KR102045247B1 - 피부 면역세포를 이용하는 피부 활성물질을 탐색하는 방법 및 이를 이용한 키트 - Google Patents

피부 면역세포를 이용하는 피부 활성물질을 탐색하는 방법 및 이를 이용한 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 피부 활성물질 탐색 방법 및 이를 이용하여 피부 활성물질을 탐색하는 키트에 관한 것으로, 보다 상세하게는 활성화된 피부 면역세포에서 생산 및 분비되는 싸이토카인 유전자 혹은 단백질을 이용하여 피부 면역세포를 활성화시켜 싸이토카인 유전자 혹은 단백질 발현을 유도하는 후보물질을 분리, 정제함으로써 미백물질 또는 흑화물질과 같은 저색소성 혹은 과색소성 질환 개선용 물질 등의 피부 활성물질을 탐색하는 방법 및 이를 이용한 피부 활성물질 탐색용 키트에 관한 것이다.

Description

피부 면역세포를 이용하는 피부 활성물질을 탐색하는 방법 및 이를 이용한 키트{Method for detecting skin-active ingredients by using the skin immune cell, and the kit using the same}
본 발명은 피부 활성물질 탐색 방법 및 이를 이용하여 피부 활성물질을 탐색하는 키트에 관한 것으로, 보다 상세하게는 활성화된 피부 면역세포에서 생산 및 분비되는 싸이토카인 유전자 혹은 단백질을 이용하여 피부 면역세포를 활성화시켜 싸이토카인 유전자 혹은 단백질 발현을 유도하는 후보물질을 분리, 정제함으로써 미백물질 또는 흑화물질과 같은 저색소성 혹은 과색소성 질환 개선용 물질 등의 피부 활성물질을 탐색하는 방법 및 이를 이용한 피부 활성물질 탐색용 키트에 관한 것이다.
성체 멜라닌 세포는 피부 표피의 기저막(basal epidermis)에 존재하며, UV와 같은 외부 인자에 의해 멜라닌 색소를 생성하여 생성된 멜라닌 색소를 주변 각질세포에 전달하여 해당 각질세포의 DNA 손상을 억제하는 역할을 한다. 그러나 이러한 성체 멜라닌 세포의 활성은 유전적인 요인, 호르몬 및 여러 질병 요인에 따라 비정상적으로 조절되어 정상적인 색소 생성 단계를 벗어나 과다한 색소 생성 및 과증식으로 인해 기미 혹은 흑자와 같은 과색소성 질환을 일으키는 요인이 되며, 해당 질환은 진피에 위치한 멜라닌 세포의 비정상적인 활성에 의해 일어나는 것으로 알려져 있고, 이렇게 생성된 색소는 각질세포 탈락에 의해 정상적으로 제거되지 않아 미용상 문제를 일으키게 된다. 또한, 멜라닌 세포의 활성이 비정상적으로 조절되어 정상적인 색소 생성 단계를 거치지 못해 색소 생성 이상으로 인해 백모증 혹은 백모와 같은 저색소성 질환을 일으키는 요인이 되며, 해당 질환은 진피에 위치한 멜라닌 세포의 비정상적인 활성 억제나 자가 면역에 의한 멜라닌 세포 파괴에 의해 일어나는 것으로 알려져 있고, 이렇게 줄어든 색소는 피부에 흰 반점을 일으키거나 모발을 희게 만들어 미용상 문제를 일으키게 된다.
이러한 성체 멜라닌 세포의 활성을 조절하는 활성물질을 탐색하는 일반적인 시험관 수준의 실험과정은 주로 성체 멜라닌 세포를 단독배양 혹은, 성체 멜라닌 세포와 각질 세포를 공배양하여 진행되어 왔다. 하지만, 실제 피부에 처리하여 임상학적으로 미백 효과를 가져오는 피부 활성물질들은 성체 멜라닌 세포의 활성을 조절할 것이라 예측됨에도 불구하고 실험실의 시험관 조건에서는 재현되지 않아 그 기전을 밝히는데 어려움을 겪고 있다. 따라서 임상학적인 결과를 유도하여 그 기전을 연구할 수 있는 새로운 시험관 배양시스템 구축에 대한 필요성이 대두되고 있다.
