JP6983664B2 - ペプチド含有組成物並びにペプチドの安定化剤、安定化方法及び保存方法 - Google Patents

Description

本発明はペプチドを含有する組成物に関する。本発明はまたペプチドを安定化するための安定化剤に関する。本発明はまたペプチドを安定化する方法に関する。本発明はまたペプチドを保存する方法に関する。

グルタチオンは、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン酸、グリシンの３つのアミノ酸から成るペプチドで、人体だけでなく、他の動物や植物、微生物など多くの生体内に存在し、活性酸素の消去作用、解毒作用、アミノ酸代謝など、生体にとって重要な化合物である。

グルタチオンは生体内で、Ｌ−システイン残基のチオール基が還元されたＳＨの形態である還元型グルタチオン（Ｎ−（Ｎ−γ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システイニル）グリシン、以下「ＧＳＨ」と称することがある）と、２分子のＧＳＨのＬ−システイン残基のチオール基が酸化されグルタチオン２分子間でジスルフィド結合を形成した形態である酸化型グルタチオン（以下「ＧＳＳＧ」と称することがある）とのいずれかの形態で存在する。

ＧＳＳＧは肥料、医薬品、化粧品などの分野で有用であることが知られている。

特許文献１には、ＧＳＳＧが植物の種子又は花の数を増加させる作用や、脇芽又は分げつの数を増加させる等、収穫指数を向上させる植物生長調整剤の有効成分として有用であると開示されている。

一方、特許文献２には、グルタチオン（ＧＳＨ又はＧＳＳＧ）が熱、酸素、光等の影響により品質が低下する性質を有しており、結果として、硫黄の様な不快臭が生じたり、製剤においては含有量の低下等が生じることがあること、並びに、グルタチオンをアルギニンと共存させるとグルタチオンの品質が顕著に低下することが記載されている。そこで特許文献２では、グルタチオンとアルギニンと有機酸とを共存させることにより、グルタチオンの保存中での分解が抑制され保存安定性が向上することが提案されている。

上記の通りグルタチオンはペプチドの一種である。ペプチドの保存安定性を向上させるために、例えば特許文献３では所定構造を有する両親媒性高分子集合体を薬物キャリアーとして用いることにより、生理活性ペプチドの安定性を向上させる方法が開示されている。

国際公開ＷＯ２００８／０７２６０２ 国際公開ＷＯ２００９／０９９１３２ 特開平５−２３８９５５号公報 国際公開ＷＯ２０１３／００２３１７

特許文献２ではグルタチオンの安定性を高める手段が開示されているが、アルギニン及び有機酸を共存させることが必須である。これらの成分は比較的高価であり、より安価な手段によりグルタチオンの保存安定性を高めるという要望を満たすものではない。また、アルギニン、有機酸等の有機化合物は無機物質と比較して長期的には化学的に不安定であるため、特許文献２に記載の技術はグルタチオンの保存安定性を向上させる技術として必ずしも満足できるものではない。

また、グルタチオンに限らず他のペプチドにおいても保存安定性を向上させるという課題が存在する。特許文献３では、生理活性ペプチドの安定性を向上させる方法が開示されているが、上記の通り所定構造の両親媒性高分子集合体を共存させることが必須である。この両親媒性高分子集合体は容易には入手することはできないものであり、しかも有機化合物であるため化学的に十分安定とは限らないことから、特許文献３に記載の技術もまた、ペプチドの保存安定性を向上させる技術としては満足できるものではない。

そこで本発明は、グルタチオン等のペプチドの保存安定性を向上させる新たな技術を提供することを解決すべき課題とする。

本発明者らはペプチドをアルカリ性鉱物質担体とともに含む組成物中ではペプチドが安定に保持されるという驚くべき知見を見出し、本発明を完成するに至った。具体的には、本発明は以下の発明を包含する。
（１）ペプチドとアルカリ性鉱物質担体とを含み、ペプチド１００質量部に対してアルカリ性鉱物質担体が８質量部以上である、ペプチド含有組成物。
（２）ペプチドがグルタチオンである、（１）に記載の組成物。
（３）アルカリ性鉱物質担体がタルク、マイカ及びベントナイトからなる群から選択される１種以上である、（１）又は（２）に記載の組成物。
（４）（１）〜（３）のいずれかに記載の組成物を植物に施用することを含む、植物の栽培方法。
（５）アルカリ性鉱物質担体を含有する、ペプチドの安定化剤。
（６）ペプチドがグルタチオンである、（５）に記載の安定化剤。
（７）アルカリ性鉱物質担体がタルク、マイカ及びベントナイトからなる群から選択される１種以上である、（５）又は（６）に記載の安定化剤。
（８）ペプチドの安定性を向上させる方法であって、ペプチドにアルカリ性鉱物質担体を混合する混合工程を含む方法。
（９）ペプチドがグルタチオンである、（８）に記載の方法。
（１０）前記混合工程において、ペプチド１００質量部に対してアルカリ性鉱物質担体を８質量部以上混合する、（８）又は（９）に記載の方法。
（１１）アルカリ性鉱物質担体がタルク、マイカ及びベントナイトからなる群から選択される１種以上である、（８）〜（１０）のいずれかに記載の方法。
（１２）ペプチドの保存方法であって、アルカリ性鉱物質担体の共存下ペプチドを保存する保存工程を含む方法。
（１３）ペプチドがグルタチオンである、（１２）に記載の方法。
（１４）前記保存工程において、ペプチド１００質量部に対してアルカリ性鉱物質担体を８質量部以上共存させる、（１２）又は（１３）に記載の方法。
（１５）アルカリ性鉱物質担体がタルク、マイカ及びベントナイトからなる群から選択される１種以上である、（１２）〜（１４）のいずれかに記載の方法。
（１６）（１）〜（３）のいずれかに記載の組成物の、植物の栽培のための使用。
（１７）ペプチドの安定性を向上させるための、アルカリ性鉱物質担体の使用。
（１８）ペプチドがグルタチオンである、（１７）に記載の使用。
（１９）ペプチド１００質量部に対してアルカリ性鉱物質担体を８質量部以上混合することでペプチドの安定性を向上させるための、（１７）又は（１８）に記載の使用。
（２０）アルカリ性鉱物質担体がタルク、マイカ及びベントナイトからなる群から選択される１種以上である、（１７）〜（１９）のいずれかに記載の使用。

