JP6884638B2

JP6884638B2 - 皮膚外用剤

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Publication number: JP6884638B2
Application number: JP2017098939A
Authority: JP
Inventors: 繁田　葉子; 葉子繁田; 晶山城; 桜井　哲人; 桜井　　哲人
Original assignee: Fancl Corp
Current assignee: Fancl Corp
Priority date: 2017-05-09
Filing date: 2017-05-18
Publication date: 2021-06-09
Anticipated expiration: 2037-05-18
Also published as: JP2018188413A; JP2021011504A; JP7111789B2

Description

本発明は、皮膚細胞のアクアポリン産生促進用組成物及びこれを含有する皮膚外用剤に関する。

アクアポリン（Ａｑｕａｐｏｒｉｎ、以下「ＡＱＰ」）とは細胞膜に存在する細孔（ｐｏｒｅ）を持ったタンパク質として知られている。ＡＱＰは、水分子を選択的に透過させるが、イオンや他の物質は透過させない水チャネル（water channel）として作用していると考えられている。ＡＱＰはＭＩＰ（ｍａｊｏｒｉｎｔｒｉｎｓｉｃｐｒｏｔｅｉｎｓ）ファミリーに属する主要膜タンパク質の一種に分類されている。
ＡＱＰは、水分子のみを選択的に通過させることができるため、主として細胞への水の取り込みに関係していると考えられている。皮膚細胞では、水チャネルとして知られるアクアポリンが、細胞膜上に発現して、細胞間隙の水をはじめとする低分子物質を細胞内へ取り込む役割を担っていることが知られている。ヒトでは、１３種類のＡＱＰ（ＡＱＰ０〜ＡＱＰ１２）の存在が知られている。表皮細胞においては、主としてＡＱＰ３が存在しており、水に加えて、水分保持作用に関与するグリセロールや尿素等の低分子化合物をも取り込む役割を担っていると考えられている（非特許文献１他）。

しかしながら、ＡＱＰ３は加齢とともに減少し、このことが水分保持機能の低下の一因であることが示唆されているため、ＡＱＰ３の発現を促進することにより、加齢による水分保持能やバリア機能等を制御することが可能であると考えられる。このため、皮膚においてＡＱＰの産生を増加することが可能となれば、老化した皮膚の保湿性を改善し、皮膚の張りや弾力性、シワを改善し、さらには皮膚老化の進行を抑制し、改善する効果が期待できる。
このためＡＱＰ産生促進物質の探索が継続的に行われている。その結果、多数の化合物や組成物が有効成分として提案されている（特許文献１〜７参照）。しかしこれらの成分が臨床的に有効であったとする例はわずかである。

一方、本出願人は、ホスホセリン（リン酸化セリン）について研究を継続的に行い、ホスホセリンに睡眠誘導やストレス改善作用を見いだし、抗不安剤の用途、睡眠誘導剤の用途で特許をすでに取得している（特許文献８、特許文献９参照）。

ホスホセリン（Ｐｈｏｓｐｈｏｓｅｒｉｎｅ）はセリンとリン酸のエステルで、アミノ酸の１種である。ホスホセリンはカゼインを始め、翻訳後修飾を受けた多くのリンタンパク質の構成成分となっている。しかしホスホセリンに関する研究は、タンパク質のリン酸化を介する情報伝達において、トレオニン、チロシン、セリンがキナーゼによってリン酸化されることで立体構造の変化が起こり、情報が伝達される一連のカスケードにおけるタンパク質上の作用開始部位として認識されているものの、ホスホセリンのみを取り出して、単独の生理作用を検討することは、あまりおこなわれていなかった。

なお、前記の特許文献８、特許文献９以外の用途として、毛髪のはり・こし改善（特許文献１０）、抗菌剤用途（特許文献１１、特許文献１２）、角層の保湿状態の評価指標（特許文献１３）、アルツハイマー病などに由来するタンパク質の変性・凝集・もつれ・プラークを改善しアルツハイマー病などの疾患を治療する用途（特許文献１４）が知られている。
しかし、ホスホセリンがＡＱＰの産生を促進することは知られていない。

特開２０１６−０７９１８６号公報特開２０１６−０７９１５４号公報特開２０１５−２０３００８号公報特開２０１５−１３４７５１号公報特開２０１３−０９５６６７号公報特開２０１１−０３２１９１号公報特開２００６−２９０８７３号公報特許第４８７８４３６号公報特許第３９９９２４９号公報特開２００６−１６０６４１号公報特開２０１６−０５０１９４号公報特開２０１５−１５７７７８号公報特開２０１４−０４８２５３号公報特表２０１４−５３４２６３号公報