이에 본 발명자들은 기존의 세포 배양시스템에서 검증되지 않던 성체 멜라닌 세포 활성 조절 기전에 있어서, 피부에 상주하고 있는 피부 면역세포의 활성을 통해 생산, 분비되는 특정 싸이토카인이 성체 멜라닌 세포의 색소생성 혹은 세포분열에 영향을 미침을 발견하고, 이를 이용하여 피부 면역세포를 피부세포의 활성을 조절하는 중요한 효과세포로 간주할 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 활성화된 피부 면역세포에서 생산 및 분비되는 특정 싸이토카인을 이용하여 피부에서의 성체 멜라닌 세포의 활성을 조절하는 피부 활성물질을 탐색할 수 있는 방법 및 키트를 제공하는 것이다.
상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 활성화된 피부 면역세포에서 싸이토카인의 발현량을 조절할 수 있는 물질을 스크리닝함으로써 피부 활성물질을 탐색하는 방법 및 이를 이용하는 키트를 제공한다.
본 발명의 방법 및 이를 이용한 키트를 사용함으로써 피부 및 모발에서의 멜라닌 세포의 활성을 증가 또는 억제시켜 각각 백반증과 같은 저색소성 질환이나 기미 또는 흑자와 같은 과색소성 질환의 환부에 적용함으로써 증상을 완화 또는 치료할 수 있는 피부 활성물질을 신속하고 간편하게 스크리닝할 수 있다.
도 1은 활성화된 피부면역세포에서 분비되는 싸이토카인이 멜라닌 생성 세포의 활성에 미치는 영향을 확인한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 2는 진세노사이드 F1을 기존에 주로 사용하였던 인간 멜라닌 세포 단독배양시스템에 처리했을 때 색소생성효소 발현을 확인한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 2는 진세노사이드 F1을 기존에 주로 사용하였던 인간 멜라닌 세포와 인간 각질형성세포 공배양시스템에 처리했을 때 색소생성효소 발현을 확인한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 4는 진세노사이드 F1을 처리한 인간 표피 유래 면역세포에서 IL-13 발현량을 확인한 결과를 보여주는 그래프이다.
본 발명은 활성화된 피부 면역세포에서 싸이토카인의 발현을 조절할 수 있는 물질을 스크리닝함으로써 피부 활성물질을 탐색하는 방법 및 이를 이용한 키트에 관한 것이다.
본 발명은 피부 활성물질을 탐색하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 구체적으로 다음과 같은 단계로 이루어진다.
1) 피부 면역세포에서 발현되는 싸이토카인의 발현량을 측정하는 단계;
2) 상기 피부 면역세포에 후보 물질을 처리하는 단계;
3) 상기 후보 물질의 처리 후 싸이토카인의 발현량을 측정하는 단계; 및
4) 상기 1) 단계와 3) 단계에서 측정된 싸이토카인의 발현량을 비교 및 평가하는 단계.
본 발명은 싸이토카인이 성체 멜라닌 세포 활성을 조절한다는 사실을 기초로 하며, 성체 멜라닌 세포의 활성화에 영향을 미쳐 멜라닌 색소의 생성량을 증가 또는 감소시킴으로써 피부 미백 또는 흑화 효과를 제공할 수 있는 피부 활성물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 피부 면역세포에서 생산 및 분비되는 특정 싸이토카인은 성체 멜라닌 세포의 색소 생성 또는 세포 분열에 영향을 미치며, 이를 통해 피부 내에서 합성되는 멜라닌의 양을 조절할 수 있다. 특히, 싸이토카인 중에서, 본원에서 대상으로 하는 싸이토카인은 바람직하게 IL-13, IL-16 및 IL-27이다.
IL-13은 피부에서 성체 멜라닌 세포의 활성을 감소시켜 색소 형성을 억제하며, 또한 멜라닌 세포의 분열도 저해한다. 또한, IL-27은 성체 멜라닌 세포의 활성을 감소시켜 색소 형성을 억제한다. 이와 같은 특성으로 인하여, IL-13 및 IL-27은 피부 미백 효과를 제공하며, 기미 또는 흑자와 같은 과색소성 피부 질환의 치료 및 개선에 도움을 줄 수 있다.
한편, IL-16은 피부에서 성체 멜라닌 세포의 색소 생성을 촉진함으로써 백반증과 백모와 같은 저색소성 피부 및 모발 질환의 치료에 도움을 준다.