本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号２０１６−０１６２４８号の開示内容を包含する。

図１は、試験１での６０℃での保存安定性試験の結果を、ＧＳＳＧ残存率の経時変化として示す。 図２は、試験１での６０℃での保存安定性試験のうち比較例１〜４と実施例１〜４の結果を、ＧＳＳＧ分解速度として示す。横軸は酸化型グルタチオン１００質量部あたりの、タルクの質量部を示す。 図３は、試験２での６０℃での保存安定性試験の結果を、ＧＳＳＧ残存率の経時変化として示す。 図４は、試験４での造粒工程における乾燥後の粒剤の外観の写真を示す。図４上が参考例１の粒剤、中が参考例２の粒剤、下が参考例３の粒剤である。 図５は、試験４での６０℃での保存安定性試験の結果を、ＧＳＳＧ残存率の経時変化として示す。 図６は、試験５での６０℃での保存安定性試験の結果を、ＧＳＨ残存率の経時変化として示す。 図７は、試験５での６０℃での保存安定性試験のうち比較例５、６と実施例１１、１２、１３の結果を、ＧＳＨ分解速度として示す。横軸はＧＳＨ１００質量部あたりの、タルクの質量部を示す。

＜１．ペプチド含有組成物＞
本発明はペプチド含有組成物（以下「本発明の組成物」と称する場合がある）に関する。本発明の組成物中では、ペプチドが安定に保持され、ペプチドの分解を促進し得る条件（例えば加温条件）での保存においてペプチドの分解が抑制される。

本発明の組成物の用途は特に限定されずペプチドの用途に応じた用途であればよい。例えばペプチドがグルタチオンである場合、本発明の組成物は植物に施用するための用途に用いることができる。以下、本発明の組成物について具体的に説明する。

１．１．ペプチド
本発明においてペプチドとは２以上のアミノ酸がペプチド結合により結合して化合物であればよく、構成アミノ酸残基数（ｎ）は特に限定されない。ペプチドとしてはｎが２〜１０のオリゴペプチドであってもよいし、１１以上のポリペプチド（ｎが約５０よりも大きいタンパク質とよばれるものも包含される）であってもよい。ペプチドは、単一のペプチド鎖からなるものであってもよいし、２以上のペプチド鎖が側鎖を介して連結して形成されるペプチド鎖の多量体であってもよい。ペプチドが、ペプチド鎖の多量体である場合は、該ペプチドの構成アミノ酸残基数（ｎ）とは、各ペプチド鎖の構成アミノ酸数を指し、各ペプチド鎖の構成アミノ酸数が上記の範囲であればよい。ペプチドはフリー体、酸及び／又は塩基との反応により形成される塩、水和物、これらの混合物などの各種形態であってよい。ペプチドはアミノ酸残基のみからなる必要はなく側鎖又は末端がアミノ酸以外の基により修飾されたものであってもよい。本発明では、ペプチドの質量は特に限定の無い限りフリー体として換算した質量で表す。

本発明において典型的なペプチドはグルタチオンである。本発明においてグルタチオンは、酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）あってもよいし、還元型グルタチオン（ＧＳＨ）であってもよいし、ＧＳＳＧとＧＳＨとの混合物であってもよい。

１．１．１．酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）
ＧＳＳＧは、ＧＳＨ（Ｎ−（Ｎ−γ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システイニル）グリシン）の２分子がジスルフィド結合を介して結合して形成される物質であり、フリー体は次式で表される。

本発明においてＧＳＳＧは、他の物質と結合しておらずイオン化していないフリー体、ＧＳＳＧと酸又は塩基とで形成される塩、これらの水和物、これらの混合物等の、各種形態のＧＳＳＧを包含し得る。

ＧＳＳＧは、同一のアミノ酸配列からなるｎが３のオリゴペプチド鎖の２つが、各々のシステイン残基の側鎖を介してジスルフィド結合により連結しているという特徴的な構造を有する。

本発明においてグルタチオンとしてＧＳＳＧを主に含む組成物は、該組成物中でＧＳＳＧの含有量がＧＳＨの含有量よりも相対的に多い組成物であり、実質的にＧＳＨを含まないことがより好ましい。より好ましくは、前記組成物中に含まれＧＳＳＧとＧＳＨとの総質量（全てフリー体として換算した質量）に対してＧＳＳＧの総質量（フリー体として換算した質量）は、合計で７０質量％以上、より好ましくは８０質量％以上、より好ましくは９０質量％以上、更に好ましくは９５質量％以上、更に好ましくは９８質量％以上、最も好ましくは１００質量％である。

