JP6466715B2 - 紙欠陥及び機械フェルトの微生物量を評価する核酸の検出及び定量化 - Google Patents

Description

《関連出願についてのクロスリファレンス》
適用なし。

《連邦支援の研究又は開発に関する記載》
適用なし。

《背景技術》
本発明は、一般に、機械フェルト及び紙欠陥に生じる又は存在する微生物の検出及び識別に有用な、組成物、装置、及び方法に関する。

例えば、米国特許第７，３０６，７０２号明細書、及び米国特許第５，９２８，８７５号明細書に記載されているように、紙は一般に、水及びセルロース繊維でできた繊維懸濁液（パルプ完成紙料）から、連続的に製造される。典型的な紙製造工程は、形成、プレス、及び乾燥の３つの工程から成る。形成工程では、希釈したパルプ完成紙料を、ワイヤ上又は２つのワイヤの間へと誘導する。大半の水がワイヤによってパルプ完成紙料から排出され、濡れたペーパーウェブを生じる。プレス工程では、残存する水の多くをウェブから抽出するのに使用される一つの又は一般的には一つ以上の多孔質機械フェルトにペーパーウェブを接触させる。多くの場合、ピックアップフェルトは、濡れたペーパーウェブが接触し、フェルトの後ろに配置されたサクションピックアップロールによってワイヤからペーパーウェブを除去し、次にペーパーウェブを残りのプレス部へと輸送するのに用いられる、最初のフェルトである。次にペーパーウェブを、一般に、回転プレスロール、及び／又は静止要素、例えば互いに近接して配置され、一般にプレスニップと呼ばれるものを形成しているシュープレスからそれぞれ構成される一つ以上のプレスを通過させる。それぞれのニップにおいて、ペーパーウェブを、ペーパーウェブから水を追い出す一つ又は２つの機械フェルトにそれぞれ接触させ、圧力及び／又は減圧機によってプレスフェルトに接触させる。シングルフェルトのプレスニップでは、ペーパーウェブは、一方の側がプレスロールに、他方の側がフェルトに接触する。ダブルフェルトのプレスニップでは、ペーパーウェブを、２つのフェルトの間を通過させる。プレス部の後、ペーパーウェブを、通常一連の水蒸気被加熱乾燥缶を波状に通すことによって乾燥させ、残りの水を除去する。

機械フェルトは、多くの場合、織目状に配置されたフィラメントの、一般に１〜４つの個々の層でできたウール又はナイロンの基材布帛から成る。一つ以上の基材織物層として、押出し高分子膜又はメッシュを挙げることができる。基材布帛フィラメントより小径のバット繊維を、両側の基材の中に縫って、フェルトを厚いブランケットの様な外観にする。機械フェルトは、ニップのペーパーウェブから水を急速に取り入れ、紙及びフェルトがプレスニップを出る際に水がシートへと再吸収されて戻らないよう保つように設計されている。機械フェルトは、通常、シート接触段階と戻り段階との間を連続的に循環するエンドレスループを通過するベルトである。ニップでペーパーウェブからフェルト内へと抜かれた水は、一般に、フェルト戻り段階の間に、一般的にユーレボックスとよばれるところで、減圧によってフェルトから除去される。

製紙系は、機械系に微生物を導入するいくつかの原料を利用している。これは、原木繊維、リサイクル繊維、淡水、澱粉、色素、及び他の化学添加物が挙げられる。微生物は、製紙系の中に存在する暖かく栄養豊かな環境の多く又は全てにおいて繁殖し、多様な微生物群につながる。微生物の成長の制御が不十分であると、剥がれてフィルタ若しくはノズルの詰まり、シートの欠陥（例えば斑点若しくは孔）又は破損につながる表面堆積の形成を許す。微生物は、フェルト及び機械布帛の中で繁殖して、水の除去、及び機械効率又は事業効率に悪影響を与える可能性がある。

製紙系における微生物の増加は、非常に有害で費用がかかる可能性がある。装置面上の微生物の成長は、剥がれてシートの欠陥及び孔の一因となる堆積の形成につながる可能性がある。汚染されたシャワー水処置又はプロセス水は、フェルト上の細菌の成長につながり、結果として一般にフェルト上の詰まりの形成につながる可能性がある。これらの詰まりは、多くの問題、最も顕著にはペーパーウェブからの水の除去の障害を生じさせる。微生物の成長の結果、フェルト又は他の製紙装置の、過剰でコストがかかる複数の煮沸及び洗浄の必要性につながる可能性がある。これらの問題は、どの微生物であるかの誤った決定がなされると、紙質を更に損なう処理につながり、処理装置に更に衝撃を与え、及び／又は潜在的な微生物の侵入の制御さえできない可能性があるので、悪化する可能性がある。更に、生物学的に生じた問題と、機械的又は化学的に生じた問題とを誤って区別することは、不適切な、浪費的な、及び場合によっては逆効果な努力につながる可能性がある。

どの微生物が製紙系に存在するかを識別する多くの従来の方法が知られている。しかしながら、これらの方法は、紙シート又はフェルトに適用する場合、特に不十分である。いくつかの従来の方法、例えば、米国特許第８，０１２，７５８号明細書、米国特許第７，９８１，６７９号明細書、及び米国特許第７，９４９，４３２号明細書は、生きた微生物学的微生物によって製造される製紙系の流体における様々な効果を検出している。他の方法、例えば、米国特許第５，２８１，５３７号明細書は、様々な分析を行うために、生きた微生物混入物のサンプルを得て、それをより成長させることに依存している。しかしながら、紙シート及びフェルトの背景においては、フェルト又は紙のサンプルを取る時に、それらは培養するのに充分な（若しくは少しも）生きた微生物、又は微生物が生産する何らかの化学的生産物をもはや含まないので、これらの方法は特に不適切である。また、加熱部又は乾燥部よりも下流にある製紙系の品目（例えば紙シート、及びフェルト）は、既に欠陥を生じたあとに死んだ欠陥を生ずる微生物の全てを有している。生きた微生物の存在に依存しない代替の方法もまた、多くの場合偽陽性を生ずるので、不十分な傾向がある。例えば、ニンヒドリン（第一級又は第二級アミンの検出に用いる）、及びＩＲ分光法は、非生物学的起源（例えば化学的な添加物又は混入物）を有することがある材料を検出するので、多くの場合偽陽性又は偽陰性を生ずる。