따라서, 본 발명은 피부 면역세포에서 특정 싸이토카인의 발현량을 조절하는 물질을 스크리닝함으로써 피부 미백 효과를 제공하는 피부 활성물질을 탐색하는 방법으로서, 상기 싸이토카인은 IL-13, IL-16 및 IL-27 중 1종 이상일 수 있고, 이 중 IL-13 및 IL-27의 발현량은 증가시키거나, IL-16의 발현량은 감소시키는 피부 활성물질을 스크리닝함으로써, 바람직하게는 IL-13 및 IL-27의 발현량을 증가시키는 피부 미백물질을 탐색하는 방법을 제공한다. 상기 피부 미백물질은 멜라닌 세포의 활성을 감소시킴으로써 피부톤을 밝게 해주거나 기미, 흑자 등의 피부 색소 침착을 개선하는 미백물질, 여드름 등 염증 후의 피부 색소 침착을 개선하는 미백물질을 모두 포함한다.
또한, 본 발명은 피부 면역세포에서 특정 싸이토카인의 발현량을 조절하는 물질을 스크리닝함으로써 피부 흑화 효과를 제공하는 피부 활성물질을 탐색하는 방법으로서, 상기 싸이토카인은 IL-13, IL-16 및 IL-27로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있고, 이 중 IL-13 및 IL-27의 발현량은 감소시키거나, IL-16의 발현량은 증가시키는 피부 활성물질을 스크리닝함으로써, 바람직하게는 IL-16의 발현량을 증가시키는 피부 흑화물질을 탐색하는 방법을 제공한다. 상기 피부 흑화물질은 멜라닌 세포의 활성을 증가시킴으로써 피부 내 멜라닌의 양을 증가시켜 피부 내 색소의 양이 적은 저색소성 피부 및 모발 질환을 치료 또는 개선시킬 수 있는 흑화물질을 포함하며, 특히 상기 저색소성 피부 및 모발 질환은 백반증 또는 백모일 수 있다.
또한, 본 발명은 피부 활성물질을 탐색하는 키트를 제공하며, 상기 키트는 피부 면역세포 및 싸이토카인 특이적 항체를 포함하고, 상기 피부 면역세포에서 싸이토카인의 발현량을 조절하는 물질을 스크리닝함으로써 피부 활성물질을 탐색할 수 있다. 상기 싸이토카인은 성체 멜라닌 세포의 활성을 증가 또는 감소시키는 것으로서 바람직하게는 IL-13, IL-16 및 IL-27으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상이다.
또한, 상기 키트는 바람직하게 상기 싸이토카인 특이적 항체에 대한 2차 항체 및 항체의 발색용 표지(label)을 포함할 수 있다.
상기 싸이토카인 특이적 항체는 IL-13, IL-16 및 IL-27에 대한 상용 키트 내에 들어 있는 포획 항체(Capture antibody)를 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한 바람직하게는 IL-13 검출 항체(MAB213, R&D systems), IL-16 검출 항체(MAB316, R&D systems) 및 IL-27 검출 항체(AF2526, R&D systems)를 사용할 수 있다.
상기 2차 항체는 IL-13, IL-16 및 IL-27 에 대한 상용 키트 내에 들어 있는 특이적 검출 항체(Detection antibody)를 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한 바람직하게는 IL-13 검출 항체(BAF213, R&D systems), IL-16 검출 항체 (BAF316, R&D systems) 및 IL-27 검출 항체 (BAF2526, R&D systems) 를 사용할 수 있다.
상기 발색용 표지(label)로는 항체는 IL-13, IL-16 및 IL-27 에 대한 상용 키트 내에 들어 있는 스트렙타비딘-HRP(Streptavidin-HRP)를 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
따라서, 본 발명은 피부 면역세포에서 특정 싸이토카인의 발현량을 조절하는 물질을 스크리닝함으로써 피부 미백 효과를 제공하는 피부 활성물질을 탐색하는 키트로서, 상기 싸이토카인은 IL-13, IL-16 및 IL-27 중 1종 이상일 수 있고, 이 중 IL-13 및 IL-27의 발현량은 증가시키는 반면, IL-16의 발현량은 감소시키는 피부 활성물질을 스크리닝함으로써, 피부 미백물질을 탐색하는 키트를 제공한다. 상기 피부 미백물질은 멜라닌 세포의 활성을 감소시킴으로써 피부톤을 밝게 해주거나 기미, 흑자 등의 피부 색소 침착을 개선하는 미백물질, 여드름 등 염증 후의 피부 색소 침착을 개선하는 미백물질을 모두 포함한다.