ＧＳＳＧの塩としてはアンモニウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、ナトリウム塩、リチウム塩等の目的に応じて許容される１種以上の塩であれば特に限定されないが、好ましくはアンモニウム塩、カルシウム塩及びマグネシウム塩から選択される１種以上の塩である。特許文献４に開示されている通り、ＧＳＳＧの固体状のアンモニウム塩、カルシウム塩及びマグネシウム塩は低潮解性であり取扱いが容易であるとともに高水溶性であることから特に好ましい。このような塩は、特許文献４に記載されている通り、アンモニウムイオン、カルシウムカチオン、及びマグネシウムカチオンから選択される少なくとも１種を生成し得る物質の存在下、ＧＳＳＧを水及び／又は水可溶性媒体から選択される水性媒体と接触させながら温度３０℃以上に加温することにより固体として得ることができる。加温温度は３０℃以上であれば特に限定されないが、好ましくは３３℃以上、より好ましくは３５℃以上、特に好ましくは４０℃以上であり、上限は特に限定されないが例えば８０℃以下、好ましくは７０℃以下、特に好ましくは６０℃以下であり、工業規模での生産においては５３〜６０℃の範囲が特に好ましい。前記水性媒体は、単独で用いてもよく２種以上を適宜組み合わせてもよいが、水と水可溶性媒体とを組み合わせて用いることが推奨される。この場合、水が酸化型グルタチオンの富溶媒として機能し、水可溶性媒体が貧溶媒として機能する。水可溶性媒体の容量は、水１０容量部に対して、例えば、１〜１０００容量部程度、好ましくは５〜５００容量部程度、さらに好ましくは１０〜１００容量部程度、特に１２〜５０容量部程度である。水可溶性媒体としてはアルコール類（メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、エチレングリコールなど）、ケトン類（アセトン、メチルエチルケトンなど）等を用いることができる。この方法で得られるＧＳＳＧ塩としてはＧＳＳＧの１アンモニウム塩、ＧＳＳＧの０．５カルシウム塩又は１カルシウム塩、ＧＳＳＧの０．５マグネシウム塩又は１マグネシウム塩等が例示できる。

１．１．２．還元型グルタチオン（ＧＳＨ）
ＧＳＨはＮ−（Ｎ−γ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システイニル）グリシン）とも表記される。本発明においてＧＳＨは、他の物質と結合しておらずイオン化していないフリー体、ＧＳＨと酸又は塩基とで形成される塩、これらの水和物、これらの混合物等の、各種形態のＧＳＨを包含し得る。

本発明においてグルタチオンとしてＧＳＨを主に含む組成物は、該組成物中でＧＳＨの含有量がＧＳＳＧの含有量よりも相対的に多い組成物であり、実質的にＧＳＳＧを含まないことがより好ましい。より好ましくは、前記組成物中に含まれＧＳＳＧとＧＳＨとの総質量（全てフリー体として換算した質量）に対してＧＳＨの総質量（フリー体として換算した質量）は、合計で７０質量％以上、より好ましくは８０質量％以上、より好ましくは９０質量％以上、更に好ましくは９５質量％以上、更に好ましくは９８質量％以上、最も好ましくは１００質量％である。

ＧＳＨの塩としてはアンモニウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、ナトリウム塩、リチウム塩等の目的に応じて許容される１種以上の塩であれば特に限定されない。

１．２．アルカリ性鉱物質担体
本発明においてアルカリ性鉱物質担体とは、２５℃において、蒸留水１００質量部に対して１０質量部を混合して十分に懸濁させて得られる懸濁混合物の水相のｐＨが７．０よりも大きい値となる鉱物質担体を指す。前記水相のｐＨは、前記懸濁混合物を形成後に遠心分離した時の上清液を試料として測定したｐＨであってもよいし、前記懸濁混合物中にｐＨ計のプローブを浸して測定したｐＨであってもよい。具体的には、２５℃において、蒸留水２５ｇに対して２．５ｇを混合して１００ｒｐｍで２時間撹拌し懸濁させて得られる懸濁混合物の水相のｐＨが７．０よりも大きい値となる鉱物質担体をアルカリ性鉱物質担体とすることができる。ここで前記懸濁混合物が遠心分離により固液分離可能なものであれば、前記懸濁混合物を更に２０００ｇ、５分間で遠心分離した時の上清液をｐＨ測定の試料としてもよく、遠心分離により容易には固液分離できないものであれば、前記懸濁混合物自体をｐＨ測定の試料としてもよい。アルカリ性鉱物質担体は、前記条件で測定される上清液のｐＨが好ましくは７．５以上、より好ましくは８．０以上、より好ましくは８．５以上であり、好ましくは１０．０以下である。一般的には、加水分解可能な結合を有する有機化合物をアルカリ性担体とともに含む組成物では有機化合物の分解が促進されることが知られているが、本発明者らは驚くべきことに、ペプチドをアルカリ性鉱物質担体とともに含む組成物中ではペプチドの保存安定性が顕著に向上すること、一方で、ペプチドと酸性鉱物質担体であるクレーとを含む組成物中ではペプチドは速やかに分解されてしまうことを見出した。

アルカリ性鉱物質担体としては単一種の担体であってもよいし、複数種の担体の混合物であってもよい。ペプチドの安定性を向上させる効果の観点から、アルカリ性鉱物質担体としてはタルク、マイカ、ベントナイト、モンモリロナイト及びスメクタイトからなる群から選択される１種以上が好ましく、タルク、マイカ及びベントナイトからなる群から選択される１種以上が特に好ましい。なかでもタルクは滑沢性を有しておりペプチドとの混合後に造粒する場合に造粒時の操作性を向上させることができるため、アルカリ性鉱物質担体が少なくともタルクを含むことが好ましい。