したがって、機械フェルト及び紙シートに存在する微生物を正確に識別する新規な方法及び組成物に明確な有用性があることは明らかである。この節に記載した技術は、具体的に示さない限り、本明細書に引用する任意の特許、刊行物、又はその他の情報が、本発明に関する「従来技術」であるとの容認を構成することを意図するものではない。更に、この節は、調査を行ったこと、又は米国特許施行規則第１．５６条（ａ）に定められている他の関連情報が存在しないことを意味するものと解釈すべきでない。

本発明の少なくとも一つの実施形態は、製紙工程における微生物の侵入を識別する方法を対象とする。方法は、１）製紙工程に関連する品目上の欠陥に注目すること、２）品目から取った少なくとも一つのサンプルに対して、少なくとも一つの微生物に関連することが知られる核酸配列を標的にしたプライマーを利用したＰＣＲ分析を少なくとも一つ行うことと、３）肯定的な結果を示す場合、微生物の測定した濃度が所定の閾値を超えるかどうか決定することと、４）測定した濃度が閾値を超える場合、少なくとも一つの更なるＰＣＲ分析を行い、サンプルに存在する特定の微生物を決定することと、５）検出したそれぞれの微生物の測定した濃度が所定の閾値を超える場合、欠陥は微生物の侵入に少なくとも一部起因している。

品目はフェルトであってもよい。欠陥はフェルトの一つ以上の詰まりでもよい。品目は、製紙工程によって製造される紙シートでもよく、欠陥は、紙シート上の一つ以上の孔、変色、線条、斑点、半透明の斑点、及び任意のこれらの組み合わせでもよい。方法は、識別した微生物を、保存及び／又は送信することができる形式に記録する工程をさらに含んでもよい。方法は識別した微生物の改善措置（ｒｅｍｅｄｙｉｎｇ）に関連する殺生物性プログラムを行う工程をさらに含んでもよい。ＰＣＲ分析はｑＰＣＲ分析でもよい。ＰＣＲ分析の閾値は、１ｍＬ当たりに１０^４セル、又は１グラム当たりに１０^４セルでもよい。品目上に、欠陥を生じたであろう生きた微生物がいないように品目を乾燥してもよい。

前記品目の状態が、製紙工程の間に品目が遭遇する流体とは大きく異なっており、品目に住む微生物が流体内の微生物とは異なっており、流体内に住む微生物の決定は、欠陥を生じている品目上の微生物の誤った識別を生ずることがある。閾値を上回る任意の微生物の存在を決定することができるよう、方法は、充分な種類のプライマーを品目のサンプルに適用する工程を更に含んでもよい。方法は、ＰＣＲ分析が閾値を超えたいかなる微生物も示さない場合、欠陥が非生物学に基づくものであると識別する工程を更に含んでもよい。方法は、非生物学的化学的混入物の改善措置（ｒｅｍｅｄｙ）を製紙工程に適用する工程を更に含んでもよい。ＰＣＲ分析はサンプルにはびこる微生物量を決定してもよい。欠陥に注目する前に、品目を製紙工程の加熱部又は乾燥部に通して、欠陥を生じた微生物を殺してもよい。

以下の図面を具体的に引用して、発明の詳細な説明を以下に記載する。
図１は、本発明を適用したサンプルの結果を説明する３つのグラフを含む。 図２は、本発明を適用したサンプルの合計細菌量のグラフを説明する。 図３は、本発明を適用したサンプルの合計細菌量のグラフである。 図４は、２つの異なる製紙ミルからの機械フェルトから集めたＤＮＡサンプルにおける、微生物の多様性が変化したことを意味する円グラフを説明する。

以下の定義を提供して、本出願において用いられる用語、特に請求項をどのように解釈すべきかを定める。定義の体系は単に便宜上のためであり、いずれの定義も何らかの特定のカテゴリーに制限することを意図するものではない。

「欠陥」とは、製紙工程に関する品目の望ましくない特性を意味する。欠陥としては限定されないが、フェルト上の一つ以上の詰まり、及び孔、変色、線条、斑点、半透明の斑点、及び任意のこれらの組み合わせとしての紙シートのそのような特性が挙げられる。

「フェルト」とは、材料の運搬装置として機能し、製紙工程において使用する、混ぜ合わせたウール又は任意の他の繊維でできたベルトを意味しており、混ぜ合わせた繊維は、水又は他の流体を通過してもよい複数の内腔（ｌｕｍｅｎ）を画定する。フェルトは、プレスするロールの間に緩衝作用を提供してもよく、製紙材料から水を除去するために用いる媒体であってもよい。フェルトとしては、限定されないが、ボトムフェルト、ボトムボードフェルト、筒状組織湿気フェルト、乾燥フェルト、無端フェルト、ピックアップフェルト、サクションピックアップフェルト、ハーパートップフェルト、及びトップフェルトが挙げられる。

「紙製品又は紙シート」とは、伝統的には必然ではないがセルロース繊維を含む、製紙工程のあらゆる形成した繊維構造の最終製品を意味する。そのような最終製品の例としては、限定されないが、化粧紙、トイレットペーパー、テーブルナプキン、コピー用紙、プリンター用紙、筆記用紙、ノート紙、新聞紙、板紙、ポスター紙、ボンド紙、ボール紙等が挙げられる。

