JP6858197B2 - 多機能融合ポリペプチドとその製造方法及び使用 - Google Patents
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Description
本発明は、生物製剤分野に属し、具体的には、新規な多機能融合ポリペプチドとその製造方法及び使用に関する。
肺線維症、特に特発性肺線維症（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）は、これまで長い間、進行性であって、ほとんど不可逆的な病理学的変化と考えられていた。診断後のIPF患者は5年死亡率が65%にも達し、公衆衛生に重大な脅威となっている。IPFに対して、現在の治療措置はほとんど効果がなく、認可された治療計画さえも形成されていない。肺線維症の最も一般的な症状は呼吸困難である。肺線維症が軽度の場合は、呼吸困難が一般的に激しい活動中に発生するため、見落とされるか、または他の疾患として誤診される場合が多い。肺線維症が進行した場合は、安静時においても呼吸困難が発生し、重度の肺線維症患者は、進行性の呼吸困難が発生することがある。
肺線維症を引き起こし得る要因は多くあり、例えば、職業性粉塵暴露、放射線障害及び薬物（ブレオマイシン）等がある。また、病因が不明な肺線維症（例えば、IPF）も存在する。病因が異なるが、肺線維症の進行過程は基本的に似ている。即ち、下気道炎症細胞の浸潤から、肺胞上皮細胞及び血管内皮細胞の損傷を徐々に引き起すとともに、筋線維芽細胞（myofibroblast, MF）及びII型肺胞上皮細胞の増殖に関するサイトカイン等の放出を伴い、細胞外マトリックスタンパク質及びコラーゲンが沈着し、最終的に肺構造の損傷を引き起こす。様々な原因で引き起こされる肺損傷は、初期は顕著な炎症状態を呈するが、肺線維症は、後期にも炎症状態が明らかではない。これは、抗炎症療法による肺線維症の治療が無効になる重要な原因であると考えられている。
肺線維症のメカニズムに関する最近の研究により、タンパク質ポリペプチドIle-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Proは、ヒト血管新生のエンドスタチンの配列であり、血管新生の阻害作用を有すること;トリペプチドArg-Gly-Aspは、新生血管の表面で発現されるインテグリンに特異的に結合できることが発見された。上記の2つのアミノ酸配列の融合ポリペプチド（特許公開番号:CN1699408A）は、抗腫瘍及び抗リウマチに関する治療に用いられている。タンパク質ポリペプチドPro-(D-Pyr)-(D-Cys) -Bip-Arg-Gly-Glu（特許公開番号:CN102746380A）は、細胞外マトリックスメタロプロテイナーゼの活性を阻害できることが発見された。現在、この2種類の短いペプチドは、腫瘍、リウマチ性疾患の治療への使用が申請されているが、これらのポリペプチドは、同時に複数のターゲットに作用できず、単一ターゲットにのみ作用することができ、また、腫瘍細胞が単一ターゲットの薬物に対して薬剤耐性をより発生しやすい。
従来のポリペプチド薬物のターゲットが単一であること、薬剤耐性が発生しやすいこと、肺線維症に対する治療効果の欠如等の問題を解決するために、本発明は、ヒト肺線維症、肺組織病変、肺がんその他の腫瘍を治療可能な多機能融合ポリペプチドとその製造方法及び使用を提供する。本発明のポリペプチドは、複数のターゲットを同時に標的とする複数のドメインを含み、肺線維症細胞のモデルにおいて、本発明のポリペプチドは、モデル群の細胞におけるヒドロキシプロリンの含有量を顕著に減少させ、肺線維症の進行を抑制することができる。
上記問題を解決するために、本発明の技術的解決手段は以下の通りである。
ポリペプチドにドメインPro-(D-Pyr)-(D-Cys)-Bip-Arg-Gly-Glu、Ile-Val -Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro、Arg-Gly-Asp及びGly-Gly-Gly-Glyが含まれる多機能融合ポリペプチド。
ポリペプチドにドメインPro-(D-Pyr)-(D-Cys)-Bip-Arg-Gly-Glu、Ile-Val -Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro、Arg-Gly-Asp及びGly-Gly-Gly-Glyが含まれる多機能融合ポリペプチド。
好ましくは、ポリペプチドのアミノ酸配列は、
ポリペプチドI:
Pro-(D-Pyr)-(D-Cys)-Bip-Arg-Gly-Glu-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg- Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp;
ポリペプチドII:
Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Pro-(D-Pyr)-(D-Cys) -Bip-Arg-Gly-Glu-Gly-Gly-Gly-Gly- Arg-Gly-Asp;
ポリペプチドIII:
Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Gly-Pro-(D-Pyr)-(D-Cys)-Bip-Arg-Gly-Glu-Gly-Gly-Gly -Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro;
ポリペプチド IV:
Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly -Gly-Gly-Gly-Pro-(D-Pyr)-(D-Cys)-Bip-Arg-Gly-Glu;
ポリペプチドV:
Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp-Gly -Gly-Gly-Gly-Pro-(D-Pyr)-(D-Cys)-Bip-Arg-Gly-Glu;
ポリペプチドVI:
Pro-(D-Pyr)-(D-Cys)-Bip-Arg-Gly-Glu-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly -Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Proであり、
ここで、Pyrは、3-（3-ピリジル）-L-アラニンであり、Bipは、L-4,4'-ビフェニルアラニンである。
ポリペプチドI:
Pro-(D-Pyr)-(D-Cys)-Bip-Arg-Gly-Glu-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg- Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp;
ポリペプチドII:
Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Pro-(D-Pyr)-(D-Cys) -Bip-Arg-Gly-Glu-Gly-Gly-Gly-Gly- Arg-Gly-Asp;
ポリペプチドIII:
Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Gly-Pro-(D-Pyr)-(D-Cys)-Bip-Arg-Gly-Glu-Gly-Gly-Gly -Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro;
ポリペプチド IV:
Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly -Gly-Gly-Gly-Pro-(D-Pyr)-(D-Cys)-Bip-Arg-Gly-Glu;
ポリペプチドV:
Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp-Gly -Gly-Gly-Gly-Pro-(D-Pyr)-(D-Cys)-Bip-Arg-Gly-Glu;
ポリペプチドVI:
Pro-(D-Pyr)-(D-Cys)-Bip-Arg-Gly-Glu-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly -Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Proであり、
ここで、Pyrは、3-（3-ピリジル）-L-アラニンであり、Bipは、L-4,4'-ビフェニルアラニンである。
上記多機能融合ポリペプチドの、抗ヒト肺線維症薬、抗肺組織病変薬、抗肺がん薬、及び抗腫瘍薬における使用。
好ましくは、上記肺線維症は、特発性肺線維症、並びに、職業性粉塵、放射線障害及び薬物による肺線維症を含む。
好ましくは、上記肺組織病変は、細菌性肺炎、ウイルス性肺炎、マイコプラズマ肺炎、クラミジア肺炎、原虫肺炎、及び真菌性肺炎を含む。
好ましくは、上記肺がんは、扁平上皮細胞がん、腺がん、腺扁平上皮がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん及び大細胞がんを含む。
好ましくは、上記腫瘍は、ヒトの頭頸部、脳、甲状腺、食道、膵臓、肝臓、胃、乳腺、腎臓、胆嚢、結腸若しくは直腸、卵巣、子宮頸、子宮、前立腺、膀胱又は精巣に由来する原発性がん又は二次発がん、黒色腫、血管腫及び肉腫である。
上記多機能融合ポリペプチドの製造方法は、固相法による合成及び液相法による合成を含む。
好ましくは、上記固相法による合成は、固相担体であるFmoc-wang-resin又はFmoc-CTC-resinを出発原料とし、保護アミノ酸を用いてノナコサペプチドとなるようにジペプチドを順次接続し、ペプチド接続工程が完了した後、洗浄、ペプチド切断、及び後処理を行うことで、上記融合ポリペプチドの粗生成物を得、融合ポリペプチドの粗生成物を溶解し、分取高速液体クロマトグラフィーにより精製し、濃縮して凍結乾燥することで上記融合ポリペプチドを得るステップを含む。
好ましくは、上記液相法による合成は、ポリペプチド配列におけるアミノ酸をアミド結合を介して順次接続し、アミノ酸の不活性基をFmocで修飾するステップを含む。
本発明では、ターゲットが異なる3種類の短いペプチドを、最適化したアミノ酸接続配列であるGly-Gly-Gly-Glyを介して一体に接続する。短いペプチド間のアミノ酸接続配列はフレキシブルであり、ポリペプチド配列Arg-Gly-Aspは細胞表面のインテグリンανβ3と結合して細胞遊走を阻害し、ポリペプチド配列Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Proは微血管の新生を阻害し、ポリペプチド配列Pro-(D-Pyr)-(D-Cys)-Bip-Arg-Gly-Gluは、細胞外マトリックスメタロプロテイナーゼの活性を阻害し、細胞が細胞外マトリックスを分解する能力を低下させる。順序が異なる短いペプチド組合せ及び異なるアミノ酸接続配列を選別することにより、本発明の融合ポリペプチドは、各アミノ酸ドメインとターゲットとの結合が互いの影響を受けないことを保証できる。本発明の融合ポリペプチドは、複数のターゲットを同時に標的とすることができるため、単一の短いペプチドに比べて、腫瘍細胞のアポトーシスシグナル伝達経路を活性化し、腫瘍細胞の薬剤感受性を向上でき、抗腫瘍効果が顕著に高い。また、本発明者は3種類の短いペプチドを融合した結果、該融合ポリペプチドは細胞におけるヒドロキシプロリンの含有量を顕著に減少でき、肺線維症の治療に対して顕著な効果を有するという完全に新しい機能を有することを予想外に見出した。肺線維症の病変進行に異常の血管新生及び細胞外マトリックスの蓄積を伴うが、従来の血管新生及び細胞外マトリックスの蓄積を阻害できる薬物又はポリペプチドは、肺線症候群の治療に顕著な効果を有しないのに対し、本発明の融合ポリペプチドは、肺線維症の進行を顕著に阻害できるとともに、多種の肺感染症を阻害できる。