各アルカリ性鉱物質担体は通常は粉末の形態のものを原料として本発明に用いる。

１．３．組成
本発明の組成物は、ペプチドとアルカリ性鉱物質担体とを含み、ペプチド１００質量部に対してアルカリ性鉱物質担体が８質量部以上であることを特徴とする。本発明者らは驚くべきことにペプチド１００質量部に対してアルカリ性鉱物質担体を８重量部以上混合した場合に、ペプチドの分解が特に顕著に抑制されることを見出した。本発明の組成物においてペプチド１００質量部に対してアルカリ性鉱物質担体は、ペプチドの分解を抑制できるという観点から、より好ましくは１０質量部以上であり、更に好ましくは２０質量部以上であり、更に好ましくは３０質量部以上であり、更に好ましくは４０質量部以上である。本発明の組成物においてアルカリ性鉱物質担体の配合量の上限は特に限定されないが典型的にはペプチド１００質量部に対してアルカリ性鉱物質担体が１０，０００質量部以下又は４，０００質量部以下である。

本発明の組成物中でのペプチドの配合量は、アルカリ性鉱物質担体との相対量が上記の範囲である限り特に限定されず組成物の用途等に応じて調整することができるが、組成物の全量に対してペプチドを例えば０．０００００１質量％以上好ましくは０．００５質量％以上、例えば２０質量％以下好ましくは５質量％以下とすることができる。この範囲はペプチドがグルタチオンである場合に特に好ましい。

本発明の組成物中でのアルカリ性鉱物質担体の配合量は、ペプチドとの相対量が上記の範囲である限り特に限定されず組成物等の用途に応じて調整することができるが、組成物の全量に対してアルカリ性鉱物質担体を例えば０．０１質量％以上好ましくは０．０２質量％以上、例えば９９．９８質量％以下好ましくは９９質量％以下とすることができる。この範囲はペプチドがグルタチオンである場合に特に好ましい。

本発明の組成物はアルカリ鉱物質担体以外にも更なる鉱物質担体を含んでもよい。更なる鉱物質担体としてはクレー、カオリン、活性白土、ゼオライト、珪藻土、パーライト、ジークライト、セリサイト、軽石、シリカ、バーミキュライト、炭酸カルシウム等から選択される少なくとも１種を使用することができ、クレーが特に好ましい。本発明の組成物は、鉱物質担体として、クレー、カオリン、活性白土、ゼオライト、珪藻土、パーライト、ジークライト、セリサイト、軽石、シリカ、バーミキュライト、炭酸カルシウム等から選択される少なくとも１種のみを含み且つそれ以外の鉱物質担体（例えば前記アルカリ性鉱物質担体の１つ）を含まない組成物であることはない。

本発明の組成物が更なる鉱物質担体を含む場合は、本発明の組成物中での鉱物質担体（アルカリ性鉱物質担体と更なる鉱物質担体との合計）の配合量は特に限定されず組成物等の用途に応じて調整することができるが、組成物の全量に対して例えば５０質量％以上好ましくは６０質量％以上、例えば９９．９８質量％以下、好ましくは９９質量％以下である。この範囲は本発明の組成物を植物に施用する用途に用いる場合に特に好ましい。

アルカリ性鉱物質担体は上記の条件のもとで担体単独で評価した場合にｐＨ値が上記範囲となるものであるが、本発明の組成物を水中に分散した時のｐＨは組成物に含まれる成分により定まる。本発明の組成物を水中に分散した時のｐＨは特に限定されないが、好ましくは８．０未満であり、より好ましくは２．０以上であり、より好ましくは３．０以上であり、より好ましくは７．０未満であり、より好ましくは６．５未満である。このｐＨ値は、２５℃において、蒸留水１００ｇに本発明の組成物１ｇを加え十分に撹拌した懸濁液のｐＨ値である。ｐＨ値がこの範囲であるときペプチドの安定化効果がより高いと考えられる。

本発明の組成物の水分は、ペプチドの保存安定性を向上させる観点からは少ないことが好ましく、具体的には１０質量％以下、好ましくは５質量％以下、より好ましくは２．５質量％以下、より好ましくは１質量％以下である。

本発明の組成物の形態は特に限定されないが、上記の水分とするには粉末、顆粒、錠剤等の固形状物であることが好ましい。また、本発明の組成物はまた液状物であってもよく、液状物としてはペプチドを含む粒子が分散相として乳化分散したエマルジョンの形態が例示できる。

