JP6515126B2

JP6515126B2 - ジンセノサイドｆ１を有効成分として含む免疫増強用組成物

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Publication number: JP6515126B2
Application number: JP2017049803A
Authority: JP
Inventors: チャンキム、ソン; シクキム、フン
Original assignee: Intelligent Synthetic Biology Center
Current assignee: Intelligent Synthetic Biology Center
Priority date: 2016-06-22
Filing date: 2017-03-15
Publication date: 2019-05-15
Anticipated expiration: 2037-03-15
Also published as: JP2017226642A; CA2961400A1; US10682366B2; KR20180000379A; CN107519189A; US20170368084A1; EP3260122A1

Description

本発明はジンセノサイドＦ１を有効成分として含む免疫増強用薬学組成物に関する。
また、本発明はジンセノサイドＦ１を有効成分として含む免疫増強用食品組成物に関する。

また、本発明はジンセノサイドＦ１を個体に投与する段階を含む、免疫強化方法に関する。
また、本発明はジンセノサイドＦ１及びナチュラルキラー細胞を含むパーフォリンまたはグランザイム生産用組成物に関する。

免疫は大きく、生まれたときから持っている先天性免疫（innate immunity）と後天的に生活などに適応されてから得られる後天性免疫（acquired immunity）に区分される。ここで、先天性免疫は別名で「自然免疫」とも呼ばれるもので、抗原に対して非特異的に反応して特別な記憶作用は見らない。このような先天性免疫は実際にほとんどの感染を防御する。一方、後天性免疫は、最初に侵入した抗原に対する記憶作用があり、再び侵入が発生した時、特異的に反応して効果的に抗原を除去する特徴がある。

最近、運動不足、ストレスなどの内的要因と大気汚染などの外的要因が複合的に作用して免疫力が著しく低下するという問題が発生しており、免疫増強の効果を示す物質に対する研究が必要であり、特に、ほとんどの感染を防御する先天性免疫の重要性が高まっている。

特許文献１は、エゾウコギ（Acanthopanax sessiliflorus）の根を有効成分として含有した免疫増強用薬学組成物を開発し、特許文献２は、黄柏（Phellodendri Cortex）抽出物を含む先天性免疫増強及び抗ウイルス組成物を開発して、様々な物質の中でも、天然物を利用した免疫増強用組成物の研究が活発に進められている。

一方、ジンセノサイドは高麗人参に含まれているサポニンであり、３０種以上の様々な種類が存在し、構造に応じてＰＰＤ（protopanaxadiol）系とＰＰＴ（protopanaxatrio）系に分けられ、化学構造に基づいてそれぞれ異なる薬理活性を示すことが知られている（非特許文献１）。前記ジンセノサイドの中でも、高麗人参の極めて少量に存在するマイナージンセノサイドは分離することが難しいため、それに関する研究は不備である。

韓国公開特許第１０−２０１５−００１１５７６号公報韓国公開特許第１０−２０１４−０１４８０８７号公報

Curr Vasc Pharmacol．2009 July; 7（3）：293-302

ここで、本発明者らは免疫増強活性が優れた化合物を発掘しようと鋭意努力した結果、ジンセノサイドＦ１が他のジンセノサイドに比べて優れた免疫増強効果、特に先天性免疫の増強効果を示すことを確認し、本発明を完成した。

本発明の主な目的は、ジンセノサイドＦ１を有効成分として含む免疫増強用薬学組成物を提供することにある。
本発明の他の目的は、ジンセノサイドＦ１を有効成分として含む免疫増強用食品組成物を提供することにある。

本発明のもう一つの目的は、本発明は、ジンセノサイドＦ１を個体に投与する段階を含む免疫強化方法を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、ジンセノサイドＦ１及びナチュラルキラー細胞を含むパーフォリンまたはグランザイム生産用組成物を提供することにある。

本発明に係る組成物は、ナチュラルキラー細胞の脱顆粒活性を促進させ、細胞傷害活性を増進させ、細胞傷害因子の発現を増加させて、免疫増強剤として有用に使用することができる。