「製紙工程」とは、原料を紙製品に変換するための一つ以上の工程を意味しており、限定されないが、パルピング、蒸解、精製、乾燥、カレンダリング、プレス、クリーピング、脱水、及び漂白等の工程の一つ以上が挙げられる。

「ＰＣＲ分析」とは、ポリメラーゼ連鎖反応分析を意味する。

「詰まり」とは、フェルトの内腔内に配置された固体、半固体、粘性体、及び／又は他の材料の堆積を意味する。詰まりは、内腔を通る物質の流れを阻害することがあり、及び／又はフェルトの何らかの他の機能性を弱めることがある。

「プライマー」とは、組成物、典型的には、ＤＮＡの特定の部分と相補的であり、ＤＮＡの特定の部分に隣接するＤＮＡと相補的なヌクレオチド鎖を合成する開始点として役立つことが知られる、ヌクレオチドの短いストランドを意味する。

「プローブ」とは、ＤＮＡの目的の部分と結合するよう構成され配置される組成物であって、そのように結合したときに容易に検出することができ、それによってＤＮＡの目的の部分の有無を示すのに用いられる組成物を意味する。

「ｑＰＣＲ分析」とは、定量的及び／又は質的ポリメラーゼ連鎖反応分析を意味する。

「微生物」とは、製紙工程において使用する装置の中に、装置に隣接して、装置の上にそれ自身が入り込むか、又は付着するのに十分小さいあらゆる微生物を意味しており、限定されないが、顕微鏡の助けを借りずに見ることができないほど小さな微生物、肉眼で見ることができるが小さすぎて肉眼では見えない多くの個々の微生物を含むそのような小さな微生物の集合又はコロニー、並びに肉眼で見ることができる一つ以上の微生物が挙げられ、限定されないが、何らかの方法で製紙工程を損なう、例えばフェルト内の詰まりの形成、及び／又は紙シート内の欠陥を引き起こす、存在する任意の微生物が挙げられる。

本出願に記載の上記の定義又は記載が、一般的に辞書で用いられている意味、又は引用によって本出願に含まれる出典に記載されている意味と（明確に又は暗に）矛盾する場合には、本出願及び特に請求項の用語は、本出願における定義又は記載に従うものであって、一般的な定義、辞書の定義、又は引用により含まれる定義に従うものではないことを理解されたい。上記に照らして、用語が辞書によって解釈される場合にのみ用語を理解することができる場合には、用語がＫｉｒｋ−Ｏｔｈｍｅｒ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第５版（２００５年）（Ｗｉｌｅｙ、Ｊｏｈｎ ＆ Ｓｏｎｓ社出版）によって定義されていれば、この定義が、請求項において用語をどのように定義すべきかについて支配するものとする。

少なくとも一つの実施形態において、紙シート及び機械フェルトにいる微生物についての、高感度で迅速な検出方法が提供される。方法は、サンプル抽出物に存在するＤＮＡの分析を含む。サンプル自体はフェルト又は紙のシートの断片である。これらのサンプルは高度に乾燥しており、混入した微生物の生きたサンプルをほとんど又は全く含まない。ＤＮＡ分析を利用するいくつかの従来の方法としては、プローブを利用して微生物の有無を決定するインサイチュの方法を記載している国際公開２００４／０４２０８２が挙げられる。しかしながら、インサイチュの方法は、サンプルを取るときに紙シート又はフェルトが乾燥しているため、紙シート又はフェルトに適用できない。また、インサイチュの方法は、微生物の細胞分裂の間にプローブを適用することを含んでおり、生きた微生物がほとんど又は全くいない紙シート又はフェルトには不可能である。

少なくとも一つの実施形態において、ＤＮＡに基づく分析はプローブの使用を含む。少なくとも一つの実施形態において、ＤＮＡに基づく分析は、ＰＣＲプライマーを使用して、微生物の有無を検出することを含む。米国特許第５，９２８，８７５号明細書は、ＰＣＲプライマーを使用して、胞子形成細菌の有無を検出することを記載している。少なくとも一つの実施形態において、プライマーは、一群の微生物の中で高度に保存されたＤＮＡストランドの一部を標的とする。その結果、ＤＮＡの特定の部分の存在の検出は、特定の微生物の存在の決定的証拠である。フェルト及び紙シートは従来のプレーティング法又はＡＴＰ測定のための生菌を欠いているので、混入した微生物を正しく識別することが困難であることにより、ＰＣＲ分析は、特にフェルト及び紙シートの分析に有用である。

少なくとも一つの実施形態において、ＰＣＲ分析は、Ａｒｔｉｃｌｅ Ｐｒｉｍｅｒ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｗｉｔｈ ａ Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｒａｎｄａｌｌ Ｓａｉｋｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２３９巻、４８７〜４９１頁（１９８８年）に記載されている方法の一つ以上を利用することを含む。少なくとも一つの実施形態において、ＰＣＲ分析は、Ａｒｔｉｃｌｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ｖｉａ ａ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ−Ｃａｔａｌｙｚｅｄ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ、Ｋａｒｙ Ｍｕｌｌｉｓら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１５５巻、３３５〜３５０頁（１９８７年）に記載されている方法の一つ以上を利用することを含む。

少なくとも一つの実施形態において、ＰＣＲ分析は、Ｔｒａｄｅ Ｂｒｏｃｈｕｒｅ ｑＰＣＲ ｇｕｉｄｅ 、序文Ｊｏ Ｖａｎｄｅｓｏｍｐｅｌｅ（２０１２年１月１９日のウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ．ｃｏｍ／ｆｉｌｅ−ｂｒｏｗｓｅｒ．ｈｔｍｌからダウンロード）に記載されているようなｑＰＣＲ分析である。少なくとも一つの実施形態において、方法は定量的ｑＰＣＲ分析である。少なくとも一つの実施形態において、方法は質的ｑＰＣＲ分析である。