従来技術に比べて、本発明は以下の効果を有する。
（1）本発明の融合ポリペプチドは、肺線維症の治療に適用でき、成分がアミノ酸であるため、合成されやすく、明らかな副作用がない。肺線維症細胞モデルにおいて、本発明の融合ポリペプチドは、細胞におけるヒドロキシプロリンの含有量を顕著に減少させ、肺線維症の症状を改善できる。
（2）本発明の融合ポリペプチドは、肺感染症に対して顕著な阻害効果を有し、最大阻害率が65%以上に達し、ペニシリンの効果よりも高い。
（3）本発明の融合ポリペプチドは、肺がん細胞の増殖に対して阻害効果を有し、最大阻害率が93%以上に達し、ドセタキセルの効果よりも高い。
（4）従来の承認された腫瘍治療薬であるドセタキセルに比べて、本発明のポリペプチドは、多種の腫瘍に対する増殖阻害効果がより高く、且つ明らかな副作用がない。本発明のポリペプチドの製造方法は簡単で、良好な応用の見込みを有する。
（5）単一ターゲットの短いペプチドに比べて、本発明の融合ポリペプチドは、抗肺線維症及び抗肺感染症の活性を有する。
（1）本発明の融合ポリペプチドは、肺線維症の治療に適用でき、成分がアミノ酸であるため、合成されやすく、明らかな副作用がない。肺線維症細胞モデルにおいて、本発明の融合ポリペプチドは、細胞におけるヒドロキシプロリンの含有量を顕著に減少させ、肺線維症の症状を改善できる。
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（3）本発明の融合ポリペプチドは、肺がん細胞の増殖に対して阻害効果を有し、最大阻害率が93%以上に達し、ドセタキセルの効果よりも高い。
（4）従来の承認された腫瘍治療薬であるドセタキセルに比べて、本発明のポリペプチドは、多種の腫瘍に対する増殖阻害効果がより高く、且つ明らかな副作用がない。本発明のポリペプチドの製造方法は簡単で、良好な応用の見込みを有する。
（5）単一ターゲットの短いペプチドに比べて、本発明の融合ポリペプチドは、抗肺線維症及び抗肺感染症の活性を有する。
以下、具体的な実施例により本発明を詳しく説明する。
実施例1
本発明の多機能ポリペプチドの製造及び測定
本実施例において、ポリペプチドI-VIは、全て固相合成法により合成され、分取HPLCにより分離精製を行い、分析用HPLCによりポリペプチドの純度を測定する。
本発明の多機能ポリペプチドの製造及び測定
本実施例において、ポリペプチドI-VIは、全て固相合成法により合成され、分取HPLCにより分離精製を行い、分析用HPLCによりポリペプチドの純度を測定する。
ポリペプチドI-VIの固相合成法は、固相担体であるFmoc-wang-resin（吉爾生化有限公司）を出発原料とし、保護アミノ酸を用いてノナコサペプチドとなるようにジペプチドを順次接続し、ペプチド接続工程が完了した後、十分に洗浄し、ペプチド切断し、後処理することでポリペプチドの粗生成物を得、粗生成物を溶解し、分取高速液体クロマトグラフィーにより2回精製し、濃縮し凍結乾燥することで精製物を得、最後に3次精製によりポリペプチドの精製物を得る。この方法によれば、合成効率を保証できると共に、生成物の純度を向上できる。
1. ペプチド接続（ノナコサペプチド/ヘプタデカペプチド/トリデカペプチドになるまでジペプチドを接続することを含む）ステップは、以下の通りである。
1.5gの固相担体であるFmoc-wang-resinを量り取り、ガラス砂中子反応カラムに入れ、5mLの無水DMF（ジメチルホルムアミド）を加え、樹脂を2時間かけて十分に膨張させ、溶媒DMFを減圧濾過で取り除く。
a. 脱保護:15mLの脱保護液（体積分率で20%ピリジン、80%DMFを含む）を加え、一定時間反応させた後、脱保護液を減圧濾過により取り除く。ここで、15mLの脱保護液で1回洗浄することで、Fmoc保護基を外す。
b. 洗浄:脱保護液を減圧除去し、15mLのDMFで樹脂を3回洗浄することで、副生成物を十分に取り除く。
c. 縮合:設計されたポリペプチドアミノ酸配列に従って、ペプチド接続に用いられるFmocで修飾された単量体アミノ酸を5mLのDMFに溶解し、さらにDIEA（N,N-ジイソプロピルエチルアミン）を0.5mL加え、混合して反応容器に入れ、N2を吹き込み2時間反応させ、反応液を濾過により除去した後、5mLのメタノールを加えて反応を1 時間停止した後、15mLのDCM（ジクロロメタン）で樹脂を3回洗浄する。
d. 洗浄:反応液を減圧濾過により取り除き、15mLのDMFで樹脂を十分に洗浄することで副生成物を取り除く。
e. ペプチド切断:溶媒を減圧濾過により取り除いた樹脂を丸底フラスコに入れ、分解液を加え、合成したノナコサペプチド中間体を十分に分解し、砂中子濾過装置により樹脂とポリペプチドとを分離する。上記分解液の組成は、体積でトリフルオロ酢酸:フェノール:水:ベンゾイルスルフィド:EDT=90:3:3:2:2である。
