JP6510054B2 - Rgdモチーフ含有ペプチドまたはその断片を含む、皮膚しわを改善するための組成物 - Google Patents

Rgdモチーフ含有ペプチドまたはその断片を含む、皮膚しわを改善するための組成物 Download PDF

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Description

本発明は、皮膚のしわ改善、火傷及び緑内障の治療、発毛促進の効果があるペプチドまたはその断片、これを含む医薬組成物、及び化粧料組成物に関する。
本出願は、2014年12月31日出願の韓国特許出願第10−2014−0195008号に基づく優先権を主張し、該当出願の明細書及び図面に開示された内容は、すべて本出願に援用される。
ディスインテグリン・メタロプロテアーゼ(A Disintegrin and Metalloproteinase、以下、「ADAM」とする)は、ディスインテグリン及びメタロプロテアーゼドメインを含む多機能たんぱく質であり、細胞−細胞及び細胞−マトリクスの相互作用における付着及びたんぱく質分解機能をともに果たすことと知られている。それらのうち、ADAM15は、そのディスインテグリン様ドメイン内にArg−Gly−Asp(RGD)モチーフを有する独特のたんぱく質である。ADAM15は、平滑筋細胞、メサンジウム細胞及び内皮細胞において発現する。ADAM系列は、受精、筋形成、神経発生及びサイトカイン分泌のような多様な生物学的過程に関与する(Blobel CP, 外; Nature 1992. 356: 248−252.;Aitken, J. Nature 1992; 356: 196−197.; Blobel CP, 外 J. Cell Biol. 1990; 111: 69−78.; White JM. Curr. Opin. Cell. Biol. 2003; 15: 598−606)。ADAM15のEGF(Epidermal growth factor)様ドメインとして知られたディスインテグリン様ドメインは、特にインテグリンβ鎖(integrin beta 3)と特異的に結合し、Src族たんぱく質のイロシンカイネーズと結合して細胞間の信号伝達及び接着(adhesion)の機能を果たすことと知られている。ADAM15たんぱく質は、リウマチのような炎症性疾患及び乳房癌、前立腺癌などの多様な疾患にも連関すると知られ、さらなる研究が必要な実情である。
一方、人の皮膚は、角質層を含む表皮と真皮、及び結合組織から構成されており、その中で角質層は表皮(epidermis)の基底細胞であるケラチノサイト(keratinocyte)の分化過程により形成される死んだ細胞層から構成されており、外部環境の影響から人体を保護する役割を担当する。また、皮膚の内部に存在する真皮層は、繊維性たんぱく質であるコラーゲンとエラスチンから構成され、皮膚に弾力を与えて皮膚が弛まないようにする役割を果たし、血管と神経が存在し、アレルギー反応に関与する肥満細胞、及びNa−PCAまたはヒアルロン酸などの天然保湿因子も含んでいる。
皮膚のしわ生成の原因については、大きく二つに分類され、一つは、「内的老化」であって年齢の増加による肌の構成単位である細胞の機能変化に起因することであり、他の一つは、「外的老化」であって外部環境、即ち、紫外線、公害、ストレスなどによることに分けられる。皮膚老化の原因の中でも最も大きい部分を占めている光老化は、UVによる持続的な露出によって皮膚癌などの急性及び慢性的な皮膚傷害を誘発してしわを誘発する。これは、太陽光に存在する波長帯によってUVA(320〜400nm)、UVB(290〜320nm)及びUVC(200〜290nm)の3種に分けられ、このうちUVCは、オゾン層によってほとんどが完全に吸収されるのに対し、UVA及びUVBは、地球の表面にまで到達して肌傷害を誘発する致命的な因子として作用する。UVAよりも短い波長帯であってさらに強いUVBは、真皮の上部に存在する表皮を貫いてケラチノサイトに傷害を加えてコラーゲン繊維を損じてしまい、その結果、しわの生成、皮膚変色または皮膚癌を誘発すると知られている。また、最近、細胞と細胞外基質たんぱく質(コラーゲン、フィブリリン、フィブロネクチン)との相互作用が、皮膚細胞の生存と増殖、組織の再建に重要な役割を果たすことが分かった。
火傷は主に事故によって発生し、原因によって、熱による火傷、電流による火傷、化学物質による火傷、放射線による火傷などに分けられる。火傷の重症度は、火傷を負った広さ、深さ、火傷を誘発した物体の温度と接触時間、皮膚状態などによって、1度、2度、3度及び4度火傷に分けられ、2度火傷からは傷跡を残し得、病院治療を要する。
1度火傷は、肌が赤くなり、ひりひりするなどの痛症を伴う。皮膚層における最も外層である表皮の損傷をもたらし、痛症と紅斑を伴いながらはれ上がったりする。数日後に症状が消えるが、その箇所に軽い落屑と色素沈着がある場合もある。回復後は瘢痕が残らない。日焼けによる火傷の場合が最も一般的な1度火傷の例である。
2度火傷は、表皮と真皮とも影響を及ぼし、紅斑、痛症、浮腫み、そして火傷後24時間内に水疱を誘発する。この火傷はまた、汗線や毛穴に影響を与えることもある。自覚的には灼熱感と痛症がひどい。水疱が裂ければ糜爛面が現われ、多量の分泌液が出る。火傷を負った面積が体表面積の約15%以上に至る場合は、特に注意を要する。数週内に癒されるが、その個所に色素沈着や色素脱失が生じることが多い。2次感染を起こせば局所症状はさらにひどくなり、経過も長くなる。
3度火傷は、表皮、真皮、そして下皮にまで影響を及ぼし、皮膚が黒くなるか半透明白色となり、皮膚表面真下の血管を凝固させる。この火傷部位は、無感覚となることもあるが、患者は極甚な痛症を感じ、皮膚組織と構造が壊死してしまい、治療に多い時間がかかり、後に傷跡が残るようになる。事故後2週が経つと、瘡蓋が剥げて潰瘍面が現われる。分泌液が多く、出血しやすいが、次第に新しい組織が生じて表皮が再生し、瘢痕が残り、癒される。皮膚壊死が深い場合、または2次感染を起こした場合、治癒が遅くなり、瘢痕の表面が不規則になってケロイドが生じたり変形や運動障害が残ったりする。火傷を負った面積が身体表面積の10%以上となる場合は、特に注意を要する。
4度火傷は、火傷を負った部位組織が炭化してしまい黒く変わった場合であり、皮膚層の下に位置する脂肪層、靭帯、筋膜、筋肉、骨組織などにまで火傷を負った場合をいう。高圧電気火傷において主に発生し、たまに深在性2、3度火傷において菌感染が発生した場合に現われ得る。火傷の範囲が20%以上である場合、全身反応が起きることがあるが、過度な体液損失による低血圧、ショック、急性腎臓機能不全などが発生し得、追って傷の感染や肺炎、敗血症、多発性臓器機能不全症候群などが発生することもある。
火傷においては、皮膚及び皮膚付属器官の再生に重点を置いているが、現在の開発技術では完全な治療が困難であるという問題がある。
緑内障とは、視神経萎縮証の形態を帯び、網膜神経叢細胞を含み視神経に発生する疾患の総称である。治療しない緑内障は、永久的に視力に影響を与え得る。過去は、正常よりも高い眼圧によって視神経損傷及びこれによる視野障害を誘発する疾患として定義されていたが、最近は、緑内障性視神経損傷の原因として高い眼圧の他に多様な要素が関与すると報告され、視神経の特徴的な変化及びこれによる視野障害が招来される進行型視神経病症と定義される。
緑内障は、原因または症状によって開放隅角緑内障、閉塞隅角緑内障、先天性緑内障、続発性緑内障、水晶体融解緑内障、偽落屑緑内障、水晶体形態性緑内障、新生血管緑内障、ステロイド緑内障などに分けられる。
緑内障患者にとって、薬物治療及びレーザ治療でも眼圧が調節されないか、または十分な薬物治療でも視野検査において視野障害が進行し、眼底検査所見において緑内障性視神経変化が進行する場合、薬物の副作用によって薬物を使いにくい場合は、手術的治療を考えるようになり、線維柱帯切除術が代表的な手術方法の一つである。線維柱帯切除術は、ろ布によって人為的に房水を排出することで眼圧下降を誘発する。手術により形成されたろ布の創傷の治癒過程及び傷跡生成は房水流出路の閉塞をもたらし、次第にろ布の機能を低下させ、結果として手術の失敗をもたらす。現在、線維柱帯切除術の長期手術成功率を高めるために、抗代謝剤である5−fluorouracil(5−FU)またはmitomycin C(MMC)を補助的に用いており、これは線維柱帯切除術の成功率は高めたが、低眼圧、ろ布漏出、ろ布による感染などの後期合併症を増加させた。これについて、最近はOculusGenTM(OculusGen Biomedical Inc.,Taipei,Taiwan)を用いて、線維芽細胞の増殖を「任意に組織化」するように骨格を提供し、「任意に配列された線維芽細胞」を、コラーゲンを細胞周りの多くの方向へ生産、配列して傷跡組織ではなく正常組織におけるコラーゲン構造に似ている様態を形成するようすることで、線維柱帯切除術に用いることができるという報告がある。しかし、線維柱帯切除術の外にも緑内障を治療できる代替方案が必要な実情である。
毛髪は通常3成長周期を有し、これは、成長期(anagen)、停滞期(catagen)、衰退期(telogen)である。成長期は、毛髪が旺盛に育つ時期であって、毛髪成長週期の多くを占める。停滞期は、アポトーシスが起きて毛髪が抜ける準備となる時期であり、衰退期は、毛髪が毛嚢から抜けた状態の時期をいう。
脱毛(Alopeciaまたはhair loss)は、毛髪が、成長期−停滞期−衰退期を繰り返す過程で毛根が小さくなって毛髪の太さが薄くなり、究極には綿毛のように変わりながら誘発される。このような脱毛誘発の原因には、遺伝的な要素、性ホルモンであるテストステロン(Testosterone)の過多分泌、毛嚢の血流量低下、皮脂の過多分泌、ストレス、不均衡的な食生活、大気汚染、過多な紫外線露出などがあり、主に多様な要因が複合的に作用する。
脱毛は、大きく男性型脱毛症(androgenetic alopecia)、女性型脱毛症(female pattern hair loss)、円形脱毛症(alopecia areata)、その他の原因による脱毛症に分けられる。男性型脱毛症は、男性の性徴を発現させ、思春期の筋肉発達、男性器官の発達などに作用するホルモンであるテストステロンという男性ホルモンによって現われる現象であり、このテストステロンが5α−リダクターゼ(α−reductase)という酵素によってさらに強いホルモンであるジヒドロテストステロン(Dihydrotestosterone:DHT)に変われば、このホルモンが毛嚢に存在する毛乳頭細胞に作用し、毛嚢を成長期の段階から退化期の段階へ誘導して脱毛を起こす。女性型脱毛症は、主に閉経期以後、エストステロン量の減少によって発生する。女性の脱毛症は、男性型脱毛症の様態とは少し相違に頭の前部は抜けず中間部分の髪が主に脱毛される。女性の脱毛症は、5α−リダクターゼとの連関関係が男性より少なく作用する。したがって、5α−リダクターゼを抑制する薬物は、閉経期以後の脱毛症の女性にとってはあまり効果がない。円形脱毛症は、自家免疫疾患や精神的ストレス、遺伝的素因によって発生する。円形または卵円形の脱毛が起こり、頭部白癬や抜毛癖が生ずる特徴を有する。このような円形脱毛症は、男性型脱毛症とは根本的に原因が異なり、治療法も異なることから、副腎皮質ホルモン剤を処方する方法を用いるか、ミノキシジルを患部に塗る。
