JP6504854B2 - ポリヌクレオチド含有サンプルの処理 - Google Patents

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Description

〔関連出願の説明〕
本願は、２００４年５月３日に出願された米国仮特許出願第６０／５６７，１７４号及び２００５年１月２１日に出願された米国仮特許出願第６０／６４５，７８４号の権益主張出願であり、これら米国仮特許出願を参照により引用し、これらの記載内容全体を本明細書の一部とする。
本発明は、ポリヌクレオチド含有サンプルを処理する方法及び関連のシステムに関する。
生物学的サンプルの分析では、サンプル中に存在する１つ又は２つ以上のポリヌクレオチドを検出するステップが実施される場合が多い。検出の一例は、定性的検出であり、この定性的検出は、例えば、ポリヌクレオチドの存在の判定及び（又は）突然変異のタイプ、サイズ、存否及び（又は）ポリヌクレオチドの配列に関連付けられた情報の判定に関する。別の検出例は、定量的検出であり、これは、例えば、ポリヌクレオチドの存在量の測定に関している。検出は、定量的側面と定性的側面の両方を含む場合がある。
ポリヌクレオチドを検出するには、酵素を用いる場合が多い。例えば、或る検出法の中には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるポリヌクレオチドの増幅又は関連の増幅技術を含むものがある。検出法の中には、ポリヌクレオチドを増幅しないものもあり、この検出法も又、酵素を利用する。しかしながら、かかる技術に用いられる酵素の機能発揮は、検出されるべきポリヌクレオチドと一緒に存在する抑制物質の存在により阻害される場合がある。抑制物質は、例えば酵素の効率及び（又は）特異性を邪魔する場合がある。
本発明の一特徴は、１つ又は２つ以上のポリヌクレオチドを処理する（例えば、ポリヌクレオチドを濃縮するため及び（又は）ポリヌクレオチドの検出及び（又は）増幅を阻害する恐れのある抑制物質（例えば、ヘモグロビン）からポリヌクレオチドを分離するため）方法及び関連システムに関する。
幾つかの実施形態では、この方法は、ポリヌクレオチドを抑制物質とは対照的にポリヌクレオチドと優先的に結び付く（例えば、保持する）比較的不動化された化合物又は構成物（compound）に接触させるステップを含む。例示の構成物は、ポリカチオンポリアミド（例えば、ポリ−Ｌ−リジン）及び（又は）ポリ−Ｄ−リジン）であり、これは、表面（例えば、１つ又は２つ以上の粒子の表面）に結合可能である。かかる構成物は、ポリヌクレオチドを保持し、ポリヌクレオチドと抑制物質を、例えば表面をかかる構成物及び関連のポリヌクレオチドで洗浄することにより分離できるようにする。分離の際、ポリヌクレオチドと構成物の結合は、壊されてポリヌクレオチドを構成物及び表面から放出させる（例えば、分離する）ことができる。
幾つかの実施形態では、表面（例えば、１つ又は２つ以上の粒子の表面）は、ポリカチオンポリアミドで改質され、これは、表面に共有結合できる。ポリカチオンポリアミドは、ポリ−Ｌ−リジン及びポリ−Ｄ−リジンのうち少なくとも一方を含むのがよい。幾つかの実施形態では、ポリカチオンポリアミド（例えば、ポリ−Ｌ−リジン及びポリ−Ｄ−リジンのうちの少なくとも一方）は、約７，５００Ｄａの平均分子量を有する。ポリカチオンポリアミド（例えば、ポリ−Ｌ−リジン及びポリ−Ｄ−リジンのうち少なくとも一方）は、約３５，０００Ｄａ以下の平均分子量（例えば、約３０，０００Ｄａ以下の平均分子量（例えば、約２５，０００Ｄａの平均分子量））を有するのがよい。ポリカチオンポリアミド（例えば、ポリ−Ｌ−リジン及びポリ−Ｄ−リジンのうち少なくとも一方）は、少なくとも約１５，０００Ｄａのメジアン分子量を有するのがよい。ポリカチオンポリアミド（例えば、ポリ−Ｌ−リジン及びポリ−Ｄ−リジンのうち少なくとも一方）は、約２５，０００Ｄａ以下のメジアン分子量（例えば、約２０，０００Ｄａ以下のメジアン分子量（例えば、約２０，０００Ｄａのメジアン分子量）を有するのがよい。
本発明の別の特徴は、サンプル調製装置であって、ポリカチオンポリアミドが結合された表面と、この表面と連通状態にあり、表面を流体サンプルに接触させるサンプル導入通路とを有するサンプル調製装置に関する。
幾つかの実施形態では、サンプル調製装置は、表面と接触状態にある水性液を少なくとも約６５℃まで加熱するよう構成された熱源を更に有する。
幾つかの実施形態では、サンプル調製装置は、ｐＨが少なくとも約１０（例えば、約１０．５以上）の液体のリザーバを更に有する。サンプル調製装置は、表面を液体に接触させるよう構成されている（例えば、圧力源を作動させて液体を移動させることによって）。
幾つかの実施形態では、表面は、複数の粒子の表面から成る。
幾つかの実施形態では、ポリカチオンポリアミドは、ポリ−Ｌ−リジン及びポリ−Ｄ−リジンを含む。
本発明の別の特徴は、サンプルを処理する方法であって、液体及び或る量のポリヌクレオチドを含む混合物を用意するステップと、保持部材をこの混合物に接触させるステップとを有するサンプル処理方法に関する。保持部材は、ポリメラーゼ連鎖反応抑制物質と比較して、ポリヌクレオチドを優先的に保持するよう構成されている。混合物中の液体の実質的に全てを保持部材から分離する。ポリヌクレオチドを保持部材から放出する。
ポリヌクレオチドは、約７．５Ｍｂｐ以下のサイズを有するのがよい。
液体は、第１の液体であるのがよく、液体の実質的に全てを分離するステップは、保持部材を第２の液体に接触させるステップを含むのがよい。
保持部材を第２の液体に接触させるステップは、熱作動式圧力源を作動させて圧力を第２の液体に加えるステップを含むのがよい。保持部材を第２の液体に接触させるステップは、熱作動式弁を開放させて第２の液体を保持部材に流体連通させるステップを含むのがよい。
第２の液体の容積は、約５０マイクロリットル以下であるのがよい。
保持部材は、ポリヌクレオチドを優先的にポリメラーゼ連鎖反応抑制物質（例えば、ヘモグロビン、ペプチド、糞便構成物、フミン酸、粘膜構成物、ＤＮＡ結合タンパク質、又はサッカリド）に結合するよう構成された構成物から成る表面を有するのがよい。
表面は、ポリリジン（ポリ−Ｌ−リジン及びポリ−Ｄ−リジン）を含むのがよい。
第２の液体は、洗浄剤（例えば、ＳＤＳ）を含むのがよい。
放出ステップは、保持部材を少なくとも約５０℃（例えば、約６０℃）の温度まで加熱するステップを含むのがよい。温度は、加熱中、保持部材の存在下では液体を沸騰させるには不十分であるのがよい。温度は、１００℃以下（例えば、１００℃未満、約９７℃以下）であるのがよい。温度を約１０分以内の間（例えば、約５分以内の間、約３分以内の間）維持するのがよい。
放出を、保持部材の遠心分離を行わないで実施するのがよい。
或る特定の実施形態では、ＰＣＲ抑制物質は、迅速に臨床サンプルから除去されていつでもＰＣＲが可能な状態のサンプルが作られる。この方法は、実質的に抑制物質の無いポリヌクレオチド含有サンプルの調製ステップを有するのがよい。サンプルを熱的方法、化学的方法、超音波を用いた方法、機械的方法、静電気を用いた方法及び他のライシング（細胞の融解）法に起因して生じた例えば粗溶解質から調製できる。サンプルを遠心分離を用いないでも調製することができる。マイクロフルイディックデバイス（microfluidic device）を用い又は大規模にサンプルを調製することができる。
本発明の別の特徴は、結合状態のポリリジン、例えばポリ−Ｌ−リジンから成る保持部材、例えば複数個の粒子、例えばビーズ並びに関連方法及びシステムに関する。保持部材は抑制物質と比較して優先的にポリヌクレオチド、例えばＤＡＮに結合する。保持部材を用いると、次の処理、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応による増幅が可能なようにポリヌクレオチドサンプルを調製することができる。
或る特定の実施形態では、サンプル中に存在するポリヌクレオチドの９０％以上を保持部材に結合し、放出させ、そして回収するのがよい。
或る特定の実施形態では、ポリヌクレオチドを、１０分未満で、７．５分未満で、５分未満で又は３分未満で、保持部材に結合し、放出させ、そして回収することができる。
ポリヌクレオチドを、ポリヌクレオチド、保持部材及び（又は）抑制物質に遠心作用を与えないで、保持部材に結合し、放出させ、そして回収するのがよい。
ポリヌクレオチドと抑制物質を互いに分離するには一般に、ポリヌクレオチド、抑制物質、処理領域及び（又は）保持部材に沈澱（例えば、遠心分離）を施すことは行われない。
本発明の別の特徴は、チャネルと、チャネルの第１の側部に被着された熱反応性物質（ＰＲＳ）の第１の塊と、チャネルの第１の側部と反対側のチャネルの第２の側部に被着されたＰＲＳの第２の塊と、ＴＲＳの第１の塊と関連したガス圧力源とを有するマイクロフルイディックデバイスに関する。ガス圧力源を作動させると、ＰＲＳの第１の塊がＴＲＳの第２の塊の中に押し込まれてチャネルが塞がれる。
マイクロフルイディックデバイスは、ＴＲＳの第２の塊と関連した第２のガス圧力源を有するのがよい。第２のガス圧力源を作動させると、ＴＲＳの第２の塊がＴＲＳの第１の塊の中に押し込まれる。
ＴＲＳの第１の塊及び第２の塊のうち少なくとも一方（例えば、両方）は、ワックス（蝋）であるのがよい。
本発明の別の特徴は、マイクロフルイディックデバイスのチャネルを塞ぐ方法に関する。塊状のＴＲＳを加熱し、チャネルを横切って（例えば、ガス圧力によって）第２の塊状のＴＲＳ中に押し込む。また、第２の塊状のＴＲＳを（例えば、ガス圧力によって）第１の塊状のＴＲＳに向かって追いやるのがよい。
本発明の別の特徴は、マイクロフルイディックデバイス用のアクチュエータに関する。アクチュエータは、チャネルと、チャネルに連結されたチャンバと、チャンバ内に設けられた包封状態の液体の少なくとも１つのリザーバと、チャンバ内のリザーバを包囲するガスとを有する。チャンバを加熱することにより、包封状態の液体のリザーバが膨張し、ガスが加圧される。代表的には、液体の沸点は、約９０℃以下である。この液体は、約１０以下の炭素原子を有する炭化水素であるのがよい。
液体をポリマーで包封するのがよい。
アクチュエータは、チャンバ内に設けられた包封状態の液体の多数のリザーバを有してもよい。多数のリザーバを固体（例えば、ワックス）内に分散させてもよい。
多数のリザーバを可撓性エンクロージャ（例えば、軟質サック）内に設けてもよい。
本発明の別の特徴は、第１の液体と第２の液体を組み合わせる（例えば、混合する）方法及び関連装置に関する。この装置は、装置の第１のチャネルと第２のチャネルを分離する熱反応性物質（ＴＲＳ）の塊を有する。この装置は、第１の液体を第２のチャネルに沿って移動させて第１の液体の一部（例えば、内側部分）がＴＲＳに隣接して位置するようにし、そして第２の液体を第２のチャネルに沿って移動させて第２の液体の一部（例えば、内側部分）がＴＲＳに隣接して位置するようにする。熱源を作動させてＴＲＳを移動させる（例えば、溶融、分散、断片化により）。第１の液体と第２の液体の内側部分は代表的には、ガスインターフェイスにより分離されることなく結合する。代表的には、第１の液体のサブセットと第２の液体のサブセットが互いに結合されるに過ぎない。液体は、混合チャネルに沿う移動時に互いに混合する。
本発明の別の特徴は、凍結乾燥試薬粒子及びこの粒子の製造方法に関する。
幾つかの実施形態では、凍結乾燥粒子は、各々がＰＣＲ抑制物質と比較して優先的にポリヌクレオチドと結び付く複数のリガンドを有する多数の小さな粒子を含む。凍結乾燥粒子は、更に（又は代替的に）細胞を融解させてポリヌクレオチドを放出させるよう構成されたライシング試薬（例えば、酵素）を含むのがよい。凍結乾燥粒子は更に（又は代替的に）タンパク質を劣化させる酵素（例えば、プロテアーゼ）を含むのがよい。
細胞の溶液と凍結乾燥粒子を組み合わせて粒子を再構成することにより細胞を融解させることができる。再構成されたライシング試薬は、細胞を融解させる。ポリヌクレオチドは、小さな粒子のリガンドと結び付く。融解中、溶液を加熱するのがよい（例えば、ランプ（例えば、ヒートランプ）を用いて輻射により）。
幾つかの実施形態では、凍結乾燥粒子は、ＰＣＲ反応を行わせるための試薬（例えば、プライマ、コントロール（対照）プラスミド、ポリメラーゼ酵素）を含む。
凍結乾燥粒子の製造方法は、粒子の試薬と凍結保護物質（例えば、糖又は多価アルコール）の溶液を形成するステップを含む。溶液を液滴の状態で冷却状態の疎水性表面（例えば、ダイヤモンド膜又はポリテトラフルオロエチレン表面）上に被着させる。粒子が凍結し、そして溶液を除去する（例えば、昇華させる）のに十分な時間の間、減圧させる（典型的には、依然として凍結状態で）。凍結乾燥粒子の直径は、約５ｍｍ以下（例えば、約２．５ｍｍ以下、約１．７５ｍｍ以下）であるのがよい。