図１に示すように、少なくとも一つの実施形態において、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、核酸配列（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を標的とし、標的配列のコピー数を増加させて、下流分析に有用な量の核酸を得る方法である。この方法は、限定されないが、機械フェルト、シート欠陥、機械堆積などを含む様々なサンプルにおける微生物の検出に適用することができる。

少なくとも一つの実施形態に示すように、商業上入手可能な任意のＤＮＡ抽出キットを用いて、一旦ＤＮＡをサンプルから抽出すれば、ＰＣＲ法、例えば量的ＰＣＲ法を使用してリアルタイムでＤＮＡを分析することができる。定量的ＰＣＲはＰＣＲと同様の手法を利用しており、リアルタイムの定量成分を含む。この技術において、プライマーを用いて、微生物の同一性又は特定の遺伝子の機能に基づいて、所望のＤＮＡ配列を標的にする。検出のいくつかの形態、例えば蛍光を用いて、得られるＤＮＡ又は「ＤＮＡ単位複製配列」を検出してもよい。蛍光の変化は標的ＤＮＡの量の変化に正比例する。所定の蛍光閾値に達するのに必要なサイクル数を、特定のＤＮＡ標的に対応する標準と比較する。標準は、典型的には、純粋で数ｌｏｇにわたる濃度で知られる量の標的遺伝子である。サンプルに存在する標的ＤＮＡのコピー数は、検量線を使用して算出する。サンプル当たりのコピー数を用いて、サンプル当たりのセル数を決定する。

少なくとも一つの実施形態において、保守的なアプローチを使用して、細菌からのＤＮＡ配列を標的とするプライマーセットを使用し、合計の細菌量を定量化する。少なくとも一つの実施形態において、主要なバイオフィルム形成細菌、例えば、メイオサーマス（Ｍｅｉｏｔｈｅｒｍｕｓ）、シュードザントモナス（Ｐｓｅｕｄｏｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、及びデイノコッカス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）を標的とするプライマーセットを使用する。少なくとも一つの実施形態において、細菌のスフィンゴモナダセア（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａ）族に属する適応可能バイオフィルム形成細菌を標的とするプライマーセットを用いる。少なくとも一つの実施形態において、適応可能バイオフィルム形成細菌は、他のバイオフィルム及びプランクトンの微生物と比較して、酸化剤ベースの生体制御プログラムに対するより高い耐性を示した。少なくとも一つの実施形態において、プライマーを用いて菌類の侵入と細菌の侵入とを区別する。

機械フェルトは、一般に、様々な微生物を含むシャワーの流れ及び液槽を出入りして通過し、ここから生きたサンプルを容易に得ることができる。しかしながら、フェルトの動的状態（濡れた状態から乾燥した状態へと急速に変化し、空気及び液体をすばやく通過し、並びに曲がり、撓曲し、及び巻かれる柔らかい基材）は、多くの場合、フェルトに住んでいる微生物の数が、接触するシャワーの流れ及び液槽中に存在する微生物の数とは異なることを意味する。その結果、シャワーの流れ及び液槽の典型的な分析は、フェルト内に存在する微生物が何であるかを正しく識別しない。しかしながら、フェルトに住むことができることが知られている種類の微生物を考慮したフェルトサンプルのＰＣＲ分析は、フェルト混入物の真に正確な分析を可能にする。

少なくとも一つの実施形態において、サンプルのＤＮＡに基づく分析は、機械フェルト及び／又は最終製品紙シートに住まないことが知られている微生物の存在可能性を差し引くことを含む。少なくとも一つの実施形態において、方法は、使用するプライマーを、機械フェルト及び／又は最終製品紙シートに住むことが知られている微生物に関するプライマーに限定することを含む。

少なくとも一つの実施形態において、方法は、生物学的区系界（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｋｉｎｇｄｏｍ）レベルでＤＮＡを区別することを含む。生物学的生命体は、５つの区系界：モネラ、原生生物、植物、動物、及び菌によって分類することができる。これらの微生物は非常に異なるＤＮＡを有しており、区系界レベルで微生物のＤＮＡを識別することに集中する手順は、より具体的な決定よりも非常に単純である。フェルトとともに、異なる区系界からの微生物は多くの場合異なって最良に処理され、そのような単純な同定の形態を用いて、特定の混入物を最良に標的とした特定の処方計画を正確に確認することができる。

少なくとも一つの実施形態において、一つより多いプライマーを用いて、一つより多い一意的に認識可能な核酸配列を有する微生物を識別する。少なくとも一つの実施形態において、ＰＣＲ分析法を用いて、特定の微生物に固有の又はほとんど固有の酵素に関するゲノム配列を検出する。

少なくとも一つの実施形態において、方法は、欠陥を検出し、ＰＣＲ分析を利用して適切に欠陥の源と関連づけることを含む。少なくとも一つの実施形態において、方法は、欠陥が全体として生物学的に基づくものであるか、全体として非生物学的に化学的に基づくものであるか、又は非生物学的に化学的、機械的、及び生物学的に基づく源の組合せから得られるものであるかを決定する。

少なくとも一つの実施形態において、欠陥は、フェルト上の一つ以上の詰まりである。少なくとも一つの実施形態において、欠陥は、孔、孔の周りの少なくとも一部に変色したハローを有する孔、変色した線条、斑点、半透明の斑点、及び任意のこれらの組み合わせの少なくとも一つ以上を有する紙シートである。

少なくとも一つの実施形態において、閾値レベルは偽陽性を差し引くために用いる方法である。場合により、ＰＣＲ分析法は、存在するが特定の欠陥の原因ではない微生物の痕跡を検出する。少なくとも一つの実施形態において、方法は、一つ以上の特定の微生物として知られる所定の濃度よりも低い濃度で検出されるあらゆる微生物の存在を差し引くことを含む。少なくとも一つの実施形態において、方法は、（欠陥の）１グラムにつき１０^４セルよりも低い濃度で検出されるあらゆる微生物の存在を差し引くことを含む。少なくとも一つの実施形態において、方法は、１ｍＬにつき１０^４セルよりも低い濃度で検出されるあらゆる微生物の存在を差し引くことを含む。