또한, 본 발명은 피부 면역세포에서 특정 싸이토카인의 발현량을 조절하는 물질을 스크리닝함으로써 피부 흑화 효과를 제공하는 피부 활성물질을 탐색하는 키트로서, 상기 싸이토카인은 IL-13, IL-16 및 IL-27로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있고, 이 중 IL-13 및 IL-27의 발현량은 감소시키는 반면, IL-16의 발현량은 증가시키는 피부 활성물질을 스크리닝함으로써, 피부 흑화물질을 탐색하는 키트를 제공한다. 상기 피부 흑화물질은 멜라닌 세포의 활성을 증가시킴으로써 피부 내 멜라닌의 양을 증가시켜 피부 내 색소의 양이 적은 저색소성 피부 및 모발 질환을 치료 또는 개선시킬 수 있는 흑화물질을 포함하며, 특히 상기 저색소성 피부 및 모발 질환은 백반증 또는 백모일 수 있다.
또한 본 발명은 상기 탐색 키트를 이용하여 피부 활성물질을 탐색하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 구체적으로 다음과 같은 단계로 이루어진다.
1) 상기 탐색 키트의 피부 면역세포에서 발현되는 싸이토카인의 발현량을 측정하는 단계;
2) 상기 피부 면역세포에 후보 물질을 처리하는 단계;
3) 상기 후보 물질의 처리 후 싸이토카인의 발현량을 측정하는 단계; 및
4) 상기 1) 단계와 3) 단계에서 측정된 싸이토카인의 발현량을 비교 및 평가하는 단계.
본 발명의 피부 활성물질을 탐색하는 방법 및 키트에서 사용되는 피부 면역세포는 인간 각질형성세포(NHEK, normal human epidermal keratinocytes), 섬유아세포(NHF, normal human fibroblasts), 멜라닌세포(NHEM, normal human epidermal melanocyte), 인간 표피 유래 면역세포, 및 인간 각질형성세포와 멜라닌세포를 공배양한 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
한편, 기존에 미백물질을 확인하는 방법으로는 주로 성체 멜라닌 세포의 단일 배양시스템 또는 성체 멜라닌 세포와 각질형성세포의 공배양시스템이 이용되었으나, 실제 피부에서는 미백효능이 입증되는 경우에 있어서 상기 배양시스템을 이용할 경우에는 미백효능이 확인할 수 없는 경우가 있었다. 그러나, 본 발명의 피부 활성물질을 탐색하는 방법 및 키트는 기존의 배양시스템에서 시험관 내(in vitro) 미백효능을 확인할 수 없었던 물질에 대해서 시험관 내에서 효과적으로 미백효능을 확인할 수 있도록 한다는 이점을 제공한다.
이하, 본 발명의 내용을 실시예 및 시험예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 이들 실시예는 본 발명의 내용을 이해하기 위해 제시되는 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이들 실시예 및 시험예로 한정되는 것은 아니고, 당업계에서 통상적으로 주지된 변형, 치환 및 삽입 등을 수행할 수 있으며, 이에 대한 것도 본 발명의 범위에 포함된다.
[ 참고예 1] 멜라닌 세포의 준비
Cascade에서 구입한 인간 멜라닌세포(Normal Human Epidermal Melanocyte-Moderately pigmented, 제품번호 C-102-5C)를 100㎠ 플레이트에 6 x 105 개수로 심고, 기본 배지는 HMGS(Human Melanocyte Growth Supplement, 제품번호 S-002-5, Gibco)를 포함한 254 배지(제품번호 M-254-500, Gibco)를 사용하였으며 37℃, 5% CO2 인큐베이터로 배양하였다. 약 70~80%의 밀도가 되었을 때 계대 배양을 하였고, 이 후 진행되는 실험들에 계대 배양한 멜라닌 세포를 제공하였다.