ナチュラルキラー細胞の脱顆粒現象を示す概略図である。末梢血単核細胞（peripheral blood mononuclear cell、PBMC）単独、またはＰＢＭＣと標的細胞とを一緒に培養した場合のＣＤ１０７ａの発現程度を比較したグラフである。末梢血単核細胞（peripheral blood mononuclear cell、PBMC）にジンセノサイドＲｇ３、Ｒｈ２、Ｆ１またはＲｇ１を処理するとＣＤ１０７ａが発現することを示すグラフである。末梢血単核細胞（peripheral blood mononuclear cell、PBMC）にジンセノサイドＲｇ３、Ｒｈ２、Ｆ１またはＲｇ１を処理する時、標的細胞に応じたＣＤ１０７ａの発現量を比較したグラフである。ナチュラルキラー細胞にジンセノサイドＦ１を処理する時の標的細胞の溶解程度を示すグラフである。ナチュラルキラー細胞にジンセノサイドＲｇ３を処理する時の標的細胞の溶解程度を示すグラフである。１次ナチュラルキラー細胞にジンセノサイドＦ１を処理する時の標的細胞の溶解程度を示すグラフである。１次ナチュラルキラー細胞にジンセノサイドＲｇ３を処理する時の標的細胞の溶解程度を示すグラフである。１次ナチュラルキラー細胞にジンセノサイドＲｇ１を処理する時の標的細胞の溶解程度を示すグラフである。ジンセノサイドＦ１がナチュラルキラー細胞のカルシウム流動を促進させることを示すグラフである。ナチュラルキラー細胞にジンセノサイドＦ１またはジンセノサイドＲｇ１を処理する時、パーフォリン（ＰＲＦ１）の発現量を比較したグラフである。ナチュラルキラー細胞にジンセノサイドＦ１またはジンセノサイドＲｇ１を処理する時、グランザイムＢ（ＧｚｍＢ）の発現量を比較したグラフである。ジンセノサイドＦ１またはジンセノサイドＲｇ１を前処理した後、ＲＭＡ−Ｓ細胞及びＲＭＡ細胞を腹腔内に注射したマウスにおいてＲＭＡ−Ｓの選択的減少比率を比較したグラフである。

本発明の発明者らは、免疫増強に関する研究を進めている中、ジンセノサイドＦ１をナチュラルキラー細胞（natural killer cell、NK cell）に前処理した後、様々な方法でナチュラルキラー細胞の細胞傷害活性を評価した結果、他のジンセノサイドに比べて優れた活性を示すことを確認して、前記ジンセノサイドＦ１を含む組成物が優れた免疫増強効果を示すことを初めて究明した。

前記の目的を達成するために、本発明の一つの態様は、ジンセノサイドＦ１を有効成分として含む免疫増強用薬学組成物を提供する。
本発明における用語、「ジンセノサイドＦ１」は、高麗人参や紅参などの主要な活性成分であるサポニンの一種であり、ＰＰＴ（protopanaxatriol）系に属するジンセノサイドを意味する。

本発明における用語、「免疫増強」は、生体の内部環境が外部因子である抗原に対する生体防御能を強化させることで、前記免疫は、生まれたときから持っている先天性免疫及び後天的に得られる獲得性免疫（適応免疫）に区分することができ、本発明では、前記の免疫は先天性免疫であり得る。

前記薬学組成物は、先天性免疫細胞の活性を促進させることができる。
前記先天性免疫細胞は、ナチュラルキラー細胞（natural killer cell、NK cell）、免疫細胞、末梢血単核細胞（peripheral blood mononuclear cell、PBMC）及び樹枝状細胞（dendritic cell）を含む群から選択されたいずれか一つであってもよいが、これに限定されるものではなく、具体的にはナチュラルキラー細胞であってもよい。

前記薬学組成物は、先天性免疫細胞の脱顆粒活性を促進させることができる。
本発明における用語、「脱顆粒活性」は、分泌顆粒内に蓄積された物質を放出する活性を意味し、本発明で脱顆粒活性は先天性免疫細胞内に蓄積された物質を放出する活性であってもよい。前記先天性免疫細胞の脱顆粒活性は、一般的に脱顆粒活性を評価するために用いられるマーカーであるＣＤ１０７ａの発現を分析して測定することができるが、これに限定されるものではない。

本発明の一実施例では、ジンセノサイドＦ１を先天性免疫細胞に前処理した場合、ＣＤ１０７ａの発現が増加したことを確認して（図２ｂ及び２ｃ）、前記ジセノサイドＦ１がナチュラルキラー細胞の脱顆粒活性を促進させることができることが分かった。特に、他のジンセノサイドに比べてジンセノサイドＦ１の脱顆粒活性の促進効果が最も優れていることが分かった。