本発明の組成物に含まれる上記で挙げた以外の成分としては増粘剤、結合剤、有機担体、水、賦形剤等の、組成物の用途において許容される成分が挙げられる。

増粘剤と結合剤とは、相互に排他的に分類できるわけではなく、増粘剤及び結合剤の両方の作用を有する材料も存在する。そこで、本明細書では、説明の便宜上、増粘剤及び結合剤の少なくとも一方の作用を有する材料を「増粘剤及び／又は結合剤」と称する。増粘剤及び／又は結合剤としては、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドン、プルラン、アクリル酸系高分子、ポリビニルアルコール、ゼラチン、寒天、アラビアガム、アラビアガム末、キサンタンガム、トランガム、グアーガム、ジェランガム、ローカストビーンガム、部分アルファ化澱粉、マクロゴール、澱粉、可溶性澱粉、デキストリン、トラガカントゴム、βグルカン、ペクチン、カゼイン、大豆タンパク、ヒドロキシエチルセルロース、アセチルセルロース、リグニンスルホン酸、カルボキシメチルスターチ、ヒドロキシエチルスターチ、ポリビニルメチルエーテル、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキサイド、ポリビニルピロリドン、セラック、ロジン、トール油、エステルガム、ポリビニルアセテート、ポリ乳酸、ポリ塩化ビニル、ポリエステル、ポリ尿素、ポリアミド、クマロン樹脂、生分解性高分子、パラフィンワックス、マイクロクリスタリンワックス、ペトロラタム、モンタンワックス、カルナウバロウ、綿ロウ、ミツロウ、羊毛ロウ、高分子の非イオン系界面活性剤、高分子の陰イオン系界面活性剤、高分子の陽イオン系界面活性剤、高分子の両性界面活性剤、アルギン酸（以上は高分子化合物である）、ケイ酸ナトリウム、グリセリン、動植物油、油脂、流動パラフィン、重油、グルコース、ショ糖、マンニトール、ソルビトール、非高分子の非イオン系界面活性剤、非高分子の陰イオン系界面活性剤、非高分子の陽イオン系界面活性剤、非高分子の両性界面活性剤（以上は非高分子化合物である）等や、これらの塩が挙げられ、これらの群から選ばれる少なくとも１種を用いることができる。特に好ましい増粘剤及び／又は結合剤は、高分子化合物の増粘剤及び／又は結合剤であり、なかでも好ましいものとして、カルボキシメチルセルロース及びその塩、ポリビニルアルコール、澱粉、アラビアガム、ヒドロキシエチルセルロース、リグニンスルホン酸及びその塩、並びにポリエチレングリコールから選択される少なくとも１種が挙げられる。カルボキシメチルセルロースの塩としてはナトリウム、カリウム、リチウム等のアルカリ金属塩、マグネシウム、カルシウム等のアルカリ土類金属塩等が挙げられる。カルボキシメチルセルロース及びその塩は組成物中でのペプチドの保存安定性の向上にも寄与すると考えられる。これらの増粘剤及び／又は結合剤を用いることで、本発明の組成物を植物へ施用する用途に用いる場合にペプチドの徐放放出を実現できる場合がある。

本発明の組成物が含み得る有機担体としてはモミガラ、オガクズ、大豆粉、トウモロコシ茎、植物繊維等の乾燥植物材料、パルプフロック、ホワイトカーボン、活性炭等の有機多孔質担体が挙げられる。

本発明の組成物が含み得る賦形剤としては乳糖、トレハロース、セルロース等が挙げられる。

本発明の組成物は用途に応じて適宜更なる成分を含有することができる。例えば本発明の組成物を植物へ施用する用途に用いる場合には、他の成分として肥料成分を含むことができる。肥料成分としてはカリウム、窒素、リン、カルシウム、マグネシウム等の肥料として有用な元素が挙げられる。

本発明の組成物の製造方法は特に限定されない。本発明の組成物が粉末、顆粒等の粒子である場合、好ましい製法としては、
ペプチドと、アルカリ性鉱物質担体と、水又は水溶性溶媒である溶媒との混合物を形成する混合工程と、
前記混合物からペプチドとアルカリ性鉱物質担体とを含む粒子を形成する造粒工程と
を含む方法が挙げられる。

混合工程では必要に応じて上記で挙げた、ペプチドとアルカリ性鉱物質担体以外の他の成分を混合する。混合工程では、溶媒に溶解したペプチドを、アルカリ性鉱物質担体を含む相の中で十分に分散させることが好ましい。

混合工程における溶媒の使用量は特に限定されず、十分に均質な混合物が得られるよう適量の溶媒を使用すればよい。前記水溶性溶媒としてはエタノール等のアルコールが使用できる。溶媒は好ましくは水、又は水とアルコールとの混合溶媒である。

混合工程で形成される混合物は粒状、ペースト状又は液状である。

造粒工程は押出造粒、攪拌造粒、転動造粒、圧縮造粒等の通常の造粒法により行うことができる。造粒工程は必要に応じて整粒工程や、乾燥工程を含むことができる。乾燥工程では、前記溶媒が揮発により除去され、アルカリ性鉱物質担体とペプチドとが共存した粒子が形成される。

造粒工程により得られる本発明の組成物の粒子の形状や寸法は特に限定されないが、作業性、および、徐放性を制御する観点から、形状は球形や円柱状であることが好ましく、寸法は、各粒子の最長寸法として０．０１ｃｍ以上、１０ｃｍ以下であることが好ましく、さらに好ましくは０．０５ｃｍ以上、特に好ましくは０．１ｃｍ以上であり、さらに好ましくは５ｃｍ以下、特に好ましくは２ｃｍ以下である。各粒子の最短寸法も同様の範囲であることができる。

＜２．植物の栽培方法＞
本発明はまた、上記の本発明の組成物を植物に施用することを含む植物の栽培方法に関する。本発明はまた、上記の本発明の組成物の、植物の栽培のための使用に関する。このとき本発明の組成物に含まれるペプチドは、植物生長促進作用等の植物に対して有用な作用を有するペプチドであることが好ましく、具体的にはグルタチオン（酸化型グルタチオンであってもよいし還元型グルタチオンであってもよい）が好ましく、酸化型グルタチオンが特に好ましい。本発明の組成物中では保存中及び施用後にペプチドの損失が少なく安定に保持されることから、これを用いた植物の栽培方法では、植物に対してペプチドを効果的に作用させることができる。