[ 참고예 2] 각질형성세포의 준비
인간 각질형성세포(Normal Human Epidermal Keratinocyte)는 Lonza에서 제공하는 NHEK-Neo, Pooled(Neonatal Normal Human Epidermal Keratinocytes, Pooled, 제품번호 00192906, Lonza)를 사용하였다. 기본 배지로는 KGM-Gold BulletKit(제품번호 192060, Lonza)를 사용하였으며, 각질 형성 세포가 기저막 (basement membrane)에 붙어서 증식하는 성질을 유지하도록 디쉬는 0.1% 젤라틴으로 코팅해서 사용하였다.
인간 각질형성세포는 100㎠ 플레이트에 6 x 105 개수로 심고, 기본 배지에서 37℃, 5% CO2 인큐베이터로 배양하였다. 약 70~80%의 밀도가 되었을 때 계대 배양을 하였고, 이 후 진행되는 실험들에 계대 배양한 각질형성세포를 제공하였다.
[ 참고예 3] 피부 유래 면역세포의 준비
CD3+ 피부 표피 유래 T 세포(CD3+ epidermal T cell)는 인체 피부 조직에서 얻었다. 피부 조직은 진피와 표피를 분리하기 위하여, 2 unit/ml의 디스파제 II 용액(Dispase II solution, 제품번호 4942078001, Roche)이 함유된 기본 배지(2mM L-글루타민, 100 U/ml 페니실린, 100?g/ml 스트렙토마이신 및 불활성화 된 10% 소태아혈청이 함유된 RPMI 1640 배지, 제품번호 12-115F, Lonza)에서 4℃, 12시간 동안 배양하였다. 멸균된 집게를 이용하여 표피층만 분리한 후, 표피층에 2 unit/ml의 디스파제 II 용액을 넣고 10분간 상온에서 배양하였다. 효소를 불활성화시키기 위하여 10mM EDTA(제품번호 E6758, Sigma)를 넣었다. 임파구가 섞여있는 부유액을 얻기 위해 필터링(cell strainer 100mm; 제품번호 REF352360, BD falcon)을 하여 부유액을 얻었다. 원심분리기(Fincoll-Paque gradient centrifugation, Hitopagne-1077, 제품번호 1077-1, Sigma)를 이용하여 세포를 분리한 후, 50 unit/ml의 인터루킨 2(IL-2, 제품번호 202-IL, R&D systems)가 함유된 기본 배지에 37℃에서, 24시간 동안 배양하였다. T 세포만을 분리하기 위하여, CD3 항체(anti-CD3 antibody, 제품번호 MBA100, R&D systems)가 코팅된 100mm 배양 접시에 상기 배양된 세포와 기본 배지를 넣고 6일 동안 배양하여 T 세포를 얻었다.
[ 참고예 4] 인간 각질 형성 세포와 인간 멜라닌 세포의 공배양
인간 멜라닌 세포(Normal Human Epidermal Melanocyte-Moderately pigmented, 제품번호 C-102-5C, Cascade)와 상기 인간 각질형성세포(Neonatal Normal Human Epidermal Keratinocytes, Pooled, 제품번호 00192906, Lonza)를 1:5의 비율로 혼합하여 공배양하였다. 구체적으로는 6웰 플레이트에 상기 참고예 1 및 2에서 배양한 인간 각질 형성 세포 1.25 x 105 개와 인간 멜라닌 세포 2.5 x 104 개를 혼합하여 KGM-Gold BulletKit(제품번호 192060, Lonza)와 HMGS(제품번호 S-002-5, Gibco)를 포함한 254 배지(제품번호 M-254-500, Gibco)를 1:1로 혼합한 배지에서 37℃, 5% CO2 인큐베이터로 24시간 동안 배양한 후 실험에 이용하였다.