少なくとも一つの実施形態において、分析結果を用いて、一つ以上の殺生物性組成物を、どれほど多く、何の種類を、どれほど頻繁に、製紙系内の一つ以上の場所に添加するかを決定することにより、生体制御プログラムを増強する。少なくとも一つの実施形態において、上記及び下記の実施形態のいずれか及び全ては、製紙工程以外のプロセス水系又は工業系に適用される。

少なくとも一つの実施形態において、方法は、従来の方法によっては検出されない微生物を検出することが可能である。例えば、汚染物質が嫌気性微生物又は硫酸還元微生物の侵入によって生じる場合、ＯＲＰ検出のような方法は生物学的な汚染物質源を正しく識別せず、したがって、抗生物学的アプローチではなく、化学的アプローチを適用することを誤って示唆することがある。しかしながら、全ての生命体はＤＮＡを含むので、ＤＮＡ法を利用することは、生物学的侵入を常に正しく示す。

少なくとも一つの実施形態において、方法は、微生物多様性を評価するために用いられる。これは、機械堆積、シートの欠陥、完成品、フェルト等で見つかる問題の微生物が挙げられる。方法は、サンプル抽出物の核酸の分析に基づく。より具体的には、方法は、例えば、細菌スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）種；エリスロバクター（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）種；シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種；バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）種；ハリスコメノバクター（Ｈａｌｉｓｃｏｍｅｎｏｂａｃｔｅｒ）種；サプロスピラ（Ｓａｐｒｏｓｐｉｒａ）種；シュレゲレラ（Ｓｃｈｌｅｇｅｌｅｌｌａ）種；レプトスリックス（Ｌｅｐｔｏｔｈｉｒｉｘ）種；スフェロチルス ナタンス（Ｓｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓ ｎａｔａｎｓ）；バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種；アノキシバチルス（Ａｎｏｘｙｂａｃｉｌｌｕｓ）種；サイトファガ―フラボバクテリウム―バクテロイデス（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ―Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）属のもの；環境に優しい非硫黄性細菌、例えばヘルペトシフォン（Ｈｅｒｔｏｓｉｐｈｏｎ）、デイノコッカス―サーマス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ―Ｔｈｅｒｍｕｓ）門のもの、例えばメイオサーマス（Ｍｅｉｏｔｈｅｒｍｕｓ）種；カタラーゼ生産性細菌、アミラーゼ生産性細菌、ウレアーゼ生産性細菌、菌類等；などの全体の微生物を検出するために、ＰＣＲ、例えば限定されないがｑＰＣＲを利用する。これらの技術は、保存された配列に基づいて標的の微生物の検出及び定量化を可能にするプライマー及び標準対を利用する。プライマーは、進化を通して高度に保存された微生物ゲノムの領域を標的とし、特定の門又は属のためのプライマーは、より様々なゲノムの領域を標的とする。

サンプル中に存在する関心の微生物を正確に定量化することが可能であることは、その微生物を、サンプルの合計細菌量の割合として表すことを可能にする。検出することができる多数の微生物が与えられると、サンプルの微生物個体群の多様性のスナップショットを決定することができる（図１）。このスナップショットは、多様性指数と呼ばれている。多様性指数は、いくつかの標的微生物の相対的な豊度として、量的に表すこともできる。方法のあらゆる部分についての多様性指数は、機械又は工程が良好に動作しているときに測定することができ、したがって基準線を作成することができる。機械又は工程の性能が劣っている時に測定される多様性指数を基準線と比較して、微生物個体群の変動を探し、その過程でどの細菌群が問題の原因となるかを決定することができる。比較の容易性のために、シャノン多様性指数の算出を使用して多様性指数を定量化し、サンプルの場所の中で又は基準線に対して監視データを比較することもできる。処理戦略及び供給点を変えて、それによって問題と闘うことができる。

ＤＮＡの定量化に基づく多様性指数は、工程における微生物の存在及び多様性を、それらの生存度とは独立して測定する。リボ核酸（ＲＮＡ）、具体的にはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は、生きた微生物によってのみ製造される分子であり、標的に応じて、細菌の特定の門又は属に固有であるような特性を有する。上に掲げた微生物に固有のｍＲＮＡ配列を増幅することによって、どの細菌がその生存した形態で存在するかを決定することが可能になる。生菌の正確な検出は、プロセス水の処理戦略の有効性を評価する手段として使用することができる。これは、生存度指数に対して多様性指数を比較することによって達成することができる。

この方法は、プロセスサンプル中に存在する生菌の量及び種類を定量化する。定量的（リアルタイム）ポリメラーゼ連鎖反応方法を適用して、メッセンジャーリボソーム核酸（ｍＲＮＡ）を検出することができる。ｍＲＮＡはリボソームへと送られる転写されたＤＮＡであり、翻訳として知られるプロセスにおけるタンパク質合成のための青写真として役立つ。ｍＲＮＡは、生きている細胞によってのみ製造される。生きている細胞からのＲＮＡは、商業的に入手可能なキットを用いて分離することができる。ｍＲＮＡの検出は、定量的ポリメラーゼ連鎖反応における追加の工程を必要とする。逆転写酵素を反応混合物に添加して、ｍＲＮＡをその相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）へと転写する。この実験のために２つのプライマーセットが必要である。第１は特定のｍＲＮＡを標的とし、第２は逆転写酵素反応によって製造される得られたｃＤＮＡを増幅するために用いる。