マイクロフルイディックデバイスの斜視図である。 ポリヌクレオチドを保持すると共に（或いは）ポリヌクレオチドを抑制物質から分離する処理領域の断面図である。 アクチュエータの断面図である。 マイクロフルイディックデバイスの斜視図である。 図４のマイクロフルイディックデバイスの断面側面図である。 図４のマイクロフルイディックデバイスのマイクロフルイディックネットワークの斜視図である。 図４のマイクロフルイディックデバイスのマイクロフルイディックネットワークの斜視図である。 図４のマイクロフルイディックデバイスの構成要素を作動させる熱源のアレイを示す図である。 弁を開放状態で示す図である。 弁を閉鎖状態で示す図である。 図６のマイクロフルイディックネットワークの混合ゲート及びこのネットワークの隣接の領域を示す図である。 図６のマイクロフルイディックネットワークの混合ゲート及びこのネットワークの隣接の領域を示す図である。 図６のマイクロフルイディックネットワークの混合ゲート及びこのネットワークの隣接の領域を示す図である。 図６のマイクロフルイディックネットワークの混合ゲート及びこのネットワークの隣接の領域を示す図である。 ポリヌクレオチドと抑制物質を分離する装置を示す図である。 図１１の装置及びその作動装置を示す図である。 マイクロフルイディックデバイスを示す図である。 図１３のマイクロフルイディックデバイスの５線矢視断面図である。 ニシンの精子ＤＮＡの保持状態を示す図である。 ＤＮＡの保持及びＢ群レンサ球菌属からのＤＡＮの放出状態を示す図である。 抑制物質を取り出した元のサンプル及び抑制物質を取り出さなかったサンプルのＰＣＲ反応を示す図である。 本発明に従って調製されたサンプル及び商業的規模のＤＮＡ抽出法を用いて調製したサンプルのＰＣＲ反応を示す図である。 ポリヌクレオチドと抑制物質の分離方法の実施中に行われるステップを示す流れ図である。 図１９Ａの方法が実施されたサンプルからのＤＮＡを示す図である。
生物学的サンプルの分析では、サンプル中に１つ又は２つ以上のポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ又はｒＲＮＡ）が存在するかどうかを判定することが行われる場合が多い。例えば、特定の病原体が存在していることを表すポリヌクレオチドが存在しているかどうかを判定するためにサンプルを分析する場合がある。代表的には、生物学的サンプルは、複雑な混合物である。例えば、サンプルは、血液サンプル、組織サンプル（例えば、綿棒で採った例えば鼻組織、頬組織、肛門組織又は膣組織）、生検吸引液、溶解質、真菌又はバクテリアとして提供される場合がある。判定されるべきポリヌクレオチドは、粒子（例えば、細胞（例えば、白血球及び（又は）赤血球）、組織断片、バクテリア（例えば、グラム陽性菌及び（又は）グラム陰性菌）、真菌、胞子）に含まれている場合がある。１つ又は２つ以上の液体（例えば、水、緩衝液、血液、血漿、唾液、尿、髄液又は有機溶剤）は、代表的にはサンプルの一部であると共に（或いは）処理ステップ中サンプルに追加される。
生物学的サンプルを分析する方法では、生物学的サンプル（例えば、綿棒）を用意し、ポリヌクレオチドをサンプルの粒子（例えば、バクテリア）から放出させ、放出したポリヌクレオチドのうち１つ又は２つ以上を増幅し（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により）、増幅したポリヌクレオチドの存在（又は不存在）を判定する（例えば、蛍光検出法により）。しかしながら、生物学的サンプルは代表的には、サンプル中のヌクレオチドの存在の判定を妨害する場合のある抑制物質（例えば、粘膜構成物、ヘモグロビン、糞便構成物及びＤＮＡ結合タンパク質）を含む。例えば、かかる抑制物質は、ＰＣＲ及びポリヌクレオチドの存在を判定する他の酵素利用法によるポリヌクレオチドの増幅効率を減少させる場合がある。抑制物質の濃度を判定されるべきポリヌクレオチドに対して減少させなければ、分析は、誤った否定的結果を生じさせる場合がある。
生物学的サンプル（例えば、判定されるべき１又は２以上のポリヌクレオチドを有するサンプル）を処理する方法及び関連システムを説明する。代表的には、この方法及びシステムは、判定されるべきポリヌクレオチドの濃度に対する抑制物質の濃度を減少させる。
図１を参照すると、マイクロフルイディックデバイス（microfluidic device）２００は、第１の層２０５、第２の層２０７及び第３の層２０９を有し、これら層は、判定されるべき１又は２以上のポリヌクレオチドを含むサンプルを処理するよう構成された種々のコンポーネントを有するマイクロフルイディックネットワーク２０１を構成している。デバイス２００は代表的には、判定されるべきポリヌクレオチドの濃度を増大させると共に（或いは）判定されるべきポリヌクレオチドの濃度に対する抑制物質の濃度を減少させることによりサンプルを処理する。
次に、ネットワーク２０１のコンポーネントの配置状態について説明する。
ネットワーク２０１は、サンプル物質をネットワークに導入することができる入口２０２及び処理済みサンプルをネットワークから取り出すことができる（例えば、ネットワークによって追い出すことができる又はネットワークから抽出することができる）出口又は出力部２３６を有する。チャネル２０４が、入口２０２と接合部２５５との間に延びている。弁２０６が、チャネル２０４に沿って設けられている。リザーバチャネル２４０が、接合部２５５とアクチュエータ２４４との間に延びている。ゲート２４２，２４６が、チャネル２４０に沿って設けられている。チャネル２５７が、接合部２５５と接合部２５７との間に延びている。弁２０８が、チャネル２５７に沿って設けられている。リザーバチャネル２４６が、接合部２５９とアクチュエータ２４８との間に延びている。ゲート２５０，２５２が、チャネル２４６に沿って設けられている。チャネル２６１が、接合部２５９と接合部２６３との間に延びている。弁２１０及び疎水性ベント２１２が、チャネル２６１に沿って設けられている。チャネル２５６が、接合部２６３とアクチュエータ５５４との間に延びている。ゲート２５８が、チャネル２５６に沿って設けられている。
チャネル２１４が、接合部２６３と処理チャンバ２２０との間に延び、この処理チャンバは、入口２６５及び出口２６７を有している。チャネル２２８が、処理チャンバ出口２６７と廃棄物リザーバ２３２との間に延びている。弁２３４が、チャネル２２８に沿って設けられている。チャネル２３０が、処理チャンバ出口２６７と出力部２３６との間に延びている。
次に、ネットワーク２０１の特定のコンポーネントについて説明する。
図２も又参照すると、処理チャンバ２２０は、第１の組をなす条件（例えば、第１の温度及び（又は）第１のｐＨ）下でサンプルのポリヌクレオチドを保持したり第２の組をなす条件（例えば、これよりも高い第２の温度及び（又は）これよりも大きな第２の基本ｐＨ）下でポリヌクレオチドを放出するよう構成された複数個の粒子（例えば、ビーズ、微小球）２１８を有する。代表的には、ポリヌクレオチドは、サンプル中に存在している場合のある抑制物質と比較して優先的に保持される。粒子２１８は、保持部材２１６（例えば、コラム）として構成され、サンプル物質（例えば、ポリヌクレオチド）は、処理領域２２０の入口２６５と出口２６７との間で動く際にかかる粒子を通過しなければならない。
フィルタ２１９は、粒子２１８が処理ステーション２２０の下流側に流れるのを阻止する。チャネル２８７は、フィルタ２１９と出口２６７を連結している。フィルタ２１９は、処理領域２２０内に、入口２６５の断面積よりも広い断面積を有する。例えば、幾つかの実施形態では、処理領域２２０内のフィルタ２１９の面積と入口２６５の断面積（この断面積的は代表的には、チャネル２１４の断面積とほぼ同じである）の比は、少なくとも約５（例えば、少なくとも約１０、少なくとも約２０、少なくとも約２０）である。幾つかの実施形態では、処理領域２２０内のフィルタ２１９の面積は、少なくとも約１ｍｍ2（例えば、少なくとも２ｍｍ2、少なくとも約３ｍｍ2）である。幾つかの実施形態では、入口２６５及び（又は）チャネル２１４の断面積は、約０．２５ｍｍ2以下（例えば約０．２５ｍｍ2以下、約０．１５ｍｍ2以下、約０．１ｍｍ2以下）である。処理領域２２０を通って流れる物質に対してフィルタ２１４により与えられる広い表面積は、処理領域のボイド容量（以下に説明する）の著しい増大を回避しながら処理領域の詰まりを阻止するのに役立つ。
粒子２１８は、ポリヌクレオチドを保持する少なくとも１つのリガンドで改質されている（例えば、抑制物質と比較して優先性を備える）。代表的には、リガンドは、ｐＨが約９．５以下（例えば、約９．０以下、約８．７５以下、約８．５以下）の液体からポリヌクレオチドを保持する。サンプル溶液が処理領域２２０を通過しているとき、ポリヌクレオチドは保持され、他方、液体及び他の溶液成分（例えば、抑制物質）は、保持の度合が低く（例えば、保持されず）、処理領域から出る。一般に、リガンドは、ｐＨが約１０以上（例えば、約１０．５以上、約１１．０以上）の場合にポリヌクレオチドを放出する。したがって、ポリヌクレオチドをリガンド改質粒子から周囲の液体中に放出することができる。
例示のリガンドとしては、ポリアミド（例えば、ポリカチオンポリアミド、例えばポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｄ−リジン、ポリ−ＤＬ−オルニチン）が挙げられる。他のリガンドとしては、例えば、インターキャレータ（intercalator）、ポリ−インターキャレータ（poly-intercalator）、浅溝結合剤ポリアミン（例えば、スペルミジン）、複数のアミノ酸を含むホモポリマー及びコポリマー、並びにこれらの組合せが挙げられる。幾つかの実施形態では、リガンドの平均分子量は、少なくとも約５，０００Ｄａ（例えば、少なくとも約７，５００Ｄａ、少なくとも約１５，０００Ｄａ）である。幾つかの実施形態では、リガンドの平均分子量は、約５０，０００Ｄａ以下（例えば、約３５，０００Ｄａ以下、約２７，５００Ｄａ以下）である。幾つかの実施形態では、リガンドは、アミノ結合により粒子表面に取り付けられたポリリジンリガンドである。
或る特定の実施形態では、リガンドは、酵素劣化、例えばペプチド結合を切断するプロテアーゼ酵素（例えば、体内プロテアーゼ及び体外プロテアーゼの混合物、例えばプロナーゼ）による劣化に対して耐性がある。例示のプロテアーゼ耐性リガンドとしては、例えば、ポリ−Ｄ−リジン及び酵素の攻撃に敏感なリガンドのエナンチオマーである他のリガンドが挙げられる。
粒子２１８は、代表的には、リガンドを結び付けることが可能な材料で作られる。粒子２１８を作ることができる例示の材料としては、リガンドを結合させるよう改質できるポリマー材料が挙げられる。代表的なポリマー材料は、リガンドを取り付けるのに利用できるカルボキシル基及び（又は）アミノ基をもたらす又はこれらをもたらすよう改質されたものであるがよい。例示のポリマー材料としては、例えば、ポリスチレン、ラテックスポリマー（例えば、ポリカルボキシレート被覆ラテックス）、ポリアクリルアミド、ポリ酸化エチレン及びこれらの誘導体が挙げられる。粒子２１８を形成するのに使用できるポリマー材料は、マシオビッツ等（Mathiowitz et al.）に付与された米国特許第６，２３５，３１３号明細書に記載されており、この米国特許を参照により引用し、その記載内容を本明細書の一部とする。他の材料としては、ガラス、シリカ、アガロース、及びアミノ−プロピル−トリ−エトキシ−シラン（ＡＰＥＳ）改質材料が挙げられる。
適当なリガンドで改質できる例示の粒子としては、カルボキシレート粒子（例えば、カルボキシレート改質磁性ビーズ（セラジン（Seradyn）社のセラ−マグ・マグネチック・カルボキシレート（Sera-Mag Magnetic Carboxylate）改質ビーズ部品番号３００８０５０２５０）及びポリサイエンス（Polyscience）社から入手できるポリビード（Polybead）・カルボキシレート改質微小球、カタログ番号０９８５０）が挙げられる。幾つかの実施形態では、リガンドは、ポリ−Ｄ−リジンを含み、ビーズは、ポリマー（例えば、ポリカルボキシレート被覆ラテックス）から成る。
一般に、粒子の質量と粒子により保持されたポリヌクレオチドの質量の比は、約２５以下（例えば、約２０以下、約１０以下）である。例えば、幾つかの実施形態では、約１グラムの粒子は、約１００ミリグラムのポリヌクレオチドを保持する。
代表的には、入口２６５とフィルタ２９０との間の処理領域２２０（粒子２１８を含む）の全容積は、約１５マイクロリットル以下（例えば、約１０マイクロリットル以下、約５マイクロリットル以下、約２．５マイクロリットル以下、約２マイクロリットル以下）である。例示の実施形態では、処理領域２２０の全容量は、約２．３マイクロリットルである。幾つかの実施形態では、粒子２１８は、処理領域２２０の全容積の少なくとも約１０パーセント（例えば、少なくとも約１５パーセント）を占める。幾つかの実施形態では、粒子２１８は、処理チャンバ２２０の全容積の約７５パーセント以下（例えば、約５０パーセント、約３５パーセント以下）を占める。
幾つかの実施形態では、リガンドによって自由に占めることができる処理領域２２０の容積（例えば、粒子２１８相互間の隙間を含む処理領域２２０のボイド容積）は、全容積から粒子により占められた容積を引いたものにほぼ等しい。代表的には、処理領域２２０のボイド容積は、約１０マイクロリットル以下（例えば、約７．５マイクロリットル以下、約５マイクロリットル以下、約２．５マイクロリットル以下、約２マイクロリットル以下）である。幾つかの実施形態では、ボイド容積は、約５０ナノリットル以上（例えば、約１００ナノリットル以上、約２５０ナノリットル以上）である。例示の実施形態では、処理領域２２０の全容積は、約２．３マイクロリットルである。例えば、例示の実施形態では、処理領域の全容積は、約２．３マイクロリットルであり、粒子により占められる容積は、約０．３マイクロリットルであり、液体により自由に占められる容積（ボイド容積）は、約２マイクロリットルである。
粒子２１８は代表的には、約２０ミクロン以下（例えば、約１５ミクロン以下、約１０ミクロン以下）の平均直径を有する。幾つかの実施形態では、粒子２１８の平均直径は、少なくとも約４ミクロン（例えば、少なくとも約６ミクロン、少なくとも約８ミクロン）である。