[ 시험예 1] 피부 면역세포에서 분비가 되는 싸이토카인 중 색소생성세포의 색소 형성 효소인 타이로시나제( tyrosinase )의 유전자 발현에 영향을 미치는 인자 탐색
상기 참고예 1에서 배양한 색소생성세포에 IL-13, IL-16 및 IL-27을 0.2μg/ml 처리하고, 대조군으로는 아무것도 처리하지 않은 세포를 37℃, 5% CO2 인큐베이터로 72시간 동안 배양한 다음 RNA을 추출하였다. 추출한 RNA는 cDNA로 합성하여 실시간 PCR(Real-time PCR)을 이용하여 샘플간 멜라닌 색소 생성 효소인 타이로시나제(tyrosinase) 유전자의 상대적인 발현 차이를 측정하였다. 이 때 프라이머는 사람 타이로시나제에 대한 프라이머(tyrosinase(oculocutaneous albinism IA), Applied Biosystems, 제품 번호; Hs00165976_m1*)를 사용하였으며, 95℃에서 15초, 60℃ 60초 싸이클을 총 40회 반복해서 대조군 유전자 발현에 비해 해당 유전자 발현이 얼마나 증가하였는지 상대적인 값을 측정하였다. 결과는 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타낸 결과를 통하여, IL-13과 IL-27은 색소 생성 효소인 타이로시나제의 유전자 발현을 감소시키는 반면, IL-16은 타이로시나제의 유전자 발현을 증가시킴을 확인할 수 있다.
이로부터, 세포 내에서 IL-13과 IL-27의 발현을 증가시키는 물질은 피부에 미백효과를 제공하며, IL-16의 발현을 증가시키는 물질은 피부에 흑화효과를 제공할 수 있을 것으로 예상할 수 있다.
[ 시험예 2] 진세노사이드 F1을 함유하는 화장료 조성물의 인체 미백 효능 평가
진세노사이드 F1 함유 수중유형 유화 액정 베이스의 피부 미백 효과를 임상에서 직접적으로 평가하기 위해서 30~50대(평균 34.7세)의 한국인 여성 50명을 대상으로 다섯 그룹으로 나누어 하기 표 1의 실시예의 화장료 조성물을 매일 하루에 2회 7주간 사용하게 하고, 피부 상태를 색차계(미놀타 CR2002)를 사용하여 피부의 흑백정 도를 측정하여 효과를 판정하였다. 색을 표시하는 데에는 L*a*b* 표색계를 사용하였으며, 여기에서 L값은 밝기를 의미하고, b값은 누런기, a값은 붉은기 의미한다. 또한, 분광 광도계(Spectrophotometer)를 이용한 피부톤 균일도를 측정하여 비교 분석하였다. 결과는 표 2에 나타내었다.
성분 대조군 실시예
증류수 to 100 to 100
EDTA-2Na 적량 적량
진세노사이드 F1 - 5
페녹시에탄올 적량 적량
세테아릴알코올 1 1
파이토스쿠알란 5 5
세테아릴알코올/세테아릴글루코사이드 1 1
트로메타민 적량 적량
카보머 적량 적량
개선율(%) 비교예 실시예
L* 개선율(%) _ 1.20%
A* 개선율(%) _ 0.61%
B* 개선율(%) _ 0.64%
멜라닌 지수 개선율(%) _ 10.89%
표 2를 보면, 진세노사이드 F1을 함유하는 실시예를 사용한 경우는 진세노사이드 F1을 함유하지 않는 대조군을 사용한 경우와 비교하여 피부 밝기, 누런기, 붉은기 항목에서 각각 현저한 향상효과를 보였다. 이로써 진세노사이드 F1은 피부에 미백 효과를 제공하는 피부 활성물질임을 확인할 수 있다.
[ 시험예 3] 기존의 색소생성세포 단일 배양시스템 또는 색소생성세포와 각질형성세포 공배양시스템에서 피부 활성물질( 진세노사이드 F1)의 탐색
진세노사이드 F1은 상기 시험예 2에 나타낸 바와 같이, 임상에서의 미백효과가 입증된 피부 활성물질이다. 이에 상기 피부 활성물질의 미백효과가 시험관 내 실험(in vitro)에서도 그 효능 및 기전을 나타내는지 여부를 탐색하기 위하여, 기존의 색소생성세포 단일 배양시스템과 색소생성세포와 각질형성세포 공배양시스템을 활용했다.
상기 참고예 1에서 배양된 피부 색소생성세포에 진세노사이드 F1을 30μM 처리하고, 대조군으로는 아무것도 처리하지 않은 세포를 72시간 동안 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양한 다음, 색소 생성에 관여하는 효소의 유전자 발현 정도를 확인하였다. 또한, 상기 참고예 4와 같이 배양된 색소생성세포와 각질형성세포 공배양시스템에도 같은 조건으로 진세노사이드 F1을 처리하고, 대조군으로는 아무것도 처리하지 않은 세포를 배양한 다음, 색소 생성에 관여하는 효소의 유전자 발현 정도를 확인하였다.