本発明の組成物の植物への施用量は、前記有用な作用を生じるための有効量とすることができる。この有効量は、植物の種類及びペプチドの種類に応じて適宜決定することができる。

植物に施用する方法としては、本発明の組成物又は本発明の組成物から放出されたペプチドが植物の根、茎、葉などの植物体に接触することができる方法であれば特に限定されず、前記植物体に本発明の組成物が直接接するように施用してもよいし、前記植物体が定着した土壌等の栽培担体に本発明の組成物を施用してもよい。

本発明の組成物の植物体及び／又は栽培担体への施用は、本発明の組成物を水及び／又は水性溶媒に分散させた液体を植物体及び／又は栽培担体に施用する方法や、本発明の組成物を植物体及び／又は栽培担体に施用する方法により行うことができる。前記水溶性溶媒としてはエタノール等のアルコールが使用できる。施用方法としては特に好ましくは、固形状の本発明の組成物を対象植物の根の近傍の栽培担体の表面又は栽培担体中に配置して施用する方法や、液状の本発明の組成物自体を、或いは液状又は固形状の本発明の組成物を水及び／又は水性媒体に分散させたものを、対象植物の植物体の地上部（茎、葉、花等）に噴霧、塗布等の方法で接触させて施用する方法が挙げられる。

本発明の組成物を植物に施用する時期は特に限定されず植物栽培の任意の段階で施用することができる。

本発明の植物を施用する対象植物は特に限定されず双子葉植物、単子葉植物等の種々の植物である。対象植物は野生型の植物には限らず変異体や形質転換体等でもよい。

＜３．ペプチドの安定性を向上させる方法、及び、ペプチドの安定化剤＞
本発明はまた、ペプチドの安定性を向上させる方法であって、ペプチドにアルカリ性鉱物質担体を混合する混合工程を含む方法に関する。

本発明はまた、アルカリ性鉱物質担体を含有する、ペプチドの安定化剤に関する。

本発明はまた、ペプチドの安定性を向上させるための、アルカリ性鉱物質担体の使用に関する。

本発明のこれらの態様におけるペプチド及びアルカリ性鉱物質担体の具体例及び好ましい形態については本発明の組成物に関して「１．ペプチド含有組成物」に記載の通りである。

本発明のこれらの態様では、ペプチドに対して、該ペプチドを安定化させるのに有効な量（安定化有効量）のアルカリ性鉱物質を用いることができる。

本発明のこれらの態様においてペプチドとアルカリ性鉱物質担体との比率は特に限定されないが、ペプチドの安定性をより高める観点から、本発明の組成物に関して「１．ペプチド含有組成物」に記載した比率の範囲となるようにすることが好ましい。

前記混合工程ではペプチドとアルカリ性鉱物質担体とが十分に混合されるように、ペプチドとアルカリ性鉱物質担体とを含有する組成物（安定化用組成物）を調製することが好ましい。前記安定化用組成物は、好ましくは、前記ペプチドと、前記ペプチドの安定化有効量の前記アルカリ性鉱物質担体とを含む。前記安定化用組成物の組成は特に限定されないが、典型的には、「１．ペプチド含有組成物」に記載した本発明の組成物と同様の組成であることができる。ただし前記安定化用組成物においてはペプチド１００質量部に対してアルカリ性鉱物質担体が８質量部以上であることが好ましいものの、この範囲外のものも包含する点で「１．ペプチド含有組成物」に記載した本発明の組成物とは異なる。

本発明のペプチドの安定化剤は、アルカリ性鉱物質担体を少なくとも含有し、他の成分を更に含んでもよい。他の成分としては、上記の「１．ペプチド含有組成物」で挙げたのと同様の、アルカリ鉱物質担体以外の更なる鉱物質担体、増粘剤、結合剤、及び、有機担体が例示でき、その具体例は上記の「１．ペプチド含有組成物」に記載の通りである。

＜４．ペプチドの保存方法＞
本発明はまた、ペプチドの保存方法であって、アルカリ性鉱物質担体の共存下ペプチドを保存する保存工程を含む方法に関する。

本発明のこの態様におけるペプチド及びアルカリ性鉱物質担体の具体例及び好ましい形態については本発明の組成物に関して「１．ペプチド含有組成物」に記載の通りである。

本発明のこの態様では、ペプチドを、該ペプチドを安定化させるのに有効な量（安定化有効量）のアルカリ性鉱物質担体の共存下で保存することができる。

本発明のこの態様においてペプチドとアルカリ性鉱物質担体との比率は特に限定されないが、保存工程でのペプチドの安定性をより高める観点から、本発明の組成物に関して「１．ペプチド含有組成物」に記載した比率の範囲となるようにすることが好ましい。

前記保存工程ではペプチドをアルカリ性鉱物質担体と共存させた状態で保存するが、このときペプチドとアルカリ性鉱物質担体とを含有する組成物（保存用組成物）を形成した状態で保存することが好ましい。前記保存用組成物の組成は特に限定されないが、典型的には、「１．ペプチド含有組成物」に記載した本発明の組成物と同様の組成であることができる。ただし前記保存用組成物においてはペプチド１００質量部に対してアルカリ性鉱物質担体が８質量部以上であることが好ましいものの、この範囲外のものも包含する点で「１．ペプチド含有組成物」に記載した本発明の組成物とは異なる。

以下、本発明を、具体例を参照して説明する。しかしながら以下の具体例は本発明の範囲を限定するものではない。なお各試験で用いたＧＳＳＧはＧＳＨ（還元型グルタチオン）を含まない。