1.5gの固相担体であるFmoc-wang-resinを量り取り、ガラス砂中子反応カラムに入れ、5mLの無水DMF（ジメチルホルムアミド）を加え、樹脂を2時間かけて十分に膨張させ、溶媒DMFを減圧濾過で取り除く。
a. 脱保護:15mLの脱保護液（体積分率で20%ピリジン、80%DMFを含む）を加え、一定時間反応させた後、脱保護液を減圧濾過により取り除く。ここで、15mLの脱保護液で1回洗浄することで、Fmoc保護基を外す。
b. 洗浄:脱保護液を減圧除去し、15mLのDMFで樹脂を3回洗浄することで、副生成物を十分に取り除く。
c. 縮合:設計されたポリペプチドアミノ酸配列に従って、ペプチド接続に用いられるFmocで修飾された単量体アミノ酸を5mLのDMFに溶解し、さらにDIEA（N,N-ジイソプロピルエチルアミン）を0.5mL加え、混合して反応容器に入れ、N2を吹き込み2時間反応させ、反応液を濾過により除去した後、5mLのメタノールを加えて反応を1 時間停止した後、15mLのDCM（ジクロロメタン）で樹脂を3回洗浄する。
d. 洗浄:反応液を減圧濾過により取り除き、15mLのDMFで樹脂を十分に洗浄することで副生成物を取り除く。
e. ペプチド切断:溶媒を減圧濾過により取り除いた樹脂を丸底フラスコに入れ、分解液を加え、合成したノナコサペプチド中間体を十分に分解し、砂中子濾過装置により樹脂とポリペプチドとを分離する。上記分解液の組成は、体積でトリフルオロ酢酸:フェノール:水:ベンゾイルスルフィド:EDT=90:3:3:2:2である。
2. 後処理ステップは、以下の通りである。
無水ジエチルエーテルを切断液に加えてポリペプチドを析出させた後、遠心分離し、上澄みを捨て、その後、無水ジエチルエーテルでポリペプチドを洗浄し、溶媒を減圧濾過により取り除くことでポリペプチド粗生成物を得る。
無水ジエチルエーテルを切断液に加えてポリペプチドを析出させた後、遠心分離し、上澄みを捨て、その後、無水ジエチルエーテルでポリペプチドを洗浄し、溶媒を減圧濾過により取り除くことでポリペプチド粗生成物を得る。
3. 精製のステップは、以下の通りである。
a. 溶解:粗生成物を5-20g/Lの溶液に調製し、0.45μmの混合濾過膜で濾過する。
調製:セミ分取高速液体クロマトグラフィーにより1次精製、2次精製及び3次精製を行うことで、ポリペプチドの精製合格品を得る。移動相は、A相がアセトニトリル、B相が0.1%のTFA水溶液である。
（1）1次精製:30%-40%のアセトニトリル水溶液を用いて、流速50mL/minで10min洗い流すことで分取カラムを平衡化させる。溶解し濾過した粗生成物を輸液ポンプにより1mL/minでサンプリングする。
a. 溶解:粗生成物を5-20g/Lの溶液に調製し、0.45μmの混合濾過膜で濾過する。
調製:セミ分取高速液体クロマトグラフィーにより1次精製、2次精製及び3次精製を行うことで、ポリペプチドの精製合格品を得る。移動相は、A相がアセトニトリル、B相が0.1%のTFA水溶液である。
（1）1次精製:30%-40%のアセトニトリル水溶液を用いて、流速50mL/minで10min洗い流すことで分取カラムを平衡化させる。溶解し濾過した粗生成物を輸液ポンプにより1mL/minでサンプリングする。
表1: 1次精製の溶出勾配
紫外線波長220nmにおける吸収が200mvを超えた溶液を収集し、純度を測定し、純度が95%を超えた溶液をピーク成分として合わせ、2次分離精製に供する。
（2）2次精製:30%-40%のアセトニトリル水溶液を用いて、流速50mL/minで10 min洗い流すことで分取カラムを平衡化させる。
1次精製で得られたピーク成分をロータリーエバポレーターにより有機溶媒を除去した後、輸液ポンプにより1mL/minでサンプリングする。
1次精製で得られたピーク成分をロータリーエバポレーターにより有機溶媒を除去した後、輸液ポンプにより1mL/minでサンプリングする。
表2: 2次精製の溶出勾配
紫外線波長220nmにおける吸収が200mvを超えた溶液を収集し、純度を測定し、純度が98%を超えた場合を合格と評価する。
b. 濃縮、濾過、凍結乾燥:合格溶液をロータリーエバポレーターにより37℃で減圧濃縮させることで、残留溶媒及び注射用水を除去する。最後に0.22μmの濾過膜で濾過し、濾液を凍結乾燥皿に入れ、凍結乾燥器で凍結乾燥することで精製物を得る。
(3)3次精製:30%-40%のアセトニトリル水溶液を用いて、流速50mL/minで10 min洗い流すことで分取カラムを平衡化させる。2次精製で得られた純度が98%を超えた合格サンプルを3次精製を行い、ポリペプチド精製物を製造する。
表3: 3次精製の溶出勾配
表3: 3次精製の溶出勾配
紫外線波長220nmにおける吸収が220mvを超えた溶液を収集し、純度を測定し、純度が99.5%を超えたサンプルを精製合格品として併合する。
4. 純度測定
凍結乾燥した精製生成物を収集し、分析用RP-HPLCによりポリペプチドの純度を測定する。分析条件は、移動相:CAN（+0.1% TFA）、H2O（+0.1% TFA）;アセトニトリル（CAN）線形勾配:15%-100%;流速:1.5 mL/min;時間:30 min;サンプリング量:20 μL;測定波長:220 nmである。
凍結乾燥した精製生成物を収集し、分析用RP-HPLCによりポリペプチドの純度を測定する。分析条件は、移動相:CAN（+0.1% TFA）、H2O（+0.1% TFA）;アセトニトリル（CAN）線形勾配:15%-100%;流速:1.5 mL/min;時間:30 min;サンプリング量:20 μL;測定波長:220 nmである。