이때, 두 가지 배양시스템에서 배양된 인간 멜라닌 세포의 총 mRNA를 추출하여 실시간 PCR(Real-time PCR)을 이용하여 샘플간 멜라닌 색소 생성 효소인 타이로시나제(tyrosinase) 유전자의 상대적인 발현차이를 측정하였다. 이 때 프라이머는 사람 타이로시나제에 대한 프라이머(tyrosinase(oculocutaneous albinism IA), Applied Biosystems, 제품 번호; Hs00165976_m1*)를 사용하였으며, 95℃에서 15초, 60℃ 60초 싸이클을 총 40회 반복해서 대조군 유전자 발현에 비해 해당 유전자 발현이 얼마나 증가하였는지 상대적인 값을 측정하였다. 단일 배양시스템을 이용한 경우의 측정 결과는 도 2에, 공배양시스템을 이용한 경우의 측정 결과는 도 3에 나타내었다.
도 2에서 대조군의 멜라닌 세포가 발현하는 타이로시나제(tyrosinase) 발현양을 1로 잡았을 때, 진세노사이드 F1을 처리한 군에서의 발현은 0.85로 15% 감소한 반면, 도 3에서는 대조군의 멜라닌 세포가 발현하는 타이로시나제(tyrosinase) 발현양을 1로 잡았을 때, 진세노사이드 F1을 처리한 군에서의 발현은 1.22로 22% 증가했다고 판단되었다.
이와 같이 배양 시스템에 따라서 타이로시나제의 발현양의 증가 또는 감소가 일관되지 않고, 유의미한 증감량이 나타나지 않아서 기존의 배양시스템으로는 통계학적으로 일치하는 데이터를 얻을 수가 없었다.
즉, 이는 진세노사이드 F1의 미백효과의 확인과 같이 기존 배양시스템으로는 확인하기 어려운 소재가 있음을 명시하는 결과라고 할 수 있다.
[ 시험예 4] 피부 면역세포의 싸이토카인 발현 변화에 의한 피부 활성물질( 진세노사이드 F1)의 탐색
상기 참고예 3에서 배양된 CD3+ 표피 유래 T 세포(CD3+ epidermal T cell)를 활성화시키기 위해 플레이트에 고정시킨 CD3 항체(immobILized anti-CD3 antibody), 200 U/ml 인터루킨 2(IL-2) 500ng/ml PHA를 기본 배지에 넣고, 임상에서 미백효능을 확인한 물질인 진세노사이드 F1 100μM을 처치하였다. 37℃, 5% CO2 인큐베이터로 48시간 배양한 후 상층액을 수득하였다. 대조군은 활성화를 위해 CD3 항체(immobILized anti CD3 antibody), 200 U/ml 인터루킨 2(IL-2), 500ng/ml PHA(Phytohaemaglutinin; 제품 번호 L1668; Sigma)는 첨가하였으나 진세노사이드 F1을 처리하지 않은 T 세포를 사용하였다. 상기에서 수득한 상층액을 싸이토카인 분석 키트(cytokine array kit A, R&D systems, 제품번호 ARY005)를 사용하여 IL-13 단백질의 상대적인 발현양을 분석하였으며, 그 결과는 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 진세노사이드 F1을 처리하지 않은 T 세포에 비하여 싸이토카인 IL-13의 발현양이 유의성있게 증가하였음을 확인할 수 있다.(P<0.01)
따라서, 임상시험에서는 미백효능이 입증되었지만, 기존의 배양시스템을 이용한 시험관 내 실험에서는 미백효능을 확인하기 어려웠던 미백 활성물질에 있어서, 본 발명에 따른 방법을 이용하여 싸이토카인 발현 변화량을 측정함으로써 미백 또는 흑화에 영향을 주는지 여부를 효과적이면서도 용이하게 판단할 수 있다.