＜試験１＞
次表に示す各組成のＧＳＳＧ含有顆粒を押出し造粒により製造し、ＧＳＳＧの保存安定性を確認した。

表１中での左向き矢印は、それを含む各欄の値が、左側の欄と同じであることを示す。すなわち、比較例２〜４及び実施例１〜８において、表１の左向き矢印を含む各欄の値は比較例１と同じであり、具体的には、比較例２〜４及び実施例１〜８では、いずれも、ＧＳＳＧ・ＮＨ_３が２．３質量％、硫酸カリウムが１１．０質量％、界面活性剤が３．０質量％、ＰＶＡが２．０質量％、ＣＭＣ Ｎａが２．０質量％であった。

酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）としては、一アンモニウム塩を用いた。

硫酸カリウムとしてはＳＥＳＯＤＡ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ製を用いた。

界面活性剤としてはライオン・スペシャリティ・ケミカルズ株式会社製直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウムを用いた。

ＰＶＡ（ポリビニルアルコール）としては電気化学工業株式会社製を用いた。

ＣＭＣＮａ（カルボキシメチルセルロースナトリウム）としては第一工業製薬製を用いた。

クレーとしては昭和ＫＤＥ株式会社製ＮＫ−３００を用いた。

タルクとしては日本タルク株式会社製ＳＳＳを用いた。

「タルク／ＧＳＳＧ」は、各組成において、タルクの質量（ｇ）の、ＧＳＳＧアンモニウム塩をフリー体として換算した質量（ｇ）に対する比を示す。

表１に示す割合の合計量５００ｇの上記原料を水９５ｇと混合し、混合物を押出造粒機（株式会社ダルトン製、マルチグランＭＧ−５５−１型）を用いて直径１．２ｍｍの円柱状顆粒となるように押出造粒し、長さ１〜４ｍｍ程度となるよう整粒し、乾燥した。乾燥後の顆粒を篩により分級し、直径１．２ｍｍ、長さ１〜４ｍｍの円柱状顆粒を得た。

顆粒製剤のｐＨの測定方法：水１００ｇに各製剤１ｇを加えてスターラーで十分に混合した液のｐＨをｐＨメーターで測定した。

顆粒製剤の水分の測定方法：赤外線水分計（株式会社ケツト科学研究所）を用いて、各製剤５ｇ、１１０℃、１５分間の測定条件にて測定した。

各製剤のｐＨ及び水分の測定結果を表１に示す。

保存試験を以下の手順で行った。各製剤２０ｇをアルミラミネート袋に密封包装し、６０℃の恒温槽で１カ月間保存した。密封包装の際に袋内の脱気は行わなかった。保存開始時、保存開始０．５カ月後、保存開始１カ月後にＧＳＳＧ含量を測定した。ＧＳＳＧ含量の測定はＨＰＬＣを用いて行った（検出波長２１０ｎｍ）。保存開始時のＧＳＳＧ量をＧＳＳＧ残存率１００％としたときの、保存開始０．５カ月後、保存開始１カ月後のＧＳＳＧ残存率（％）を算出した。また１カ月間でのＧＳＳＧ減少率（％）をＧＳＳＧ分解速度（％／月）とした。

保存試験の結果を図１及び図２に示す。図２では、説明のため比較例１〜４と実施例１〜４でのＧＳＳＧ分解速度のみを示す。図２における横軸はＧＳＳＧ１００質量部あたりのタルクの質量部を示す。タルクを配合した実施例１〜８の顆粒では、タルクを含まず鉱物質担体としてクレーのみを含む比較例１の顆粒と比較して、ＧＳＳＧの保存安定性が顕著に向上することが確認された。

＜試験２＞
次表に示す各組成のＧＳＳＧ含有顆粒を押出し造粒により製造し、ＧＳＳＧの保存安定性を確認した。

表２中での左向き矢印は、それを含む各欄の値が、左側の欄と同じであることを示す。すなわち、実施例６、９、１０において、表２の左向き矢印を含む各欄の値は比較例１と同じであり、具体的には、実施例６、９、１０では、いずれも、ＧＳＳＧ・ＮＨ_３が２．３質量％、硫酸カリウムが１１．０質量％、界面活性剤が３．０質量％、ＰＶＡが２．０質量％、ＣＭＣ Ｎａが２．０質量％であった。

マイカとしては株式会社ヤマグチマイカ製Ａ−１１を用いた。

ベントナイトとしては三立砿業株式会社製２５０ＳＡ−Ｂを用いた。

比較例１、実施例６は試験１と同一である。

他の材料及びＧＳＳＧ含有顆粒の製造方法については試験１と同様とした。得られたＧＳＳＧ含有顆粒の６０℃での保存安定性を試験１に記載した手順により評価した。

結果を図３に示す。タルクの代わりにマイカ又はベントナイトをＧＳＳＧに対して質量比で４．４７となるように配合した実施例９及び実施例１０の顆粒においても、タルクを配合した実施例６の顆粒と同様に、ＧＳＳＧの保存安定性が顕著に向上することが確認された。

＜試験３＞
試験１及び試験２で用いた各鉱物質担体、モンモリロナイト及びスメクタイトについてｐＨ値を測定した。

ｐＨ値は、２５℃の温度条件において、鉱物質担体２．５ｇと蒸留水２５ｇとを混合し、１００ｒｐｍで２時間振とうしたのち、遠心分離（２０００ｇ、５分間）し、上清のｐＨをｐＨメーターで測定して得た。鉱物質担体としてはクレー、タルク、マイカ、ベントナイト、モンモリロナイト及びスメクタイトを用いた。タルク及びマイカについては複数の市販品を入手しそれぞれについてｐＨ値を測定した。鉱物質担体としてモンモリロナイト及びスメクタイトを用いた場合、懸濁混合物がゲル状であり上記遠心分離条件では固液分離できなかったため、懸濁混合液にｐＨ計のプローブを浸してｐＨ値を測定した。