幾つかの実施形態では、フィルタ２１９と出口２６７との間のチャネル２８７の容積は、処理領域２２０のボイド容積よりも実質的に少ない。例えば、幾つかの実施形態では、フィルタ２１９と出口２６７との間のチャネル２８７の容積は、ボイド容積の約３５％以下（例えば、約２５％以下、約２０％以下である）。例示の実施形態では、フィルタ２１９と出口２６７との間のチャネル２８７の容積は、約５００マイクロリットルである。
粒子密度は代表的には、１ミリリットル当たり少なくとも約１０8個の粒子（例えば、１ミリリットル当たり約１０9個の粒子）である。例えば、全容積約１マイクロリットルの処理領域は、約１０3個のビーズを入れることができる。
フィルタ２１９は代表的には、粒子２１８の直径よりも小さな幅を持つ細孔を有する。例示の実施形態では、フィルタ２１９は、約８ミクロンの平均幅を持つ細孔を有し、粒子２１８の平均直径は、約１０ミクロンである。
幾つかの実施形態では、粒子のうち少なくとも何割か（例えば、全て）は、磁性である。変形実施形態では、粒子のうちのほんの僅かが磁性である（例えば、磁性である粒子は無い）。
幾つかの実施形態では、粒子のうちの少なくとも何割か（例えば、全て）は、中実である。幾つかの実施形態では、粒子の少なくとも何割か（例えば、全て）は、多孔質である（例えば、粒子は、これをこの中に少なくとも部分的に延びるチャネルを備える場合がある）。
マイクロフルイディックネットワーク２０１のチャネルは代表的には、少なくとも１ｍｍ以下の断面寸法を有する。例えば、ネットワーク２０１のチャネルの幅及び（又は）深さは、約１ｍｍ以下（例えば、約７５０ミクロン以下、約５００ミクロン以下、約２５０ミクロン以下）であるのがよい。
弁は、物質が弁の一方の側の（例えば、弁の上流側の）位置から弁の他方の側の（例えば、弁の下流側の）位置までチャネルに沿って通ることができるようにする常開状態を有するコンポーネントである。作動時、弁は、物質が弁の一方の側から他方の側までチャネルに沿って通るのを阻止する閉鎖状態に移る。例えば、弁２０５は、第１の温度では比較的動きにくく、第２の温度ではより動きやすい熱応答性物質（ＴＲＳ）の塊２５１を有している。チャンバ２５３は、塊２５１と気体連通状態にある。チャンバ２５３内のガス（例えば、空気）を加熱すると共にＴＲＳの塊２５１を第２の温度まで加熱すると、チャンバ２５３内のガス圧力は、塊２５１をチャネル２０４内に移動させ、それにより物質がこのチャネルに沿って通るのを妨げる。ネットワーク２０１の他の弁は、弁２０６と同一の構造を有すると共に同一の仕方で動作する。
ＴＲＳの塊は、本質的に中実の塊であってもよく、或いは、通路を塞ぐよう互いに協働する小さな粒子の凝集体であってもよい。ＴＲＳの例としては、共融合金（例えば、はんだ）、ワックス（例えば、オレフィン）、ポリマー、プラスチック及びこれらの組合せが挙げられる。第１の温度及び第２の温度は、例えばデバイス２００のポリマー層のような材料を損傷させるのに足るほど高くはない。一般に、第２の温度は、約９０℃以下であり、第１の温度は、第２の温度よりも低い（例えば、約７０℃以下である）。
ゲートは、物質がゲートの一方の側の位置からゲートの別の側までチャネルに沿って通ることができないようにする常閉状態を有するコンポーネントである。作動時、ゲートは、物質がゲートの一方の側（例えば、ゲートの上流側）からゲートの他方の側（例えば、ゲートの下流側）まで通るようにする閉鎖状態に移る。例えば、ゲート２４２は、接合部２５５とチャネル２４０との間で物質の流れを妨げるよう位置決めされたＴＲＳの塊２７１を有する。塊２７１を第２の温度まで加熱すると、この塊は、接合部２５５とチャネル２４０との間での物質の通過を可能にするよう状態を変える（例えば、溶融、分散、断片化及び（又は）溶解により）。
ゲート２４２，２４６相互間のチャネル２４０の部分は、液体（例えば、水、有機液体又はこれらの組合せ）を収容するよう構成された流体リザーバ２７９を形成する。貯蔵中、ゲート２４２，２４６は、流体リザーバ内の液体の蒸発を制限する（例えば、阻止する）。デバイス２００の動作中、リザーバ２７９の液体は代表的には、ポリヌクレオチドを粒子２１８に関連させた状態で、抑制物質を処理領域２２０から除去する洗浄液として用いられる。代表的には、洗浄液は、１又は２以上の追加の成分（例えば、緩衝液、キレータ、界面活性剤、洗浄剤、塩基、酸又はこれらの組合せ）を有する溶液である。例示の溶液としては、例えば、ｐＨが８．０の１０〜５０ｍＭトリス、０．５〜２ｍＭのＥＤＴＡ及び０．５％〜２％のＳＤＳの溶液、ｐＨが８０．の１０〜５０ｍＭトリス、０．５〜２ｍＭＥＤＴＡ及び０．５％〜２％トリトンＸ−１００の溶液が挙げられる。
ゲート２５０，２５２相互間のチャネル２４６の部分は、リザーバ２７９と同様、蒸発が制限され又は蒸発が行えない状態で液体（例えば、溶液）を収容するよう構成された流体リザーバ２８１を形成する。デバイス２００の動作中、リザーバ２８１の液体は代表的には、粒子２１８により保持されたポリヌクレオチドが放出されるリリース又は放出液として用いられる。例示のリリース液は、濃度が例えば約２ｍＭ水酸化物（例えば、約２ｍＭＮａＯＨ）及び約５００ｍＭ水酸化物（例えば、５００ｍＭＮａＯＨ）の水酸化物溶液（例えば、ＮａＯＨ溶液）である。幾つかの実施形態では、リザーバ２８１内の液体は、約２５ｍＭ以下の濃度（例えば、約１５ｍＭの水酸化物濃度）を有する水酸化物溶液である。
リザーバ２７９，２８１は代表的には、少なくとも約０．３７５マイクロリットル（例えば、少なくとも約０．７５０マイクロリットル、少なくとも約１．２５マイクロリットル、少なくとも約２．５マイクロリットル）の液体を収容する。幾つかの実施形態では、リザーバ２７９，２８１は、約７．５マイクロリットル以下（例えば、約５マイクロリットル以下、約４マイクロリットル以下、約３マイクロリットル以下）の液体を収容する。
アクチュエータは、物質（例えば、サンプル物質及び（又は）試薬物質）をネットワーク２０１の或る１つの場所と別の場所との間で移動させるができるガス圧力をもたらすコンポーネントである。例えば、図３を参照すると、アクチュエータ２４４は、熱膨張性物質（ＴＥＭ）の塊２７３を収容したチャンバ２７２を有している。加熱されると、ＴＥＭは、膨張してチャンバ２７２内の自由容積を減少させると共にチャンバ２７２内の塊２７３を包囲しているガス（例えば、空気）を加圧する。代表的には、ゲート２４６，２６２がアクチュエータ２４４によって作動される。その結果、加圧ガスは、流体リザーバ２７９内の液体を接合部２５５に向かって追いやる。幾つかの実施形態では、アクチュエータ２４４は、アクチュエータと接合部２５５との間に約３ｐｓｉ以上（例えば、少なくとも約４ｐｓｉ、少なくとも約５ｐｓｉ）の圧力差を生じさせることができる。
ＴＥＭは、キャリヤ２７７内に分散して設けられた複数の密封液体リザーバ（例えば、球）２７５を有する。代表的には、液体は、ケーシング（例えば、モノマー、例えば塩化ビニリデン、アクリロニトリル及びメチルメタクリレートで作られたポリマーケーシング）内に封入されている高蒸気圧液体（例えば、イソブタン及び（又は）イソペンタン）である。キャリヤ２７７は、リザーバがチャネル２４０に沿って移動することができるようにしないで、リザーバ２７５の膨張を可能にする特性（例えば、柔軟性及び（又は）高温で軟化する（例えば、溶融する）能力）を有する。幾つかの実施形態では、キャリヤ２７７は、適当なガラス転移温度を備えたワックス（例えば、オレフィン）又はポリマーである。代表的には、リザーバは、ＴＥＭの少なくとも約２５重量パーセント（例えば、少なくとも約３５重量パーセント、少なくとも約５０重量パーセント）を占める。幾つかの実施形態では、リザーバは、ＴＥＭの約７５重量パーセント以下（例えば、約６５重量パーセント以下、約５０重量パーセント以下）を占める。適当な密封液体リザーバをエキスパンセル（Expancel）（アクゾ・ノーベル（Akzo Nobel）社）から入手することができる。
ＴＥＭを加熱すると（例えば、少なくとも約５０℃の温度まで（例えば、少なくとも約７５℃、少なくとも約９０℃まで））、液体は、蒸発して各密封リザーバの容積及び塊２７３の容積を増大させる。キャリヤ２７３は軟化し、それにより塊２７３が膨張することができる。代表的には、ＴＥＭを作動中、約１５０℃以下（例えば、約１２５℃以下、約１１０℃以下、約１００℃以下）の温度まで加熱する。幾つかの実施形態では、ＴＥＭの容積は、少なくとも約５倍（例えば、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍）膨張する。
疎水性ベント（例えば、ベント２１２）は、ガスがチャネルから出ることができるようにする一方で液体がチャネルから出るのを制限する（例えば、阻止する）構造体である。代表的には、疎水性ベントは、チャネルの壁を構成する多孔質疎水性物質の層（例えば、多孔質フィルタ、例えばオスモニックス（Osmonics）社製の多孔質疎水性メンブレン）を含む。以下に説明するように、疎水性ベントを用いると、サンプルの微小液滴をネットワーク２０１内の所望の場所に配置することができる。
疎水性ベントは代表的には、チャネルに沿って少なくとも約２．５ｍｍ（例えば、少なくとも約５ｍｍ、少なくとも約７．５ｍｍ）の長さを有する。疎水性ベントの長さは代表的には、疎水性ベント内のチャネルの深さの少なくとも約５倍（例えば、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍）である。例えば、幾つかの実施形態では、疎水性ベント内のチャネル深さは、約３００ミクロン以下（例えば、約２５０ミクロン以下、約２００ミクロン以下、約１５０ミクロン以下）である。
疎水性ベント内のチャネルの深さは代表的には、疎水性ベントの上流側及び下流側のチャネルの深さの約７５％以下（例えば、約６５％以下、約６０％以下）である。例えば、幾つかの実施形態では、疎水性ベント内のチャネル深さは、約１５０ミクロンであり、疎水性ベントの上流側及び下流側のチャネル深さは、約２５０ミクロンである。
疎水性ベント内のチャネルの幅は代表的には、ベントから見て上流側であってベントから見て下流側のチャネルの幅よりも少なくとも約２５％広い（例えば、少なくとも約５０％広い）。例えば、例示の実施形態では、疎水性ベント内のチャネルの幅は、約４００ミクロンであり、ベントから見て上流側及び下流側のチャネルの幅は、約２５０ミクロンである。
マイクロフルイディックデバイス２００を所望に応じて作製することができる。代表的には、層３０５，２０７，２０９は、ポリマー材料で作られる。ネットワーク２０１のコンポーネントは代表的には、層２０７，２０９を成形することにより（例えば、射出成形することにより）形成される。層２０５は代表的には、ネットワーク２０１のコンポーネントを密封するよう層２０７に固定された（例えば、接着されると共に（或いは）熱により固定された）軟質ポリマー材料（例えば、ラミネート）である。接着剤を用いて層２０７，２０９を互いに固定することができる。
使用に当たり、デバイス２００を代表的には、デバイスのコンポーネント（例えば、弁、ゲート、アクチュエータ及び処理領域２２０）を動作させるよう構成された熱源のアレイに熱的に関連させる。幾つかの実施形態では、熱源は、使用中デバイスを動作させる作動システムと一体である。作動システムは、熱源を所望のプロトコルに従って作動させるよう構成されたプロセッサ（例えば、コンピュータ）を含む。マイクロフルイディックデバイスを動作させるよう構成されたプロセッサは、２００１年３月２８日に出願された米国特許出願第０９／８１９，１０５号明細書に記載されており、この米国特許出願を参照により引用し、その記載内容を本明細書の一部とする。他の実施形態では、熱源は、デバイスそれ自体と一体である。
デバイス２００を次のように動作させるのがよい。ネットワーク２０１の弁は、開放状態に構成されている。ネットワーク２０１のゲートは、閉鎖状態に構成されている。ポリヌクレオチドを含む流体サンプルを入口２０２からネットワーク２０１に導入する。例えば、サンプルをルアー（Luer）継手を有するシリンジにより導入するのがよい。シリンジは、ネットワーク２０１内でサンプルを最初に移動させる圧力をもたらす。サンプルは、チャネル２０４，２５７，２６１，２１４に沿って移動して処理領域２２０の入口２６５に達する。サンプルは、処理領域２２０中を通り、出口２６７を介して流出し、チャネル２２８に沿って流れて廃棄物チャンバ２３２に至る。サンプルの後縁（例えば、上流側の液体と気体のインターフェイス）が疎水性ベント２１２に達すると、導入装置（例えば、シリンジ）により提供される圧力が、ネットワーク２０１から解除されてサンプルのそれ以上の運動が停止する。
代表的には、サンプルの導入量は、約５００マイクロリットル以下（例えば、約２５０マイクロリットル以下、約１００マイクロリットル以下、約５０マイクロリットル以下、約２５マイクロリットル以下、約１０マイクロリットル以下）である。幾つかの実施形態では、サンプルの量は、約２マイクロリットル以下（例えば、約０．５マイクロリットル以下）である。
処理領域２２０に入ったポリヌクレオチドは、粒子２１８相互間の隙間を通過する。サンプルのポリヌクレオチドは、保持部材２１６に接触し、サンプルの液体及び或る特定の他のサンプル成分（例えば、抑制物質）と比較して優先的に保持される。代表的には、保持部材２２０は、処理領域２２０に流入したサンプル中に存在したポリヌクレオチドの少なくとも約５０％（少なくとも約７５％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％）を保持する。サンプルの液体及びサンプル中に存在する抑制物質は、出口２６７を介して処理領域２２０から流出し、廃棄物チャンバ２３２に流入する。処理領域は代表的には、サンプルの導入中、約５０℃以下（例えば、３０℃以下）の温度状態にある。