Claims (16)

  1. 멜라닌 세포의 색소 생성을 조절하는 물질을 탐색하는 방법으로서,
    1) 피부 면역세포의 싸이토카인 발현량을 확인하는 단계;
    2) 상기 피부 면역세포에 후보 물질을 처리하는 단계;
    3) 상기 후보 물질을 처리한 피부 면역세포의 싸이토카인 발현량을 확인하는 단계; 및
    4) 상기 1) 단계 및 3) 단계에서 확인한 싸이토카인 발현량을 비교하여 상기 후보 물질에 의한 멜라닌 세포의 색소 생성의 촉진 또는 억제 여부를 평가하는 단계;를 포함하며,
    상기 피부 면역세포는 CD3+ 표피 유래 T 세포이고,
    상기 1) 단계 및 3) 단계의 싸이토카인은 IL-13, IL-16 및 IL-27로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 멜라닌 세포의 색소 생성을 조절하는 물질을 탐색하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 멜라닌 세포의 색소 생성을 조절하는 물질은 멜라닌 세포의 색소 생성을 촉진 또는 억제시키는 것을 특징으로 하는, 멜라닌 세포의 색소 생성을 조절하는 물질을 탐색하는 방법.
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 IL-13 또는 IL-27은 멜라닌 세포의 색소 생성을 억제시키는 것을 특징으로 하는, 멜라닌 세포의 색소 생성을 조절하는 물질을 탐색하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 IL-13 또는 IL-27을 통해 멜라닌 세포의 색소 생성을 억제시키는 물질은 피부 미백 물질인 것을 특징으로 하는, 멜라닌 세포의 색소 생성을 조절하는 물질을 탐색하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 IL-16은 멜라닌 세포의 색소 생성을 촉진시키는 것을 특징으로 하는, 멜라닌 세포의 색소 생성을 조절하는 물질을 탐색하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 IL-16을 통해 멜라닌 세포의 색소 생성을 촉진시키는 물질은 피부 흑화 물질인 것을 특징으로 하는, 멜라닌 세포의 색소 생성을 조절하는 물질을 탐색하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 CD3+ 표피 유래 T 세포 및 멜라닌 세포는 인간으로부터 유래한 것임을 특징으로 하는, 멜라닌 세포의 색소 생성을 조절하는 물질을 탐색하는 방법.
  9. 피부 면역세포, 싸이토카인 특이적 항체, 싸이토카인 특이적 항체에 대한 2차 항체 및 항체의 발색용 표지(label)를 포함하는 멜라닌 세포의 색소 생성을 조절하는 물질 탐색용 키트로서,
    상기 피부 면역세포는 CD3+ 표피 유래 T 세포이고,
    상기 싸이토카인은 IL-13, IL-16 및 IL-27로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 멜라닌 세포의 색소 생성을 조절하는 물질 탐색용 키트.
  10. 제9항에 있어서, 상기 멜라닌 세포의 색소 생성을 조절하는 물질은 멜라닌 세포의 색소 생성을 촉진 또는 억제시키는 것을 특징으로 하는, 멜라닌 세포의 색소 생성을 조절하는 물질 탐색용 키트.
  11. 삭제
  12. 제9항에 있어서, 상기 IL-13 또는 IL-27은 멜라닌 세포의 색소 생성을 억제시키는 것을 특징으로 하는, 멜라닌 세포의 색소 생성을 조절하는 물질 탐색용 키트.
  13. 제12항에 있어서, 상기 IL-13 또는 IL-27을 통해 멜라닌 세포의 색소 생성을 억제시키는 물질은 피부 미백 물질인 것을 특징으로 하는, 멜라닌 세포의 색소 생성을 조절하는 물질 탐색용 키트.
  14. 제9항에 있어서, 상기 IL-16은 멜라닌 세포의 색소 생성을 촉진시키는 것을 특징으로 하는, 멜라닌 세포의 색소 생성을 조절하는 물질 탐색용 키트.
  15. 제14항에 있어서, 상기 IL-16을 통해 멜라닌 세포의 색소 생성을 촉진시키는 물질은 피부 흑화 물질인 것을 특징으로 하는, 멜라닌 세포의 색소 생성을 조절하는 물질 탐색용 키트.
  16. 제9항에 있어서, 상기 CD3+ 표피 유래 T 세포 및 멜라닌 세포는 인간으로부터 유래한 것임을 특징으로 하는, 멜라닌 세포의 색소 생성을 조절하는 물질 탐색용 키트.
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