鈴木雅一、田中滋康、「アクアポリンの構造、機能、およびその多様性−脊椎動物を中心として」生化学（日本生化学会）平成２６年２月２５日、第８６巻、第１号、（ｐ４１−５３）

本発明者らは、これらの先行技術に基づき、ホスホセリンの生体における機能について各種の研究を行ってきた。その過程でホスホセリンが皮膚細胞におけるＡＱＰの産生を促進する機能を有していることを見いだし、本発明をなすに至った。またホスホセリンは、皮膚コラーゲン産生促進、シワ改善、皮膚老化の改善作用を有することを見いだした。
すなわち本発明は、ホスホセリンを含有する皮膚細胞のアクアポリン産生促進用組成物及びこれを利用した皮膚外用剤を提供することを課題とする。また本発明は、ホスホセリンを含有する皮膚コラーゲン産生促進、シワ改善、皮膚老化の改善用組成物を提供することを課題とする。

本発明は、次の構成からなる。
（１）ホスホセリンを含有する皮膚外用剤。
（２）ホスホセリンを含有するアクアポリン産生促進用組成物。
（３）ホスホセリンを含有する皮膚コラーゲン産生促進用組成物。
（４）ホスホセリンを含有するシワ改善用組成物。
（５）ホスホセリンを含有する皮膚老化改善用組成物。
（６）ホスホセリンを含有するシワ改善用化粧料。

本発明により、新たなアクアポリン産生促進用組成物が提供される。また皮膚のアクアポリンが増加することによって、皮膚の保湿性が改善され、それに伴って皮膚コラーゲン産生促進、シワ改善、皮膚老化の改善作用などの効果を示す。

臨床試験におけるシワスコアの４週間の変化を示すグラフである臨床試験における皮膚角層の２週目の角層水分量の変化を示すグラフである臨床試験における皮膚角層の２週目の皮膚弾力性の変化を示すグラフである

本願は、ホスホセリンを有効成分として含有するアクアポリン産生促進用組成物及びその利用に関する発明である。
本発明の有効成分であるホスホセリンはリン酸化タンパク質加水分解法、化学合成法、酵素法、発酵法の何れかの方法によって製造することができる。ホスホセリンはセリンの生合成の先駆体として、また日本酒の香気成分としても知られる。リン酸が含まれるタンパク質の構成成分であることから、収率は低いものの動物、植物などから抽出・精製して製造することもできる。ホスホセリンを多く含むタンパク質として、カゼイン、ホスビチンなどがある。さらに、動物、植物などの由来成分から、例えばカゼインやホスビチンなどから化学処理により生成・抽出・精製して製造することもできる。本発明に関わるホスホセリンは特に製造方法を限定するものではない。

本発明のＡＱＰ産生促進用組成物及びホスホセリンを含有する皮膚外用剤には、目的部位においてホスホセリンがＡＱＰ産生促進作用を発揮する濃度に達するように製剤化することが好ましい。外用に用いるＡＱＰ産生促進用組成物には、ホスホセリンとして０．０１〜１．５質量％、より好ましくは０．０３〜０．７質量％含有させることが好ましい。
ホスホセリンを含有する組成物又はホスホセリンを含有する製剤は、製剤上の常套手段により調製することができる。医薬あるいは化粧料用無毒性担体としては、例えば、澱粉、マンニトール、デキストリン、脂肪酸グリセリド、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルデンプン、エチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、アミノ酸、アルブミン、水、生理食塩水、油脂等を配合して、所望の濃度に調整すれば良い。また、必要に応じて、安定化剤、潤滑剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤等の慣用の添加剤を適宜添加し、外用剤として調製することができる。
投与回数は、１日当たり１〜３回投与することで、外用剤の投与部位でＡＱＰ産生を促進することができる。またＡＱＰの産生が促進することで、皮膚にあっては保湿性が改善し、皮膚コラーゲンの産生が促進され、その結果シワの改善が進む。そしてこの状態が維持されることで、皮膚老化が抑制又は改善することが期待される。