本実験では、固相合成法によりポリペプチドを合成する。該方法は、再現性が高く、操作性が高く、汚染が少ない。また、逆相高速液体クロマトグラフィーによりポリペプチドを精製し、グラジエント溶出は、アイソクラティック溶出よりも、分離効果が良好であり、分離過程では、保持時間が適切で、生産効率が高く、純度が高い。
実施例2
本実施例において、ポリペプチドI-VIは、全て液相合成法により合成され、分取HPLCにより分離精製を行い、分析用HPLCによりポリペプチドの純度を測定する。以下はポリペプチドIの合成ステップであり、ポリペプチドII-VIの合成ステップはポリペプチドIと同じである。
本実施例において、ポリペプチドI-VIは、全て液相合成法により合成され、分取HPLCにより分離精製を行い、分析用HPLCによりポリペプチドの純度を測定する。以下はポリペプチドIの合成ステップであり、ポリペプチドII-VIの合成ステップはポリペプチドIと同じである。
ポリペプチドIの合成ステップは、以下の通りである。
ステップ1. ポリペプチドIの配列に従って、10 mLのジクロロメタン中で1 mgの1番目のアミノ酸Proと1 mgの2番目のアミノ酸D-Pyrをアミド結合を介して接続し、反応に関与するアミノ酸の不活性基をFmocで修飾する。
ステップ2. 上記反応系に10mLのアンモニア水を加えてFmoc基を外す。
ステップ3. ステップ1を繰り返し、合成されたポリペプチドの配列に従って、3番目のアミノ酸D-Cysを加え、アミノ酸の不活性基をFmocで修飾する。
ステップ4. ポリペプチド配列Pro-(D-Pyr)-(D-Cys)-Bip-Arg-Gly-Glu-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Aspの全てが合成されるまでステップ2及びステップ3を繰り返す。
ステップ5. 分取HPLCによりポリペプチド生成物の分離を行う。移動相:アセトニトリル線形勾配:15%-100%;流速:1.5 mL/min;時間:60 min;サンプリング量:100 mL;測定波長:220 nm。
ステップ1. ポリペプチドIの配列に従って、10 mLのジクロロメタン中で1 mgの1番目のアミノ酸Proと1 mgの2番目のアミノ酸D-Pyrをアミド結合を介して接続し、反応に関与するアミノ酸の不活性基をFmocで修飾する。
ステップ2. 上記反応系に10mLのアンモニア水を加えてFmoc基を外す。
ステップ3. ステップ1を繰り返し、合成されたポリペプチドの配列に従って、3番目のアミノ酸D-Cysを加え、アミノ酸の不活性基をFmocで修飾する。
ステップ4. ポリペプチド配列Pro-(D-Pyr)-(D-Cys)-Bip-Arg-Gly-Glu-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Aspの全てが合成されるまでステップ2及びステップ3を繰り返す。
ステップ5. 分取HPLCによりポリペプチド生成物の分離を行う。移動相:アセトニトリル線形勾配:15%-100%;流速:1.5 mL/min;時間:60 min;サンプリング量:100 mL;測定波長:220 nm。
実施例3
生体外肺線維症モデルの構築
10%（体積分率）のウシ胎仔血清を含むDMEM培地でヒト非小細胞肺がん細胞A549を37 ℃の5%（体積分率）二酸化炭素インキュベータ内で培養し、1日おきに培地を交換し、細胞密度に応じて継代させる。対数増殖期にあるA549細胞を取り、0.25%のトリプシンで消化した後、細胞懸濁液を調製し、細胞濃度を1×109個/Lに調整し、4×105個/cm2の密度で90cm2の細胞培養皿に接種し、対照群及びモデル群の2群にランダムに分ける。対照群は、10%（体積分率）のウシ胎仔血清を含むDMEMで培養する。モデル群は、10%（体積分率）のウシ胎仔血清、トランスフォーミング増殖因子（TGF-β1，最終濃度5μg /L）を含むDMEMで培養する。37℃の5%（体積分率）二酸化炭素インキュベータ内で培養し、1日おきに培地を交換し、細胞密度に応じて予定の通りに継代させる。毎日倒立顕微鏡で細胞形態を観察することでモデル構築にかかる時間を確定する。A549細胞が元の上皮細胞の玉石状から間質細胞の紡錘状に変わったときに、モデル構築が完了する。
生体外肺線維症モデルの構築
10%（体積分率）のウシ胎仔血清を含むDMEM培地でヒト非小細胞肺がん細胞A549を37 ℃の5%（体積分率）二酸化炭素インキュベータ内で培養し、1日おきに培地を交換し、細胞密度に応じて継代させる。対数増殖期にあるA549細胞を取り、0.25%のトリプシンで消化した後、細胞懸濁液を調製し、細胞濃度を1×109個/Lに調整し、4×105個/cm2の密度で90cm2の細胞培養皿に接種し、対照群及びモデル群の2群にランダムに分ける。対照群は、10%（体積分率）のウシ胎仔血清を含むDMEMで培養する。モデル群は、10%（体積分率）のウシ胎仔血清、トランスフォーミング増殖因子（TGF-β1，最終濃度5μg /L）を含むDMEMで培養する。37℃の5%（体積分率）二酸化炭素インキュベータ内で培養し、1日おきに培地を交換し、細胞密度に応じて予定の通りに継代させる。毎日倒立顕微鏡で細胞形態を観察することでモデル構築にかかる時間を確定する。A549細胞が元の上皮細胞の玉石状から間質細胞の紡錘状に変わったときに、モデル構築が完了する。
実施例4
ポリペプチドによる肺線維症治療の実験ステップ
TGF-β1で誘発されていないA549細胞を対照群とし、TGF-β1で誘発された肺線維症モデル群を複数の群に分ける。そのうちの1群は、ポリペプチドを投与せずモデル群対照とする一方、他の群は、それぞれ用量の異なるポリペプチドを投与する。ポリペプチド投与の48時間後、対照群、モデル群、投与群の細胞を収集して、次の肺線維症関連分子指標の測定を行う。
ポリペプチドによる肺線維症治療の実験ステップ