説明のために示し、本発明の範囲を制限することを意図しない以下の例を参照することによって、以上をよりよく理解することができる。

非塗工シートミル（ｃｏａｔｅｄ ｆｒｅｅ ｓｈｅｅｔ ｍｉｌｌ）は、最終製品の欠陥の原因であると考えられる機械ヘッドボックスの一つの中に持続性の堆積を経験した。問題の潜在的な原因は微生物であると考えられた。しかしながら、従来の監視技術（例えば標準的なプレート計数、及びＡＴＰ濃度）は、高濃度の微生物活性を示さなかった。

ヘッドボックスからの堆積サンプルを、ｑＰＣＲ技術を使用した数カ月の過程にわたって分析した。ヘッドボックス堆積の最初のｑＰＣＲ分析結果は、高水準の微生物量、及び高濃度の主要な及び適応可能なバイオフィルム形成細菌を示した（図１）。パルパー及びブロークサイロに殺生物剤を添加することによって、処理戦略を増強させた。酸化剤ベースの生体制御プログラムの流速もまた増加させた。１ヵ月後に集めた堆積の分析は、ヘッドボックスの堆積（図１Ａ）の合計細菌量における変化をほとんど検出しなかった。主要なバイオフィルム形成細菌の数は１ｌｏｇ減少し、適応可能バイオフィルム形成細菌の濃度は４ｌｏｇ（図１Ｂ及び１Ｃ）減少した。ヘッドボックス堆積の量及びシートの欠陥の頻度は不変のままであった。ストック及びプロセス水系の従来のプレーティング及びＡＴＰ分析は、ほとんど生物活性を示さなかった。ＡＴＰ及びプレート計数値は、それぞれ平均して、１００ＲＬＵ未満、及び１グラム当たりに１００コロニー形成数（ＣＦＵ／ｇ）であった。

ブロークサイロ及びパルパーに、非安定化塩素、及び殺生物剤を添加することにより、処理戦略を更に最適化した。最後の変化を実施した後、更なるサンプルを集めて分析した。堆積の総細菌量は、ほぼ１ｌｏｇ（図１Ａ）の減少を示した。堆積したサンプルの最後の集合は、主要なバイオフィルム形成細菌の濃度において、ほぼ２ｌｏｇの減少を示した（図１Ｂ）。適応可能なバイオフィルム形成細菌は、ほとんどバックグラウンドのレベルで残存した（図１Ｃ）。また、微生物個体群の制御を改善したにもかかわらず、欠陥の頻度、欠陥の性質、及びヘッドボックスの堆積は不変のままであった。

このミルからのシート欠陥を、同様のｑＰＣＲに基づく方法を使用して分析した。欠陥に存在することがある細菌の多くは乾燥部の高温によって死ぬので、従来のプレーティング及びＡＴＰ法を用いて欠陥の細菌含有量を決定することは不可能である。化学的分析は、ニンヒドリン染色に依存するので、シートに存在する細菌についての決定的な回答を提供しない。この方法は非特異性であり、偽陽性、及び誤った否定的結果になる傾向がある。このミルからの孔及びシート欠陥のＤＮＡ分析が検出した細菌濃度は非常に低かった（図２、サンプル１〜５）。このミルから分析したシートの欠陥において、主要な及び適応可能なバイオフィルム形成細菌は検出されなかった。従って、細菌性スライムは、このミルでの欠陥及び品質問題の一因ではないようであった。比較的に、著しい生物学的堆積を受けたミルは、非常により高い微生物量を含む欠陥を有していた（図２、サンプル６）。更に、堆積及び欠陥において同様の細菌種が識別された。これらの欠陥のニンヒドリン染色は、結果として微生物の存在を示す肯定的な反応になった。他の場合では、生物学的欠陥と考えられなければならない最小限の濃度をちょうど上回る濃度で、シート欠陥中に細菌が検出された。しかしながら、ニンヒドリン反応は否定的であり、欠陥が微生物を含まないことを示した（図２、サンプル７）。ヘッドボックスの堆積の定量的ｑＰＣＲ検査は、処理戦略をそれぞれの変形した後の、主要な及び適応可能なバイオフィルム形成細菌の両方の低減を実証した。これらの標的微生物が急激に減少し、堆積又は欠陥頻度の量が減少していないとう事実は、この機械系における欠陥の問題の原因はおそらく細菌ではないということを示す。主要なバイオフィルム形成細菌は、機械表面にコロニーを作り、他の微生物種類の付着及び増殖のための有利な環境を生じさせる。これらの微生物が存在せずに、良好な成長媒体として役立つことができる化学的破片が堆積した後、細菌が機械面に付着することがある。化学添加物及び繊維がヘッドボックス内部に堆積して、微生物のコロニー形成に適する微小環境につながるようである。シート欠陥の分析は、無関心な微生物の存在を明らかにしたので、微生物はヘッドボックス内の堆積及び製品品質に対する悪影響の主要な源として除外した。機械性能を改善する労力は、生体制御から離れて系のより良好な機械的制御の方へと焦束し、改善された操作上の状態及び製品品質を可能にした。

非塗工シートミルは、競争的酸化剤ベースの生体制御プログラムを数年間利用した。十分な微生物成長の制御が認められたが、しかしながら、改善された方法効率のためにシート破壊を更に低減する機会があった。数段階でプログラムを実施して最適化した。方法の全体にわたる細菌濃度は低いままであり、シート破壊の低減を記録した。１日当たりの破壊の平均数は、１日につき平均１．２の破壊から、１日につき０．４２の破壊にまで低減した。

最適化されたプログラムを実施した約２年後に、処理条件がより可変的になったことが観察され、同じ濃度の制御を維持するのに増大した濃度の生体制御生成物を必要とした。従来の監視手段（例えばプレート計数及びＡＴＰ測定）を使用した系の調査は、プロセス水系の細菌濃度が低いままであることを示し、ヘッドボックス及びブローク系において増加は全く又はほとんど観察されなかった。しかしながら、ミルは、孔及び欠陥の激しい発生を被っていた。従来の監視技術は生体制御プログラムの性能における変化を示さず、オンライン活性監視は増大した微生物活性を検出した（図３）。