前記薬学組成物は、ナチュラルキラー細胞の細胞傷害活性を増進させることができる。
本発明の一実施例では、ジンセノサイドＦ１をナチュラルキラー細胞に前処理して、前記細胞の細胞傷害活性を評価した結果、標的細胞の細胞溶解の程度が高く表示され（図３ａ）、特に、１次ナチュラルキラー細胞に前処理した場合も、標的細胞の細胞溶解程度が高く表示されたことを確認した（図４ａ）。また、ナチュラルキラー細胞に対して感受性であるＲＭＡ−Ｓ細胞の減少を通じてジンセノサイドＦ１のｉｎｖｉｖｏ細胞傷害活性の有効性を評価した場合も、ＲＭＡ−Ｓの減少効果が優れていることを確認した（図７）。

前記薬学組成物は、ジンセノサイドＲｇ３をさらに含むことができる。前記ジンセノサイドＲｇ３はＰＰＤ（protopanaxadiol）系に属するジンセノサイドの一種に該当する。
本発明の一実施例では、ジンセノサイドＲｇ３をナチュラルキラー細胞に前処理して前記細胞の細胞傷害活性を評価した結果、ナチュラルキラー細胞のＣＤ１０７ａの発現が増加し（図２ｂ及び２ｃ）、標的細胞の細胞溶解の程度が高く表示され（図３ｂ）、特に、１次ナチュラルキラー細胞に前処理した場合も、標的細胞の細胞溶解程度が高く示されることを確認した（図４ｂ）。したがって、本発明の薬学組成物は、免疫増強活性を有するジンセノサイドＲｇ３をさらに含むことができることが分かった。

前記薬学組成物は、ジンセノサイドＦ１とジンセノサイドＲｇ３とを１：０．１〜１：１の重量比で含むことができる。
ジンセノサイドＦ１とジンセノサイドＲｇ３との比率が１：０．１の重量比以下の場合、ジンセノサイドＲｇ３による免疫増強効果がほとんど示されず、１：１の重量比以上である場合、混合による免疫増強の相乗効果があまり示されないことがある。

前記薬学組成物は、ナチュラルキラー細胞の細胞傷害因子の発現を増加させることができる。
本発明における用語、「細胞傷害因子」は、細胞傷害活性を示す物質を意味し、本発明において前記細胞傷害因子はナチュラルキラー細胞から分泌され、細胞傷害活性を示す物質であり、具体的にはパーフォリンまたはグランザイムでありうるが、これに限定されるものではない。

本発明の一実施例では、ジンセノサイドＦ１をナチュラルキラー細胞に前処理した場合、パーフォリン及びグランザイムＢの発現が増加することを確認して（図６ａ及び６ｂ）、ジンセノサイドＦ１がナチュラルキラー細胞の細胞傷害因子の発現を増加させることが分かった。

前記薬学組成物は、薬学的に許容可能な担体を含むことができる。前記「薬学的に許容可能な担体」は、生物体を刺激することなく、注入される化合物の生物学的活性及び特性を阻害しない担体、賦形剤または希釈剤を意味することができ、具体的には、非自然的担体（non-naturally occuring carrier）でありうる。本発明において使用可能な前記担体の種類は特に限定されないが、当該技術分野で一般的に使用され、薬学的に許容可能な担体であれば、いずれのものであっても使用することができる。前記担体の非制限的な例としては、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、アルブミン注射溶液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノールなどを挙げることができる。これらは単独で使用したり、２種以上を混合して使用することができる。

薬学的に許容可能な担体を含む前記組成物は、経口または非経口の様々な剤型でありうる。製剤化する場合には、通常使用している充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を使用して調製される。

具体的には、経口投与用の固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、これらの固形製剤は前記化合物に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロース、ラクトース、ゼラチンなどを混ぜて調剤することができる。また、単純な賦形剤以外にステアリン酸マグネシウム、タルクのような潤滑剤も使用することができる。経口用の液状製剤としては、懸濁剤、内溶液剤、乳剤、シロップ剤などが該当するが、よく使用される単純希釈剤である水、液体パラフィン以外に様々な賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などを含むことができる。非経口投与用の製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤及び坐剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどが使用されてもよい。坐剤の基剤としては、ウィテプソール（witepsol）、マクロゴール、ツイン（tween）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどを使用されてもよい。