かかる脱毛による問題点を解決するために、脱毛防止及び治療効果を有する多様な有効成分と、これを含む組成物について研究されつつある。このような研究において目的とする主な効果として、毛髪の太さを維持するか、太くする効果、毛髪の成長期が早く渡来するか長く維持させる効果、毛髪の衰退期の到来を遅らせるか短く維持させる効果、5α−リダクターゼの活性を阻害する効果、毛嚢への血行を促進する効果、保湿効果、抗酸化効果、ふけ防止効果、殺菌効果、細胞外マトリクス(Extra−Celluar matrix;ECM)の発現促進効果などが挙げられる。
現在、医薬品として登録されて用いられている物質には、ミノキシジルがある。ミノキシジルは、本来、平滑筋血管の拡張作用をする高血圧治療剤として作られたが、その副作用から全身に毛の育つ現象が発見された後、発毛剤として開発された(米国特許登録第4,596,812号:第4,139,619号)。この科学的な作用機転の詳細は知られていないが、毛嚢への血流量を増加させるなどの複合的な作用により毛髪の成長を促進すると推測されている。このような効果に基づき、FDAで一般医薬品として承認されたが、皮膚刺激、かゆみ、紅潮、希望しない部位での発毛、脱毛の悪化などの副作用が報告されており、薬効を維持するために持続的に使わなければならないなどの問題点を有している。
本発明が解決しようとする課題は、特定配列及び構造を有するペプチドを提供することで上述の問題点を解消し、皮膚のしわ、火傷、緑内障及び脱毛において、優れた改善または治療効果を奏する医薬組成物及び化粧料組成物を提供することを目的とする。
上記の課題を達成するために、RGDモチーフを含む配列番号1のアミノ酸配列からなるペプチドまたはその断片を有効成分として含み、以下の一つ以上の効果を奏する組成物を提供する:
火傷治療;
緑内障治療;
皮膚のしわ改善;または
脱毛防止、頭皮改善または発毛及び育毛促進。
望ましくは、断片は、下記より選択された一種以上であり得る。
1)配列番号1のアミノ酸配列の、RGDモチーフを含む5〜45個のアミノ酸からなり、選択的に断片内におけるシステイン間の二硫化結合がないか、または三つ以下の二硫化結合が形成されたことを特徴とする断片;
2)配列番号1のアミノ酸配列の30〜38番目のアミノ酸を含み、選択的に断片内におけるシステイン間の二硫化結合がないか、または一つ以上の二硫化結合が形成されたことを特徴とする断片;
3)配列番号1のアミノ酸配列の32〜43番目のアミノ酸を含み、選択的に断片内におけるシステイン間の二硫化結合がないか、または一つ以上の二硫化結合が形成されたことを特徴とする断片;
4)配列番号1のアミノ酸配列の30〜44番目のアミノ酸を含み、選択的に断片内におけるシステイン間の二硫化結合がないか、または一つ以上の二硫化結合が形成されたことを特徴とする断片;
5)配列番号1のアミノ酸配列の18〜54番目のアミノ酸を含み、選択的に断片内におけるシステイン間の二硫化結合がないか、または一つ以上の二硫化結合が形成されたことを特徴とする断片;及び
6)配列番号1のアミノ酸配列の10〜54番目のアミノ酸を含み、選択的に断片内におけるシステイン間の二硫化結合がないか、または一つ以上の二硫化結合が形成されたことを特徴とする断片。
より望ましくは、ペプチドの断片は、下記より選択された一種以上であり得る。
1)配列番号1のアミノ酸配列の、RGDモチーフを含む9個、12個または15個のアミノ酸からなり、選択的に断片内におけるシステイン間の二硫化結合がないか、または三つ以下の二硫化結合が形成されたことを特徴とする断片;
2)配列番号1のアミノ酸配列の30〜38番目のアミノ酸からなることを特徴とする断片;
3)配列番号1のアミノ酸配列の32〜43番目のアミノ酸からなり、36番目のシステインと42番目のシステインとの間に二硫化結合が形成されることを特徴とする断片;
4)配列番号1のアミノ酸配列の30〜44番目のアミノ酸からなり、断片内におけるシステイン間の二硫化結合がないことを特徴とする断片;または
5)配列番号1のアミノ酸配列の30〜44番目のアミノ酸からなり、断片内におけるシステイン間に一つの二硫化結合が形成されることを特徴とする断片。
本発明による組成物は、医薬組成物、化粧料組成物、健康機能食品組成物、医薬外品組成物などとして用いることができる。
また、本発明は、RGDモチーフ(Arg−Gly−Asp motif)を含む配列番号1のアミノ酸配列からなるペプチドまたはその断片を投与し、以下のいずれか一つ以上の効果を奏する方法を提供する(以下、単に「方法」とする。)。
火傷治療;
緑内障治療;
皮膚のしわ改善;または
脱毛防止、頭皮改善または発毛及び育毛促進。
また、本発明は、RGDモチーフを含む配列番号1のアミノ酸配列からなるペプチドまたはその断片の、以下のいずれか一つ以上の効果を発揮するための用途を提供する(以下、単に「用途」とする。)。
火傷治療;
緑内障治療;
皮膚のしわ改善;または
脱毛防止、頭皮改善または発毛及び育毛促進。
本発明において、前記「組成物」、「方法」及び「用途」ともRGDモチーフを含む配列番号1のアミノ酸配列からなるペプチドまたはその断片の火傷治療;緑内障治療;皮膚のしわ改善;または脱毛防止、頭皮改善または発毛及び育毛促進の効果に基づき、以下、「組成物」についての説明は、特に制限的に記載しない限り、「方法」、「用途」についても同一に適用し、重複記載を避けるために、「方法」、「用途」についての説明は省略する。
本発明によるペプチドまたはその断片を用いれば、火傷及び緑内障を効果的に治療することができ、皮膚のしわ改善に優れた効果を奏し、脱毛防止は勿論、育毛及び発毛促進にも効果的であることから、化粧料組成物及び薬学的組成物に活用することができる。
HU024のMALDI−TOF質量分析法で測定した結果を示した図である。 HU025のMALDI−TOF質量分析法で測定した結果を示した図である。 HU026のMALDI−TOF質量分析法で測定した結果を示した図である。 HU027のMALDI−TOF質量分析法で測定した結果を示した図である。 G1〜G6の体重変化を測定した結果を示した図である。(G1:正常群,n=5;G2:陰性対照群,n=9〜10;G3:試験群(3.3μg/匹/日),n=10;G4:試験群(10μg/匹/日),n=10;G5:試験群(30μg/匹/日),n=10;G6:陽性対照群(10μg/匹/日),n=9〜10)。 G1〜G6の火傷面積変化を測定した結果を示した図である。(G2:陰性対照群,n=9〜10;G3:試験群(3.3μg/匹/日),n=10;G4:試験群(10μg/匹/日),n=10;G5:試験群(30μg/匹/日),n=10;G6:陽性対照群(10μg/匹/日),n=9〜10)。 G2〜G6の火傷面積得減少率を示した図である。(G1:正常群,n=5;G2:陰性対照群,n=9〜10;G3:試験群(3.3μg/匹/日),n=10;G4:試験群(10μg/匹/日),n=10;G5:試験群(30μg/匹/日),n=10;G6:陽性対照群(10μg/匹/日),n=9〜10)。 G1〜G6の痂皮形成及び炎症細胞浸潤の変化を示した図である。(G1:正常群,n=5;G2:陰性対照群,n=9〜10;G3:試験群(3.3μg/匹/日),n=10;G4:試験群(10μg/匹/日),n=10;G5:試験群(30μg/匹/日),n=10;G6:陽性対照群(10μg/匹/日),n=9〜10)。 G1〜G6の皮膚付属器官再生、結合組織増殖、上皮細胞再生変化を示した図である。(G1:正常群,n=5;G2:陰性対照群,n=9〜10;G3:試験群(3.3μg/匹/日),n=10;G4:試験群(10μg/匹/日),n=10;G5:試験群(30μg/匹/日),n=10;G6:陽性対照群(10μg/匹/日),n=9〜10)。 G1〜G6の痂皮形成及び炎症細胞浸潤の程度を示した図である。(e:表皮、d:真皮、hd:下皮),(A:正常群,B:陰性対照群,C:試験群(3.3μg/匹/日),D:試験群(10μg/匹/日),E:試験群(30μg/匹/日),F:陽性対照群(10μg/匹/日))。 試験製品(HU022)及び対照製品の使用によるR1の数値変化を示した図である。 試験製品(HU022)及び対照製品の使用によるR2の数値変化を示した図である。 試験製品(HU022)及び対照製品の使用によるR3の数値変化を示した図である。 試験製品(HU022)及び対照製品の使用によるR4の数値変化を示した図である。 試験製品(HU022)及び対照製品の使用によるR5の数値変化を示した図ある。 試験製品(HU022)及び対照製品の使用によるRaの数値変化を示した図である。 試験製品(HU022)及び対照製品の使用によるRmaxの数値変化を示した図である。 試験製品(HU022)及び対照製品の使用によるRtの数値変化を示した図である。 試験製品(HU022)及び対照製品の使用によるRpの数値変化を示した図である。 試験製品(HU022)及び対照製品の使用によるRvの数値変化を示した図である。 試験製品(HU022)及び対照製品の使用による専門家の目視評価点数値の変化を示した図である。 試験製品(HU024)及び対照製品の使用によるR1の数値変化を示した図である。 試験製品(HU024)及び対照製品の使用によるR2の数値変化を示した図である。 試験製品(HU024)及び対照製品の使用によるR3の数値変化を示した図である。 試験製品(HU024)及び対照製品の使用によるR4の数値変化を示した図である。 試験製品(HU024)及び対照製品の使用によるR5の数値変化を示した図である。 試験製品(HU024)及び対照製品の使用によるRaの数値変化を示した図である。 試験製品(HU024)及び対照製品の使用によるRmaxの数値変化を示した図である。 試験製品(HU024)及び対照製品の使用によるRtの数値変化を示した図である。 試験製品(HU024)及び対照製品の使用によるRpの数値変化を示した図である。 試験製品(HU024)及び対照製品の使用によるRvの数値変化を示した図である。 試験製品(HU024)及び対照製品の使用による専門家の目視評価点数値の変化を示した図である。 G1〜G10の体重変化を測定した結果を示した図である。(G1:陰性対照群(滅菌注射用水),n=10;G2:試験群I(HU024 20μg/匹/日),n=10;G3:試験群I(HU024 60μg/匹/日),n=10;G4:試験群II(HU025 20μg/匹/日),n=10;G5:試験群II(HU025 60μg/匹/日),n=10;G6:試験群III(HU026 20μg/匹/日),n=10;G7:試験群III(HU026 60μg/匹/日),n=10;G8:試験群IV(HU027 20μg/匹/日),n=10;G9:試験群IV(HU027 60μg/匹/日),n=10;G10:陽性対照群(マイノキシル3%)、n=10)。 