機械堆積及びシート欠陥の定量的ｑＰＣＲ分析はすべて、主要な及び適応可能なバイオフィルム形成細菌の存在を確認した。欠陥における合計細菌濃度は、１グラム当たりに約１．８ｘ１０^７セルであった（図３）。この証拠は、欠陥及び品質問題における微生物の役割を示す。機械に腐食性の煮沸を行った後、オンライン活性監視は、微生物活性の低減及びより安定なＯＲＰ値を実証し、改善されたプログラム性能及び回復力を示した。シート欠陥内の微生物の量は、煮沸の後、１０^７から１０^５セル／ｇに減少した（図３）。これは、ｑＰＣＲが、従来の技術を使用して検出することができないシート欠陥への微生物の寄与を検出することができることを確認した。更に、ｑＰＣＲを用いて、最終製品上の生体制御プログラムの有効性を評価することができる。

機械上の堆積及びシートの欠陥として現れた性能問題を経験した２つの製紙ミルからのフェルトサンプルを、ｑＰＣＲを使用して分析した。微生物の存在についてそれぞれのサンプルを試験した。一旦それぞれのサンプルが大量の細菌を含むと判断した場合、適応可能な及び主要なバイオフィルム形成細菌、例えば機械効率及び製品品質に関する問題の原因となることが知られている、スフィンゴモナダセアエ（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ ｆｍ．）、メイオサーマス（Ｍｅｉｏｔｈｅｒｍｕｓ）、ゲオサーマス（Ｇｅｏｔｈｅｒｍｕｓ）、及びシュードザントモナス（Ｐｓｅｕｄｏｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）などの存在についてサンプルを分析した。両方のミルは通常の濃度の適応可能なバイオフィルム形成細菌を含んでいたが、しかしながら、ミル１はミル２の二倍多い主要なバイオフィルム形成細菌を有していた（図４）。適応可能なバイオフィルム形成細菌の濃度は、濃度が問題に寄与しないであろうことを示す範囲内であったので、通常であると判断した。ミル２の主要なバイオフィルム形成細菌の濃度は、ほとんどバックグラウンドレベルであった。ミル２の高水準な主要なバイオフィルム形成細菌は、フェルトの詰まり及びシートからの水の除去の低減につながるフェルト内のバイオフィルム形成を示唆した。フェルト上のバイオフィルムの存在は、シートの上に堆積する可能性がある他の物質の堆積の増加につながる可能性がある。ミル１における主要なバイオフィルム形成細菌の増大した濃度は、これらの微生物の起源を決定するために、工程の他の部分、例えばシャワー水、添加物、保存容器等の更なる分析が必要であることを示唆した。

これらの例の結果は、従来のプレーティング技術及び酸化剤残渣では、堆積、欠陥、及び破壊が普及したまま、十分な殺生物剤薬品の注入及び微生物成長の制御を示すことがあることを示す。ＰＣＲ及びｑＰＣＲ方法の利用は、工業用水系における微生物の成長、及びバイオフィルムの形成に関して、より正確な情報を提供する。これらの戦略は、堆積形成に対する微生物の寄与の迅速な分析を可能にし、微生物を含む堆積が欠陥に寄与しているか否かをすばやく決定することができる。

定量的ｑＰＣＲ技術は、シートの欠陥を迅速に分析し、品質問題に対する微生物の寄与を決定することを可能にする。この新規な方法は、より先を見越した問題の診断を可能にし、改善された機械効率及び製品品質につながることを実証した。

本発明は、多くの異なる形態で実施してもよく、それらは本発明の詳細な説明に詳細に記載した。本開示は、本発明の原理の例示であって、本発明を例示されている特定の実施形態に限定することを意図するものではない。言及した全ての特許、特許出願、学術論文、及び他の引用した資料は、引用によりその全体が本明細書中に含まれる。更に、本発明は、本明細書に記載され、及び／又は本明細書に取り入れられる様々な実施形態の一部若しくは全部の可能な組み合わせを含む。更に、本発明は、本明細書に記載されており及び／又は本明細書中に取り入れられる様々な実施形態の任意の一つ又はいくつかを具体的に除外する、あらゆる可能な組み合わせを包含する。

上記の開示は、説明的であって、網羅的ではないことを意図する。この記載は、多くの変形及び代替を当業者に示唆している。これらの代替及び変形の全ては、請求項の範囲に含まれることを意図しており、ここで、用語「含む」は、「含むが、これに限定されるものではない」ことを意味する。当業者であれば、本明細書中に記載されている特定の実施形態に対する他の均等物であって、請求項にも含まれることが意図された均等物を認識してもよい。

本明細書中に開示されている全ての範囲及びパラメータは、そこに包含されるありとあらゆる全てのサブレンジ、及びエンドポイントの間のあらゆる数を包含するものと解する。例えば、「１〜１０」と定められた範囲は、最小値である１と最大値である１０との間（並びに最小値である１及び最大値である１０を含む）の、全てのサブレンジ；すなわち、１以上の最小値（例えば１〜６．１）から始まり、１０以下の最大値（例えば２．３〜９．４、３〜８、４〜７）で終わる全てのサブレンジ、並びに範囲内に含まれる１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０のそれぞれの数をも含むと考えるべきである。