処理は、保持部材２１６をリザーバ２７９の液体で洗浄して残存する抑制物質を保持部材２１６によって保持されたポリヌクレオチドから分離することによって続く。保持部材２１６を洗浄するため、弁２０６を閉じ、第１のリザーバ２４０のゲート２４２，２４６を開く。アクチュエータ２４４を作動させ、このアクチュエータは、リザーバ２７９内の洗浄液をチャネル２５７，２６１，２１４に沿って移動させ、処理領域２２０を通って廃棄物リザーバ２３２内へ流入させる。洗浄液は、チャネル２０４，２５７，２６１，２１４内に残存している可能性のあるサンプルを、処理領域を通って廃棄物チャンバ２３２内へ移動させる。洗浄液の後縁がいったんベント２１２に達すると、アクチュエータ２４４により生じているガス圧力を抜き、液体のそれ以上の運動を停止させる。
処理領域２２０を通ってアクチュエータ２４４によって移動させられる洗浄液の容積は代表的には、処理領域２２０のボイド容積の少なくとも約２倍（例えば、ボイド容積の少なくとも約３倍）であり、ボイド容積の約１０倍以下（例えば、ボイド容積の約５倍以下）であるのがよい。処理領域は代表的には、洗浄中、約５０℃以下（例えば、３０℃以下）の温度状態にある。例示の洗浄液としては、リザーバ２７９，２８１について説明した液体が挙げられる。
処理は、ポリヌクレオチドを保持部材２１６から放出させることにより続行する。代表的には、リザーバ２７９からの洗浄液をリザーバ２８１からのリリース液（例えば、水酸化物溶液）で置き換え、次にポリヌクレオチドを放出させる。弁２０８を閉じ、ゲート２５０，２５２を開く。アクチュエータ２４８を作動させ、それにより、リザーバ２８１内のリリース液をチャネル２６１，２１４に沿って移動させて処理領域２２０に流入させ、保持部材２１６に接触させる。リザーバ２８１からのリリース液の後縁が疎水性ベント２１２に達すると、アクチュエータ２４８により生じる圧力を抜き、液体のそれ以上の運動を停止させる。処理領域２２０を通ってアクチュエータ２４８により移動させられる液体の容積は代表的には、処理領域２２０のボイド容積に少なくともほぼ等しく（例えば、ボイド容積の少なくとも約２倍）、ボイド容積の約１０倍以下（例えば、ボイド容積の約５倍以下）であるのがよい。
ポリヌクレオチドを保持した保持部材２１６をリザーバ２８１からの液体にいったん接触させると、代表的には放出ステップを実施する。代表的には、放出ステップでは、処理領域２１６内に存在するリリース液を加熱する。一般に、液体を、保持部材の存在下で液体を沸騰させるには不十分な温度まで加熱する。幾つかの実施形態では、この温度は、１００℃以下（例えば、１００℃未満、約９７℃以下）である。幾つかの実施形態では、温度は、約６５℃以上（例えば、約７５℃以上、約８０℃以上、約９０℃以上）である。幾つかの実施形態では、温度は、約１分間以上（例えば、約２分間以上、約５分間以上、約１０分間以上）維持する。幾つかの実施形態では、温度を約３０分間（例えば、約１５分間以下、約１０分間以下、約５分間以下）維持する。例示の実施形態では、処理領域２２０を約１分〜７分間（例えば、約２分間）、約６５℃〜９０℃に（例えば、７０℃に）加熱する。
ポリヌクレオチドを処理領域２２０中に存在する液体中へ放出する（例えば、ポリヌクレオチドを代表的には、処理領域２２０のボイド容積とほぼ同じ容積を持つリリース液中に放出する）。代表的には、ポリヌクレオチドを約１０マイクロリットル以下（例えば、約５マイクロリットル以下、約２．５マイクロリットル以下）の液体中に放出する。
或る特定の実施形態では、処理領域２２０を通って移動する元のサンプルの容積とポリヌクレオチドが放出導入された液体の容積の比は、少なくとも約１０（例えば、少なくとも約５０、少なくとも約１００、少なくとも約２５０、少なくとも約５００、少なくとも約１０００）である。幾つかの実施形態では、容積が約２ｍｌのサンプルからのポリヌクレオチドを処理領域内に保持し、そして約４マイクロリットル以下（例えば、約３マイクロリットル以下、約２マイクロリットル以下、約１マイクロリットル以下）の液体中に放出するのがよい。
ポリヌクレオチドが放出導入された液体は代表的には、処理領域２２０に流入したサンプル中に存在するポリヌクレオチドの少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約７５％、少なくとも８５％、少なくとも約９０％）を含む。リリース液中に存在するポリヌクレオチドの濃度は、リリース液の容積が処理領域を通って移動した元の液体サンプルの容積よりも小さいので、元のサンプル中のポリヌクレオチド濃度よりも高い場合がある。例えば、リリース液中のポリヌクレオチドの濃度は、デバイス２００に導入されたサンプル中のポリヌクレオチドの濃度の少なくとも約１０倍以上（例えば、少なくとも約２５倍以上、少なくとも約１００倍以上）であるのがよい。ポリヌクレオチドが放出導入された液体中に存在する抑制物質の濃度は一般に、ポリヌクレオチドについて増幅効率を増大させるのに十分な量だけ元の流体サンプル中の抑制物質の濃度よりも少ない。
サンプルを含むポリヌクレオチドを処理領域２２０に導入する時期とポリヌクレオチドをリリース液中に放出する時点との時間間隔は代表的には、約１５分以下（例えば、約１０分以下、約５分以下）である。
放出されたポリヌクレオチドを含む液体を次のようにして処理領域２２０から取り出すのがよい。弁２１０，２３４を閉じる。ゲート２３８，２５８を開く。アクチュエータ２５４を作動させて圧力を発生させ、この圧力により、液体及びポリヌクレオチドを処理領域２２０からチャネル２３０内へ流入させ、そして出口２３６に向かって移動させる。ポリヌクレオチドを含む液体を取り出すのに例えばシリンジ又は自動サンプル採取装置を用いるのがよい。ポリヌクレオチドの放出中、保持部材２１６と接触状態にある液体に応じて、放出されたポリヌクレオチドを含む溶液を或る量の緩衝液（例えば、等量の２５〜５０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．０）で中和させるのがよい。
ポリヌクレオチドの放出を加熱ステップを含むものとして説明したが、加熱しないでポリヌクレオチドを放出することができる。例えば、幾つかの実施形態では、リザーバ２８１の液体は、ポリヌクレオチドを保持部材から放出するイオン強度、ｐＨ、界面活性剤濃度、組成又はこれらの組合せを有する。
ポリヌクレオチドを処理領域２２０内に存在する単一の容積の液体中に放出するものとして説明したが、他の形態を使用できる。例えば、ポリヌクレオチドを放出する際にこれに伴って（段階的に又は連続的に）流体を処理領域２２０内及び（又は）処理領域２２０を通って流体を導入してもよい。かかる実施形態では、ポリヌクレオチドを処理領域２２０のボイド容積の約１０倍以下（例えば、約７．５倍以下、約５倍以下、約２．５倍以下、約２倍以下）の容積の液体中に放出するのがよい。
リザーバ２７９，２８１をこれが第１のゲートと第２のゲートとの間で液体を保持するものとして説明したが、他の形態を使用できる。例えば、各リザーバの液体を全体として不浸透性のメンブレンによりネットワーク２０１から隔離されたパウチ（例えば、ブリスターパック）内に保持してもよい。パウチは、ユーザがメンブレンを穴あけし、それによりアクチュエータが使用中液体を移動させることができるリザーバ２７９，２８１内へ送り込むように構成されている。
処理領域をこれがマイクロリットル級の寸法形状を有するものとして説明したが、他の寸法形状を使用することができる。例えば、抑制物質とは対照的にポリヌクレオチドを優先的に保持するよう構成された表面（例えば、粒子）を備えた処理領域は、大きな容積（例えば、数十マイクロリットル以上、少なくとも約１ミリリットル以上）を有してもよい。幾つかの実施形態では、処理領域は、ベンチトップスケールを有する。
処理領域２２０をこれが多数の表面改質粒子で形成された保持部材を有するものとして説明したが、他の形態を使用できる。例えば、幾つかの実施形態では、処理領域２２０は、ポリヌクレオチドを通過させる多数の開口部（例えば、細孔及び（又は）チャネル）を有する多孔質部材（例えば、フィルタ、多孔質メンブレン又はゲルマトリックス）として構成された保持部材を有する。多孔質メンブレンの表面は、ポリヌクレオチドを優先的に保持するよう改質される。例えばオスモニックス社から入手できるフィルタメンブレンは、表面が改質されると共に処理領域２２０内にポリヌクレオチドを保持するために用いることができるポリマーで作られている。幾つかの実施形態では、処理領域２２０は、サンプルを通過させる複数の表面（例えば、壁又はバッフル）として構成された保持部材を有する。壁又はバッフルは、ポリヌクレオチドを優先的に保持するよう改造される。
処理領域２２０をマイクロフルイディックネットワークの一コンポーネントとして説明したが、他の形態を使用できる。例えば、幾つかの実施形態では、保持部材をどこか他のところで処理するための処理領域から取り出すのがよい。例えば、保持部材を或る１つの場所でポリヌクレオチド及び抑制物質を含む混合物に接触させ、次に、別の場所に移動させ、この別の場所において、ポリヌクレオチドを保持部材から取り出す。
リザーバ２７５をキャリヤ内に分散して配置したものとして説明したが、他の形態を使用してもよい。例えば、リザーバ２７５を例えばメンブレン、例えばエンクロージャ、例えばサックで形成された軟質エンクロージャ内に収納するのがよい。幾つかの実施形態では、リザーバは、チャンバ２７２内に固定されていない状態にある。かかる実施形態では、アクチュエータ２４４は、あまりに小さいのでリザーバ２７５を通すことができないが、ガスをチャンバ２７２から流出させることができるほど大きい細孔を備えた多孔質部材を有するのがよい。
種々のコンポーネントを備えたマイクロフルイディックデバイスが、パルナック等（Parunak et al.）により２００４年３月１７日出願された米国仮特許出願第６０／５５３，５５３号に記載されており、この米国仮特許出願を参照により引用し、その記載内容を本明細書の一部とする。
マイクロフルイディックデバイス３００を既に細胞から放出されたポリヌクレオチドを受け入れるよう構成されたものとして説明したが、マイクロフルイディックデバイスは、ポリヌクレオチドを細胞から放出するよう（例えば、細胞を融解させることにより）構成されたものであるのがよい。例えば、図４〜図６を参照すると、マイクロフルイディックデバイス３００は、サンプルライシングチャンバ３０２を有し、このサンプルライシングチャンバ内で、細胞がこの中に含まれるポリヌクレオチドを放出するよう融解される。マイクロフルイディックデバイス３００は、基板層Ｌ１〜Ｌ３、マイクロフルイディックネットワーク３０４（図４には、この所々の部分しか示されていない）及び液体試薬リザーバＲ１〜Ｒ４を更に有している。液体試薬リザーバＲ１〜Ｒ４は、液体試薬（例えば、サンプル物質を処理するための液体試薬）を保持し、これらリザーバは、試薬ポートＲＰ１〜ＲＰ４によりネットワーク３０４に連結されている。
ネットワーク３０４は、実質的に層Ｌ２，Ｌ３相互間に形成されているが、一部が３つ全ての層Ｌ１〜Ｌ３相互間に延びている。マイクロフルイディックネットワーク３０４は、多数のコンポーネントを有し、かかるコンポーネントとしては、チャネルＣｉ、弁Ｖｉ、二重弁Ｖ′ｉ、ゲートＧｉ、混合ゲートＭＧｉ、ベントＨｉ、ガスアクチュエータ（例えば、ポンプ）Ｐｉ、第１の処理領域Ｂ１、第２の処理領域Ｂ２、検出ゾーンＤ１、空気ベントＡＶｉ及び廃棄物ゾーンＷｉが挙げられる。ネットワーク３０４のコンポーネントは代表的には熱作動式である。図７に示すように、熱源ネットワーク３１２は、マイクロフルイディックネットワーク３０４のコンポーネントに対応した場所を有する熱源（例えば、抵抗加熱源）を有する。例えば、熱源ＨＰｉの設置場所は、アクチュエータＰｉの設置場所に対応し、熱源ＨＧｉの設置場所は、ゲートＧｉ及び混合ゲートの設置場所に対応し、熱源ＨＶｉの設置場所は、弁Ｖｉ及び二重弁Ｖ′ｉの設置場所に対応し、熱源ＨＤ１の設置場所は、ネットワーク３０４の処理チャンバＤ１の設置場所に対応している。使用に当たり、デバイス３００のコンポーネントを代表的にはデバイス２００について上述したようなプロセッサを用いて作動されるネットワーク３１２の対応の熱源と熱的接触状態に配置する。熱源ネットワーク３１２は、デバイス２００について上述したようにデバイス３００と一体であってもよく、これとは別体であってもよい。
マイクロフルイディックデバイス３００のコンポーネントについて説明する。
空気ベントＡＶｉは、ネットワーク３０４内の液体の移動により押し退けられたガス（例えば、空気）を抜くことができるコンポーネントであり、したがって、圧力の増大によって液体の所望の運動が妨げられるようなことはない。例えば、空気ベントＡＶ２は、ガスを液体の下流側にベントＡＶ２を通って逃がすことにより液体をチャネルＣ１４に沿ってチャネルＣ１６内へ流入させることができる。
弁Ｖｉは、物質が弁の一方の側部（例えば、弁の上流側）の位置から弁の他方の側（例えば、弁の下流側）の位置までチャネルに沿って流れることができるようにする常開状態を有するコンポーネントである。弁Ｖｉは、マイクロフルイディックデバイス２００の弁と同一の構造を有するのがよい。
