CN113621054B - 一种具有抑制人结肠癌细胞（ht-29细胞）增殖作用的鸡源胶原肽及其制备与应用 - Google Patents
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Abstract
一种具有抑制人结肠癌细胞（HT‑29细胞）增殖作用的鸡源胶原肽及其制备与应用。本发明涉及一种具有抑制人结肠癌细胞（HT‑29细胞）增殖的鸡源III型胶原蛋白肽GSpGPpGPSGPAGDR，其氨基酸序列为Gly‑Ser‑Hyp‑Gly‑Pro‑Hyp‑Gly‑Pro‑Ser‑Gly‑Pro‑Ala‑Gly‑Asp‑Arg。多肽GSpGPpGPSGPAGDR具有抑制HT‑29细胞增殖的功能，并且具有补充人体必须氨基酸的能力及营养功能，用其制备出的相关食品、保健品或药物用于治疗结肠炎或结肠癌的食品或药物具有潜在的应用价值以及广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白领域，具体涉及一种具有抑制人结肠癌细胞（HT-29细胞）增殖作用的鸡III型胶原肽GSpGPpGPSGPAGDR及其应用。
背景技术
结肠癌是全世界发病率和病死率较高的恶性肿瘤之一, 在世界范围内年发病率较高,仅次于肺癌及胃癌，严重威胁人类的健康。结肠癌发病的主要原因是高脂肪饮食和纤维素摄入不足。近年来, 随着人们的生活质量与水平逐渐提高,人们的生活习惯与饮食结构发生了很大的变化。我国结肠癌的发病率呈逐年上升的趋势,如何有效控制及治疗结肠癌是一个比较热门的课题。
生物活性肽一类天然的多肽类物质。其活性随着氨基酸组成的不同以及氨基酸排列顺序不同而发生改变，因此具有抗氧化、抗菌、抗癌、降血压和提高人体免疫力等生理活性。生物活性肽具有易消化、吸收的营养特点，在医药、保健品、食品基料等方面具有很大的发展潜力，已成为当前国际抗癌药物及具有抗癌活性的产品。
发明内容
本发明的目的是提供鸡III型胶原肽GSpGPpGPSGPAGDR具有抑制HT-29细胞增殖作用（p为羟脯氨酸），作为预防和治疗结肠炎或结肠癌有关的疾病的药物先导化合物具有良好的应用前景。
为实现上述目的，本发明一所述胶原肽GSpGPpGPSGPAGDR为抑制HT-29细胞增殖作用的有效成份。
胶原肽GSpGPpGPSGPAGDR来自鸡III型胶原。胶原肽GSpGPpGPSGPAGDR为预防和治疗结肠炎或结肠癌有关的疾病的药物先导化合物的活性成份，其中可添加食品学或药物学上可接受的载体或辅料。
具有抑制HT-29细胞增殖作用的胶原肽GSpGPpGPSGPAGDR的氨基酸序列为Gly-Ser-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Ala-Gly-Asp-Arg。单链线性结构，分子量为1337.30，白色粉末状，易溶于水，对HT-29细胞增殖有抑制作用。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明从鸡源III型胶原中获得并确定了胶原肽GSpGPpGPSGPAGDR的活性与功效，其具有抑制HT-29细胞增殖作用，易于被人体吸收，并且具有补充人体必须氨基酸的能力及营养功能，作为预防和治疗结肠炎或结肠癌有关的疾病的药物先导化合物具有良好的应用前景。
附图说明
图1为胶原肽GSpGPpGPSGPAGDR的一级质谱图。
图2为胶原肽GSpGPpGPSGPAGDR的二级质谱图。
图3为胶原肽GSpGPpGPSGPAGDR抑制HT-29细胞增殖的实验结果。
具体实施方式
下面结合实施例用于说明本发明作进一步详细的描述，但不用来限制本发明的范围。
实施例1胶原肽GSpGPpGPSGPAGDR的合成
本发明利用多肽合成仪采用固相合成法合成胶原肽:
称取0.05mmol Fmoc-Ala-Wang树脂（官能团含量0.33mmol/g)置于固相反应器中，加8mL DCM溶胀过夜，减压抽去溶剂。加入浓度为 200mL/L的哌啶溶液8mL，室温下反应5min，抽干 ；再加入浓度为200mL/L的哌啶溶液8mL，室温下反应20min，抽干；依次用8mL的DMF洗涤3次，每次lmin。准确量取0.2mmol的α-氨基被Fmoc保护的氨基酸溶液、0.2mmol的HBTU溶液、0.195mmol的HOBT 溶液加入固相反应器中，反应5min后加入0.4mmol的DIEA，室温下氮气气泡振荡反应2h。依次用8mL的DMF洗涤3次，每次1min。加入浓度为200mL/L的哌啶溶液8mL，室温下反应5min，抽干；再加入浓度为200mL/L的哌啶溶液8mL，室温下反应20min，抽干；依次以8mL的 DMF洗涤3次，每次1min。按照如上步骤从肽链的碳端到氮端逐一连续合成了胶原肽GSpGPpGPSGPAGDR。待合成完毕后，分别用DMF和DCM先后清洗连有多肽链的树脂，后将树脂至于真空干燥箱内干燥备用。
待树脂干燥后，将树脂转移至鸡心瓶中，加入磁子，在冰水浴下缓慢加入用于脱除树脂的切割液10mL(切割液中TFA :纯水:苯甲硫醚:苯酚:乙二硫醇比例为82.5:5:5:5:2.5)，冰水浴下反应2h。待反应完成，将反应液连同树脂一同转移至过滤器中，用水泵抽滤，将得到的滤液置于圆底烧瓶中，并在氮气流下吹干。待圆底烧瓶中的样品吹至粘稠，撤下氮气管，在圆底烧瓶中倒入约20mL的4℃冰乙醚，混合后充分打散，然后于冷冻离心机内，4℃下 8000r/min离心15min，弃上清，再于20mL的4℃冰乙醚中打散，离心；如此重复操作3次，将沉淀再次真空干燥，即得胶原肽。