ここで、本発明の好ましい及び代替の実施形態の記載を終了する。当業者であれば、本明細書中に記載されている特定の実施形態に対する他の均等物を認識してもよく、均等物は、本願明細書に添付した請求項に含まれることが意図されている。以下、本発明の実施形態を列記する。
〔１〕
製紙工程における微生物の侵入を識別する方法であって、
製紙工程に関する品目上の欠陥に注目することと、
前記品目から取った少なくとも一つのサンプルに対して、少なくとも１種の微生物に関連することが知られる核酸配列を標的にしたプライマーを利用したＰＣＲ分析を少なくとも一つ行うことと、
肯定的な結果を示す場合、微生物の測定した濃度が所定の閾値を超えるか否かを決定することと、
測定した前記濃度が閾値を超える場合、少なくとも一つの更なるＰＣＲ分析を行い、サンプルに存在する特定の微生物を決定することと
を含んでおり、
検出された前記微生物のそれぞれの測定した前記濃度が所定の閾値を超える場合、前記欠陥は前記微生物の侵入に少なくとも一部起因する、
方法。
〔２〕
前記品目がフェルトであり、前記欠陥が前記フェルト内の一つ以上の詰まりである、項目１に記載の方法。
〔３〕
前記品目が製紙工程によって製造される紙シートであり、前記欠陥が紙シート上の一つ以上の孔、変色、線条、斑点、半透明の斑点、及び任意のこれらの組み合わせである、項目１に記載の方法。
〔４〕
識別した前記微生物を、保存及び／又は送信することができる形式に記録する工程を更に含む、項目１の方法。
〔５〕
識別した前記微生物の改善措置に関連する殺生物性プログラムを行う工程を更に含む、項目１に記載の方法。
〔６〕
前記ＰＣＲ分析がｑＰＣＲ分析である、項目１に記載の方法。
〔７〕
前記ＰＣＲ分析の閾値が、１ｍＬ当たりに１０ ^４ セル、又は１グラム当たりに１０ ^４ セルである、項目１に記載の方法。
〔８〕
前記品目上に、欠陥を生じたであろう生きた微生物がほとんどいないか又はいないように前記品目を乾燥させる、項目１に記載の方法。
〔９〕
前記品目の状態が、製紙工程の間に前記品目が遭遇する流体とは大きく異なっており、前記品目に住む微生物が前記流体内の微生物とは異なっており、前記流体内に住む微生物の決定は、欠陥を生じている品目上の微生物の誤った識別を生ずる、項目１に記載の方法。
〔１０〕
前記閾値を上回る任意の微生物の存在を決定することができるよう、充分な種類のプライマーを品目のサンプルに適用する工程を更に含む、項目１に記載の方法。
〔１１〕
前記ＰＣＲ分析が前記閾値を超えたいかなる微生物も示さない場合、前記欠陥が非生物学に基づくものであると識別する工程を更に含む、項目１０に記載の方法。
〔１２〕
非生物学的化学的混入物の改善措置を製紙工程に適用する工程を更に含む、項目１１に記載の方法。
〔１３〕
前記ＰＣＲ分析がサンプルにはびこる微生物量を決定する、項目１に記載の方法。
〔１４〕
欠陥に注目する前に、前記品目を製紙工程の加熱部又は乾燥部に通して、欠陥を生じた微生物を殺す、項目１に記載の方法。
〔１５〕
製紙工程における微生物の侵入を識別する方法であって、
製紙工程に関する品目上の欠陥に注目することと、
品目から取った少なくとも一つのサンプルに対して、品目にそのような欠点を生じることが知られる少なくとも一つの微生物に関連することが知られる核酸配列を標的にしたプライマーを利用したＰＣＲ分析を少なくとも一つ行うことと、
少なくとも一つの微生物について肯定的な結果が示された場合、前記微生物の測定した濃度が前記微生物についての所定の閾値を超えているかどうかを決定することと、
測定した前記濃度が前記閾値を超えている場合、前記欠陥が前記微生物の侵入に少なくとも一部起因することを識別することと
を含む、方法。

Claims (10)

1. 製紙工程における微生物の侵入を識別する方法であって、
   製紙工程に関する品目上の欠陥に注目することと、
   前記品目から取った少なくとも一つのサンプルに対して、少なくとも１種の前記品目に住むことができる微生物に関連することが知られる核酸配列を標的にしたプライマーを利用した第一のｑＰＣＲ分析を少なくとも一つ行うことと、
   肯定的な結果を示す場合、微生物の測定した濃度が所定の閾値を超えるか否かを決定することと、
   測定した前記微生物の前記濃度が所定の閾値を超える場合、少なくとも一つの更なる第二のｑＰＣＲ分析を行い、サンプルに存在する特定の微生物を決定することであって、前記第二のｑＰＣＲ分析は、サンプル中の微生物がサンプルに存在する合計微生物量の割合として表される多様性指数を与え、
   多様性指数として検出された前記微生物のそれぞれの測定した前記濃度が所定の閾値を超える場合、前記欠陥は前記微生物の侵入に少なくとも一部起因すると判断することと
   を含む、方法。
2. 前記品目がフェルトであり、前記欠陥が前記フェルト内の一つ以上の詰まりである、請求項１に記載の方法。
3. 前記品目が製紙工程によって製造される紙シートであり、前記欠陥が紙シート上の一つ以上の孔、変色、線条、斑点、半透明の斑点、及び任意のこれらの組み合わせである、請求項１に記載の方法。
4. 識別した前記微生物に関する情報を、保存及び／又は送信することができる形式に記録する工程を更に含む、請求項１の方法。
5. 識別した前記微生物の改善措置に関連する殺生物性プログラムを行う工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
6. 前記欠陥に注目する工程の前に、前記品目上に、欠陥を生じたであろう生きた微生物がほとんどいないか又はいないように前記品目を乾燥させる工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
7. 前記閾値を上回る任意の微生物の存在を決定することができるよう、充分な種類のプライマーを品目のサンプルに適用する工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
8. 前記第二のｑＰＣＲ分析が前記閾値を超えたいかなる微生物も示さない場合、前記欠陥が非生物学に基づくものであると識別する工程を更に含む、請求項７に記載の方法。
9. 非生物学的化学的混入物の改善措置を製紙工程に適用する工程を更に含む、請求項８に記載の方法。
10. 前記欠陥に注目する工程の前に、前記品目を製紙工程の加熱部又は乾燥部に通して、欠陥を生じた微生物を殺す工程を更に含む、請求項１に記載の方法。

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