TGF-β1で誘発されていないA549細胞を対照群とし、TGF-β1で誘発された肺線維症モデル群を複数の群に分ける。そのうちの1群は、ポリペプチドを投与せずモデル群対照とする一方、他の群は、それぞれ用量の異なるポリペプチドを投与する。ポリペプチド投与の48時間後、対照群、モデル群、投与群の細胞を収集して、次の肺線維症関連分子指標の測定を行う。
細胞におけるヒドロキシプロリンの含有量の測定
人体検体実験は、肺線維症の後期に間質に大量のコラーゲンが蓄積することを示している。コラーゲンの含有量は肺線維症のレベルを反映し、ヒドロキシプロリンがコラーゲン中13.4%を占めるため、ヒドロキシプロリンの含有量は、肺線維症の進行中におけるコラーゲンの蓄積状況を反映し、ひいては肺線維症のレベルを反映し得る。
人体検体実験は、肺線維症の後期に間質に大量のコラーゲンが蓄積することを示している。コラーゲンの含有量は肺線維症のレベルを反映し、ヒドロキシプロリンがコラーゲン中13.4%を占めるため、ヒドロキシプロリンの含有量は、肺線維症の進行中におけるコラーゲンの蓄積状況を反映し、ひいては肺線維症のレベルを反映し得る。
クエン酸緩衝液の調製:クエン酸ナトリウム120 g、氷酢酸12 mL、クエン酸46 g、水酸化ナトリウム34 g を蒸留水に溶解し、pH値を6.0に調整した後、混合液が1000mLとなるまで蒸留水を添加する。
0.05mol/LのクロラミンT溶液の調製:クロラミンT 7.05gを量り取り、100mLの蒸留水に溶解した後、エチレングリコール150mLを加え、さらに250mLのクエン酸緩衝液を加え、均一に混合する。
p-ジメチルアミノベンズアルデヒドの調製:無水エタノール20 mLに濃硫酸2.74mLをゆっくりと加えることで試薬Aを調製し、試薬B:p-ジメチルアミノベンズアルデヒド12.0gに無水エタノール40mLをゆっくりと加え、水浴中で加熱して完全に溶解させた後、室温まで冷却することで試薬Bを調製する。試薬Aを試薬Bにゆっくりと加え、均一に混合する。
3.5mol/Lの過塩素酸溶液の調製:27 mLの過塩素酸を取り、蒸留水で溶液の体積を100mLにする。
具体的なステップは以下の通りである。
細胞を収集し、1mLの水中でホモジナイザーを用いて溶解し、pHを中性に調製し、溶液の体積を3mLにした後、活性炭を加えて遠心分離する。次いで、上澄み1mLを取り、溶液1（1mLのクエン酸緩衝液及び1mLの0.05mol/LクロラミンT溶液）を加え、10分間静置し、過塩素酸1mLを加え、5分間静置し、p-ジメチルアミノベンズアルデヒド試薬1mLを加え、60℃の水浴で15分間加熱した後、3500rpm/minで10分間遠心分離し、上澄みを取って550nmの波長における吸光度値を測定する。
細胞を収集し、1mLの水中でホモジナイザーを用いて溶解し、pHを中性に調製し、溶液の体積を3mLにした後、活性炭を加えて遠心分離する。次いで、上澄み1mLを取り、溶液1（1mLのクエン酸緩衝液及び1mLの0.05mol/LクロラミンT溶液）を加え、10分間静置し、過塩素酸1mLを加え、5分間静置し、p-ジメチルアミノベンズアルデヒド試薬1mLを加え、60℃の水浴で15分間加熱した後、3500rpm/minで10分間遠心分離し、上澄みを取って550nmの波長における吸光度値を測定する。
試験を3回独立して繰り返し、式:阻害率（%）=（1-実験群吸光度値/モデル吸光度値）×100%、により阻害率を算出する。表4は、本発明のポリペプチドの肺線維症モデルのヒドロキシプロリンの含有量に対する抑制率を示している。図1から明らかなように、本発明のポリペプチドI及びポリペプチドIIは、肺線維症モデル細胞におけるヒドロキシプロリンの含有量を抑制でき、肺線維症の進行を阻害できる。図2から明らかなように、本発明のポリペプチドIII及びポリペプチドIVは、肺線維症モデル細胞におけるヒドロキシプロリンの含有量を抑制でき、肺線維症の進行を阻害できる。図3から明らかなように、本発明のポリペプチドV及びポリペプチドVIは、肺線維症モデル細胞におけるヒドロキシプロリンの含有量を抑制でき、肺線維症の進行を阻害できる。
表4 本発明のポリペプチドの肺線維症モデルにおけるヒドロキシプロリンの含有量に対する抑制率（%）
実施例5
本発明のポリペプチドの多種の肺感染症に対する阻害作用
点鼻法によりマウス肺炎モデルを構築する。具体的には、体重16〜22gのBALB/Cマウスを選択し、それぞれ0日目、1日目及び2日目にジエチルエーテルで麻酔した後、調製された肺炎連鎖球菌の菌液、アデノウイルス濃縮液、肺炎マイコプラズマ、肺炎クラミジア、原虫、肺炎真菌をマウスの鼻腔に滴下して気管気管支に入れることにより、マウス肺炎モデルを構築する。操作過程において、菌液を不活化することを回避するために、菌液が食道に入ることを防止する必要がある。モデル構築した後、本発明のポリペプチドを投与する。表5の結果より、ペニシリン投与群に比べて、本発明のポリペプチドは、多種の肺感染症に対してより顕著な改善作用を有することが分かる（図4）。試験の結果は、平均値±標準偏差によって表される。
本発明のポリペプチドの多種の肺感染症に対する阻害作用
点鼻法によりマウス肺炎モデルを構築する。具体的には、体重16〜22gのBALB/Cマウスを選択し、それぞれ0日目、1日目及び2日目にジエチルエーテルで麻酔した後、調製された肺炎連鎖球菌の菌液、アデノウイルス濃縮液、肺炎マイコプラズマ、肺炎クラミジア、原虫、肺炎真菌をマウスの鼻腔に滴下して気管気管支に入れることにより、マウス肺炎モデルを構築する。操作過程において、菌液を不活化することを回避するために、菌液が食道に入ることを防止する必要がある。モデル構築した後、本発明のポリペプチドを投与する。表5の結果より、ペニシリン投与群に比べて、本発明のポリペプチドは、多種の肺感染症に対してより顕著な改善作用を有することが分かる（図4）。試験の結果は、平均値±標準偏差によって表される。