用反向高效液相色谱法对胶原肽进行纯化鉴定。采用C18半制备柱，流动相:
A相（水相) :去离子水（含0.1% TFA(m/v)) ；
B相(有机相）:80%乙腈水溶液（含0.1%TFA(m/v)) ；
流速:6mL/min ；洗脱梯度: A相以每分钟1%的变化从55%降到10%，B相以每分钟1%的变化从45%升到90%。采集6-8min 的洗脱液，采用旋转蒸发仪除去洗脱液中的有机相乙腈，之后将剩余的肽水溶液放入冰箱冷冻，最后用冷冻干燥机除去水分，得到蓬松固体粉末，为胶原肽纯品。图1为其一级质谱图，一级质谱中的信号为胶原肽母离子肽段信号。图2为胶原肽的二级质谱，该质谱图中包含了胶原肽的各种碎片离子信息的质荷比及丰度。
实施例2 胶原肽GSpGPpGPSGPAGDR抑制HT-29细胞增殖活性检测
将HT-29细胞接种于平底96孔细胞培养板，每孔100μL，含5×104个细胞，使细胞贴壁，孵育培养24h后，用DMEM完全培养液稀释胶原肽，然后将稀释的药物加入96孔细胞培养板，胶原肽浓度设三个复孔，对照孔只加100μL细胞培养液。由于加药后，各孔总体积为100μL，胶原肽浓度为600 μg/mL。加药后，细胞继续培养24小时。
如无特殊说明，本发明所制备的胶原肽处理细胞24小时后，采用CCK-8法检测细胞生长情况。细胞培养完成后，吸出孔中液体。每孔加入100μL含有10% CCK-8的DMEM培养基，在37℃下孵育1-4h。使用酶标仪测定孔在450nm处的吸光度值。细胞存活率（%）=加药孔OD值/对照孔OD值×100%。实验重复3次。
以未加药的对照组细胞数为100, 对各组数据作统计学分析。胶原肽处对HT-29细胞的生长具有抑制作用。与不加药的对照组相比，在浓度为600 μg/mL时，胶原肽对HT-29细胞生长的具有抑制作用，此时细胞存活率为75.50%。
实施例3 胶原肽GSpGPpGPSGPAGDR抑制HT-29细胞增殖活性检测
将HT-29细胞接种于平底96孔细胞培养板，每孔100μL，含5×104个细胞，使细胞贴壁，孵育培养24h后，用DMEM完全培养液稀释胶原肽，然后将稀释的药物加入96孔细胞培养板，胶原肽浓度设三个复孔，对照孔只加100μL细胞培养液。由于加药后，各孔总体积为100μL，胶原肽终浓度分别为300μg/mL。加药后，细胞继续培养24小时。
如无特殊说明，本发明所制备的胶原肽处理细胞24小时后，采用CCK-8法检测细胞生长情况。细胞培养完成后，吸出孔中液体。每孔加入100μL含有10% CCK-8的DMEM培养基，在37℃下孵育1-4h。使用酶标仪测定孔在450nm处的吸光度值。细胞存活率（%）=加药孔OD值/对照孔OD值×100%。实验重复3次。
以未加药的对照组细胞数为100, 对各组数据作统计学分析。胶原肽处对HT-29细胞的生长具有抑制作用。与不加药的对照组相比，在浓度为300 μg/mL时，胶原肽对HT-29细胞生长的具有抑制作用，此时细胞存活率为80.45%。
实施例4 胶原肽GSpGPpGPSGPAGDR抑制HT-29细胞增殖活性检测
将HT-29细胞接种于平底96孔细胞培养板，每孔100μL，含5×104个细胞，使细胞贴壁，孵育培养24h后，用DMEM完全培养液稀释胶原肽，然后将稀释的药物加入96孔细胞培养板，胶原肽浓度设三个复孔，对照孔只加100μL细胞培养液。由于加药后，各孔总体积为100μL，胶原肽终浓度分别为200 μg/mL。加药后，细胞继续培养24小时。
如无特殊说明，本发明所制备的胶原肽处理细胞24小时后，采用CCK-8法检测细胞生长情况。细胞培养完成后，吸出孔中液体。每孔加入100μL含有10% CCK-8的DMEM培养基，在37℃下孵育1-4h。使用酶标仪测定孔在450nm处的吸光度值。细胞存活率（%）=加药孔OD值/对照孔OD值×100%。实验重复3次。
以未加药的对照组细胞数为100, 对各组数据作统计学分析。胶原肽处对HT-29细胞的生长具有抑制作用。与不加药的对照组相比，在浓度为200 μg/mL时，胶原肽对HT-29细胞生长的具有抑制作用，此时细胞存活率为83.97%。
以上实施例显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，而不是以任何方式限制本发明的范围，在不脱离本发明范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的范围内。
Claims (2)
1.胶原肽在制备用于预防和/或治疗结肠癌有关的疾病的药物中的应用；所述多肽为GSpGPpGPSGPAGDR；该多肽的氨基酸序列为Gly-Ser-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Ala-Gly-Asp-Arg，其中p和Hyp代表羟脯氨酸。
2.按照权利要求1所述的应用，其特征在于：所述用于预防和治疗结肠癌有关的疾病的药物是以所述胶原肽为活性成分，其中添加食品学或药物学上可接受的载体或辅料。
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