G1〜G10の毛髪の面積変化を測定した結果を示した図である。(G1:陰性対照群(滅菌注射用水)、n=10;G2:試験群I(HU024 20μg/匹/日)、n=10;G3:試験群I(HU024 60μg/匹/日)、n=10;G4:試験群II(HU025 20μg/匹/日)、n=10;G5:試験群II(HU025 60μg/匹/日)、n=10;G6:試験群III(HU026 20μg/匹/日)、n=10;G7:試験群III(HU026 60μg/匹/日)、n=10;G8:試験群IV(HU027 20μg/匹/日)、n=10;G9:試験群IV(HU027 60μg/匹/日)、n=10;G10:陽性対照群(マイノキシル3%)、n=10)。 毛髪の重さ変化を測定した結果を示した図である。(G1:陰性対照群(滅菌注射用水)、n=10;G2:試験群I(HU024 20μg/匹/日)、n=10;G3:試験群I(HU024 60μg/匹/日)、n=10;G4:試験群II(HU025 20μg/匹/日)、n=10;G5:試験群II(HU025 60μg/匹/日)、n=10;G6:試験群III(HU026 20μg/匹/日)、n=10;G7:試験群III(HU026 60μg/匹/日)、n=10;G8:試験群IV(HU027 20μg/匹/日)、n=10;G9:試験群IV(HU027 60μg/匹/日)、n=10;G10:陽性対照群(マイノキシル3%)、n=10)。 眼圧上昇の動物モデルに試料1〜5を投与し、眼圧の変化を測定した結果を示した図である。Nor:正常のマウス;Microbead:眼圧上昇動物モデル;試料1:タフルプロスト+HU024(20μg/ml);試料2:HU024(20μg/ml);試料3:HU025(20μg/ml);試料4:HU026(20μg/ml);試料5:HU027(20μg/ml);Pos Cont:タフルプロスト。 眼圧上昇の動物モデルに試料1〜5を投与し、視神経細胞の変化を測定した結果を示した図である。Control:正常のマウス;Microbead:眼圧上昇動物モデル;試料1:タフルプロスト+HU024(20μg/ml);試料2:HU024(20μg/ml);試料3:HU025(20μg/ml);試料4:HU026(20μg/ml);試料5:HU027(20μg/ml);(+)Control:タフルプロスト。
以下、本発明を詳しく説明する。
本発明は、RGDモチーフ(Arg−Gly−Asp motif)を含む特定配列及び構造のペプチドを投与すれば、コラーゲンの生成を促進し、火傷治療、緑内障治療、発毛促進及び皮膚のしわ改善に効果的であることを確認した。
本発明による組成物には、RGDモチーフを含む配列番号1のアミノ酸配列からなるペプチドまたはその断片を含む。
前記配列番号1のアミノ酸配列からなるペプチドは、RGDアミノ酸を含み、58個のアミノ酸からなり、該当のペプチド内においてシステイン間の二硫化結合が形成できるため、選択的に断片内におけるシステイン間の二硫化結合がないか、1個以上の二硫化結合が形成されたペプチドを意味し得る。望ましくは、前記配列番号1のアミノ酸配列からなるペプチドは、ADAMメタロペプチダーゼドメイン15(ADAM metallopeptidase domain 15;ADAM 15)(GenBank accession no.AAH14566.1)の452〜509番目のアミノ酸からなるポリペプチドであり得る。例えば、前記配列番号1のアミノ酸配列からなるペプチドはHU022であり得、前記HU022はペプチド内のシステイン間の二硫化結合は含まない。
前記配列番号1のアミノ酸配列からなるペプチドの断片は、RGDモチーフを含む3個以上のアミノ酸からなる断片であり得る。望ましく、RGDモチーフを含む5〜45個のアミノ酸からなり得る。より望ましくは、RGDモチーフを含む9個、12個または15個のアミノ酸からなり得る。RGDモチーフは、前記配列番号1のアミノ酸配列のうち、33、34、35番目のアミノ酸である。前記配列番号1のアミノ酸配列からなるペプチドの断片は、前記RGDモチーフ、即ち、前記配列番号1の33、34、35番目のアミノ酸を含めばよく、必ずしもRGDモチーフと連続したアミノ酸を含むことに制限されない。前記配列番号1のアミノ酸配列からなるペプチドの断片は、該当の断片に含まれているシステイン間の二硫化結合を含むことができる。前記該当の断片に含まれているシステイン間の二硫化結合は、該当の断片内の一つのシステインと、該当の断片外の一つのシステインとの二硫化結合とは区別される。該当の断片に含まれているシステイン間の二硫化結合は、該当の断片に含まれているシステインの個数によって0個以上の二硫化結合を含むことができ、選択的に二硫化結合がないか、1個以上の二硫化結合を含むことができ、望ましくは、二硫化結合がないか、3個以下の二硫化結合を含むことができる。
望ましくは、前記配列番号1のアミノ酸配列からなるペプチドの断片は、以下のいずれか一種であり得る。
1)配列番号1のアミノ酸配列の、RGDモチーフを含む5〜45個のアミノ酸からなり、選択的に断片内のシステイン間の二硫化結合がないか、3個以下の二硫化結合が形成されたことを特徴とする断片;
2)配列番号1のアミノ酸配列のうち、30〜38番目のアミノ酸を含み、選択的に断片内のシステイン間の二硫化結合がないか、1個以上の二硫化結合が形成されたことを特徴とする断片;
3)配列番号1のアミノ酸配列のうち、32〜43番目のアミノ酸を含み、選択的に断片内のシステイン間の二硫化結合がないか、1個以上の二硫化結合が形成されたことを特徴とする断片;
4)配列番号1のアミノ酸配列のうち、30〜44番目のアミノ酸を含み、選択的に断片内のシステイン間の二硫化結合がないか、1個以上の二硫化結合が形成されたことを特徴とする断片;
5)配列番号1のアミノ酸配列のうち、18〜54番目のアミノ酸を含み、選択的に断片内のシステイン間の二硫化結合がないか、1個以上の二硫化結合が形成されたことを特徴とする断片;及び
6)配列番号1のアミノ酸配列のうち、10〜54番目のアミノ酸を含み、選択的に断片内のシステイン間の二硫化結合がないか、1個以上の二硫化結合が形成されたことを特徴とする断片。
これらの断片は、前記2)〜6)で特定したアミノ酸を含み、58個以下のアミノ酸配列からなり、該当の断片に含まれているシステイン間の二硫化結合を含むことができる。該当の断片に含まれているシステインの個数に応じて0個以上の二硫化結合を含むことができ、望ましくは、0個以上3個以下の二硫化結合を含むことができる。
より望ましくは、前記配列番号1のアミノ酸配列からなるペプチドの断片は、以下のいずれか一種であり得る。
1)配列番号1のアミノ酸配列の、RGDモチーフ含む9個、12個または15個のアミノ酸からなり、選択的に断片内のシステイン間の二硫化結合がないか、3個以下の二硫化結合が形成されたことを特徴とする断片;
2)配列番号1のアミノ酸配列のうち、30〜38番目のアミノ酸からなることを特徴とする断片;
3)配列番号1のアミノ酸配列のうち、32〜43番目のアミノ酸からなり、36番目のシステインと42番目のシステインとの間に二硫化結合が形成されることを特徴とする断片;
4)配列番号1のアミノ酸配列のうち、30〜44番目のアミノ酸からなり、断片内のシステイン間の二硫化結合がないことを特徴とする断片;または
5)配列番号1のアミノ酸配列のうち、30〜44番目のアミノ酸からなり、断片内のシステイン間に1個の二硫化結合が形成されることを特徴とする断片。
前記2)の断片は、本発明の具体的な実施例によれば、HU027であり得、これは配列番号5である。
前記3)の断片は、本発明の具体的な実施例によれば、HU026であり得、これは配列番号4である。
前記4)の断片は、本発明の具体的な実施例によれば、HU025であり得、これは配列番号3である。
前記5)の断片は、本発明の具体的な実施例によれば、HU024であり得、これは配列番号2である。
本発明による「ペプチドまたはその断片」は、これらの薬学的に許容可能な誘導体を包括して定義され、薬学的に許容可能な誘導体は、本発明によるペプチドまたは断片と等しい生物学的機能及び/または活性を有するか、提供することと認識されるべきであり、本発明の目的を害しない以上、本発明によるペプチドまたは断片の薬学的に許容可能な塩を含み得る。
前記「薬学的に許容可能な塩」とは、前記化合物の、所望の生物学的及び/または生理学的活性を保有し、希望しない毒物学的効果は最小限にした全ての塩を意味する。塩としては、薬学的に許容可能な遊離酸によって形成された酸付加塩が有用である。酸付加塩は、通常の方法、例えば、化合物を過量の酸水溶液に溶解させ、この塩を水混和性有機溶媒、例えば、メタノール、エタノール、アセトンまたはアセトニトリルを用いて沈殿させて製造する。同モル量の化合物及び水中の酸またはアルコール(例えば、グリコールモノメチルエーテル)を加熱し、続いて前記混合物を蒸発させて乾燥させるか、または析出した塩を吸引ろ過することができる。この際、遊離酸としては、無機酸及び有機酸を用いることができ、無機酸には、塩酸、臭化水素酸、リン酸、窒酸、硫酸、スズ酸などが挙げられ、有機酸には、メタンスルホン酸、p−トルエンスルホン酸、アセト酸、トリフルオロアセト酸、マレイン酸、コハク酸、シュウ酸、安息香酸、酒石酸、フマル酸、マンデル酸、プロピオン酸、クエン酸、乳酸、グリコール酸、グルコン酸、ガラクツロン酸、グルタミン酸、グルタル酸、グルクロン酸、アスパラギン酸、アスコルビン酸、カルボン酸、バニリン酸、ヨウ化水素酸などが挙げられるが、これらに制限されない。また、塩基を用いて薬学的に許容可能な金属塩を形成することができる。アルカリ金属またはアルカリ土類金属塩は、例えば、化合物を過量のアルカリ金属水酸化物またはアルカリ土類金属水酸化物溶液中に溶解させ、非溶解化合物塩をろ過した後、余液を蒸発、乾燥することで得る。ここで、金属塩としては、特に、ナトリウム、カリウムまたはカルシウム塩を製造することが製薬上望ましいが、これに制限されることではない。また、これに対応する銀塩は、アルカリ金属またはアルカリ土類金属塩を適当な銀塩(例えば、窒酸銀)と反応させることで得ることができる。本発明によるペプチドまたはその断片は、特に示さない限り、本発明によるペプチドまたは断片に存在し得る酸性または塩基性基の塩をほとんど含む。例えば、薬学的に許容可能な塩としては、ヒドロキシ基のナトリウム、カルシウム及びカリウム塩などが含まれ得、アミノ基のその他薬学的に許容可能な塩としては、臭化水素酸塩、硫酸塩、水素硫酸塩、リン酸塩、水素リン酸塩、二水素リン酸塩、アセテート、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、乳酸塩、マンデル酸塩、メタンスルホン酸塩(メチレート)及びp−トルエンスルホン酸塩(トシレート)などがあり、当業界で知られた塩の製造方法により製造され得る。
本発明によるペプチドまたはその断片は、当分野における公知の多様な方法によって製造することができ、望ましくは、たんぱく質合成法によって製造することができる(Merrifield,R.B.,J.Am.chem.Soc.85:2149,1963)。