表5: 本発明のポリペプチドの多種の肺感染症に対する阻害効果（%）
実施例6
MTT法により、本発明のポリペプチドの多種の肺がん腫瘍細胞増殖に対する阻害作用を測定する。
MTT法により本発明のポリペプチドのヒト由来肺がん腫瘍細胞増殖に対する阻害作用を測定する。肺がん腫瘍細胞を37℃の5%（体積分率）CO2インキュベータで密度が90%以上に達するまで培養し、次いでトリプシンで消化して収集し、培養液で細胞を再懸濁させ、顕微鏡下でカウントする。細胞濃度を2.0×104個/mLに調整した後、細胞懸濁液を100μL/ウェルで96ウェルプレートに接種し、37℃の5%（体積分率）CO2インキュベータで一晩培養する。細胞が完全にプレートに接着した後、本発明のポリペプチドを加えた培養液を投与群とし、いずれの薬物も加えなかった培養液をブランク対照群とし、培養液で各所定濃度に希釈する。各希釈液をそれぞれ100μL/ウェルで96ウェルプレートに加え、37℃の5%（体積分率）CO2インキュベータで48時間インキュベートする。96ウェルプレートの各ウェルに20μLの5mg/mL MTTを加え、引き続き4時間培養する。培地を吸引により除去した後、各ウェルに100μLのDMSOを加えて溶解する。マイクロプレートリーダーを用いて測定波長570nm、参照波長630nmで吸光度値を測定し、式:腫瘍増殖阻害率（%）=（1-投与群吸光度値/未投与群吸光度値）×100%、により増殖阻害率を算出する。実験を3回独立して繰り返し、実験結果は、平均値±標準偏差によって表される。表6の結果より、本発明のポリペプチドはヒト由来の多種の肺がん腫瘍に対して良好な増殖阻害作用を有することが分かる（図5）。
MTT法により、本発明のポリペプチドの多種の肺がん腫瘍細胞増殖に対する阻害作用を測定する。
MTT法により本発明のポリペプチドのヒト由来肺がん腫瘍細胞増殖に対する阻害作用を測定する。肺がん腫瘍細胞を37℃の5%（体積分率）CO2インキュベータで密度が90%以上に達するまで培養し、次いでトリプシンで消化して収集し、培養液で細胞を再懸濁させ、顕微鏡下でカウントする。細胞濃度を2.0×104個/mLに調整した後、細胞懸濁液を100μL/ウェルで96ウェルプレートに接種し、37℃の5%（体積分率）CO2インキュベータで一晩培養する。細胞が完全にプレートに接着した後、本発明のポリペプチドを加えた培養液を投与群とし、いずれの薬物も加えなかった培養液をブランク対照群とし、培養液で各所定濃度に希釈する。各希釈液をそれぞれ100μL/ウェルで96ウェルプレートに加え、37℃の5%（体積分率）CO2インキュベータで48時間インキュベートする。96ウェルプレートの各ウェルに20μLの5mg/mL MTTを加え、引き続き4時間培養する。培地を吸引により除去した後、各ウェルに100μLのDMSOを加えて溶解する。マイクロプレートリーダーを用いて測定波長570nm、参照波長630nmで吸光度値を測定し、式:腫瘍増殖阻害率（%）=（1-投与群吸光度値/未投与群吸光度値）×100%、により増殖阻害率を算出する。実験を3回独立して繰り返し、実験結果は、平均値±標準偏差によって表される。表6の結果より、本発明のポリペプチドはヒト由来の多種の肺がん腫瘍に対して良好な増殖阻害作用を有することが分かる（図5）。
表6: MTT法により測定された本発明のポリペプチドの多種の肺がん腫瘍増殖に対する阻害効果（%）
実施例7
MTT法により本発明のポリペプチドの由来が異なる多種の腫瘍細胞の増殖に対する阻害作用を測定する。
ヒト由来の多種の腫瘍細胞を37℃の5%（体積分率）CO2インキュベータで密度が90%以上に達するまで培養し、次いでトリプシンで消化して収集し、培養液で細胞を再懸濁させ、顕微鏡下でカウントする。細胞濃度を2.0×104個/mLに調整した後、細胞懸濁液を100μL/ウェルで96ウェルプレートに接種し、37℃の5%（体積分率）CO2インキュベータで一晩培養する。細胞が完全にプレートに接着した後、本発明のポリペプチドを加えた培養液を投与群とし、いずれの薬物も加えなかった培養液をブランク対照群とし、培養液で各所定濃度に希釈する。各希釈液をそれぞれ100μL/ウェルで96ウェルプレートに加え、37℃の5%（体積分率）CO2インキュベータで48時間インキュベートする。96ウェルプレートの各ウェルに20μLの5mg/mL MTTを加え、引き続き4時間培養する。培地を吸引により除去した後、各ウェルに100μLのDMSOを加えて溶解する。マイクロプレートリーダーを用いて測定波長570nm、参照波長630nmで吸光度値を測定し、式:腫瘍増殖阻害率（%）=（1-投与群吸光度値/未投与群吸光度値）×100%、により増殖阻害率を算出する。実験を3回独立して繰り返し、実験結果は、平均値±標準偏差によって表される。未投与群の腫瘍増殖阻害率は0である。表7の結果より、本発明のポリペプチドは多種の腫瘍の増殖に対して顕著な阻害作用を有することが分かる（図6）。
MTT法により本発明のポリペプチドの由来が異なる多種の腫瘍細胞の増殖に対する阻害作用を測定する。