図８及び図９で理解されるように、二重弁Ｖ′ｉも又、物質が弁の一方の側部（例えば、弁の上流側）の位置から弁の他方の側（例えば、弁の下流側）の位置までチャネルに沿って流れることができるようにする常開状態を有するコンポーネントである。一例として図８及び図９の二重弁Ｖ′１１を取り上げると、二重弁Ｖ′ｉは、チャネル（例えば、チャネルＣ１４）の各側で互いに間隔を置いて設けられたＴＲＳ（例えば、共融合金及び（又は）ワックス）の第１及び第２の塊３１４，３１６を有する。代表的には、ＴＲＳ塊３１４，３１６は、互いに（例えば、ＴＲＳ塊の幅の約５０％以下の距離だけ）ずらされている。開放状態の弁を通って移動する物質は、第１のＴＲＳ塊３１４と第２のＴＲＳ塊３１６との間を通る。各ＴＲＳ塊３１４，３１６は、代表的にはガス（例えば、空気）を収容したそれぞれのチャンバ３１８，３２０と関連している。
ＴＲＳ塊３１４，３１６及び二重弁Ｖ′ｉのチャンバ３１８，３２０は、熱源ネットワーク３１２の対応の熱源ＨＶ′１１と熱的接触状態にある。熱源ＨＶ′１１を作動させることにより、ＴＲＳ塊３１４，３１６は、より移動性の高い第２の状態（例えば、部分溶融状態）に移り、チャンバ３１８，３２０内のガスの圧力が増大する。ガス圧力は、チャネルＣ１１を横切ってＴＲＳ塊３１４，３１６を押し遣り、弁ＨＶ′１１（図９）を閉じる。代表的には、塊３１４，３１６は、少なくとも部分的に互いに結合してチャネルＣ１１を塞ぐ塊３２２を形成する。
図６を参照すると、ゲートＧｉは、物質をゲートの一方の側の位置からゲートの別の側までチャネルに沿って移動させないようにする常閉状態を有するコンポーネントである。ゲートＧｉは、デバイス２００のゲートについて説明したのと同一の構造を有するのがよい。
図１０Ａ〜図１０Ｄで分かるように、混合ゲートＭＧｉは、液体のうちの２つの容積分をネットワーク３０４内で結合させる（例えば、混合させる）ことができるコンポーネントである。混合ゲートＭＧｉについて以下に更に説明する。
アクチュエータＰｉは、物質（例えば、サンプル物質及び（又は）試薬物質）をネットワーク３０４の或る１つの場所と別の場所との間で移動させるガス圧力をもたらすコンポーネントである。アクチュエータＰｉは、デバイス２００のアクチュエータと同一であるのがよい。例えば、各アクチュエータＰｉは、チャンバ内のガスを加圧するよう加圧できるＴＥＭの塊２７３を収容したチャンバを有する。各アクチュエータＰｉは、液体がアクチュエータのチャンバに入るのを阻止する対応のゲートＧｉ（例えば、アクチュエータＰ１のゲートＧ２）を有する。ゲートは代表的には、アクチュエータのチャンバ内に生じた圧力がマイクロフルイディックネットワークに入ることができるようにするよう作動される（例えば、開かれる）。
廃棄物チャンバＷ１は、ネットワーク３０４内の液体の取り扱い（例えば、移動及び（又は）混合）に起因して生じる廃棄物（例えば、オーバーフロー）液体を受け入れることができるコンポーネントである。代表的には、各廃棄物チャンバＷ１は、チャンバに流入する液体により押し退けられたガスを抜くことができるようにする関連の空気ベントを有する。
第１の処理領域Ｂ１は、ポリヌクレオチドを濃縮させると共に（或いは）サンプルの抑制物質から分離することができるようにするコンポーネントである。処理領域Ｂ１は、デバイス２００の処理領域２２０と同様な構成及び作用を有するのがよい。幾つかの実施形態では、第１の処理領域Ｂ１は、処理領域２２０について上述した１又は２以上のリガンドで改質された少なくとも１つの表面を備える保持部材（例えば、多数の粒子（例えば、微小球又はビーズ）、多孔質部材、多数の壁）を有する。例えば、リガンドは、１又は２以上のポリアミド（例えば、ポリカチオンポリアミド、例えばポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｄ−リジン、ポリ−ＤＬ−オルニチン）を含むのがよい。幾つかの実施形態では、保持部材の粒子は、ライシングチャンバ３０２内に設けられ、サンプル物質と一緒に処理領域Ｂ１内に入れられる。
第２の処理領域Ｂ２は、１又は２以上のポリアミドが存在するかどうかを判定するために物質（例えば、サンプル物質）を構成物（例えば、試薬）と結合させることができるコンポーネントである。幾つかの実施形態では、構成物としては、１又は２以上のＰＣＲ試薬（例えば、プライマ、コントロール（対照）プラスミド及びポリメラーゼ酵素）を含む。代表的には、構成物を１又は２以上の凍結乾燥粒子（例えば、ペレット）として処理領域内に収納する。粒子は一般に、室温（例えば、約２０℃）で少なくとも約６ヶ月（例えば、少なくとも約１２ヶ月）の保存寿命を有する。第２の処理領域Ｂ２に流入した液体は、凍結乾燥構成物を溶解させる（例えば、再構成する）。
代表的には、処理領域Ｂ２の凍結乾燥粒子の平均容積は、約５マイクロリットル以下（例えば、約４マイクロリットル以下、約３マイクロリットル以下、約２マイクロリットル以下）である。幾つかの実施形態では、処理領域Ｂ２の凍結乾燥粒子の平均直径は、約４ｍｍ以下（例えば、約３ｍｍ以下、約２ｍｍ以下）である。例示の実施形態では、凍結乾燥粒子の平均容積は、約２マイクロリットルであり、その平均直径は約１．３５ｍｍである。１又は２以上のポリアミドが存在しているかどうかを判定するための凍結乾燥粒子としては、代表的には、多数の構成物が挙げられる。幾つかの実施形態では、凍結乾燥粒子は、ポリアミドが存在しているかどうかを判定すると共に（或いは）ポリアミドの濃度を増大させる反応に用いられる１又は２以上の構成物を含む。例えば、凍結乾燥粒子は、例えばＰＣＲによりポリヌクレオチドを増幅させる１又は２以上の酵素を含むのがよい。次に、Ｂ群レンサ球菌属（ＧＢＳ）バクテリアと関連したポリヌクレオチドを増幅させるための例示の試薬を含む例示の凍結乾燥粒子について説明する。幾つかの実施形態では、凍結乾燥粒子としては、凍結保護物質、１又は２以上の塩、１又は２以上のプライマ（例えば、ＧＢＳプライマＦ及び（又は）ＧＢＳプライマＲ）、１又は２以上のプローブ（例えば、ＧＢＳプローブ−ＦＡＭ）、１又は２以上の内部コントロールプラスミド、１又は２以上の特異性コントロール（例えば、ＧＢＳのＰＣＲに関するコントロールとしてレンサ球菌属肺炎球菌ＤＮＡ）、１又は２以上のＰＣＲ試薬（例えば、ｄＮＴＰ及び（又は）ｄＵＴＰ）、１又は２以上の閉塞剤又は増量剤（例えば、非特異性タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ＲＮＡｓｅＡ、又はゲラチン）及びポリメラーゼ（例えば、グリセロールが含まれていないタックポリメラーゼ（Taq Polymerase））が挙げられる。当然のことながら、他の成分（例えば、他のプライマ及び（又は）特異性コントロール）を他のポリヌクレオチドの増幅のために使用できる。
凍結保護物質は一般に、凍結乾燥粒子の安定性を高めるのに役立つと共に粒子の他の構成物への損傷を阻止するのに役立つ（例えば、粒子の調製及び（又は）貯蔵中の酵素の変性を阻止することにより）。幾つかの実施形態では、凍結保護物質は、１又は２以上の糖（例えば、１又は２以上の二糖類（例えば、トレハロース、メリジトース、ラフィノース））及び（又は）１又は２以上の多価アルコール（マニトール、ソルビトール）を含む。
凍結乾燥粒子を所望に応じて調製することができる。代表的には、凍結乾燥粒子の構成物を溶剤（例えば、水）と結合させて溶液を作り、次に、この溶液を（例えば、別々のアリコート（例えば、液滴）の状態で例えばピペットにより）冷却状態の疎水性表面（例えば、ダイヤモンド膜又はポリテトラフルオロエチレン表面）上に配置する。一般に、表面の温度は、液体窒素の温度の近くまで（例えば、約−１５０°Ｆ以下（−１０１℃以下）、約−２００°Ｆ以下（−１２８℃以下）、約−２７５°Ｆ以下（−１７５℃以下））まで減少させる。溶液は、別個独立の粒子として凍結する。凍結粒子に、溶剤（例えば、昇華により）ペレットから除去するのに十分な圧力及び時間の間、依然として凍結状態で真空作用を及ぼす。
一般に、粒子の構成材料の溶液中の構成物の濃度は、マイクロフルイディックデバイス中に再構成された場合よりも高い。代表的には、溶液濃度と再構成濃度の比は、少なくとも約３（例えば、少なくとも約４．５）である。幾つかの実施形態では、比は約６である。
ＧＢＳの存在を表すポリヌクレオチドの増幅に使用される凍結乾燥ペレットを調製する例示の溶液を作るには、凍結保護物質（例えば、乾燥粉末としてトレハロースを１２０ｍｇ）、緩衝溶液（例えば、ｐＨ８．４の１Ｍトリス、２．５ＭのＫＣｌ及び２００ｍＭのＭｇＣｌ2の溶液４８マイクロリットル）、第１のプライマ（例えば、５００マイクロモルのＧＢＳプライマＦ（インビトロゲン）を１．９２マイクロリットル）、第２のプライマ（例えば、５００マイクロモルのＧＢＳプライマＲ（インビトロゲン）を１．９２マイクロリットル）、プローブ（例えば、２５０マイクロモルのＧＢＳプローブ−ＦＡＭ（ＩＤＴ／バイオサーチ・テクノロジーズ（Biosearch Technologies）社を１．９２マイクロリットル）、コントロールプローブ（例えば、２５０マイクロモルのCal Orange５６０（バイオサーチ・テクノロジーズ社）を１．９２マイクロリットル）、テンプレートプラスミド（例えば、１マイクロリットル当たり１０5コピーのプラスミドの溶液を０．６マイクロリットル）、特異性コントロール（例えば、１マイクロリットル当たり１０ナノグラム（例えば、１マイクロリットル当たり約５，０００，０００コピー）レンサ球菌属肺炎球菌ＤＡＮ（ＡＴＣＣ）の溶液を１．２マイクロリットル）、ＰＣＲ試薬（例えば、ｄＮＴＰ（エピセンター（Epicenter）社）の１００ミリモル溶液を４．８マイクロリットル及びｄＵＴＰ（エピセンター社）の２０ミリモル溶液を４マイクロリットル）、増量剤（例えば、ＢＳＡ（インビトロゲン（Invitorogen）社）の１ミリリットル溶液当たり５０ミリグラムを２４マイクロリットル）、ポリメラーゼ（例えば、グリセロールが含まれていないTaq Polymerase（インビトロゲン／エッペンドルフ（Eppendorf）社）の１マイクロリットル溶液当たり５Ｕを６０マイクロリットル）及び溶剤（例えば、水）を化合させて約４００マイクロリットルの溶液を作るのがよい。この溶液の約２マイクロリットル当たり約２００アリコートを上述したように凍結させると共に脱溶媒和して２００個のペレットを作る。再構成時、２００個の粒子は、総容積が約２．４ミリリットルのＰＣＲ試薬溶液を作る。
図５に示すように、試薬リザーバＲｉは、使用の準備ができるまでネットワーク３００から分離された液体試薬（例えば、水、緩衝溶液、水酸化物溶液）を収容するよう構成されている。リザーバＲ１は、液体を収容する密閉空間３３０を画定するエンクロージャ３２９を有する。各空間３３０は、エンクロージャ３２９の下部壁３３３によって試薬ポートＲＰｉ及びネットワーク３０４から分離されている。エンクロージャ３２９の一部は、各エンクロージャの下部壁３３３の方へ差し向けられた穿刺部材３３１として形成されている。デバイス３００を使用する場合、穿刺部材３３１を押し下げて壁３３３を穴あけすることにより試薬リザーバＲｉを作動させる。穿刺部材３３１をユーザにより（例えば、親指で）又はデバイス３００を動作させるために用いられる作動システムにより押し下げるのがよい。
壁３３３を穴あけすると、リザーバからの流体がネットワーク３３３に流入する。例えば、図５及び図６で分かるように、リザーバＲ２からの液体は、ポートＲＰ２によりネットワーク３０４に流入し、チャネルＣ２に沿って移動する。ゲートＧ３は、液体がチャネルＣ８に沿って流れるのを阻止する。過剰の液体は、チャネルＣ７に沿って流れて廃棄物チャンバＷ２に流入する。リザーバＲ２からの液体の後縁が疎水性ベントＨ２を通ると、リザーバ内に作られる圧力が逃がされて、液体のそれ以上の運動を停止させる。その結果、ネットワーク３０４は、接合部Ｊ１と接合部Ｊ２との間のチャネルＣ２の容積によって定められた容積を有する液体試薬のアリコートを受け入れる。アクチュエータＰ１を作動させると、この試薬アリコートをネットワーク３０４内で更に移動させる。試薬リザーバＲ１，Ｒ３，Ｒ４は、対応のチャネル、疎水性ベント及びアクチュエータと関連している。
図示の形態では、試薬リザーバＲ１は代表的には、処理領域Ｂ１内に保持されたポリヌクレオチドを放出するためのリリース液（例えば、デバイス２００について上述したような水酸化物溶液）を収容する。試薬リザーバＲ２は代表的には、ポリヌクレオチドの放出に先立って、処理領域Ｂ１からの非保持状態の物質（例えば、抑制物質）を除去するための洗浄液（例えば、デバイス２００について上述したような緩衝溶液）を収容する。試薬リザーバＲ３は代表的には、中和緩衝液（例えば、ｐＨ８．０の２５〜５０ｍＭトリス−ＨＣＬ緩衝溶液）を収容する。試薬リザーバＲ４は代表的には、脱イオン水を収容する。
ライシングチャンバ３０２は、主ライシングチャンバ３０６と廃棄物チャンバ３０８に分割されている。物質は、チャンバ３０６，３０８の一方から他方のチャンバに流れる際に必ずネットワーク３０４の少なくとも一部を通過する。主ライシングチャンバ３０６は、サンプルをチャンバ３０６に導入するサンプル入力ポートＳＰ１、チャンバ３０６をネットワーク３０４に連結するサンプル出力ポートＳＰ２及び以下に説明するようにチャンバ３０６内のサンプル物質と相互作用する凍結乾燥試薬ＬＰを有する。入力ポートＳＰ１は、物質（例えば、サンプル物質及びガス）がチャンバ３０６に流入することができるが、物質がポートＳＰ１によりチャンバ３０８から流出するのを制限する（例えば、阻止する）一方向弁を有する。代表的には、ポートＳＰ１は、気密シールを形成するようサンプル入力装置（例えば、シリンジ）と結合するよう構成された継手（例えば、ルアー継手）を有する。主チャンバ３０６は代表的には、約５ミリリットル以下（例えば、約４ミリリットル以下）の容積を有する。使用に先立って、代表的には、主チャンバ３０６をガス（例えば、空気）で満たす。