本発明によるペプチドまたはその断片は、以下のいずれか一つ以上の効果を発揮する。
火傷治療;
緑内障治療;
皮膚のしわ改善;または
脱毛防止、頭皮改善または発毛及び育毛促進。
また、本発明によるペプチドまたはその断片は、医薬組成物または化粧料組成物の形態で提供され得、前記医薬組成物及び化粧料組成物を総括し、以下、「本発明による組成物」ともする。
本発明において、「促進」、「改善」または「治療」とは、本発明による組成物の投与によって症状が好転するか、良子に変わる全ての行為を意味する。また、「防止」とは、本発明による組成物の投与によって症状が抑制されるか、発病が遅延する全ての行為を意味する。
前記効果別の望ましい本発明によるペプチドまたはその断片は、以下のようである。
火傷治療
本発明において、「火傷」とは、高温の気体、液体、固体または火炎などに皮膚が触れることにより発生する損傷を意味し、やけどした広さ、深さ、火傷を誘発した物体の温度と接触時間、皮膚状態などによって多様な症状及び合併症が発生し得る。火傷の重症度によって、表皮、真皮及び/または下皮が損傷し、皮膚付属器官である毛嚢、汗腺、皮脂腺などが損傷し、皮膚層の下に位置する脂肪層、靭帯、筋膜、筋肉、骨組織などまで損傷し得る。また、痂皮、紅斑、痛症、浮腫み、水疱、灼熱感などが伴われ得る。
本発明による火傷治療用組成物には、RGDモチーフ(Arg−Gly−Asp motif)を含む配列番号1のアミノ酸配列からなるペプチドまたはその断片を含む。最も望ましくは、配列番号1のアミノ酸配列からなる二硫化結合を含まないペプチドを含むことができる。
緑内障治療
本発明において、「緑内障」とは、視神経萎縮症の形態を帯びながら、網膜神経叢細胞を含んで視神経に生じる疾患の総称である。緑内障の症状には、眼圧上昇、視野変化、角膜浮腫、羞明、流涙、まぶた痙攣、散瞳、頭痛、嘔吐、充血、視力減退、眼球のひどい痛症などがある。
本発明による緑内障治療用組成物には、RGDモチーフを含む配列番号1のアミノ酸配列からなるペプチドまたはその断片を含む。
望ましくは、本発明による緑内障治療用組成物には、RGDモチーフを含む配列番号1のアミノ酸配列からなるペプチド断片が含まれ得る。
前記RGDモチーフを含む配列番号1のアミノ酸配列からなるペプチド断片は望ましくは以下のようである。
1)配列番号1のアミノ酸配列の、RGDモチーフを含む5〜45個のアミノ酸からなり、選択的に断片内のシステイン間の二硫化結合がないか、3個以下の二硫化結合が形成されたことを特徴とする断片;
2)配列番号1のアミノ酸配列のうち、30〜38番目のアミノ酸を含み、選択的に断片内のシステイン間の二硫化結合がないか、1個以上の二硫化結合が形成されたことを特徴とする断片;
3)配列番号1のアミノ酸配列のうち、32〜43番目のアミノ酸を含み、選択的に断片内のシステイン間の二硫化結合がないか、1個以上の二硫化結合が形成されたことを特徴とする断片;
4)配列番号1のアミノ酸配列のうち、30〜44番目のアミノ酸を含み、選択的に断片内のシステイン間の二硫化結合がないか、1個以上の二硫化結合が形成されたことを特徴とする断片;
5)配列番号1のアミノ酸配列のうち、18〜54番目のアミノ酸を含み、選択的に断片内のシステイン間の二硫化結合がないか、1個以上の二硫化結合が形成されたことを特徴とする断片;及び
6)配列番号1のアミノ酸配列のうち、10〜54番目のアミノ酸を含み、選択的に断片内のシステイン間の二硫化結合がないか、1個以上の二硫化結合が形成されたことを特徴とする断片。
より望ましくは、前記配列番号1のアミノ酸配列からなるペプチドの断片は以下のいずれか一種であり得る。
1)配列番号1のアミノ酸配列の、RGDモチーフ含む9個、12個または15個のアミノ酸からなり、選択的に断片内のシステイン間の二硫化結合がないか、3個以下の二硫化結合が形成されたことを特徴とする断片;または、
4)配列番号1のアミノ酸配列のうち、30〜44番目のアミノ酸からなり、断片内の二硫化結合がないことを特徴とする断片。
前記4)の断片は、本発明の具体的な実施例によれば、HU025であり得、これは配列番号3である。
皮膚のしわ改善
本発明において、「皮膚のしわ」とは、皮膚変性、弾力減少などによって皮膚が老化して弛むことで生成されるものを意味する。
本発明による皮膚のしわ改善用組成物には、RGDモチーフを含む配列番号1のアミノ酸配列からなるペプチドまたはその断片を含む。
望ましくは、本発明による皮膚のしわ改善用組成物には、配列番号1のアミノ酸配列からなるペプチド内のシステイン間の二硫化結合が形成されていないペプチドを含むことができる。
または、望ましく、本発明による皮膚のしわ改善用組成物には、RGDモチーフを含む配列番号1のアミノ酸配列からなるペプチド断片が含まれ得る。
前記RGDモチーフを含む配列番号1のアミノ酸配列からなるペプチド断片は、望ましくは以下のようである。
1)配列番号1のアミノ酸配列の、RGDモチーフを含む5〜45個のアミノ酸からなり、選択的に断片内のシステイン間の二硫化結合がないか、3個以下の二硫化結合が形成されたことを特徴とする断片;
2)配列番号1のアミノ酸配列のうち、30〜38番目のアミノ酸を含み、選択的に断片内のシステイン間の二硫化結合がないか、1個以上の二硫化結合が形成されたことを特徴とする断片;
3)配列番号1のアミノ酸配列のうち、32〜43番目のアミノ酸を含み、選択的に断片内のシステイン間の二硫化結合がないか、1個以上の二硫化結合が形成されたことを特徴とする断片;
4)配列番号1のアミノ酸配列のうち、30〜44番目のアミノ酸を含み、選択的に断片内のシステイン間の二硫化結合がないか、1個以上の二硫化結合が形成されたことを特徴とする断片;
5)配列番号1のアミノ酸配列のうち、18〜54番目のアミノ酸を含み、選択的に断片内のシステイン間の二硫化結合がないか、1個以上の二硫化結合が形成されたことを特徴とする断片;及び
6)配列番号1のアミノ酸配列のうち、10〜54番目のアミノ酸を含み、選択的に断片内のシステイン間の二硫化結合がないか、1個以上の二硫化結合が形成されたことを特徴とする断片。
さらに望ましくは、前記配列番号1のアミノ酸配列からなるペプチドの断片は、以下のいずれか一種であることができる。
1)配列番号1のアミノ酸配列の、RGDモチーフ含む9個、12個または15個のアミノ酸からなり、選択的に断片内のシステイン間の二硫化結合がないか、3個以下の二硫化結合が形成されたことを特徴とする断片;または
5)配列番号1のアミノ酸配列のうち、30〜44番目のアミノ酸からなり、断片内のシステイン間の1個の二硫化結合が形成されたことを特徴とする断片。
前記5)の断片は、本発明の具体的な実施例によれば、HU024であり得、これは配列番号2である。
脱毛防止、頭皮改善または発毛及び育毛の促進
本発明において、「脱毛(Alopeciaまたはhair loss)」は、毛根が小さくなることで毛髪の太さが薄くなり、究極に、正常に毛髪が存在すべき部位に毛髪が消失する状態を意味する。このような脱毛を誘発する原因としては、遺伝的な要素、性ホルモンであるテストステロンの過多分泌、毛嚢の血流量低下、皮脂の過多分泌、ストレス、不均衡的な食生活、大気汚染、過多な紫外線露出などがあり、主に色々な要因が複合的に作用する。
また、本発明において、「頭皮」とは、皮膚(Skin)、結合組織(Connective tissue)、腱膜(Aponeurosis)、疎性結合組織(Loose connective tissue)、頭蓋骨膜(Pericranium)の5つの層から構成され、頭皮を構成する主要構造物には毛髪が含まれる。
本発明による脱毛防止、頭皮改善または発毛及び育毛促進用組成物には、RGDモチーフを含む配列番号1のアミノ酸配列からなるペプチドまたはその断片を含む。
望ましくは、本発明による緑内障治療用組成物には、RGDモチーフを含む配列番号1のアミノ酸配列からなるペプチド断片が含まれ得る。
前記RGDモチーフを含む配列番号1のアミノ酸配列からなるペプチド断片は、望ましくは以下のようである。
1)配列番号1のアミノ酸配列の、RGDモチーフを含む5〜45個のアミノ酸からなり、選択的に断片内のシステイン間の二硫化結合がないか、3個以下の二硫化結合が形成されたことを特徴とする断片;
2)配列番号1のアミノ酸配列のうち、30〜38番目のアミノ酸を含み、選択的に断片内のシステイン間の二硫化結合がないか、1個以上の二硫化結合が形成されたことを特徴とする断片;
3)配列番号1のアミノ酸配列のうち、32〜43番目のアミノ酸を含み、選択的に断片内のシステイン間の二硫化結合がないか、1個以上の二硫化結合が形成されたことを特徴とする断片;
4)配列番号1のアミノ酸配列のうち、30〜44番目のアミノ酸を含み、選択的に断片内のシステイン間の二硫化結合がないか、1個以上の二硫化結合が形成されたことを特徴とする断片;
5)配列番号1のアミノ酸配列のうち、18〜54番目のアミノ酸を含み、選択的に断片内のシステイン間の二硫化結合がないか、1個以上の二硫化結合が形成されたことを特徴とする断片;及び
6)配列番号1のアミノ酸配列のうち、10〜54番目のアミノ酸を含み、選択的に断片内のシステイン間の二硫化結合がないか、1個以上の二硫化結合が形成されたことを特徴とする断片。
より望ましくは、前記配列番号1のアミノ酸配列からなるペプチドの断片は、以下のいずれか一種であり得る。
1)配列番号1のアミノ酸配列の、RGDモチーフ含む9個、12個または15個のアミノ酸からなり、選択的に断片内のシステイン間の二硫化結合がないか、3個以下の二硫化結合が形成されたことを特徴とする断片と、
2)配列番号1のアミノ酸配列のうち、30〜38番目のアミノ酸からなることを特徴とする断片;
3)配列番号1のアミノ酸配列のうち、32〜43番目のアミノ酸からなり、36番目のシステインと42番目のシステインとの間に二硫化結合が形成されることを特徴とする断片;
4)配列番号1のアミノ酸配列のうち、30〜44番目のアミノ酸からなり、断片内のシステイン間の二硫化結合がないことを特徴とする断片;または
5)配列番号1のアミノ酸配列のうち、30〜44番目のアミノ酸からなり、断片内のシステイン間の1個の二硫化結合が形成されることを特徴とする断片。
前記2)の断片は、本発明の具体的な実施例によれば、HU027であり得、これは配列番号5である。
前記3)の断片は、本発明の具体的な実施例によれば、HU026であり得、これは配列番号4である。
前記4)の断片は、本発明の具体的な実施例によれば、HU025であり得、これは配列番号3である。
前記5)の断片は、本発明の具体的な実施例によれば、HU024であり得、これは配列番号2である。
本発明による組成物は、薬学的組成物または化粧料組成物の形態に製造できる。このような薬学的組成物または化粧料組成物は、薬学的に(または化粧学的に)許容される賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、湿潤剤、乳化剤または懸濁化剤などを含み得る。本発明による組成物は、単独またはいかなる便利な運搬剤、賦形剤などとともに混合して使用可能であり、そのような使用剤形は、単回投与または反復投与剤形であり得る。