また、本発明の薬学組成物は薬剤学的に有効な量のジンセノサイドＦ１を含むことができる。本発明における用語、「薬剤学的に有効な量」は、医学的治療に適用可能な合理的な利益／リスク比で疾患を治療するのに十分な量を意味し、一般的に０．００１〜１０００ｍｇ／ｋｇの量、具体的には、０．０５〜２００ｍｇ／ｋｇ、より具体的には、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇの量を１日１回から数回に分けて投与することができる。しかし、本発明の目的上、特定の患者に対する具体的な治療的有効量は達成しようとする反応の種類と程度、場合によっては、他の製剤が使用されるかどうかを含め、具体的組成物、患者の年齢、体重、一般的な健康状態、性別及び食事、投与時間、投与経路、及び組成物の比率、治療期間、具体的組成物と組み合わせて使用したり、同時使用される薬物をはじめとする様々な因子と医薬分野でよく知られている類似因子に応じて異なる適用をすることが望ましい。

本発明の薬学組成物は、免疫増強剤、ワクチンの効能を向上させることができる補助剤（adjuvants）添加物、治療効果を増進させることができる補助治療薬剤（例えば、抗癌補助剤）などで使用することができる。

本発明の他の一つの態様は、ジンセノサイドＦ１を有効成分として含む先天性免疫増強用食品組成物を提供する。
本発明において、「ジンセノサイドＦ１」及び「免疫強化」は、前記で説明した通りである。

本発明における用語、「食品」は、肉、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンディ類、スナック類、菓子類、ピザ、ラーメン、その他麺類、ガム類、アイスクリーム類を含む酪農製品、各種スープ、飲料、お茶、ドリンク剤、アルコール飲料、ビタミン複合剤、健康機能食品及び健康食品などがあり、通常の意味の食品をすべて含む。

前記健康機能（性）食品（functional food）とは、特定保健用食品（food for special health use、FoSHU）と同様の用語で、栄養供給の他、生体調節機能を効率的に示すよう加工された医学、医療効果が高い食品を意味する。ここで、「機能（性）」とは、人体の構造及び機能についての栄養素を調整したり、生理学的作用などの保健の用途に有用な効果を得ることを意味する。本発明の食品は、当業界で通常使用される方法によって製造可能であり、前記製造の時には、当業界で通常的に添加する原料及び成分を添加して製造することができる。また、前記食品の製剤の場合、食品として認められている剤形であれば制限なく製造することができる。本発明の食品用組成物は様々な形態の剤形に製造することができ、一般的な薬品とは異なり、食品を原料として薬品の長期服用時に発生しうる副作用などがないという利点があり、携帯性に優れ、本発明の食品は免疫増強効果を増進させるためのサプリメントとして摂取が可能である。

前記健康食品（health food）は、一般的な食品に比べて積極的な健康維持や増進効果を有する食品を意味し、健康補助食品（health supplement food）は、健康補助目的の食品を意味する。場合によっては、健康機能食品、健康食品、健康補助食品の用語は、混用される。

具体的には、前記健康機能食品はジンセノサイドＦ１を飲料、お茶類、香辛料、ガム、菓子類などの食品素材に添加したり、カプセル化、粉末化、懸濁液などとして製造した食品であり、これを摂取した場合、健康上の特定の効果をもたらすことを意味するが、一般的な薬品とは異なり、食品を原料として薬品の長期服用時に発生しうる副作用がないという長所がある。

本発明の食品組成物は、日常的に摂取することが可能なため、高い免疫増進効果を期待することができ、非常に有用である。
前記組成物は、生理学的に許容可能な担体をさらに含むことができるが、担体の種類は特に限定されず、当該技術分野で通常使用される担体であれば、いずれのものであっても使用することができる。

また、前記組成物は食品組成物に一般的に使用され、香り、味、視覚などを向上させることができる追加の成分を含むことができる。例えば、ビタミンＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ６、Ｂ１２、ナイアシン（niacin）、ビオチン（biotin）、葉酸（folate）、パントテン酸（panthotenic acid）などを含むことができる。また、亜鉛（Zn）、鉄（Fe）、カルシウム（Ca）、クロム（Cr）、マグネシウム（Mg）、マンガン（Mn）、銅（Cu）などのミネラルを含むことができる。また、リジン、トリプトファン、システイン、バリンなどのアミノ酸を含むことができる。