廃棄物チャンバ３０８は、液体がネットワーク３０４からチャンバ３０８に流入することができるようにする廃棄物部分Ｗ６及びチャンバ３０８に流入した液体により押し退けられるガスが出ることができるようにするベント３１０を有する。
ライシング３０２の凍結乾燥試薬粒子ＬＰは、ポリヌクレオチドを細胞から放出する（例えば、細胞を融解させることにより）構成された１又は２以上の構成物（例えば、試薬）を含む。例えば、粒子ＬＰは、タンパク質（例えば、プロテイナーゼ、プロテアーゼ（例えば、プロナーゼ）、トリプシン、プロテイナーゼＫ、ファージ溶菌性酵素（例えば、PlyGBS）、リゾチーム（例えば、改質リゾチーム、例えばReadyLyse）、細胞特異性酵素（例えば、Ｂ群レンサ球菌属を溶解させるためミュータノリシン））を減少させる（例えば、変性させる）よう構成された１又は２以上の酵素を含むのがよい。
幾つかの実施形態では、物品ＬＰは代表的には、代替的に又は追加的に、抑制物質と比較して、ポリヌクレオチドを保持するコンポーネントを有する。例えば、粒子ＬＰは、デバイス２００について上述したようにリガンドで改質された多数の粒子２１８の表面を有するのがよい。粒子ＬＰは、表面改質粒子上の部位を結合するために決定されるべきポリヌクレオチドと競合する恐れのあるポリヌクレオチドを減少させる酵素を含むのがよい。例えば、決定されるべきＤＮＡと競合する恐れのあるＲＮＡを減少させるため、粒子ＬＰは、酵素、例えばＲＮＡアーゼ（例えば、ＲＮＡｓｅＡ ＩＳＣ BioExpress（アムレスコ（Amresco）社）を含むのがよい。
例示の実施形態では、粒子ＬＰ細胞は、凍結保護物質、抑制物質と比較してポリヌクレオチドを保持するよう構成されたリガンドで改質された粒子、及び１又は２以上の酵素を含む。
代表的には、粒子ＬＰの平均容積は、約３５マイクロリットル以下（例えば、約２７．５マイクロリットル以下、約２５マイクロリットル以下、約２０マイクロリットル以下）である。幾つかの実施形態では、粒子ＬＰの平均直径は、約８ｍｍ以下（例えば、約５ｍｍ以下、約４ｍｍ以下）である。例示の実施形態では、凍結乾燥粒子の平均容積は、約２０マイクロリットルであり、その平均直径は、約３．５ｍｍである。
粒子ＬＰを所望に応じて調製することができる。代表的には、上述したような凍結保護物質及び冷却状態の疎水性表面を用いて粒子を調製する。例えば、粒子ＬＰを調製するための溶液を調製するには、凍結保護物質（例えば、トレハロースを６グラム）、リガンドで改質された複数個の粒子（例えば、ポリ−Ｄ−リジンリガンドによりカルボキシレート改質された粒子のサスペンションを約２ミリリットル）、プロテアーゼ（例えば、プロテアーゼを４００ミリグラム）、ＲＮＡアーゼ（例えば、ＲＮＡアーゼを３０ミリグラム（１ミリグラム当たり１２０Ｕの活性度））、ペプチドグリカンを消化する酵素（例えば、ReadyLyse（１マイクロリットルReadyLyse溶液当たり３０，０００Ｕを１６０マイクロリットル））、細胞特異性酵素（例えば、ミュータノリシン（例えば、１マイクロリットルのミュータノリシン溶液当たり５０Ｕを２００マイクロリットル）及び溶剤（例えば、水）を化合させて約２０ミリリットルを生じさせるのがよい。この溶液の各々について約２０マイクロリットルの約１０００アリコートを上述したように凍結すると共に脱溶媒和させて１０００本のペレットを作る。再構成されると、ペレットは、全部で約２００ミリリットルの溶液を作るよう用いられる。
使用に当たり、デバイス３００を次のように動作させるのがよい。ネットワーク３０４の弁Ｖｉ及びＶ′ｉは、開放状態に構成されている。ネットワーク３０４のゲートＧｉ及び混合ゲートＭＧｉは、閉鎖状態に構成されている。試薬ポートＲ１〜Ｒ４を押し下げて液体試薬を上述したようにネットワーク３０４内に導入する。サンプルを、ポートＳＰ１を介してライシングチャンバ３０２に導入し、主ライシングチャンバ３０６内の凍結乾燥粒子ＬＰに結合させる。代表的には、サンプルは、粒子（例えば、細胞）と緩衝溶液の組合せを含む。例えば、例示のサンプルは、約２部の全血及び約３部の緩衝容器（例えば、ｐＨが８．０の二重ｍＭトリス、１ｍＭＥＤＴＡ及び１％ＳＤＳの溶液）を含む。別の例示のサンプルは、Ｂ群レンサ球菌属及び緩衝溶液（例えば、ｐＨが８．０の２０ｍＭトリス、１ｍＭＥＤＴＡ及び１％トリトンＸ−１００）を含む。
一般に、サンプルの導入量は、主アイシングチャンバ３０６の全容積よりも小さい。例えば、サンプルの容積は、チャンバ３０６の全容積の約５０％以下（例えば、約３５％以下、約３０％以下）であるのがよい。代表的なサンプルの容積は、約３ミリリットル以下（例えば、約１．５ミリリットル以下）である。或る量のガス（例えば、空気）を一般にサンプルと共に主チャンバ３０６に導入する。代表的には、ガスの導入容積は、チャンバ３０６の全容積の約５０％以下（例えば、約３５％以下、約３０％以下）である。かかる容積のサンプルとガスが結合して既にチャンバ３０６内に存在しているガスを加圧する。ポートＳＰ１の弁３０７は、ガスがチャンバ３０６から流出するのを阻止する。ゲートＧ３，Ｇ４，Ｇ８，Ｇ１０は、閉鎖状態にあるので、加圧サンプルは、ポートＳＰ２を介してネットワーク３０４に入るのが阻止される。
サンプルは、チャンバ３０６内の粒子ＬＰを溶解させる。再構成されたライシング試薬（例えば、ReadyLyse、ミュータノリシン）は、サンプルの細胞を融解させ始めてポリヌクレオチドを放出させる。他の試薬（例えば、プロテアーゼ酵素、例えばプロナーゼ）は、サンプル内の抑制物質（例えば、タンパク質）を減少させ又は変性させ始める。サンプルからのポリヌクレオチドは、粒子ＬＰから放出された粒子２１８のリガンドと結び付き始める（例えば、結合し始める）。代表的には、チャンバ３０６内のサンプルを融解が生じている間、或る期間（例えば、約１５分間以下、約１０分間以下、約７分間以下）、加熱する（例えば、少なくとも約５０℃に、少なくとも約６０℃に）。幾つかの実施形態では、少なくとも部分的にライシングチャンバの内容物を加熱するために光エネルギーが用いられる。例えば、デバイス３００を動作させるために用いられる作動システムは、チャンバ３０６と熱的及び光学的接触状態に置かれたランプ（例えば、主として赤外光を発生するランプ）を有するのがよい。チャンバ３０６は、チャンバ３０６内のサンプルの温度をモニタするために用いられる温度センサＴＳを有する。ランプ出力をセンサＴＳで測定された温度に基づいて増減する。
デバイス３００の動作を続行し、Ｇ２を作動させ（例えば、開放し）主ライシングチャンバ３０６のポートＳＰ２とライシング廃棄物チャンバ３０８のポートＷ６との間に経路を生じさせる。この経路は、チャネルＣ９、チャネルＣ８に沿って処理領域Ｂ１及びチャネルＣ１１を通って延びる。チャンバ３０６内の圧力は、融解されたサンプル物質（融解質、粒子２１８に結合されたポリヌクレオチド及び他のサンプル成分を含む）を経路に沿って移動させる。粒子２１８（ポリヌクレオチドを含む）を、サンプルの液体及び他の成分が廃棄物チャンバ３０８に流入しながら、処理領域Ｂ１（例えば、フィルタにより）保持する。或る期間（例えば、約２〜約５分間）後、ゲートＧ１を開くことによりライシングチャンバ３０６内の圧力を抜いてポートＳＰ２とＷ６との間に第２の経路を作る。二重弁Ｖ′１及びＶ′８を閉じてライシングチャンバ３０２をネットワーク３０４から隔離する。
デバイス３００の動作は、ポンプＰ１を作動させ、ゲートＧ２，Ｇ３，Ｇ９を開くことにより続行する。ポンプＰ１は、チャネルＣ２内の洗浄液を接合部Ｊ１の下流側に押し遣り、処理領域Ｂ１を通って廃棄物チャンバＷ５内に流入させる。洗浄液は、粒子２１８により保持されなかった抑制物質及び他の構成物を処理領域Ｂ１から除去する。洗浄液の後縁（例えば、上流側インターフェイス）が疎水性ベントＨ１４を通過すると、アクチュエータＰ１からの圧力がネットワーク３０４から抜かれ、液体のそれ以上の運動を停止させる。二重弁Ｖ′２，Ｖ′９を閉じる。
動作は、ポンプＰ２を作動させ、ゲートＧ６，Ｇ４，Ｇ８を開いてリリース液を試薬リザーバＲ１から処理領域Ｂ１内に移動させ、そして粒子２１８に接触させる。空気ベントＡＶ１は、移動中のリリース液の前方の圧力を抜く。疎水性ベントＨ６は、リリース液の後縁の後ろの圧力を抜き、リリース液のそれ以上の運動を停止させる。二重弁Ｖ′６，Ｖ′１０を閉じる。
動作は、処理領域Ｂ１を加熱し（例えば、粒子２１８を加熱することにより）ポリヌクレオチドを粒子２１８から放出させる。粒子をデバイス２００について上述したように加熱するのがよい。代表的には、リリース液は、約１５ｍＭの水酸化物（例えば、ＮａＯＨ溶液）を含み、粒子を約２分間掛けて約７０℃まで加熱してポリヌクレオチドを粒子２１８から放出する。
動作は、ポンプＰ３を作動させ、ゲートＧ５，Ｇ１０を開いてリリース液を処理領域Ｂ１から下流側に放出することにより続行する。空気ベントＡＶ２は、リリース液の下流側の圧力を抜き、液体がチャネルＣ１６内に流入できるようにする。疎水性ベントＨ８は、圧力をリリース液の上流側から抜き、それ以上の運動を停止させる。二重弁Ｖ′１１，Ｖ′１４を閉じる。
図１０Ａ〜図１０Ｄを参照すると、混合ゲートＭＧ１１を用いて粒子２１８から放出されたポリヌクレオチドを含むリリース液の一部と試薬リザーバＲ３からの中和緩衝液を混合させる。図１０Ａは、試薬リザーバＲ３を押し下げて中和緩衝液をネットワーク３０４内に導入する前の混合ゲートＭＧ１１領域を示している。図１０Ｂは、中和緩衝剤をチャネルＣ１３，Ｃ１２内に導入した後の混合ゲートＭＧ１１領域を示している。二重弁Ｖ′１３を閉じてネットワーク３０４を試薬リザーバＲ３から隔離する。二重弁Ｖ′１２を閉じてネットワーク３０４を廃棄物チャンバＷ３から隔離する。中和緩衝液は、ゲートＭＧ１１のＴＲＳの塊３２４の一方の側に接触する。
図１０Ｃは、リリース液をチャネルＣ１６内に移動させた後の混合ゲートＭＧ１１領域を示している。マイクロフルイディックネットワーク３０４の寸法（例えば、チャネル寸法及び疎水性ベントＨ８の位置）は、チャネルＣ１６，Ｃ１４の結合部Ｊ３，Ｊ４相互間に位置決めされたリリース液の部分が、放出ステップ中、粒子２１８と接触状態にある液体の容積にほぼ相当するように構成されている。幾つかの実施形態では、接合部Ｊ３，Ｊ４相互間に位置する液体の容積は、約５マイクロリットル以下（例えば、約４マイクロリットル以下、約２．５マイクロリットル以下）である。例示の実施形態では、接合部Ｊ３，Ｊ４の相互間のリリース液の容積は、約１．７５マイクロリットルである。代表的には、接合部Ｊ３，Ｊ４相互間の液体は、処理領域Ｂ１に流入したサンプル中に存在するポリヌクレオチドの少なくとも約５０％（少なくとも約７５％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％）を含む。弁Ｖ１４を閉じてネットワーク３０４を空気ベントＡＶ２から隔離する。
混合ゲートＭＧ１１を作動させる前に、接合部１４のところのリリース液とチャネルＣ１３，Ｃ１２相互間の接合部Ｊ６のところの中和緩衝液をＴＲＳの塊３２４から分離する（例えば、液体は、ガスの容積によっては間隔を置いて位置しない）。リリース液と中和緩衝液を結合させ又は組み合わせるため、ポンプＰ４及びゲートＧ１２，Ｇ１３，ＭＧ１１を作動させる。ポンプＰ４は、接合部Ｊ５，Ｊ６の相互間の中和液の容積及び接合部Ｊ４，Ｊ３相互間のリリース液の容積を混合チャネルＣ１５（図１０Ｄ）内に押し遣る。ＴＲＳの塊３２４は代表的には、分散すると共に（或いは）溶融し、それにより２つの液体を結合させ又は組み合わせることができる。結合（又は組合せ）状態の液体は、下流側インターフェイス３３５（接合部Ｊ３によって形成される）及び上流側インターフェイス（接合部Ｊ５によって形成される）。これらインターフェイスが存在することにより、インターフェイスが存在しない場合よりもより効率的な混合（例えば、結合状態の液体の再循環）が可能である。図１０Ｄで分かるように、混合は代表的には、２つの液体相互間のインターフェイスの近くで始まる。混合チャネルＣ１５は代表的には、チャネル内の結合状態の液体の全長と少なくともほぼ同じぐらい長く（例えば、少なくとも約２倍）である。
リリース液と結合された中和緩衝液の容積は、接合部Ｊ５，Ｊ６相互間のチャネル寸法により定められる。代表的には、結合状態の中和液の容積は、結合状態のリリース液の容積とほぼ同じである。幾つかの実施形態では、接合部Ｊ５，Ｊ６相互間に位置する液体の容積は、約５マイクロリットル以下（例えば、約４マイクロリットル以下、約２．５マイクロリットル以下）である。例示の実施形態では、接合部Ｊ５，Ｊ６相互間のリリース液の容積は、約２．２５マイクロリットルである（例えば、リリース液と中和緩衝剤の全容積は、約４マイクロリットルである）。
図６を参照すると、結合状態のリリース液と中和緩衝液は、混合チャネルＣ１５に沿って流れてチャネルＣ３２内に流入する（空気ベントＡＶ８により下流側に抜かれる）。運動は、結合状態の液体の上流側インターフェイスが、疎水性ベントＨ１１を通過するまで続行し、この疎水性ベントは、圧力をアクチュエータＰ４から抜いて、結合状態の液体のそれ以上の運動を停止させる。
デバイス３００の動作を続行させ、アクチュエータＰ５及びゲートＧ１４，Ｇ１５，Ｇ１７を作動させて第２の処理領域Ｂ２中に存在する凍結乾燥ＰＣＲ粒子を試薬リザーバＲ４からの水の中に溶解させる。疎水性ベントＨ１０は、アクチュエータＰ５からの圧力を水の上流側で抜き、それ以上の運動を停止させる。溶解は代表的には、ＰＣＲ試薬ペレットを溶解させるために約２分掛からないで（例えば、約１分掛からないで）生じる。弁Ｖ１７を閉じる。