以下に、試験例を示して本発明を具体的に説明する。
１．試験例１（ＡＱＰ産生促進試験）
＜試験方法＞
正常ヒト新生児表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を、正常ヒト表皮角化細胞増殖培地（ＫＧＭ）を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。
次いでＫＧＭを用いて３５ｍｍシャーレに４０×１０^４ｃｅｌｌｓ／２ｍＬずつ播き、３７℃、５％ＣＯ_２下で２４時間培養した。
培養後に培養液を捨て、ＫＧＭで必要濃度に溶解した被験試料を各シャーレに２ｍＬずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気下で２４時間培養した。なお被験試料としてホスホセリン及びセリンを用いた。
２４時間経過後、培養液を捨て、ＩＳＯＧＥＮＩＩ（株式会社ニッポンジーン）を用いて全ＲＮＡを抽出し、それぞれのＲＮＡ量を分光光度計にて測定した。また全ＲＮＡ濃度が２００ｎｇ／μＬになるようにＲＮＡ濃度を調製した。
この全ＲＮＡを鋳型とし、ＡＱＰ３および内部標準であるＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量を測定した。
検出はリアルタイムＰＣＲ装置ＳｍａｒｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）（Ｃｅｐｈｅｉｄ社）を用いて、「ＴａＫａＲａＳＹＢＲ（登録商標）ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（商標）ＲＴ−ＰＣＲＫｉｔ（ＰｅｒｆｅｃｔＲｅａｌＴｉｍｅ）」（タカラバイオ株式会社製）によるリアルタイム２ＳｔｅｐＲＴ−ＰＣＲ反応により行った。ＡＱＰ３の発現量は、ＧＡＰＤＨｍＲＮＡの発現量で補正し算出した。ＡＱＰ３ｍＲＮＡ発現促進率の計算方法は以下の通りである。

ＡＱＰ３ｍＲＮＡ発現促進率（％）＝Ａ／Ｂ × １００
Ａ：被験試料添加時の補正値
Ｂ：被験試料無添加時の補正値

＜結果＞
測定結果を下記の表１に示す。

セリンは、対照に比較してＡＱＰ産生能が低下しているが、ホスホセリンはＡＱＰの産生を促進していた。すなわちホスホセリンは表皮角化細胞に発現するＡＱＰを増加させていることが明らかとなった。

２．試験例２（Ｉ型コラーゲン産生促進作用試験）
＜試験方法＞
ヒト正常線維芽細胞（ＮＢ１ＲＧＢ）を１０％ＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭを用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。
回収した細胞を細胞密度１．６×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度に上記培地で希釈した後、９６ｗｅｌｌマイクロプレートに、１ｗｅｌｌ当たり１００μＬずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ_２下で一晩培養した。
培養終了後、０．２５％ＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭに溶解した被験試料を各ｗｅｌｌに１００μＬ添加し、３日間培養した。なお被験試料としてホスホセリン及びセリンを用いた。
培養後、培地を回収し、各ｗｅｌｌの培地中のＩ型コラーゲン量をＥＬＩＳＡ法により測定した。
また細胞生存率を、ＭＴＴアッセイ法を用いて測定した。
すなわち、０．４ｍｇ／ｍＬの濃度にＰＢＳ（−）に溶解したＭＴＴを各ｗｅｌｌに１００μＬずつ添加し、２時間培養した後に、細胞内に生成したブルーホルマザンを２−プロパノール１００μＬで抽出し、波長５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。同時に波長６５０ｎｍにおける吸光度を測定し、両者の差をもってブルーホルマザン生成量とした。
Ｉ型コラーゲン産生促進率および細胞生存率の計算方法は以下のとおりである。

Ｉ型コラーゲン産生促進率（％）＝Ａ／Ｂ × １００
Ａ：被験試料添加時のＩ型コラーゲン量
Ｂ：被験試料無添加時のＩ型コラーゲン量
細胞生存率（％）＝Ｃ／Ｄ × １００
Ｃ：被験試料添加時の細胞での吸光度
Ｄ：被験試料無添加時の細胞での吸光度

＜結果＞
測定結果は５ウエルの平均を求めた。また対照に対するｔ検定を行った。
結果を下記の表２に示す。

表２に示すとおり、ホスホセリンの添加によってヒト線維芽細胞のＩ型コラーゲン産生を顕著に促進した。セリンもＩ型コラーゲンの産生を促進するがホスホセリンには及ばなかった。

以上の試験結果からホスホセリンはヒト表皮角化細胞のＡＱＰ産生を促進し、表皮を構成する線維芽細胞のＩ型コラーゲンの産生能を促進することが判明した。

３．ホスホセリン含有化粧料を用いたヒト試験
ホスホセリンを０．１質量％含有する試験品（化粧料）を常法により調製し、これを用いたヒト試験を実施した。またホスホセリンを含有しない以外は同じ組成の化粧料を調製し、これを比較対照試験品とした。
試験に用いた試験品（化粧料；化粧液）の組成を以下に示す。