また、前記組成物はまた、防腐剤（ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム、サリチル酸、デヒドロ酢酸ナトリウムなど）、殺菌剤（さらし粉と高度さらし粉、次亜塩素酸ナトリウムなど）、酸化防止剤（ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）など）、着色剤（タール色素など）、発色剤（亜硝酸ナトリウム、亜酢酸ナトリウムなど）、漂白剤（亜硫酸ナトリウム）、調味料（ＭＳＧグルタミン酸ナトリウムなど）、甘味料（ズルチン、サイクラミン酸ナトリウム、サッカリン、ナトリウムなど）、香料（バニリン、ラクトン類など）、膨張剤（ミョウバン、Ｄ−酒石酸水素カリウムなど）、強化剤、乳化剤、増粘剤（糊料）、皮膜剤、ガム基礎剤、泡抑制剤、溶剤、改良剤などの食品添加物を添加することができる。前記添加物は、食品の種類に応じて選別され、適切な量で使用される。

前記ジンセノサイドＦ１をそのまま添加したり、他の食品または食品成分と併用して使用することができ、通常の方法に応じて適切に使用することができる。有効成分の混合量はその使用目的（予防、健康または治療的処置）に応じて適切に決定することができる。一般的には、食品または飲料の製造時に、本発明の食品組成物は食品または飲料に対して５０重量部以下、具体的には２０重量部以下の量で添加することができる。しかし、健康及び衛生を目的として長期間摂取した場合には、前記の範囲以下の含有量を含むことができ、安全性の面で何ら問題がないので、有効成分は前記範囲以上の量でも使用することができる。

本発明の食品組成物の一例として、健康飲料組成物に使用することができ、この場合、通常の飲料のように様々な香味剤または天然炭水化物などを追加成分として含有することができる。前述した天然炭水化物は、ブドウ糖、果糖などの単糖類；マルトース、スクロースのような二糖類；デキストリン、シクロデキストリンのような多糖類；キシリトール、ソルビトール、エリスリトールなどの糖アルコールであってもよい。甘味料は、タウマチン、ステビア抽出物のような天然甘味料；サッカリン、アスパルテームのような合成甘味料などを使用することができる。前記天然炭水化物の割合は、本発明の組成物１００ｍｌ当たり、一般的に約０．０１〜０．０４ｇ、具体的には、約０．０２〜０．０３ｇである。

前記の他に、健康飲料組成物は様々な栄養剤、ビタミン、電解質、風味剤、着色剤、ペクチン酸、ペクチン酸の塩、アルギン酸、アルギン酸の塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調整剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコールまたは炭酸化剤などを含有することができる。その他の天然フルーツジュース、フルーツジュース飲料、または野菜飲料の製造用果肉を含有することができる。これらの成分は、独立して、または混合して使用することができる。これらの添加剤の割合は、それほど重要ではないが、本発明の組成物１００重量部あたり０．０１〜０．１重量部の範囲で選択されるのが一般的である。

本発明の食品組成物は、免疫増強効果を示すことができれば、様々な重量％で含むことができるが、具体的には、ジンセノサイドＦ１を食品組成物の総重量比０．００００１〜１００重量％、または０．０１〜８０重量％で含むことができる。

本発明の他の一つの態様は、ジンセノサイドＦ１を個体に投与する段階を含む、免疫強化方法を提供する。
本発明において、「ジンセノサイドＦ１」及び「免疫強化」は前記で説明した通りである。

本発明における用語、「投与」は、ある適切な方法で個体に本発明の組成物を導入することを意味し、前記組成物の投与経路は目的組織に到達することができる限り、いかなる一般的な経路を通じて投与することができる。腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、局所投与、鼻内投与されることができるが、これに限定されない。

本発明における用語、「個体」は、免疫増進が必要か、または必要とする可能性があるヒトを含むラット、マウス、家畜などのすべての動物を意味する。具体的には、ヒトを含む哺乳動物でありうる。

前記組成物は、薬学的に有効な量で投与することができる。
前記の「薬学的に有効な量」は、医学的治療に適用可能な合理的な受益／リスク比で疾患を治療するのに十分な量を意味し、有効容量レベルは疾患の重症度、薬物の活性、患者の年齢、体重、健康、性別、患者の薬物に対する敏感度、使用された本発明の組成物の投与時間、投与経路及び排出比率、治療期間、使用された本発明の組成物と配合または同時に使用される薬物を含む要素及びその他の医学分野でよく知られている要素により決定してもよい。例えば、ジンセノサイドＦ１を含む前記薬学組成物は、１日に０．０００１〜１０００ｍｇ／ｋｇで、具体的には、０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇで投与してもよい。