デバイス３００の動作を続行して、アクチュエータＰ６及びゲートＧ１６を作動させて凍結乾燥粒子の溶解構成物を処理領域Ｂ２からチャネルＣ３１内に押し遣り、このチャネル内で、溶解状態の試薬が混ざって均質の溶解状態の凍結乾燥粒子溶液を形成する。アクチュエータＰ６は、溶液をチャネルＣ３５，Ｃ３３内に移動させる（空気ベントＡＶ５によって下流側に抜かれる）。疎水性ベントＨ９は、アクチュエータＰ６により生じた圧力を溶液の上流側で抜き、それ以上の運動を停止させる。弁Ｖ１８，Ｖ１９，Ｖ′２０及びＶ′２２を閉じる。
デバイス３００の作動を続行して、アクチュエータＰ７及びゲートＧ１８，ＭＧ２０，Ｇ２２を作動させてゲートＭＧ２０とゲートＧ２２との間のチャネル３２内の中和されたリリース液の一部とゲートＧ１８とＭＧ２０との間のチャネルＣ３５中の溶解された凍結乾燥粒子溶液の一部を組み合わせる（例えば、混合する）。結合状態の液体は、混合チャネルＣ３７に沿って移動して検出領域Ｄ２内に入る。空気ベントＡＶ３は、結合状態の液体の下流側でガス圧力を抜く。結合状態の液体の上流側インターフェイスが疎水性ベントＨ１３を通過すると、アクチュエータＰ７からの圧力を抜き、結合状態の液体を検出領域Ｄ２内に入れる。
アクチュエータＰ８及びゲートＭＧ２，Ｇ２３及びＧ１９を作動させてゲートＭＧ２とゲートＧ２３との間の試薬リザーバＲ４からの水の一部とゲートＧ１９とゲートＭＧ２との間のチャネルＣ３３内の溶融状態の凍結乾燥粒子溶液の第２の部分を組み合わせる。結合状態の液体は、混合チャネルＣ４１に沿って移動して検出領域Ｄ１内に流入する。空気ベントＡＶ４は、結合状態の液体の下流側のガス圧力を抜く。結合状態の液体の上流側インターフェイスが疎水性ベントＨ１２を通過すると、圧力をアクチュエータＰ８から抜き、結合状態の液体を検出領域Ｄ１内に入れる。
デバイス３００の作動を続行して、二重弁Ｖ′２６，Ｖ′２７を閉じて検出領域Ｄ１をネットワーク３０４から隔離し、二重弁Ｖ′２４，Ｖ′２５を閉じて検出領域Ｄ２をネットワーク３０４から隔離する。各検出領域の内容物（検出領域Ｄ２中のサンプルポリヌクレオチドを含む中和リリース液、溶解状態の凍結乾燥粒子溶液からのＰＣＲ試薬、溶解状態の凍結乾燥粒子溶液から検出領域Ｄ１内へのＰＣＲ試薬を含む脱イオン水）に加熱及び冷却ステップを施してポリヌクレオチドを増幅する（検出領域Ｄ２中に存在していれば）。各検出領域の二重弁は、加熱中、検出領域の内容物の蒸発を阻止する。増幅されたポリヌクレオチドは一般に、蛍光検出法を用いて検出される。
図１１を参照すると、デバイス７００が、例えばサンプルをポリヌクレオチドの増幅に備えて準備するようポリヌクレオチド含有サンプルを処理するために構成されている。デバイス７００は、サンプルリザーバ７０４、試薬リザーバ７０６、ガス圧力発生器７０８、クロージャ（例えば、キャップ７１０）及び複数個の粒子（例えば、リガンド、例えばポリ−Ｌ−リジン及び（又は）ポリ−Ｄ−リジンで表面改質されたカルボキシレートビーズ７０５）を有する保持部材７０４を含む処理領域７０２を有している。保持部材７０４及びビーズ７０５は、保持部材２１６及び表面改質粒子２１８の任意の特性又は全ての特性を共有するのがよい。デバイス７００は、開口部７１６及び開口部７１６を開閉する弁、例えば熱作動式弁７１５を更に有している。
使用に当たり、ポリヌクレオチド含有サンプルをサンプルリザーバ７０４に添加する。代表的なサンプルの量は、約１００μＬ〜約２ｍＬである。ただし、これよりも多い又は少ない量を使用できる。試薬リザーバ７０６をあらかじめ試薬が入れられたデバイス７００のユーザに提供するのがよい。変形例として、デバイス７００は、ユーザが試薬をデバイス７００に追加するよう構成されたものであってもよい。いずれの場合においても、試薬は、例えばＮａＯＨ溶液及び（又は）緩衝溶液、例えば、本明細書において説明したかかる溶液のうちの任意のものを含むのがよい。
サンプル及び必要ならば試薬をデバイス７００にいったん追加すると、キャップ７１０を閉じてサンプル及び試薬物質の蒸発を阻止する。
また図１２を参照すると、オペレータ７１８は、デバイス７００を動作させるよう構成されている。オペレータ７１８は、第１の熱源７２０及び第２の熱源７２２を有している。第１の熱源７２０は、例えばサンプルリザーバ７０４内に存在するサンプルを加熱してポリヌクレオチド含有サンプルの細胞を溶解させて自由なポリヌクレオチドを調製する。
デバイス７００は、ポリヌクレオチド含有サンプル中に存在するポリペプチドのペプチド結合を分割するよう構成された酵素、例えばプロテアーゼ、例えばプロナーゼを含む酵素リザーバ７１２を更に有するのがよい。酵素リザーバ７１２をあらかじめ酵素が入れられたデバイス７００のユーザに提供するのがよい。変形例として、デバイス７００は、ユーザが酵素をデバイス７００に追加するよう構成されたものであってもよい。
デバイス７００を用いると、測定されるべきポリヌクレオチドの量に対して存在する抑制物質の量を減少させることができる。かくして、サンプルを処理領域７０２を通って溶出させてサンプルの成分をビーズ７０５に接触させる。ビーズ７０５は、本明細書のどこか別の場所に説明したように抑制物質と比較して、サンプルのポリヌクレオチドを保持する。弁７１４が開放状態にある場合、処理領域７０２中に保持されなかったサンプル成分は、開口部を通ってデバイス７００から出る。
ポリヌクレオチド含有サンプルが処理領域７０２を通っていったん出ると、或る量の試薬、例えば洗浄溶液、例えば、バッファ液、例えば１％トリトンＸ１００を含むｐＨ８．０のトリス−ＥＤＴＡを処理領域７０２を通って溶出させる。洗浄溶液は一般に、試薬リザーバ７０６内に蓄えられ、この試薬リザーバは、或る量の洗浄溶液を放出するよう構成された弁を有するのがよい。洗浄溶液は、保持されたポリヌクレオチドを溶出させないで、残りのポリヌクレオチド含有サンプル及び抑制物質を溶出させる。
抑制物質を保持状態のポリヌクレオチドからいったん分離すると、ポリヌクレオチドは、ビーズ７０５から放出される。幾つかの実施形態では、ビーズ７０５、リリース溶液、例えば洗浄溶液とは異なるｐＨを持つＮａＯＨ溶液又はバッファ溶液に接触させることによりポリヌクレオチドを放出する。変形例として又は組合せ例として、保持状態のポリヌクレオチドを有するビーズを例えば、オペレータ７１８の第２の熱源７２２を用いることによって加熱する。加熱を用いてポリヌクレオチドを放出させると、リリース溶液は、洗浄溶液と同一であるのがよい。
ガス圧力発生器７０８を用いると、放出状態のポリヌクレオチドを含む或る量のリリース溶液をデバイス７００から追い出すことができる。ガス圧力発生器及び（又は）オペレータ７１８は、発生器７０８内に存在するガスを加熱する熱源を有するのがよい。加熱されたガスは膨張し、ガス圧力を発生させてサンプルを追い出す。幾つかの実施形態では、熱的に発生したガス圧力を用いるにせよそうでないにせよ、ガス圧力発生器７０８は、所定容積の物質を追い出すよう構成されている。代表的には、追い出された溶液の量は、約５００μＬ以下、約２５０μＬ以下、約１００μＬ以下、約５０μＬ以下、例えば約２５μＬ以下である。
実施例
以下の実施例は、例示であって、本発明を限定するものではない。
保持部材の調製
約１０11ｍＬ-1の濃度のカルボキシレート表面磁性ビーズ（セラジン社のセラ−マグ・マグネチック・カルボキシレート（Sera-Mag Magnetic Carboxylate）改質ビーズ部品番号３００８０５０２５０）をｐＨが６．１の５００ｍＭ２−（Ｎ−モルフォリニオ）−エタンスルフォン酸（ＭＥＳ）緩衝液中のＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）及び１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ）を用いて３０分間活性化させた。活性化状態のビーズを、３０００Ｄａ又は３００，０００Ｄａの平均分子量ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）で培養した。非結合状態のＰＬＬを除去するために２回の洗浄後、ビーズをいつでも使用できる状態にした。
マイクロフルイディックデバイス
図１３及び図１４を参照すると、マイクロフルイディックデバイス３００を作製して抑制物質からのポリヌクレオチドの分離を実証した。デバイス３００は、第１の基板部分３０２′及び第２の基板部分３０４′を有し、かかる第１及び第２の基板部分は、それぞれ、第１及び第２の層３０２ａ′，３０２ｂ′及び３０４ａ′，３０４ｂ′を備えている。第１の層３０２ａ′及び第２の層３０２ｂ′は、入口３１０′及び出口３１２′を有するチャネル３０６′を画定している。第１及び第２の層３０４ａ′，３０４ｂ′は、入口３１４′及び出口３１６′を有するチャネル３０８′を画定している。接着剤３２４′を用いて第１の基板部分３０２′と第２の基板部分３０４′を結合してフィルタ３１８′が出口３１２′と入口３１４′との間に位置した状態で出口３１２′が入口３１４′と連通するようにした。出口３１２′の一部を上述したように調製した活性化状態のビーズで満たして保持部材（ビーズ）を有する処理領域３２０′を提供した。接着剤３２６′で固定したピペット３２２′（図１４）は、サンプルの導入を容易にした。
使用に当たり、入口３１０′を介して導入したサンプルは、チャネルに沿って流れて処理領域３２０′を通過した。過剰のサンプル物質は、チャネル３０８′に沿って流れ、出口３１６′を介してデバイス３００′から流出した。ポリヌクレオチドを抑制物質と比較してビーズにより優先的に保持した。サンプルをいったん導入すると、追加の液体、例えば洗浄液及び（又は）保持状態のポリヌクレオチドを放出するのに用いられる液体を入口３２６′から導入した。
ＤＮＡの保持
デバイス３００′のポリ−Ｌ−リジン改質ビーズによるポリヌクレオチドの保持を、約１０００個のビーズを含む約１μＬの容量の処理領域を有するデバイスをそれぞれ調製することにより実証した。ビーズを約１５，０００〜３０，０００Ｄａのポリ−Ｌ−リジンで改質した。各処理領域をニシンの精子ＤＡＮを含む液体（濃度が約２０ｍｇ／ｍＬの約２０μＬのサンプル）で満たし、それによりビーズと液体を接触状態に配置した。液体とビーズを１０分間接触状態にした後、液体を各処理領域から取り出し、これに定量リアルタイムＰＣＲを施して液体中に存在するニシンの精子ＤＡＮの量を測定した。
２つのコントロール（対照）を実施した。先ず最初に、他の点では同一の処理領域に非改質状態のビーズ、即ち、活性化ステップ及びポリ−Ｌ−リジン培養ステップを除き、ポリ−Ｌ−リジンビーズと同一であるビーズを詰め込んだ。ニシンの精子ＤＮＡを含む液体をこれらビーズに接触させ、１０分間放置し、取り出し、次にこれに定量リアルタイムＰＣＲを施した。第２に、ニシンの精子ＤＮＡを有する液体（「非処理液体」）に定量リアルタイムＰＣＲを施した。
図１５を参照すると、第１及び第２のコントロールは、非改質状態のビーズと接触した液体及び非処理液体中にニシンの精子ＤＮＡが存在していることを表す本質的に同一の反応を示した。３０００個のポリ−Ｌ−リジンビーズと接触した液体は、改質状態のビーズがニシンの精子ＤＡＮの実質的に全てを保持したことを表す弱い応答を示した。３００，０００Ｄａのポリ−Ｌ−リジンビーズと接触した液体のＰＣＲ応答は、３０００Ｄａの場合よりも少なくとも約５０％高く、低分子量表面改質がニシンの精子ＤＮＡを保持するのに一層効率的であったことを表す増幅応答を示した。
ポリ−Ｌ−リジン改質ビーズからのＤＮＡの放出
処理領域を有するデバイスに３０００Ｄａのポリ−Ｌ−リジン改質ビーズを詰め込んだ。ビーズレンサ球菌属（ＧＢＳ）から得たポリヌクレオチドを含む液体を、ニシン精子ＤＮＡについて上述したように、ビーズに接触させ、１０分間培養した。ｐＨ８の二重ｍＭトリス、１ｍＭＥＤＴＡ及び１％トリトンＸ−１００緩衝溶液中の約１０，０００個のＧＢＳバクテリアに３分間９７℃で熱的ライシングを施すことによりこの液体を得た。
１０分後、ビーズと接触状態の液体を、処理領域を通って約１０μｌの洗浄溶液（１％トリトンＸ−１００を含むｐＨ８のトリス−ＥＤＴＡ）を流すことにより除去した。次いで、約１μｌの５ｍＭＮａＯＨ溶液を処理領域に添加した。このプロセスは、詰め込まれた処理領域をビーズと接触状態のＮａＯＨ溶液で満たされたままにした。ビーズと接触状態の溶液を９５℃まで加熱した。９５℃で５分間加熱した後、ビーズと接触状態の溶液を、処理領域に処理領域のボイド容積の３倍に等しい容積の溶液で溶出させることにより除去した。
図１６を参照すると、溶液の５つのアリコートに定量リアルタイムＰＣＲ増幅を施した。アリコートＥ１，Ｅ２，Ｅ３は各々、約１μｌの液体を収容していた。アリコートＬは、処理領域を通過した元のサンプルの液体に対応していた。アリコートＷは、加熱を行わないで洗浄溶液から得られた液体であった。アリコートＥ１は、チャネル３０８の容積にほぼ等しいデバイス３００の排除容積ボイド容量に相当している。かくして、アリコートＥ１の液体は、加熱中、ビーズと非接触状態でチャネル３０８内に存在していた。この液体は、加熱に先立って処理領域を通過した。アリコートＥ２は、加熱中、ビーズと接触状態で加熱領域内に存在していた液体から成る。アリコートＥ３は、アリコートＥ２を処理領域から除去するために用いられた液体から成る。
図１６で分かるように、初期のサンプル中に存在するＧＢＳのＤＮＡの６５％以上は、ビーズにより保持され、ビーズから放出された（アリコートＥ２）。アリコートＥ２は又、ビーズにより保持されたＤＮＡのうち８０％以上の放出を立証している。ＧＢＳのＤＮＡの約１８％以下は、捕捉されることなく処理領域を通過した。加熱が行われなかった洗浄溶液は、ＧＢＳのＤＡＮのうち５％未満から成っていた（アリコートＷ）。
