型とプライマーは表７に、ｖＡｂ抗体配列情報は表８～表１０に整理した。
抗体ライブラリー作製方法と同一にして最終クローンｐｖＡｂを作製し、使用した鋳型とプライマーは表７に、ｖＡｂ抗体配列情報は表８～表１０に整理した。
上記見つけたＣＤＲ配列の組合せ（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）によって変形抗体ｖＡｂ１、ｖＡｂ２、ｖＡｂ３、ｖＡｂ４、ｖＡｂ５を作製した。ｖＡｂ１はＣＤＲ－Ｈ３とＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２が全て反映された変形抗体であり、ｖＡｂ２はＣＤＲ－Ｌ１及びＣＤＲ－Ｌ２、ｖＡｂ３はＣＤＲ－Ｌ１、ｖＡｂ４はＣＤＲ－Ｌ２、ｖＡｂ５はＣＤＲ－Ｈ３が反映された変形抗体である。
実施例３：変形抗体（ｖＡｂ）の発現及び精製
変形抗体（ｖＡｂ）を生産するために、ｅｘｐｉＣＨＯ細胞に変形抗体（ｖＡｂ）タンパク質をコーディングする遺伝子を含むベクター（ｐｃ３．４－ｖＡｂＬ、ｐｃ３．４－ｖＡｂＨ）を形質感染させて培養し、親和性クロマトグラフィー（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を用いて精製した。親和性樹脂であるＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅＴＭ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をＸＫ１６カラムに充填し、バッファーＡ（２５ｍＭトリス、ｐＨ７．０、２５ｍＭ ＮａＣｌ）を流してカラムを平衡化した後、培養液を流して親和性樹脂と結合させてバッファーＢ（２５ｍＭクエン酸、ｐＨ３．５）で変形抗体（ｖＡｂ）タンパク質を溶出させた。精製の終わったカラムは０．５Ｍ ＮａＯＨで洗浄した後、２０％エタノールで満たして冷蔵保管した。溶出された試料に１Ｍのトリス（ｐＨ９．０）を適正量添加して試料のｐＨを６．０に調整した。試料の状態は１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥを通じて確認した。こうして得た変形抗体（ｖＡｂ）タンパク質は１０ｍＭコハク酸ナトリウム、３０ｍＭスクロースｐＨ６．０の組成を持つバッファーで透析（ｄｉａｌｙｓｉｓ）によってバッファー交換を行った。
変形抗体（ｖＡｂ）を生産するために、ｅｘｐｉＣＨＯ細胞に変形抗体（ｖＡｂ）タンパク質をコーディングする遺伝子を含むベクター（ｐｃ３．４－ｖＡｂＬ、ｐｃ３．４－ｖＡｂＨ）を形質感染させて培養し、親和性クロマトグラフィー（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を用いて精製した。親和性樹脂であるＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅＴＭ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をＸＫ１６カラムに充填し、バッファーＡ（２５ｍＭトリス、ｐＨ７．０、２５ｍＭ ＮａＣｌ）を流してカラムを平衡化した後、培養液を流して親和性樹脂と結合させてバッファーＢ（２５ｍＭクエン酸、ｐＨ３．５）で変形抗体（ｖＡｂ）タンパク質を溶出させた。精製の終わったカラムは０．５Ｍ ＮａＯＨで洗浄した後、２０％エタノールで満たして冷蔵保管した。溶出された試料に１Ｍのトリス（ｐＨ９．０）を適正量添加して試料のｐＨを６．０に調整した。試料の状態は１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥを通じて確認した。こうして得た変形抗体（ｖＡｂ）タンパク質は１０ｍＭコハク酸ナトリウム、３０ｍＭスクロースｐＨ６．０の組成を持つバッファーで透析（ｄｉａｌｙｓｉｓ）によってバッファー交換を行った。
実施例４：ＥＬＩＳＡ方法を用いた変形抗体（ｖＡｂ）結合能確認
実施例２で製造した変形抗体（ｖＡｂ）の結合能を親抗体と比較するために、ＥＬＩＳＡを抗体濃度０．００６～６．２５０ｎｇ／ｍＬ条件で行った。方法は、実施例１－５に記述の内容と同様にした。測定の結果、変形抗体であるｖＡｂ１～ｖＡｂ５は親抗体に比べて４．４８～１．４２倍さらに強くＦＯＬＲ１と結合することが測定された（表１１）。各測定は親抗体に対比して個別の実験から得た測定値である。
実施例２で製造した変形抗体（ｖＡｂ）の結合能を親抗体と比較するために、ＥＬＩＳＡを抗体濃度０．００６～６．２５０ｎｇ／ｍＬ条件で行った。方法は、実施例１－５に記述の内容と同様にした。測定の結果、変形抗体であるｖＡｂ１～ｖＡｂ５は親抗体に比べて４．４８～１．４２倍さらに強くＦＯＬＲ１と結合することが測定された（表１１）。各測定は親抗体に対比して個別の実験から得た測定値である。
実施例５：ＳＰＲ方法を用いた変形抗体（ｖＡｂ）結合能確認
ＦＯＬＲ１に対する実施例２で製造した変形抗体であるｖＡｂ１の結合親和度を測定するためにＢｉａｃｏｒｅ３０００を用いてＳＰＲ方法を行った。実行方法は、実施例１－５に記述の内容と同様にした。結果は、ＢＩＡ評価用ソフトウェアを用いてセンサグラム分析してＫＤ値を計算した。変形抗体ｖＡｂ１は０．２４ｎＭのＫＤ値であり、親抗体に比べて４倍も高い結合親和度を示した（表１２）。これは、ＥＬＩＳＡを用いて得た値の相対的比と類似している。