本発明の薬学組成物を毎日投与または間歇的に投与してもよく、１日当たりの投与回数は、１回または２〜３回に分けて投与することが可能である。また、本発明の薬学組成物は、免疫増強のために単独、または他の薬物治療と併用して使用することができる。前記要素をすべて考慮して、副作用のない、最小限の量で最大の効果を得ることができる量を投与することが重要であり、当業者によって容易に決定することができる。

本発明の他の一つの態様は、ジンセノサイドＦ１及びナチュラルキラー細胞を含むパーフォリンまたはグランザイム生産用組成物を提供する。
本発明において、「ジンセノサイドＦ１」及び「ナチュラルキラー細胞」は、前記で説明した通りである。

本発明の一実施例では、ジンセノサイドＦ１をナチュラルキラー細胞に前処理した場合、パーフォリン及びグランザイムＢの発現が増加することを確認して（図６ａ及び６ｂ）、ジンセノサイドＦ１及びナチュラルキラー細胞を含む組成物がパーフォリンまたはグランザイムを生産することができることが分かった。

以下、本発明を実施例を通じて本発明の構成及び効果をより詳しく説明する。しかし、これら実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれら実施例に限定されるものではない。

実施例１：ジンセノサイドＦ１による先天性免疫細胞の脱顆粒活性効果
フローサイトメトリー分析（fluorescence activated cell sorter、FACS）を使用してジンセノサイドＦ１による先天性免疫細胞の脱顆粒（degranulation）活性の程度を測定した。

具体的には、血液から分離した末梢血単核細胞（peripheral blood mononuclear cell、PBMC）及び純粋分離されたナチュラルキラー細胞にジンセノサイドを前処理した後、前記細胞をそれぞれ標的細胞であるＫ５６２細胞または７２１．２２１細胞と一緒に培養した。その後、蛍光色素（fluorochrome）が結合された抗−ＣＤ３、抗−ＣＤ５６及び抗−ＣＤ１０７ａ抗体を用いて末梢血単核細胞及びナチュラルキラー細胞の表面を染色した。一方、末梢血単核細胞またはナチュラルキラー細胞の脱顆粒活性は、図１のように、細胞表面のＣＤ１０７ａの発現と比例するので、末梢血単核細胞及びナチュラルキラー細胞のＣＤ１０７ａの発現程度をフローサイトメトリー（FACS machine）を利用して測定した。

測定の結果、標的細胞と一緒に培養しなかった末梢血単核細胞は、ＣＤ１０７ａをほとんど発現していないのに対し、標的細胞と一緒に培養した末梢血単核細胞は、ＣＤ１０７ａを発現することを確認した（図２ａ）。また、標的細胞と一緒に培養したとしても、ＤＭＳＯ（vehicle）を処理した群に比べてジンセノサイドを処理した群でＣＤ１０７ａが過発現されることを確認した（図２ｂ）。

具体的には、標的細胞として慢性骨髄性白血病の患者由来の細胞株であるＫ５６２細胞またはヒトＢ細胞である７２１．２２１細胞と一緒に培養した場合、ＤＭＳＯを処理した群に比べてすべてのジンセノサイド処理群においてＣＤ１０７ａ発現が増加しており、ジンセノサイドＦ１処理群でＣＤ１０７ａが最も多く発現したことを確認した（図２ｂ及び２ｃ）。したがって、ジンセノサイドＦ１及びＲｇ３は、優れた免疫増強効果を示すことを確認し、特にジンセノサイドＦ１が最も優れた免疫増強効果を示すことを確認した。

実施例２：ジンセノサイドＦ１によるナチュラルキラー細胞の細胞傷害活性効果
ジンセノサイドＦ１がナチュラルキラー細胞の細胞傷害活性を増強させるかどうかを確認するために、標的細胞の細胞溶解（cytolysis）程度を測定した。

具体的には、血液から分離した末梢血単核細胞（peripheral blood mononuclear cell、PBMC）及び純粋分離されたナチュラルキラー細胞にジンセノサイドＦ１またはＲｇ３を前処理した後、前記細胞をユーロピウム（europium）で標識された標的細胞であるＫ５６２細胞または７２１．２２１細胞と一緒に培養した。前記ナチュラルキラー細胞と標的細胞との比率を５：１、１０：１、２０：１及び４０：１で混合して培養した。一方、標的細胞から排出される蛍光度の程度はナチュラルキラー細胞の細胞傷害活性の程度に比例するため、前記培養液を遠心分離した後、マイクロプレートリーダー（microplate reader）を使用して標的細胞の細胞溶解により排出された蛍光度を測定した。