本発明による組成物は、臨床投与時、非経口投与が可能である。
本発明による組成物は、固形製剤、半固形剤または液状製剤であり得る。固形製剤としては、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、坐剤などがあるが、これらに限定されることではない。固形製剤には、賦形剤、着香剤、結合剤、防腐剤、崩壊剤、滑沢剤、充填剤などが含まれ得るが、これらに限定されることではない。半固形製剤としては、クリーム剤、ローション剤、乳化剤、リニメント剤などがあるが、これらに限定されず、適当な着色剤、着香剤、安定化剤、粘性化剤、界面活性剤などを添加して製造することができる。液状製剤としては、水、アルコール、プロピレングリコール溶液のような溶液剤、懸濁液剤、油剤などがあるが、これらに限定されず、適当な着色剤、着香剤、安定化剤、粘性化剤などを添加して製造することができる。例えば、散剤は、本発明の有効成分と、乳糖、でん粉、微結晶セルロースなど、薬剤学的に許容される適当な賦形剤とを単純混合することで製造することができる。顆粒剤は、本発明の有効成分;薬剤学的に許容される適当な賦形剤;及びポリビニールピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロースなどの薬剤学的に許容される適当な結合剤を混合した後、水、エタノール、イソプロパノールなどの溶媒を用いた湿式顆粒法または圧縮力を用いた乾式顆粒法を用いて製造できる。また、錠剤は、前記顆粒剤をマグネシウムステアレートなどの薬剤学的に許容される適当な滑沢剤と混合した後、打錠機を用いて打錠することで製造することができる。また、例えば、皮膚外用剤は、バセリン、ステアリルアルコールなどの薬剤学的に許容される適当な基剤;ポリソルベート、ソルビタンセスキオレートなどの薬剤学的に許容される適当な界面活性剤;グリセリンなどの薬剤学的に許容される適当な保湿剤;薬剤学的に許容される適当な溶剤;及び着香剤、着色剤、安定化剤、粘性化剤などを均質に混合する通常の皮膚外用剤の製造方法によって製造することができる。
本発明による組成物において、本発明によるペプチドまたはその断片の含量は、組成物全体重量に対し0.01〜10重量%であることが望ましい。0.01重量%未満の場合、目的とする効果(皮膚のしわ、火傷、緑内障及び脱毛など)が充分発揮できず、10重量%超過の場合、産業上の利用可能性面でペプチドの合成費用を考慮すれば、経済的競争力が弱いだけでなく、免疫原性(immunogenicity)を誘発して初期活性を有するが、反復投与時、抗体形成による効力減衰を誘発し得る。
本発明による化粧料組成物は、基礎化粧用またはメイクアップ用製品類である化粧水類、エッセンス類、オイル類、クリーム類、パウダー類、パック類、ファンデーション類、メークアップベース類、スティック類などの剤形で製造されて用いられ得る。また、このような化粧料組成物は、液状、クリーム状、ペースト状、固体状などの多様な性状に適用可能であり、通常の化粧料製造法により製造できる。例えば、本発明の組成物は、カーボマー、ブチレングリコール、グリセリン、PEG、エタノール、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、トリエタノールアミン、精製水などを用いて柔軟化粧水として製造でき、または、セテアリルアルコール、グリセリルステアレート/PEG−100ステアレート、ポリソルベート60、ソルビタンセスキオレエート、セチルオクタノエート、スクアラン、アプリコットカーネルオイル、ブチレングリコール、カーボマー、キサンタンガム、防腐剤、精製水、アルギニンなどの成分を用いてローションタイプに製造できるが、本発明はかかる剤形に限定されない。
本発明による薬学的組成物は、本発明が属する技術分野における公知の通常の方法によって、軟膏、クリーム、ゲル、フィルム剤、錠剤、カプセル、顆粒剤、懸濁液、またはシロップなどの多様な剤形に剤形化して使用可能である。
本発明による薬学的組成物の薬学的有効量、有効投与量は、薬学的組成物の製剤化方法、投与方式、投与時間及び/または投与経路などによって変わり得る。また、前記医薬組成物の投与によって達成しようとする反応の種類と程度、投与対象となる個体の種類、年齢、体重、一般的な健康状態、疾病の症状や程度、性別、食餌、排泄、該当個体に同時または異時にともに用いられる薬物、その他の組成物の成分などを含め、多くの因子及び医薬分野においてよく知らている類似因子によって変わり得る。当該技術分野における通常の知識を有する者は、目的とする治療に効果的な投与量を容易に決定して処方することができる。本発明による医薬組成物の投与は、一日に1回投与され得、数回に分けて投与され得る。したがって、前記投与量は、いかなる面においても本発明の範囲を限定しない。本発明による薬学的組成物の望ましい投与量は、1日に0.01mg/kg〜10mg/kgであり得る。
本発明による組成物は、本発明によるペプチドまたはその断片の他に、本発明が目的とする主な効果を損じない範囲内において、望ましくは、主な効果に相乗効果を与える他の成分などを含んでもよい。
例えば、本発明の組成物が脱毛防止のために用いられる場合、毛髪の特性を考慮して付加的な機能付与のために、ふけ防止剤、毛根強化剤、毛髪補修剤、頭皮保護剤、清凉剤などの補助成分を添加してもよい。これらの通常の発毛及び育毛用組成物に配合される防止剤、毛根強化剤、毛髪補修剤、頭皮保護剤、清凉剤などの補助成分は、通常のものを用いることができるが、これらに限定されない。
以下、本発明を具体的な実施例を挙げて説明する。しかし、本発明による実施例は本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲が後述する実施例に限定されないことは、当業界における通常の知識を有する者にとって自明である。
実施例1.ペプチドの合成
ADAMメタロペプチダーゼドメイン15(ADAM metallopeptidase domain 15, ADAM15)(GenBank accession no.AAH14566.1)の452〜509番目のアミノ酸からなるポリペプチドをHU022(配列番号1)とし、これはディスインテグリン(disintegrin)の一部を含む。
また、ADAM15たんぱく質(NCBI Reference Sequence:NM_001261464)のディスインテグリン部分のうち、RGDモチーブを中心でペプチドを構成し、RGDモチーブを中心で3次的構造で主な役割を果すシステイン(cysteine)を含み、これらのシステイン間の二硫化(disulfide)結合が形成されるようにデザインすることで総15個のアミノ酸から構成されたペプチドを製作し、これをHU024とした(配列番号2)。
また、HU024と等しいアミノ酸配列を有するが、二硫化結合を含まないように構成されたペプチドを製作し、これをHU025とした(配列番号3)。
また、追加的に、ADAM15たんぱく質のディスインテグリン部分のうち、RGDモチーブを中心でペプチドを構成し、かつより小さいサイズのペプチドを製作し、総12個のアミノ酸から構成されたペプチドをHU026とし(配列番号4)、そして総9個のアミノ酸から構成されたペプチドをHU027とした(配列番号5)。
以下、これらのペプチドの製作方法をより詳しく説明する。
本発明のRGDモチーフを含む新規ペプチドの合成のために、固相ペプチド合成法(solid−phase method)を用いた(Merrifield,R.B.,J.Am.Chem.Soc.85:2149,1963)。合成しようとする目的のペプチドHU024、HU025、HU026、HU027は、Fmoc chemistryを用いてリンクアミドMBHA樹脂(Rink amide MBHA resin)を合成し、ここに用いられたアミノ酸は、N−末端と測鎖部分が9−フルオレニルメトキシカルボニル基(9−fluorenylmethoxycarbonyl group)により保護されているものを用い、合成時に用いられるアミノ酸の量は、レジンの量0.1mmolを基準で3当量である0.3mmolを用いた。各段階別のカップリング時、C−末端の活性化試薬(activation reagent)として、DIC(N,N’−Diisoprpyl Cabodiimide)とのラセミ化(racemization)を防ぐための試薬としてCl−HOBt(6−Chloro−1−hydroxybenzotriazole)を用いてそれぞれの配列に合わせて順次添加して反応させ、前記ペプチドのFmoc基を除去するために50%ピペリジン/DMF(50/50,v/v)溶液を常温で10〜20分間処理することで除去した。ペプチド合成が完了した後、固相から分離して測鎖の脱保護(deprotection)のためにTFA(Trifluoroacetic acid)/水(9.5/0.5,v/v)の混合溶液を常温で2時間処理した。ペプチド内の二硫化結合の形成のために高希釈(High dilution)の空気酸化(air oxidation)方法を用いて分子内のS−S結合を形成した。ここで、反応を加速化するために触媒量のDMSOを用いた。
前記合成されたペプチドを逆相のC18カラムを用いてHPLCで分離し、分析用HPLCで95%以上の純度を確認し、それぞれのペプチド分子量をMALDI−TOF(matrix−associatied laser desorption ionization)質量分析法で測定した結果、測定値と一致した(図1、図2、図3及び図4)。
合成されたポリペプチドの構成、アミノ酸配列及び特徴を表1に示した。
併せて、目的のペプチドHU022は、商業的に製造された市販のもの(EYEGENE Inc.)を用いた。
実施例2.火傷治療効果
雄SD(Sprague−Dawley)ラット55匹を5群に分け、正常群5匹(1群、G1)、陰性対照群9〜10匹(1群、G2)、試験群30匹(10匹ずつ3群、G3、G4、G5)、及び陽性対照群9〜10匹(1群、G6)に分けて実験を行った。正常群を除いた残りの群では火傷誘発の雄SDラットを実験対象として用い、SDラットを麻酔した後、アルミ電気ごてで直径2cmの2度火傷を誘発した。
火傷誘発の雄SDラットに試験物質HU022(G3、G4、G5)、生理食塩水(G2)及びフィブラスト(Fiblast)(G6)を、1日1回、1週に7回、7日間繰り返して皮膚に塗布した。対照群(G6)には、フィブラスト10μg/回/匹塗布し、試験群は、3群に分けて各群に3.3μg/回/匹(G3)、10μg/回/匹(G4)、30μg/回/匹(G5)塗布した。
火傷誘発後、試験物質の塗布前に写真撮影を行い、1、4、8、11、15日目に写真撮影を行い、写真撮影後、試験物質を塗布して塗布部位をガーゼで覆った後テガダーム(tegaderm、登録商標)で巻いた。また、火傷面積の測定のために撮影した写真を画像分析プログラムを用いて分析した。