ＦＯＬＲ１に対する実施例２で製造した変形抗体であるｖＡｂ１の結合親和度を測定するためにＢｉａｃｏｒｅ３０００を用いてＳＰＲ方法を行った。実行方法は、実施例１－５に記述の内容と同様にした。結果は、ＢＩＡ評価用ソフトウェアを用いてセンサグラム分析してＫＤ値を計算した。変形抗体ｖＡｂ１は０．２４ｎＭのＫＤ値であり、親抗体に比べて４倍も高い結合親和度を示した（表１２）。これは、ＥＬＩＳＡを用いて得た値の相対的比と類似している。
本発明に係る変形抗体は、親抗体の基本構造を保存しながら、親抗体本来の抗原結合部位が抗原とよりよく結合するアミノ酸に置換された配列を提供し、これによって抗原との結合能を高めた。なお、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片は、癌の予防又は治療用途に利用可能であり、また疾病の診断用途に利用可能である。
以上、本発明内容の特定の部分を詳細に記述したが、当業界の通常の知識を有する者にとって、このような具体的記述は好ましい実施様態にすぎず、これによって本発明の範囲が制限されるわけではない点は明らかであろう。したがって、本発明の実質的な範囲は添付の請求項とそれらの等価物によって定義されるといえよう。
Claims (11)
- ＦＯＬＲ１（Ｆｏｌａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－α）に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片であって、
ｉ）配列番号３の重鎖ＣＤＲ１；配列番号４の重鎖ＣＤＲ２；配列番号２８の重鎖ＣＤＲ３；配列番号２９の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号３０の軽鎖ＣＤＲ２；及び配列番号８の軽鎖ＣＤＲ３；
ｉｉ）配列番号３の重鎖ＣＤＲ１；配列番号４の重鎖ＣＤＲ２；配列番号５の重鎖ＣＤＲ３；配列番号２９の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号３０の軽鎖ＣＤＲ２；及び配列番号８の軽鎖ＣＤＲ３；
ｉｉｉ）配列番号３の重鎖ＣＤＲ１；配列番号４の重鎖ＣＤＲ２；配列番号５の重鎖ＣＤＲ３；配列番号２９の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号７の軽鎖ＣＤＲ２；及び配列番号８の軽鎖ＣＤＲ３；
ｉｖ）配列番号３の重鎖ＣＤＲ１；配列番号４の重鎖ＣＤＲ２；配列番号５の重鎖ＣＤＲ３；配列番号６の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号３０の軽鎖ＣＤＲ２；及び配列番号８の軽鎖ＣＤＲ３；又は
ｉ）配列番号３の重鎖ＣＤＲ１；配列番号４の重鎖ＣＤＲ２；配列番号２８の重鎖ＣＤＲ３；配列番号６の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号７の軽鎖ＣＤＲ２；及び配列番号８の軽鎖ＣＤＲ３；
を含む、抗体又はその抗原結合断片。 - 前記抗体又はその抗原結合断片は、ＦＯＬＲ１の生物学的活性を抑制することを特徴とする、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
- 前記抗体又はその抗原結合断片は、ＦＯＬＲ１を発現する細胞の抗体依存性細胞傷害活性（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）を誘導することを特徴とする、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
- 前記抗体又はその抗原結合断片は、ＦＯＬＲ１に対する結合分離定数（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｃｏｎｓｔａｎｔ）が１×１０－７Ｍ以下であることを特徴とする、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
- 配列番号１の重鎖可変領域及び配列番号３２の軽鎖可変領域、
配列番号１の重鎖可変領域及び配列番号３３の軽鎖可変領域、
配列番号１の重鎖可変領域及び配列番号３４の軽鎖可変領域、
配列番号３１の重鎖可変領域及び配列番号２の軽鎖可変領域、又は
配列番号３１の重鎖可変領域及び配列番号３２の軽鎖可変領域、
を含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。 - 請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片に薬物が接合された抗体－薬物接合体。
- 前記抗体又はその抗原結合断片はリンカーを介して薬物と結合することを特徴とする、請求項６に記載の抗体－薬物接合体。
- 前記薬物は、化学療法剤、毒素、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又は放射性同位元素であることを特徴とする、請求項６に記載の抗体－薬物接合体。
- 請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片、又は請求項６～８のいずれか一項に記載の抗体－薬物接合体を含む、癌の予防又は治療用医学組成物。
- 前記癌は、卵巣癌、乳癌、肺癌、腎臓癌、結腸癌、脳癌、直膓癌、子宮頸癌又は子宮内膜癌であることを特徴とする、請求項９に記載の癌の予防又は治療用医学組成物。
- 請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を含む、疾病の診断用組成物。
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