測定の結果、すべての培養の割合でジンセノサイドＦ１とＲｇ３投与群がＤＭＳＯ投与群に比べて標的細胞の溶解度が高く表示されることを確認した（図３ａ、及び３ｂ）。したがって、ジンセノサイドＦ１とＲｇ３は、ナチュラルキラー細胞に対する優れた細胞傷害活性を示すことを確認した。

実施例３：ジンセノサイドＦ１による１次ナチュラルキラー細胞の細胞傷害活性効果
実施例３−１：１次ナチュラルキラー細胞の分離
健康なドナーの血液（５０ｍｌ）をヘパリンナトリウムを含む真空採血器細胞準備チューブ（Vacutainer Cell Preparation Tube、BD Biosciences）に採取した。その後、前記血液を遠心分離して血小板と白血球に形成された白の薄い層であるバフィーコート（buffy coat）を回収した。前記バフィーコートをＰＢＳで洗浄し、得られた末梢血単核細胞をｈｕｍａｎＮＫｃｅｌｌｎｅｇａｔｉｖｅｓｅｌｅｃｔｉｏｎｋｉｔ（Miltenyl Biotech）を使用して分離した。分離されたナチュラルキラー細胞の一部とＦＡＣＳバッファとを混合した後、ＦＡＣＳ機械及び蛍光色素（fluorochrome）が結合された抗-ＣＤ３、抗-ＣＤ５６及び抗-ＣＤ１０７ａ抗体を用いて、ナチュラルキラー細胞（ＣＤ３-／ＣＤ１６+）の純度、ＣＤ５６^ｄｉｍ／ＣＤ１６+、ＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ}／ＣＤ１６-及びＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ}／ＣＤ１６+の数及び割合を測定して、純度が９５％以上であるナチュラルキラー細胞を実験に使用した。

実施例３−２：１次ナチュラルキラー細胞の細胞傷害活性効果
前記実施例３−１の方法で分離された１次ナチュラルキラー細胞を用いて前記実施例２と同様の方法でジンセノサイドＦ１が１次ナチュラルキラー細胞の細胞傷害活性を増強させるかどうかを確認した。

測定の結果、すべてのジンセノサイドＦ１、Ｒｇ３、及びＲｇ１投与群の中で、ＤＭＳＯ投与群に比べて標的細胞の溶解程度が高く表示されることを確認した（図４ａ〜４ｃ）。特に、ジンセノサイドＦ１投与群の溶解程度は、ジンセノサイドＲｇ３及びＲｇ１投与群に比べてはるかに優れていることを確認した。したがって、ジンセノサイドＦ１及びＲｇ３は１次ナチュラルキラー細胞に対する優れた細胞傷害活性を示し、特にジンセノサイドＦ１が最も優れた効果を示すことを確認した。

実施例４：ジンセノサイドＦ１の処理によるカルシウム流動分析（Calcium flux assay）
ジンセノサイドＦ１のナチュラルキラー細胞ベースの免疫増強機序を解明するために、共焦点顕微鏡（confocal microscopy）を用いた生細胞イメージング（live cell imaging）により単一細胞のカルシウム流動分析を行った。

具体的には、前記実施例３−１の方法で１次ナチュラルキラー細胞を純粋分離（> ９７％）した後、ジンセノサイドＦ１またはＲｇ１を処理した。３０秒間の基礎カルシウムレベルを測定した後、ＮＫＧ２Ｄ抗体及び２Ｂ４抗体の組み合わせでナチュラルキラー細胞を活性化させた後、共焦点生細胞イメージング（confocal live cell imaging）でカルシウム流動を分析した。

分析の結果、ジンセノサイドＦ１がＲｇ１に比べて、ナチュラルキラー細胞のカルシウム流動をさらに有効に増進させることを確認した（図５）。したがって、ジンセノサイドＦ１がジンセノサイドＲｇ１に比べて優れた免疫増強効果を示すことを確認した。

実施例５：細胞傷害因子の分析
ジンセノサイドＦ１によるナチュラルキラー細胞の細胞傷害活性機序を分析するために、前記実施例３−１の方法で純粋分離した１次ナチュラルキラー細胞にＦ１またはＲｇ１を処理した。１２時間経過した後、総ＲＮＡを分離した後、ナチュラルキラー細胞の代表的な細胞傷害因子であるパーフォリン（perforin）及びグランザイムＢ（granzyme B）の発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲで分析した。