火傷誘発後14日目に、火傷を誘発した部位を真皮部位まで摘出して10%中性緩衝ホルマリン溶液に固定した後、H&E染色により組織病理学的検査を行った。皮膚組織は、光学顕微鏡(Olympus BX41、Olympus、Japan)で観察し、表皮(epidermis)、真皮(dermis)、下皮(hypodermis)及び皮下筋肉(muscle)における火傷治療に係わる組織学的変化を、次の6項目について分析した;
1)痂皮(Eschar)、(0;なし、1+;微弱、2+;中程度、3+;ひどい、4+;非常にひどい)
2)炎症細胞浸潤(Infiltration of inflammatory cells)、(0;なし、1+;上皮浸潤、2+;真皮浸潤、3+;下皮浸潤、4+;筋肉浸潤)
3)血管形成(Angiogenesis)(400倍率でランダムで3ヶ所を選定して観察される全ての血管の個数を数えて平均値を求めた)
4)皮膚付属器官再生(Pilosebaceous)、(0;なし、1+;再生程度が微弱、2+;再生が複数の箇所で観察される、3+;付属器官の再生が形態は正常であるが、正常に比べて数が足りない場合、4+;正常群に等しい水準)
5)結合組織増殖(Fibroplasia)(0;正常群水準、1+;真皮または下皮の一部でのみ観察される、2+;真皮及び下皮で観察される、3+;真皮及び下皮で広範囲に観察される、4+;火傷部位の全領域で観察される)
6)上皮再生(Epidermal regeneration)(0;再生が観察されない、1+;一部で基底細胞の一層として観察される、2+;基底細胞が列をなして観察される、3+;損傷した皮膚の多くの箇所で基底細胞が一層または多層として観察され、有棘層または顆粒層に区分される場合、4+;正常群の上皮構造)で評価した後、群ごとに平均値を計算した。
測定結果において、母数的な比較は、スチューデントt検定(Student’s t−test)及び一元配置分散分析(One−Way ANOVA)によって有意性を確認し、陰性対照群との有意性を検定した。また、火傷の組織病理学的検査結果は、クラスカル・ウォリスH検定(Kruskal−Wallis’H−test)を行い、群間有意性が認められれば、マン・ホイットニーU検定(Mann−Whitney U−test)によって群間比較を行った。統計のための電算プログラムとしては、SPSS 10.1 Kを用いた。P<0.05である場合、統計学的に有意であると判定した。
その結果、試験物質塗布による特別な異常症状は観察されず、正常群に比べて火傷誘発群において8日目(Day8)に統計学的に有意な体重減少が観察されたが(P<0.01)、火傷誘発によることと判断した(表2及び図5)。
火傷面積の測定結果、面積絶対値の比較においては、陰性対照群に比べて全ての試験群から統計学的に有意な変化は観察されなかった(表3及び図6)。火傷面積減少率(%)を比べた結果、試験物質30μg/匹/日群(G5)が、陰性対照群に比べて4日目において統計学的に有意な面積減少が観察され(P<0.05)、残りの試験物質投与群では差が観察されなかった(表4及び図7)。
組織病理学的検査結果は、以下のようである(表5、図8、図9及び図10):
1)痂皮(Eschar)
火傷で損傷した皮膚上皮には、繊維素、白血球、凝固した滲出液及び壊死組織がともに凝固して痂皮を形成する。痂皮形成の程度を5段階(0〜4点)で評価した。正常群G1では痂皮が観察されない正常の皮膚組織であった。陰性対照群(G2)及び試験物質3.3μg/匹/日投与群(G3)では、平均4.0±0.0及び4.0±0.0点であって、厚く形成された痂皮が火傷が誘発した全体部位で観察され、「非常にひどい」と評価した。試験物質10μg/匹/日投与群(G4)は、3.2±0.6点であって、火傷誘発部位の全体面積の約80%水準で痂皮が観察され、試験物質30μg/匹/日投与群(G5)及び陽性対照群(G6)は、2.7±0.7及び2.6±0.5点であって痂皮形成が減少した。また、試験物質10μg/匹/日投与群(G4)、30μg/匹/日投与群(G5)及び陽性対照群(G6)では、痂皮形成が減少したことに加え、痂皮の厚さも減少したことが観察され、統計学的分析結果、陰性対照群(G2)に比べて有意性があると確認された(P<0.01)。
2)炎症細胞浸潤(Infiltration of inflammatory cells)
火傷誘発後、急性炎症反応が起き、この際、リンパ球と好中球の浸潤が主に観察される。炎症細胞浸潤の程度を5段階(0〜4点)で評価した。正常群(G1)では、炎症細胞浸潤が観察されない正常組織であった。陰性対照群(G2)、全ての試験物質投与群(G3、G4、G5)及び陽性対照群(G6)は、上皮、真皮及び下皮層でリンパ球、好中球及び単球などの炎症細胞の浸潤が観察され、各群間の差はなかった。
3)皮膚付属器官再生(Pilosebaceous)
真皮層に位置している毛嚢、汗腺、皮脂腺などのような皮膚付属器官の火傷後の再生程度は、上皮再生と共に皮膚再生程度を判断する重要な基準となる。皮膚付属器官は上皮細胞で構成されており、付属器官に位置している微分化した細胞は分化して上皮へ移動し、上皮の再生過程に参与する。皮膚付属器官の再生程度は、5段階(0〜4点)として評価した。正常群(G1)は、毛嚢及び皮脂腺などの皮膚付属器官が正常構造に観察され、4点で評価した。陰性対照群(G2)は、皮膚付属器官の再生が全く観察されないか、再生程度が非常に微々たることに観察された。試験物質10μg/匹/日投与群(G4)及び試験物質30μg/匹/日投与群(G5)では、試験物質の濃度依存的に皮膚付属器官の再生が促進する様相を示し、皮膚付属器官の再生水準が陰性対照群(G2)に比べて統計学的有意性があることが示された(P<0.05またはP<0.01)。陽性対照群(G6)においても皮膚付属器官の再生促進が観察され、統計学的には有意であった(P<0.01)。
4)結合組織増殖(Fibroplasia)
火傷誘発後、治癒過程において、線維芽細胞の増殖及びこれらの細胞から生産されるコラーゲンの増加が観察される。結合組織増殖の程度は、5段階(0〜4点)で評価した。皮膚再生とともに真皮で線維細胞の増殖及びコラーゲンの形成が緻密に行われた後、再生が終わって行きながら増殖した線維細胞と増加したコラーゲンは、徐々に減少して正常な水準に戻る。正常群(G1)は、線維芽細胞が観察されない正常組織であった。陰性対照群(G2)、全ての試験物質投与群(G3、G4、G5)と陽性対照群(G6)は、真皮及び下皮において非常に活発な線維細胞の増殖とコラーゲンの増加が観察され、各群間差はなかった。
5)上皮再生(Epidermal regeneration)
上皮細胞再生は、基底細胞の増殖が行われながら、皮膚上皮細胞に分化して損傷または脱落した上皮を再生する。表皮上皮の再生程度は、上皮形成及び基底細胞の増殖程度を観察して5段階(0〜4点)で評価した。正常群(G1)において、上皮組織は、基底層、有棘層、顆粒層及び角質層が正常に観察された。陰性対照群(G2)は、ほとんどの動物から上皮再生が全く観察されなかった。試験物質3.3μg/匹/日投与群(G3)においては、一部領域で微々たる水準の基底層細胞の再生が観察され、試験物質10μg/匹/日投与群(G4)及び30μg/匹/日投与群(G5)と陽性対照群(G6)において、より広い基底層の再生が観察されることから、陰性対照群に比べて統計学的に有意な上皮細胞の再生促進の効果があると評価された(P<0.05)。
実施例3.しわの改善効果
満30〜65歳の成人女性であって、目元にしわがある者を対象として実験を進んだ。4週間、試験製品(HU022またはHU024)と対照製品(DI−water)をランダムで割り当て、顔面の左右にそれぞれ1日2回使用し、被験者は、訪問1において、4週間使用する試験製品と対照製品を受領するとともに、製品使用前の評価及び調査を完了した。訪問2、3は、製品使用開始後2週間隔で、各訪問時には計画書に定められた各種評価及び調査に応じるようにした。
評価項目、試験方法及び結果は、以下のようである。
(1)試験製品HU022のしわ改善効果の評価
機器を用いて目元のしわの程度を測定した。しわ程度の測定対象部位は、被験者の目元部位であって、顔を半分に分けて左側と右側を測定部位にした。しわ程度の測定のために、被験者は、測定部位を水で洗った後、室内温度20〜25℃、湿度40〜60%の恒温恒湿条件の控え室で30分間安定を取って皮膚表面の温度と湿度を測定空間の環境に適応するようにし、安定を取る間の水分攝取は制限した。客観的測定のために研究者1人が測定し、製品使用前である訪問1と製品使用2、4週後である訪問2、訪問3の各測定時、同一部位を測定した。試験製品の使用前と、使用後2、4週に試験製品と対照製品を適用した部位の皮膚レプリカをVisiometer SV600(Courage−Khazaka electronic GmbH,Germany)を用いてtransparency profilometry analysisを行い、対照群と試験群のそれぞれで製品使用4週後に差があるかを検証するために、使用前に対する製品使用2週、4週後のR1、R2、R4、R5測定値の変化率を分析した。
しわ程度のパラメーターは、以下のようである。
試験製品(HU022)の使用によるR3数値の変化を確認するために、使用前、使用2週後、使用4週後のR3数値を測定した。試験製品のR3数値は、使用前が34.24±3.51、使用2週後が24.41±4.16、使用4週後が18.62±2.79で示され、対照製品のR3数値は、使用前が22.48±2.74、使用2週後が20.70±1.76、使用4週後が18.13±0.91で示され、このようなR3数値の変化をより明確に分かるように各時間帯ごとのR3変化率を計算して表した(表7、図13)。
試験製品(HU022)の使用によるR1の数値変化を確認するために、使用前、使用2週後、使用4週後のR1数値を測定した。試験製品のR1数値は、使用前が76.23±12.15、使用2週後が54.59±10.99、使用4週後が51.06±19.28で示され、対照製品のR1数値は、使用前が55.74±12.48、使用2週後が56.17±11.11、使用4週後が50.86±4.67で示された(表8、図11)。
試験製品(HU022)の使用によるR2の数値変化を確認するために、使用前、使用2週後、使用4週後のR2数値を測定した。試験製品のR2数値は、使用前が54.26±5.70、使用2週後が36.87±6.02、使用4週後が29.16±2.74で示され、対照製品のR2数値は、使用前が35.24±5.12、使用2週後が31.64±4.37、使用4週後が27.57±2.89で示された(表9、図12)。
試験製品(HU022)の使用によるR4数値の変化を確認するために、使用前、使用2週後、使用4週後のR4数値を測定した。試験製品のR4数値は、使用前が30.41±7.01、使用2週後が23.64±5.11、使用4週後が22.94±10.03で示され、対照製品のR4数値は、使用前が24.50±5.43、使用2週後が25.06±5.49、使用4週後が24.42±4.57で示された(表10、図14)。
試験製品(HU022)の使用によるR5数値の変化を確認するために、使用前、使用2週後、使用4週後のR5数値を測定した。試験製品のR5数値は、使用前が13.57±3.65、使用2週後が9.44±2.44、使用4週後が10.10±5.97で示され、対照製品のR5数値は、使用前が11.02±2.94、使用2週後が11.44±3.14、使用4週後が10.51±1.90で示された(表11、図15)。