ヒト由来の多種の腫瘍細胞を37℃の5%（体積分率）CO2インキュベータで密度が90%以上に達するまで培養し、次いでトリプシンで消化して収集し、培養液で細胞を再懸濁させ、顕微鏡下でカウントする。細胞濃度を2.0×104個/mLに調整した後、細胞懸濁液を100μL/ウェルで96ウェルプレートに接種し、37℃の5%（体積分率）CO2インキュベータで一晩培養する。細胞が完全にプレートに接着した後、本発明のポリペプチドを加えた培養液を投与群とし、いずれの薬物も加えなかった培養液をブランク対照群とし、培養液で各所定濃度に希釈する。各希釈液をそれぞれ100μL/ウェルで96ウェルプレートに加え、37℃の5%（体積分率）CO2インキュベータで48時間インキュベートする。96ウェルプレートの各ウェルに20μLの5mg/mL MTTを加え、引き続き4時間培養する。培地を吸引により除去した後、各ウェルに100μLのDMSOを加えて溶解する。マイクロプレートリーダーを用いて測定波長570nm、参照波長630nmで吸光度値を測定し、式:腫瘍増殖阻害率（%）=（1-投与群吸光度値/未投与群吸光度値）×100%、により増殖阻害率を算出する。実験を3回独立して繰り返し、実験結果は、平均値±標準偏差によって表される。未投与群の腫瘍増殖阻害率は0である。表7の結果より、本発明のポリペプチドは多種の腫瘍の増殖に対して顕著な阻害作用を有することが分かる（図6）。
表7 MTT法により測定された本発明のポリペプチドの多種の腫瘍の増殖に対する阻害効果（%）
Claims (8)
- 多機能融合ポリペプチドであって、前記ポリペプチドのアミノ酸配列は、
ポリペプチドI:
Pro-(D-Pyr)-(D-Cys)-Bip-Arg-Gly-Glu-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp -Arg- Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp;
ポリペプチドII:
Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Pro-(D-Pyr)-(D-Cys) -Bip-Arg-Gly-Glu-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp;
ポリペプチドIII:
Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Gly-Pro-(D-Pyr)-(D-Cys)-Bip-Arg-Gly-Glu-Gly-Gly-Gly -Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro;
ポリペプチド IV:
Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly -Gly-Gly-Gly-Pro-(D-Pyr)-(D-Cys)-Bip-Arg-Gly-Glu;
ポリペプチドV:
Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp-Gly -Gly-Gly-Gly-Pro-(D-Pyr)-(D-Cys)-Bip-Arg-Gly-Glu;
又はポリペプチドVI:
Pro-(D-Pyr)-(D-Cys)-Bip-Arg-Gly-Glu-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly -Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Proであり、
ここで、Pyrは、3-（3-ピリジル）-L-アラニンであり、Bipは、L-4,4'-ビフェニルアラニンであることを特徴とする多機能融合ポリペプチド。 - 請求項1に記載の多機能融合ポリペプチドの、抗ヒト肺線維症薬、抗肺組織病変薬、抗肺がん薬及び抗腫瘍薬の製造における使用。
- 前記肺組織病変は、細菌性肺炎、ウイルス性肺炎、マイコプラズマ肺炎、クラミジア肺炎、原虫肺炎及び真菌性肺炎を含むことを特徴とする請求項２に記載の多機能融合ポリペプチドの、抗ヒト肺線維症薬、抗肺組織病変薬、抗肺がん薬及び抗腫瘍薬の製造における使用。
- 前記肺がんは、扁平上皮細胞がん、腺がん、腺扁平上皮がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん及び大細胞がんを含むことを特徴とする請求項２に記載の多機能融合ポリペプチドの、抗ヒト肺線維症薬、抗肺組織病変薬、抗肺がん薬及び抗腫瘍薬の製造における使用。
- 前記腫瘍は、ヒトの頭頸部、脳、甲状腺、食道、膵臓、肝臓、胃、乳腺、腎臓、胆嚢、結腸若しくは直腸、卵巣、子宮頸、子宮、前立腺、膀胱又は精巣に由来する原発性がん又は二次発がん、黒色腫、血管腫及び肉腫であることを特徴とする請求項２に記載の多機能融合ポリペプチドの、抗ヒト肺線維症薬、抗肺組織病変薬、抗肺がん薬及び抗腫瘍薬の製造における使用。
- 固相法による合成及び液相法による合成を含むことを特徴とする請求項1に記載の多機能融合ポリペプチドの製造方法。
- 前記固相法による合成は、
Fmoc-wang-resin又はFmoc-CTC-resinを出発原料とし、保護アミノ酸を用いてノナコサペプチドとなるようにジペプチドを順次接続し、ペプチド接続工程が完了した後、洗浄、ペプチド切断、及び後処理を行うことで、請求項1に記載の融合ポリペプチドの粗生成物を得、融合ポリペプチドの粗生成物を溶解し、分取高速液体クロマトグラフィーにより精製し、濃縮して凍結乾燥することで、請求項1に記載の融合ポリペプチドを得るステップを含むことを特徴とする請求項６に記載の多機能融合ポリペプチドの製造方法。 - 前記液相法による合成は、
ポリペプチド配列におけるアミノ酸をアミド結合を介して順次接続し、アミノ酸の不活性基をFmocで修飾するステップを含むことを特徴とする請求項６に記載の多機能融合ポリペプチドの製造方法。
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