具体的には、TRIzol試薬を使用して、ナチュラルキラー細胞からトータルRNAを分離して、配列が知られていないToyobo製品のプライマーと逆転写酵素を使用してcDNAを合成した。その後、下記表１のプライマーを使用してSYBR PCR Master Mix（Toyobo）を用いて、定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った。

前記ＰＣＲを行う条件は下記表２の通りである。

分析の結果、すべてのジンセノサイド処理群においてパーフォリン及びグランザイムＢの発現が増加することを確認した。具体的には、ジンセノサイドＦ１の処理群は無処理群に比べパーフォリンの発現量が約２倍に増加することを確認し、ジンセノサイドＲｇ１処理群に比べても高い発現量を示すことを確認した（図６ａ）。また、ジンセノサイドＦ１の処理群はグランザイムＢの発現量も無処理群に比べて約１．５倍以上に増加することを確認し、ジンセノサイドＲｇ１処理群に比べても高い発現量を示すことを確認した（図６ｂ）。したがって、ジンセノサイドＦ１がジンセノサイドＲｇ１に比べて優れた免疫増強効果を示すことを確認した。

実施例６：ジンセノサイドＦ１のナチュラルキラー細胞ベースのｉｎｖｉｖｏ免疫増強活性
ジンセノサイドＦ１のｉｎｖｉｖｏ細胞傷害活性の有効性を評価するために、ナチュラルキラー細胞に対して感受性であるＲＭＡ−Ｓ（ＭＨＣｃｌａｓｓＩ-）と抵抗性を有するＲＭＡ（ＭＨＣｃｌａｓｓＩ+）標的細胞システムを使用した。

具体的には、ジンセノサイドＦ１を２５ｍｇ／ｋｇの濃度でマウスに前処理した。その後、それぞれ異なる蛍光で標識したＲＭＡ−Ｓ／ＲＭＡ細胞の混合物をマウスの腹腔内に注射した。８時間後、ナチュラルキラー細胞によるＲＭＡ−Ｓの選択的減少の割合をＦＡＣＳで分析した。

分析の結果、すべてのジンセノサイド処理群でＲＭＡ−Ｓが選択的に減少することを確認した。具体的には、ジンセノサイドＦ１の処理群は約７０％以上の除去能を示すのに対し、無処理群（vehicle）は、約３５％程度の除去能を示し、ジンセノサイドＦ１の処理群が無処理群に比べてＲＭＡ−Ｓが２倍以上の優れた減少効果を示すことを確認した。また、同量のジンセノサイドＲｇ１処理群に比べても優れた減少効果を示すことを確認した（図７）。したがって、ジンセノサイドＦ１は、ｉｎｖｉｖｏでも免疫増強効果を示し、特にジンセノサイドＦ１がジンセノサイドＲｇ１に比べて優れた免疫増強効果を示すことを確認した。

以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者は、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更せずに他の具体的な形態で実施することができることを理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例は、すべての面で例示的なものであり、限定的なものではないものと理解しなければならない。本発明の範囲は前記詳細な説明よりは、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲そしてその等価概念から導出されるすべての変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。

Claims

有効成分としてジンセノサイドＦ１とジンセノサイドＲｇ３とを１：０．１〜１：１の重量比で含む、先天性免疫増強用薬学組成物。
前記薬学組成物が先天性免疫細胞の活性を増進させるものである、請求項１に記載の薬学組成物。
前記先天免疫細胞が、ナチュラルキラー細胞（natural killer cell、NK cell）、免疫細胞、末梢血単核細胞（peripheral blood mononuclear cell、PBMC）、及び樹枝状細胞（dendritic cell）を含む群から選択されるいずれか一つのものである、請求項２に記載の薬学組成物。
前記薬学組成物が、ナチュラルキラー細胞（natural killer cell、NK cell）の脱顆粒活性を促進させるものである、請求項１に記載の薬学組成物。
前記薬学組成物が、ナチュラルキラー細胞（natural killer cell、NK cell）の細胞傷害活性を増進させるものである、請求項１に記載の薬学組成物。
前記薬学組成物が、ナチュラルキラー細胞の細胞傷害因子の発現を増加させるものである、請求項１に記載の薬学組成物。
前記細胞傷害因子が、パーフォリン（perforin）またはグランザイム（granzyme）であるものである、請求項６に記載の薬学組成物。
有効成分としてジンセノサイドＦ１とジンセノサイドＲｇ３とを１：０．１〜１：１の重量比で含む、先天性免疫増強用食品組成物。