また、3次元イメージ撮影によるしわの程度を測定した。しわ程度の測定対象部位は、被験者の目元部位であって、顔の右側を測定部位にした。しわ程度の測定のために被験者は、測定部位を水で洗った後、室内温度20〜25℃、湿度40〜60%の恒温恒湿条件の控え室で30分間安定を取って皮膚表面の温度と湿度を測定空間の環境に適応するようにし、安定を取る間の水分攝取は制限した。客観的測定のために研究者1人が測定し、製品使用前である訪問1と製品使用2、4週後である訪問2、訪問3の各測定時、同一部位を測定した。試験製品(HU022)の使用前と、使用後2、4週に試験製品(HU022)を適用した部位を、3D皮膚撮影装置(PRIMOS Premium)で撮影し、対照群と試験群のそれぞれで製品使用4週後に差があるかを検証するために、使用前に対する製品使用2週、4週後の保存されたイメージのしわパラメーターであるRa、Rmax、Rt、Rp、Rv値を分析した。
しわ程度のパラメーターは、以下のようである。
試験製品の使用によるRa数値の変化を確認するために、使用前、使用2週後、使用4週後のRa数値を測定した。
試験製品のRa数値は、使用前が19.19±4.27、使用2週後が18.20±3.94、使用4週後が17.00±3.88で示され、対照製品のRa数値は、使用前が14.86±4.48、使用2週後が14.94±4.73、使用4週後が14.60±4.58で示された(表13、図16)。
試験製品の使用によるRmax数値の変化を確認するために、使用前、使用2週後、使用4週後のRmax数値を測定した。試験製品のRmax数値は、使用前が176.29±27.79、使用2週後が168.83±29.61、使用4週後が168.80±33.21で示され、対照製品のRmax数値は、使用前が162.81±64.15、使用2週後が159.52±61.85、使用4週後が158.36±62.80で示された(表14、図17)。
試験製品の使用によるRt数値の変化を確認するために、使用前、使用2週後、使用4週後のRt数値を測定した。試験製品のRt数値は、使用前が195.05±31.31、使用2週後が187.85±34.10、使用4週後が184.63±36.83で示され、対照製品のRt数値は、使用前が174.12±68.96、使用2週後が171.13±66.76、使用4週後が169.86±65.80で示された(表15、図18)。
試験製品の使用によるRp数値の変化を確認するために、使用前、使用2週後、使用4週後のRp数値を測定した。試験製品のRp数値は、使用前が122.73±31.55、使用2週後が116.47±35.75、使用4週後が121.88±38.06で示され、対照製品のRp数値は、使用前が123.29±57.51、使用2週後が120.32±53.57、使用4週後が119.57±56.77で示された(表16、図19)。
試験製品の使用によるRv数値の変化を確認するために、使用前、使用2週後、使用4週後のRv数値を測定した。試験製品のRv数値は、使用前が72.32±17.16、使用2週後が71.38±16.44、使用4週後が62.75±11.92で示され、対照製品のRv数値は、使用前が50.83±16.13、使用2週後が50.81±16.29、使用4週後が50.29±11.75で示された(表17、図20)。
また、目視評価を行った。試験製品の使用前及び使用後の訪問時ごとに専門家がグローバルフォトデミージスコア(global photodamage score、Br J Dermatol. 2010;162(3):497−502)を用いて点数化してしわの程度を評価した。対照群と試験群の各々で製品使用4週後に差があるかを検証するために、使用前に対する製品使用2週、4週後の目視評価点数値の変化率を分析した。Visual assessment scoreは、以下のようである(表18)。
その結果、試験製品の専門家の目視評価点数は、使用前が2.17±0.75、使用2週後が2.17±0.75、使用4週後が1.67±1.03で示され、対照製品の専門家の目視評価点数は、使用前が2.33±1.03、使用2週後が2.33±1.03、使用4週後が2.33±1.03で示された(表19、図21)。
また、被験者による有効性のアンケート調査を行った。試験製品の使用後に被験者が感じるしわ改善の程度について、改善された(4)、やや改善された(3)、変化なし(2)、やや悪くなった(1)、悪くなった(0)の5段階にし、被験者本人が応答するようにした。研究者は、各答弁に対する被験者数の百分率を求めて試験製品の効能有無を判断した。
しわ改善についてのアンケートの評価結果、試験製品と対照製品とも使用4週後である訪問3でしわが改善し、特に、対照製品に比べて試験製品においてさらに高い改善度として応答した。このような結果から、本試験に参与した被験者は、試験製品のしわ改善の効能に対して優秀であると感じることに示された(表20)。
また、使用感及び嗜好度のアンケート調査を行った結果、臨床試験製品使用4週後に被験者が感じる製品の使用感について被験者が直接アンケートに応答するようにした。評価項目は、「しっとりさ、滑らかさ、伸び、吸収性、べたつき及び香り」の程度について調査し、「非常に良い、良い、普通、悪い、非常に悪い」の5段階で評価した。
調査結果、全般的に試験製品に対して肯定的な嗜好度を持っていることが確認された。特に、べたつき面で対照製品に比べて優れた嗜好度を示した(表21)。
また、順応度評価を行い、訪問2、訪問3で試験用の製品使用日誌を回収して試験製品の使用回数を確認して順応度を求めた。各訪問時、順応度において80%未満または6回以上連続使用しなかった場合は、試験参与を中止させた。その結果、試験を終了した全体順応度は100%であり、最大順応度は100.00%、最低順応度は100.00%であった。本試験において80%以下の順応度を示された被験者はいなかったため、全体被験者のデータを結果分析に使った。
また、安全性評価を行い、臨床試験製品の安全性は1回以上試験製品を用いた全ての被験者を対象として、製品使用後2週目、4週目に確認された異常反応と、試験期間中報告された全ての異常反応を総合して製品の安全性評価資料として使用した。異常反応についての報告は全くなく、皮膚科専門医による理学的検査においても、紅斑、発疹及び掻痒感などの皮膚異常所見は見られなかった。したがって、試験製品は、皮膚に刺激のない安全な製品であることが分かった。
(2)試験製品HU024のしわ改善効果の評価
評価項目及び試験方法は、試験製品HU022の評価と同様に行った。
機器を用いて目元のしわ部位を測定した後、試験製品の使用によるR3の数値変化を確認するために、使用前、使用2週後、使用4週後のR3の数値を測定した。試験製品のR3数値は、使用前が29.15±5.56、使用2週後が20.80±3.97、使用4週後が17.81±4.00で示され、対照製品のR3数値は、使用前が24.43±3.12、使用2週後が23.56±3.53、使用4週後が18.57±1.86で示された(表22、図24)。
試験製品のR1数値は、使用前が71.33±15.86、使用2週後が57.29±3.21、使用4週後が45.23±13.77で示され、対照製品のR1数値は、使用前が58.01±21.09、使用2週後が56.17±15.89、使用4週後が45.03±14.74で示された(表23、図22)。
試験製品のR2数値は、使用前が46.06±11.62、使用2週後が30.71±6.57、使用4週後が28.67±7.47で示され、対照製品のR2数値は、使用前が35.97±5.82、使用2週後が37.15±4.96、使用4週後が26.68±3.30で示された(表24、図23)。
試験製品のR4数値は、使用前が31.44±11.04、使用2週後が26.24±2.90、使用4週後が20.64±6.07で示され、対照製品のR4数値は、使用前が26.22±11.38、使用2週後が24.11±8.82、使用4週後が20.67±8.43で示された(表25、図25)。
試験製品のR5数値は、使用前が13.52±5.43、使用2週後が11.58±0.89、使用4週後が8.42±3.48で示され、対照製品のR5数値は、使用前が10.93±6.72、使用2週後が10.68±5.56、使用4週後が8.79±4.95で示された(表26、図26)。
3次元イメージ撮影によるしわの程度を測定した後、試験製品の使用によるRa数値の変化を確認するために、使用前、使用2週後、使用4週後のRa数値を測定した。
試験製品のRa数値は、使用前が18.64±3.19、使用2週後が18.33±2.12、使用4週後が17.71±2.43で示され、対照製品のRa数値は、使用前が15.49±2.77、使用2週後が15.23±2.51、使用4週後が15.53±2.46で示された(表27、図27)。
試験製品のRmax数値は、使用前が206.55±40.54、使用2週後が198.77±39.74、使用4週後が196.85±39.02で示され、対照製品のRmax数値は、使用前が162.86±35.17、使用2週後が158.09±40.68、使用4週後が165.26±39.77で示された(表28、図28)。
試験製品のRt数値は、使用前が225.94±45.00、使用2週後が216.37±41.76、使用4週後が210.60±38.61で示され、対照製品のRt数値は、使用前が174.55±34.66、使用2週後が167.65±41.28、使用4週後が176.14±39.43で示された(表29、図29)。
試験製品のRp数値は、使用前が160.85±37.51、使用2週後が155.24±43.18、使用4週後が153.78±36.12で示され、対照製品のRp数値は、使用前が118.80±39.02、使用2週後が112.77±44.16、使用4週後が123.39±42.81で示された(表30、図30)。
試験製品のRv数値は、使用前が65.09±11.95、使用2週後が61.12±8.02、使用4週後が56.82±12.01で示され、対照製品のRv数値は、使用前が55.75±17.98、使用2週後が54.87±21.72、使用4週後が52.75±15.00で示された(表31、図31)。
目視評価点数値の変化を確認するために、使用前、使用2週後、使用4週後の専門家の目視評価点数を評価した。
試験製品の専門家の目視評価点数は、使用前が2.00±0.63、使用2週後が2.00±0.63、使用4週後が1.67±0.82で示され、対照製品の専門家目視評価点数は、使用前が2.00±0.63、使用2週後が2.00±0.63、使用4週後が2.00±0.63で示された(表32、図32)。
しわ改善についてのアンケート評価結果、試験製品と対照製品とも、4週後である訪問3でしわが改善し、特に、対照製品に比べて試験製品においてさらに高い改善度で応答された。このような結果から、本試験に参与した被験者は、試験製品のしわ改善の効能に対して優秀であると感じることに示された(表33)。