結果を下記の表に示す。

以上の結果から、ＧＳＳＧを安定化する作用を有する鉱物質担体であるタルク、マイカ、ベントナイトは７を超えるアルカリ性のｐＨ値を示したのに対して、ＧＳＳＧを安定化する作用を有していないクレーでは酸性のｐＨ値であった。このように、ＧＳＳＧにアルカリ性を呈する鉱物質担体を組み合わせることによりＧＳＳＧが安定化されることが確認された。アルカリ性のｐＨ値を示すモンモリロナイト及びスメクタイトについても、ＧＳＳＧを安定化する作用が期待できる。

＜試験４（参考試験）＞
試験１〜３の結果から、アルカリ性を呈する鉱物質担体がＧＳＳＧの保存安定性を顕著に向上させることが示された。この効果が、鉱物質担体以外のアルカリ成分によっても生じるのかを確認するために以下の参考試験を行った。

硫酸カリウム、リン酸水素二カリウム、重炭酸カリウムを２５℃の蒸留水に１質量％の濃度となるように溶解し十分に撹拌した時のｐＨ値は次表の通りであった。

そこでｐＨが異なるこれらのカリウム塩を用い下記の表に示す配合に従いＧＳＳＧ含有粒剤を製造した。

撹拌造粒は次の手順で行った。上記の表に示す組成の原料を粉砕して混合し、原料混合物５００ｇと水４３．８ｇとを撹拌造粒機（株式会社ダルトン製、ＳＰＧ−２ＴＧ型）に入れ、撹拌７００ｒｐｍ、チョッパー３０００ｒｐｍ、ジャケット温度２５℃の条件にて４分間撹拌造粒を行った。造粒後、造粒物を７０℃で乾燥させ、篩を用いて分級し、粒径２ｍｍ未満のＧＳＳＧ含有粒剤を得た。

ＧＳＳＧ含有粒剤の保存安定性を試験１と同様の手順で求めた。

また保存試験開始前の時点での各粒剤のＧＳＳＧ含量をＨＰＬＣにより求めた。

上記の造粒工程における造粒後乾燥前の粒剤の外観を観察したところ、アルカリ性のカリウム剤を用いた参考例２及び３では淡黄色に変色したのに対して、酸性のカリウム剤を用いた参考例１では白色であった。また参考例２及び３では造粒中にアンモニア臭が感じられた。

図４に、上記の造粒工程における乾燥後の粒剤の外観の写真を示す。アルカリ性のカリウム剤を用いた参考例２及び３では褐色に変色したのに対して、酸性のカリウム剤を用いた参考例１では白色であった。また表５に示す通り、保存開始時点でのＧＳＳＧ含量（フリー体換算量）が参考例１の粒剤では１６．０質量％であるのに対して、参考例２、参考例３の粒剤ではそれぞれ１０．９質量％、１０．４質量％でありＧＳＳＧの約３分の１が製造工程にて分解していることが確認された。

図５に、保存安定性試験の結果を、保存開始時点での各粒剤のＧＳＳＧ量を１００％としたときの各時点でのＧＳＳＧ残存率として示す。アルカリ性のカリウム剤を用いた参考例２及び３では参考例１と比較してＧＳＳＧの分解が進み易いことが確認された。

＜試験５＞
次表に示す各組成の還元型グルタチオン（ＧＳＨ）含有顆粒を押出し造粒により製造し、ＧＳＨの保存安定性を確認した。

還元型グルタチオン（ＧＳＨ）はＧＳＳＧを含まない。

ＧＳＨ以外の成分は、試験１と同じものを用いた。

「タルク／ＧＳＨ」は、各組成において、タルクの質量（ｇ）の、ＧＳＨ（フリー体）の質量（ｇ）に対する比を示す。

表６に示す割合の原料を用いて試験１と同様の手順で顆粒製剤を製造した。

顆粒製剤のｐＨ及び水分の測定方法は試験１に記載の通りである。

各製剤のｐＨ及び水分の測定結果を表６に示す。

製造された顆粒製剤について試験１と同じ手順で保存試験を行った。

試験１と同様に、保存開始時のＧＳＳＧ量をＧＳＳＧ残存率１００％としたときの、保存開始０．５カ月後、保存開始１カ月後のＧＳＳＧ残存率（％）を算出した。結果を表７及び図６に示す。

また、試験１と同様に、１カ月間でのＧＳＳＧ減少率（％）をＧＳＳＧ分解速度（％／月）とした。結果を表８及び図７に示す。

タルクを配合した実施例１１〜１３の顆粒では、タルクを含まず鉱物質担体としてクレーのみを含む比較例５の顆粒と比較して、ＧＳＨの保存安定性が顕著に向上することが確認された。

本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (1)

1. 植物の栽培方法であって、
   グルタチオンとアルカリ性鉱物質担体とを含み、グルタチオン１００質量部に対してアルカリ性鉱物質担体が８質量部以上であり、
   アルカリ性鉱物質担体がタルク及びマイカからなる群から選択される１種以上である、グルタチオン含有組成物
   を植物に施用することを含む方法。

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