成分名配合量（質量％）
１．ホスホセリン０．１
２．グリセリン４
３．１，３−ブチレングリコール６
４．ジプロピレングリコール４
５．１，２−ペンタンジオール１．５
６．フェノキシエタノール０．３
７．ＰＨ調整剤適量
８．精製水残余

＜試験方法＞
日本香粧品学会抗老化機能評価専門委員会「新規効能取得のための抗シワ製品評価ガイドライン」に則り、４０〜５９歳（平均年齢約５０歳）の被験者２１名を対象にホスホセリン含有化粧料使用群、非使用群（比較対照試験品使用群）を設定して４週間の連用試験を行った。
評価項目は、シワグレード評価（ＴｒａｉｎｅｄＥｘｐｅｒｔによる目視評価）、角層水分量（ＣｏｒｎｅｏｍｅｔｅｒＣＭ８２５Ｃ＋Ｋ社製）、皮膚弾力性（ＣｕｔｏｍｅｔｅｒＭＰＡ５８０Ｃ＋Ｋ社製）とした。各評価項目の具体的な方法は次のとおりである。

シワグレード評価
使用開始前、使用開始２週間後、使用開始４週間後の３回計測した。
ＴｒａｉｎｅｄＥｘｐｅｒｔがシワグレード標準１）およびシワグレード標準写真２）をもとに被験者の目尻のシワの程度を評価した。各グレードの標準１）およびシワグレード標準写真２）に当てはまらない場合は、その中間値のスコアの導入も可とした。
シワグレード標準１）
グレード０：シワはない
グレード１：不明瞭な浅いシワが僅かに認められる
グレード２：明瞭な浅いシワが僅かに認められる
グレード３：明瞭な浅いシワが認められる
グレード４：明瞭な浅いシワの中に、やや深いシワが僅かに認められる
グレード５：やや深いシワが認められる
グレード６：明瞭な深いシワが認められる
グレード７：著しく深いシワが認められる

角層水分量
使用開始前、使用開始２週間後の２回計測した。
ＣｏｒｎｅｏｍｅｔｅｒＣＭ８２５を用いて、目尻を３回測定し平均値を求めた。測定箇所は、各回測定箇所の隣接部位とした。

皮膚弾力性
使用開始前、使用開始２週間後の２回計測した。
ＣｕｔｏｍｅｔｅｒＭＰＡ５８０を用いて、目尻と鼻の下部を結んだ直線の中点を２回計測した。測定箇所は、各回測定箇所の隣接部位とした。
キュートメーターによる皮膚粘弾性の測定は、吸引口２ミリのプローブを用い４００ｍｂ吸引圧で２秒間吸引し、その後開放したときの変形する皮膚の変位を解析した。本試験では皮膚の粘弾性指標として用いられるパラメータ（Ｒ２）を解析したが、これは「吸引時の皮膚の伸びた長さに対する吸引開放時の皮膚の戻り率＝皮膚の復元率」であり、皮膚全体の弾力を測る一般的な手法である。

なお各評価項目は、被験者の平均値を求め、シワグレード評価についてはWilcoxonの符号付順位和検定で、角層水分量と皮膚弾力性はｔ検定を用いて有意差検定を行った。
有意水準はｐ＜０．０５とした。

＜結果＞
シワスコアの変化を示すグラフを図１に、角層水分量の変化を示すグラフを図２に、皮膚弾力性の変化を示すグラフを図３に示した。
シワスコアは４週連続使用によって効果が現れ、有意差を確認できた。
角層水分量及び皮膚弾力性は２週目に効果が現れて非使用群（比較対照試験品使用群）との有意差が確認された。
以上の臨床試験から、ホスホセリンは皮膚の水分量を増加させ、保湿性を改善して皮膚の弾力性を向上させたことがわかった。また皮膚の水分量が増加し、弾力性が改善されることによってシワが改善した。すなわちホスホセリンは皮膚の老化を抑制し、また改善することが明らかとなった。

Claims

ホスホセリンを含有する皮膚細胞のアクアポリン産生促進用の皮膚外用剤（ただし、抗アポトーシス用剤、アポトーシスに起因する皮膚もしくは粘膜の老化症状の改善又は創傷治癒促進用剤を除く)。