試験製品のしっとりさ、滑らかさ、伸び、吸収性、べたつき、香りに対して被験者が感じる嗜好度を調査した結果、全般的に試験製品に対して肯定的な嗜好度を持っていることが確認された。特に、べたつき面で対照製品に比べて優れた嗜好度を示した(表34)。
また、本試験製品を4週間被験者が用いる間、異常反応についての報告は全くなく、皮膚科専門医による理学的検査においても、紅斑、発疹及び掻痒感などの皮膚異常所見は見られなかった。したがって、試験製品は、皮膚に刺激のない安全な製品であることが分かった。
実施例4.発毛試験効果
本試験は、試験物質HU024、HU025、HU026、HU027の4種を、14日間皮膚に塗布したとき、C57BL/6マウスの発毛に及ぶ影響を評価するために行った。
群の構成は、陰性対照群(滅菌注射用水G1)、試験物質HU024 20μg/匹/日(G2)、試験物質HU024 60μg/匹/日(G3)、試験物質HU025 20μg/匹/日(G4)、試験物質HU025 60μg/匹/日(G5)、試験物質HU026 20μg/匹/日(G6)、試験物質HU026 60μg/匹/日(G7)、試験物質HU027 20μg/匹/日(G8)、試験物質HU027 60μg/匹/日(G9)及び陽性対照群マイノキシル 3%(G10)投与群に設定した。各群当り動物は10匹で行った。
動物は、ゾレチル(1mL/kg、i.p)を用いて麻酔させた後、動物の背部位を除毛機を用いて1次除毛した後、市販のVeet除毛剤を背部位に均一に塗布した。約5分経過後、塗布部位を滅菌注射用水に濡らしたガーゼを用いてきれいに拭き取った。毛が除去された動物の背部位の皮膚色が鮮紅色である動物のみを群分離に用いた。1回/日、7回/週、14日間塗布し、毎日同一部位にガラス棒で約10回擦って除毛部位(背部位)に均一に塗布した。
試験項目としては、死亡動物、一般症状、体重変化、発毛面積及び毛重さの測定を施し、陰性対照群と比較した。
試験物質の塗布面積に対する育毛面積(%)を測定して判定し、画像分析プログラム(Imgae Pro Plus ver.6.3,Cybermetics,USA)を用いて測定した。測定は、試験物質投与後、1、3、7、10及び14日目に測定した。写真撮影は、毛面積測定日に共に行った。塗布終了翌日、動物をCOガスで計画致死後、発毛部位の毛を除毛機で除毛して毛重さを測定した。
測定結果は、SPSS(ver.10.1K)を用い、体重変化は一元配置分散分析によるダンカンt検定(Duncan t−test)を施し、毛重さはスチューデントt検定(Student’s t−test)で群間比較を行い、発毛面積は非母数的な多重比較(nonparametric multiple comparison procedures)であるマン・ホイットニー検定(Mann−Whitney methods)によって群間比較を行った。P<0.05である場合、統計学的に有意であると判定した。
試験結果は、次のようである。
体重変化に係わり、陰性対照群と比較して試験物質投与群では差が観察されなかった。但し、対照物質のマイノキシル3%投与群は、投与7日目及び11日目に陰性対照群に比べ統計学的に有意な体重増加が観察された(P<0.05またはP<0.01)。対照物質のマイノキシル3%投与群における体重増加はマイノキシルの有効成分であるミノキシジルによる副作用と判断した(表36、図33)。
発毛面積の測定結果、塗布7日目までは試験物質投与群と陰性対照群との比較においては差が観察されなかった。10日目及び14日目に、試験物質HU025 60μg/匹/日投与群(G5)において、陰性対照群と比較して統計学的に有意な発毛面積の増加が観察された(P<0.05)。試験物質HU025 20μg/匹/日投与群を除いた他の試験物質投与群においても、10日目及び14日目に陰性対照群と比較して約20%以上の発毛面積の増加が観察された。対照物質であるマイノキシル3%投与群は、陰性対照群と比較して4日目、10日目及び14日目に、統計学的に有意な発毛面積の増加が観察された(P<0.01)(表37、図34)。
毛重さの測定結果、試験物質HU026 60μg/匹/日投与群においては、陰性対照群と比較して統計学的に有意な毛重さの増加が観察された(P<0.05)。その外の試験物質投与群においては、HU025 20μg/匹/日及びHU027 20μg/匹/日投与群を除いた残りの試験物質投与群から、陰性対照群と比較して約100%以上の重さの増加が観察された。対照物質のマイノキシル3%投与群においては、陰性対照群と比較して統計学的に有意な毛重さの増加が観察された(P<0.01)(表38、図35)。
実施例5.緑内障試験の効果
対照薬としてはタフロタン点眼液(韓国参天製薬株式会社)を用い、試験薬としてはタフロタン点眼液+HU024(試料1)、HU024(試料2)、HU025(試料3)、HU026(試料4)、HU027(試料5)を用いてマイクロビードで眼圧を上昇させた緑内障動物モデルを対象として試験を行った。実験動物モデルは、ロンプン(Rompun)注射液とゾレチルを混合して実験動物を麻酔した後、眼球に局所麻酔剤であるアルカインを点眼し、マイクロガラスニードルを用いて前房(anterior chamber)に1×10microbead/mL 1μLを注入して2週間眼圧上昇を誘導した(IOVS 2011 Vol. 52 36〜)。
対照薬及び試料5種は、2週間眼圧が上昇した実験動物に提供し、試料5種を1日1回点眼して薬効を比較検証し、4週間の投与により眼圧下降と網膜視神経細胞を観察した。
眼圧(Intra ocular pressure)は、接触式眼圧計であるTonoLabのtonometer TV02モデルを用いて測定した。また、緑内障動物モデルの網膜視神経細胞を分析するために麻酔されたラットの頭皮を切開して頭蓋骨を露出させた後、ブレグマ(Bregma)、ラムダ(Lamda)を基点で視神経と連結された脳部位である上丘(superior colliculus)の座標を確認し、座標にマークした後に打ち抜いて3%フルオロゴールド(Fluorogold)を注入した。蛍光プローブを注入してから5〜7日後に眼球を摘出して4%パラホルムアルデヒド(paraformaldehyde)に常温で4時間固定した。固定した眼球は脈絡膜から網膜を分離してスライドの上にマウントした。各実験群のスライドは、蛍光顕微鏡を用いて蛍光を発現する視神経細胞を確認し、40倍、200倍で撮影してデータを収集した。
眼圧試験結果、2週間上昇した眼圧は、21.9±8.3mmHgまで上昇した。眼圧上昇確認後、1〜5番試料を投与した結果は、図36のとおりである。2番、3番試料において眼圧下降が観察され、残りの試料においては有意性が観察されなかった。全体的に眼圧が微細に下がることはマイクロビードモデル特性に起因したことであって、試料の眼圧下降効果とは無関係なことと思料される。陽性対照群は、報告されたように眼圧下降がなされ、陰性対照群に比べて大幅下降した眼圧数値(15.9±2.9,20.89%)を示した(図36)。
視神経細胞の分析結果、陰性対照群は、対照群に比べて有意な視神経細胞死滅が観察され、3番試料、4番試料の投与群及び陽性対照群であるタフルプロストを点眼した群において視神経細胞の死滅から保護される結果を示した。3番試料の場合、図36のように下降した眼圧によることと判断され、4番試料の場合、眼圧は下降しなかったが、視神経細胞の保護効果が示された(図37)。
結論的に、3番試料であるHU025試料の場合が、緑内障の特徴である眼圧下降の効果があった。しかのみならず、国内の緑内障患者の多くの場合、眼圧が高くないながらも視神経損傷によって視力を失うことが多いが、HU025試料の場合、損傷した視神経の回復にも効能があったため、緑内障治療剤として用いることができると判断される。
本発明によるペプチドまたはその断片を用いれば、火傷及び緑内障を効果的に治療することができ、皮膚のしわ改善に優れた効果が得られ、脱毛防止に加え育毛及び発毛促進にも効果的であることから、化粧料組成物及び薬学的組成物に活用することができる。

Claims (5)

  1. RGDモチーフを含む配列番号1のアミノ酸配列からなるペプチドまたはその断片を有効成分として含む、皮膚しわを改善するための組成物であって、
    前記組成物は、医薬組成物または化粧料組成物である、組成物
  2. 前記断片が、下記の断片からなる群より選択された一種以上であることを特徴とする請求項1に記載の組成物
    1)配列番号1のアミノ酸配列の、RGDモチーフを含む5〜45個のアミノ酸からなり、選択的に断片内におけるシステイン間の二硫化結合がないか、または三つ以下の二硫化結合が形成されたことを特徴とする断片;
    2)配列番号1のアミノ酸配列の30〜38番目のアミノ酸を含み、選択的に断片内におけるシステイン間の二硫化結合がないか、または一つ以上の二硫化結合が形成されたことを特徴とする断片;
    3)配列番号1のアミノ酸配列の32〜43番目のアミノ酸を含み、選択的に断片内におけるシステイン間の二硫化結合がないか、または一つ以上の二硫化結合が形成されたことを特徴とする断片;
    4)配列番号1のアミノ酸配列の30〜44番目のアミノ酸を含み、選択的に断片内におけるシステイン間の二硫化結合がないか、または一つ以上の二硫化結合が形成されたことを特徴とする断片;
    5)配列番号1のアミノ酸配列の18〜54番目のアミノ酸を含み、選択的に断片内におけるシステイン間の二硫化結合がないか、または一つ以上の二硫化結合が形成されたことを特徴とする断片;及び
    6)配列番号1のアミノ酸配列の10〜54番目のアミノ酸を含み、選択的に断片内におけるシステイン間の二硫化結合がないか、または一つ以上の二硫化結合が形成されたことを特徴とする断片。
  3. 前記断片が、下記の断片からなる群より選択された一種以上であることを特徴とする請求項2に記載の組成物
    1)配列番号1のアミノ酸配列の、RGDモチーフを含む9個、12個または15個のアミノ酸からなり、選択的に断片内におけるシステイン間の二硫化結合がないか、または三つ以下の二硫化結合が形成されたことを特徴とする断片;
    2)配列番号1のアミノ酸配列の30〜38番目のアミノ酸からなることを特徴とする断片;
    3)配列番号1のアミノ酸配列の32〜43番目のアミノ酸からなり、36番目のシステインと42番目のシステインとの間に二硫化結合が形成されることを特徴とする断片;
    4)配列番号1のアミノ酸配列の30〜44番目のアミノ酸からなり、断片内におけるシステイン間の二硫化結合がないことを特徴とする断片;または
    5)配列番号1のアミノ酸配列の30〜44番目のアミノ酸からなり、断片内におけるシステイン間に一つの二硫化結合が形成されることを特徴とする断片。
  4. 前記ペプチドまたはその断片が、コラーゲン合成促進効果を奏することを特徴とする請求項1〜3のうちいずれか一項に記載の組成物
  5. 前記組成物は、局所投与剤形であることを特徴とする請求項1〜3のうちいずれか一項に記載の組成物
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