ポリヌクレオチドと抑制物質の分離
頬の内層からの頬細胞は、単一のヌクレオチド多型性（ＳＮＰ）検出に使用できるヒトの遺伝子物質（ＤＮＡ）の源となる。頬細胞から成るサンプルに熱的融解を施してＤＮＡを細胞内部から放出させた。上述したように、デバイス３００を用いてＤＮＡを付随した抑制物質から分離した。図１６のアリコートＥ２に対応した洗浄済みサンプルにポリメラーゼレンサ反応を施した。熱的融解から得られたコントロール又は手を加えていないサンプルも又増幅させた。
図１７を参照すると、洗浄後サンプルは、コントロールサンプルの場合よりも少ないサイクルで実質的に高いＰＣＲ応答を示した。例えば、洗浄後サンプルは、３２サイクル中２０の応答を超え、コントロールサンプルは、同一の応答を達成するのに約４５サイクルを必要とした。
血液は、感染症薬、癌マーカ及び他の遺伝マーカの検出を含む種々の診断検査におけるサンプルマトリックスとして役立つ。血液サンプル中に存在するヘモグロビンは、ＰＣＲの文書化された能力の有る抑制剤である。２つの５ｍｌ血液サンプルを２０ｍＭトリスｐＨ８、１ｍＭＥＤＴＡ、１％ＳＤＳ緩衝液中で溶解させてそれぞれのデバイス３００に導入し、かかるデバイスを上述したように動作させて２つの洗浄サンプルを調製した。第３の５ｍｌ血液サンプルを溶解させ、ミネソタ州所在のジェントラ・システムズ（Gentra Systems）社の商用ＤＮＡ抽出法Puregeneを用いて調製した。それぞれの洗浄サンプル及び商用抽出法を施したサンプルを対立遺伝子弁別分析（Allelic discrimination analysis）（カリフォルニア州所在のアプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社のＣＹＰ２Ｄ６＊４試薬）のために使用した。各サンプルは、血液の薬１ｍｌ分に相当するＤＮＡの量を収容していた。
図１８を参照すると、洗浄後サンプル及び商用抽出サンプルは、ほぼ同じＰＣＲ応答を示し、デバイス３００′の処理領域は、抑制剤を血液サンプルから効果的に除去したことを立証した。
耐プロテアーゼ性保持部材
次の処理のためにポリヌクレオチドサンプルの調製では、サンプルにプロテアーゼ処理を行う場合が多く、このプロテアーゼ処理では、プロテアーゼは、サンプル中のタンパク質のペプチド結合を分割する。例示のプロテアーゼは、プロナーゼ、即ち、体内プロテアーゼと体外プロテアーゼの混合物である。プロナーゼは、大抵のペプチド結合を分割する。或る特定のリガンド、例えばポリ−Ｌ−リジンは、プロナーゼ及び他のプロテアーゼによる断裂を受けやすい。かくして、サンプルが一般に保持部材の存在下でプロテアーゼ処理を受けない場合、これに結合されたリガンドは、プロテアーゼに敏感である。
ポリ−Ｄ−リジン、即ち、ポリ−リジンの右旋エナンチオマーは、プロナーゼ及び他のプロテアーゼによる分割に抵抗する。プロテアーゼ処理を受けた場合であっても結合状態のポリ−Ｄ−リジンを含む保持部材がＤＮＡを保持する能力について研究した。
８つのサンプルを調製した。４つで第１の群から成るサンプルは、１０μｌ緩衝溶液中に１０００個のＧＢＳ細胞を含んでいた。４つで第２の群をなすサンプルは、１０μｌ緩衝液中に１００個のＧＢＳ細胞を含んでいた。８つのサンプルの各々を３分間掛けて９７℃まで加熱してＧＢＳ細胞を融解させた。４つのサンプルの組を加熱状態のサンプルから作った。各サンプル組は、第１及び第２の群の各々から１つのサンプルを含んでいた。各サンプル組のサンプルを次のように処理した。
図１９Ａを参照すると、サンプル組１のサンプルにプロナーゼ培養を施してそれぞれのタンパク質分割サンプルを調製し、次にこれらサンプルを加熱してプロテアーゼを非活性化した。タンパク質分割加熱サンプルを各々が１組のポリ−Ｌ−リジン改質ビーズから成るそれぞれの保持部材に接触させた。５分後、それぞれの組のビーズを５マイクロリットルの５ｍＭＮａＯＨ溶液で洗浄して抑制剤及びタンパク質分割生成物を結合状態のＤＡＮから分離した。それぞれの組のビーズを各々、ＮａＯＨ溶液の第２のアリコットに接触させ、２分間８０℃に加熱してＤＮＡを放出させた。放出状態のＤＡＮを含む溶液を等量の緩衝液で中和した。中和溶液を分析してＤＮＡ回収効率を求めた。結果を平均して図１９Ｂに示した。
サンプル組２のサンプルにプロナーゼ培養を施してそれぞれのタンパク質分割サンプルを調製し、次にこれらサンプルを加熱してプロテアーゼを非活性化した。タンパク質分割加熱サンプルを各々が１組のポリ−Ｄ−リジン改質ビーズから成るそれぞれの保持部材に接触させた。５分後、それぞれの組のビーズを５マイクロリットルの５ｍＭＮａＯＨ溶液で洗浄して抑制剤及びタンパク質分割生成物を結合状態のＤＡＮから分離した。それぞれの組のビーズを各々、ＮａＯＨ溶液の第２のアリコットに接触させ、２分間８０℃に加熱してＤＮＡを放出させた。放出状態のＤＡＮを含む溶液を等量の緩衝液で中和した。中和溶液を分析してＤＮＡ回収効率を求めた。結果を平均して図１９Ｂに示した。
サンプル組３のサンプルにプロナーゼ培養を施してそれぞれのタンパク質分割サンプルを調製した。プロテアーゼを熱的又は化学的の何れによっても非活性化させなかった。タンパク質分割サンプルを各々が１組のポリ−Ｌ−リジン改質ビーズから成るそれぞれの保持部材に接触させた。５分後、それぞれの組のビーズを５マイクロリットルの５ｍＭＮａＯＨ溶液で洗浄して抑制剤及びタンパク質分割生成物を結合状態のＤＡＮから分離した。それぞれの組のビーズを各々、ＮａＯＨ溶液の第２のアリコットに接触させ、２分間８０℃に加熱してＤＮＡを放出させた。放出状態のポリヌクレオチドを含む溶液をそれぞれ等量の緩衝液で中和した。中和溶液を分析してＤＮＡ回収効率を求めた。結果を平均して図１９Ｂに示した。
サンプル組４のサンプルにプロナーゼ培養を施してそれぞれのタンパク質分割サンプルを調製した。プロテアーゼを熱的又は化学的の何れによっても非活性化させなかった。タンパク質分割加熱サンプルを各々が１組のポリ−Ｄ−リジン改質ビーズから成るそれぞれの保持部材に接触させた。５分後、それぞれの組のビーズを５マイクロリットルの５ｍＭＮａＯＨ溶液で洗浄して抑制剤及びタンパク質分割生成物を結合状態のＤＡＮから分離した。それぞれの組のビーズを各々、ＮａＯＨ溶液の第２のアリコットに接触させ、２分間８０℃に加熱してＤＮＡを放出させた。放出状態のポリヌクレオチドを含む溶液を等量の緩衝液で中和した。中和溶液を分析してＤＮＡ回収効率を求めた。結果を平均して図１９に示した。
図１９Ｂで理解されるように、サンプル組４を用いて平均で８０％を超えるＤＮＡをＧＢＳ細胞から回収し、この場合、サンプルをポリ−Ｄ−リジン改質ビーズに接触させ、プロテアーゼ非活性化を行わないでビーズの存在下でプロナーゼ培養を施した。サンプル組４に関する回収効率は、他のサンプルのいずれの場合よりも２倍以上高い。具体的に説明すると、サンプル組１，２，３，４に関する回収効率はそれぞれ、２９％、３２％、１４％、８１．５％であった。かかる回収効率の立証するところによれば、高い回収効率をＤＮＡを保持する保持部材の存在下でプロテアーゼ培養を施したサンプルについて得ることができる。
次に、本発明の好ましい態様を示す。
１． サンプル調製装置であって、
ポリカチオンポリアミドが結合された表面と、
前記表面と連通状態にあり、前記表面を流体サンプルに接触させるサンプル導入通路とを有する、サンプル調製装置。
２． 前記表面と接触状態にある水性液を少なくとも約６５℃まで加熱するよう構成された熱源を更に有する、上記１記載のサンプル調製装置。
３． ｐＨが少なくとも約１０の液体のリザーバを更に有し、前記装置は、前記表面を前記液体に接触させるよう構成されている、上記１記載のサンプル調製装置。
４． 前記表面は、複数の粒子の表面から成る、上記１記載のサンプル調製装置。
５． 前記表面を前記装置から取り出すことができる、上記１記載のサンプル調製装置。
６． 前記ポリカチオンポリアミドは、ポリ−Ｌ−リジン及びポリ−Ｄ−リジンのうち少なくとも一方を含む、上記１記載のサンプル調製装置。
７． サンプルを処理する方法であって、
液体及び或る量のポリヌクレオチドを含む混合物を用意するステップと、
ポリメラーゼ連鎖反応抑制物質と比較して、ポリヌクレオチドを優先的に保持するよう構成された保持部材を前記混合物に接触させるステップと、
混合物中の液体の実質的に全てを前記保持部材から分離するステップと、
前記保持部材によって保持されたポリヌクレオチドを前記保持部材から放出するステップとを有する、方法。
８． 前記ポリヌクレオチドは、約７．５Ｍｂｐ以下のサイズを有する、上記７記載の方法。
９． 前記液体は、第１の液体であり、前記液体の実質的に全てを分離するステップは、前記保持部材を第２の液体に接触させるステップを含む、上記７記載の方法。
１０． 前記保持部材を第２の液体に接触させるステップは、熱作動式圧力源を作動させて圧力を前記第２の液体に加えるステップを含む、上記９記載の方法。
１１． 前記保持部材を第２の液体に接触させるステップは、熱作動式弁を開放させて前記第２の液体を前記保持部材に流体連通させるステップを含む、上記１０記載の方法。
１２． 前記第２の液体の容積は、約５０マイクロリットル以下である、上記１０記載の方法。
１３． 前記保持部材は、ポリヌクレオチドを優先的にポリメラーゼ連鎖反応抑制物質に結合するよう構成された構成物から成る表面を有する、上記１０記載の方法。
１４． 前記抑制物質は、ヘモグロビン、ペプチド、糞便構成物、フミン酸、粘膜構成物、ＤＮＡ結合タンパク質、又はサッカリドのうち少なくとも１つを含む、上記１３記載の方法。
１５． 前記表面は、ポリリジンから成る、上記１３記載の方法。
１６． 前記ポリリジンは、ポリ−Ｌ−リジン及びポリ−Ｄ−リジンのうちの少なくとも一方から成る、上記１５記載の方法。
１７． 前記分離ステップは、前記第１の液体を第２の液体で置き換えるステップを含む、上記１５記載の方法。
１８． 前記第２の液体は、洗浄剤から成る、上記１７記載の方法。
１９． 前記放出ステップは、前記保持部材を少なくとも約５０℃の温度まで加熱するステップを含む、上記９記載の方法。
２０． 前記保持部材は、液体の存在下で加熱され、前記温度は、加熱中、前記保持部材の存在下では前記液体を沸騰させるには不十分である、上記１９記載の方法。
２１． 前記温度は、１００℃以下である、上記２０記載の方法。
２２． 前記温度は、約１０分間以内にわたって維持される、上記１９記載の方法。
２３． 前記方法は、前記保持部材の遠心分離法を含まない、上記１９記載の方法。

Claims (11)

  1. ポリヌクレオチド含有サンプルを処理する方法であって、
    第１の組をなす条件下で、サンプルからのポリヌクレオチドを処理チャンバ内の複数の結合粒子上に保持する保持ステップを含み、前記保持ステップは、ポリカチオンポリアミドを含む前記複数の結合粒子の表面に前記ポリヌクレオチドを結合する結合ステップを含み、前記サンプルの体積は０．５マイクロリットルから３ミリリットルであり、前記第１の組をなす条件は、サンプル含有溶液について、８．５以下の第１のｐＨと、５０℃以下の第１の温度を含み、
    第２の組をなす条件下で、前記複数の結合粒子から前記ポリヌクレオチドを塩基性水酸化物溶液に放出する放出ステップを含み、
    前記第２の組をなす条件は、塩基性水酸化物溶液を添加することによる前記ｐＨの第２のｐＨへの増加と、塩基性水酸化物溶液の温度の第２の温度への上昇を含み、前記第２のｐＨは１１．０以上であり、前記第２の温度は８０℃と１００℃の間である、方法。
  2. 前記ポリカチオンポリアミドは前記結合粒子の前記表面に共有結合する、請求項１記載の方法。
  3. 前記結合粒子は、前記ポリカチオンポリアミドのための結合ポイントを提供するために、１又は２以上のカルボキシル基を含む、請求項１記載の方法。
  4. 前記放出ステップは、液体の存在下で前記複数の結合粒子を加熱するステップを含み、前記第２の温度は、前記液体を沸騰させるには不十分である、請求項１記載の方法。
  5. 前記方法はさらに、前記第２の温度を１分から１０分の間、維持するステップを含む、請求項１記載の方法。
  6. ポリヌクレオチド含有サンプルを処理する方法であって、
    前記サンプルを、表面に結合したポリカチオンポリアミドを有する複数の結合粒子に接触させる接触ステップを含み、第１のｐＨ及び第１の温度において前記結合粒子は該結合粒子上に１又は２以上のポリヌクレオチドを保持し、前記サンプルの体積は０．５マイクロリットルから３ミリリットルであり、
    サンプル含有溶液について、前記第１のｐＨは８．５以下であり、前記第１の温度は５０℃以下であり、
    １１．０以上の第２のｐＨ及び８０℃と１００℃の間の第２の温度の塩基性水酸化物溶液に前記結合粒子を接触させ、これにより前記複数の結合粒子から前記ポリヌクレオチドを放出する、放出ステップを含み、前記塩基性溶液は、２ｍＭから５００ｍＭのモル濃度を有する水酸化物溶液を含む、方法。
  7. 前記水酸化物溶液は、水酸化ナトリウムを含む、請求項６記載の方法。
  8. 前記水酸化物溶液は、１５ｍＭのモル濃度を有する、請求項６記載の方法。
  9. 前記水酸化物溶液は、５ｍＭのモル濃度を有する、請求項６記載の方法。
  10. 前記ポリカチオンポリアミドは、前記結合粒子の表面に共有結合している、請求項６記載の方法。
  11. 前記結合粒子は、前記ポリカチオンポリアミドのための結合点を提供するための１又は２以上のカルボキシル基を含む、請求項６記載の方法。
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