BR112014016391B1 - Método de identificar uma infestação de micro-organismo formador de biopelícula em um processo de fabricação de papel - Google Patents

Abstract

detecção e quantificação de ácido nucleico para avaliar a biomassa microbiana em defeitos de papel e feltros de máquina. a invenção é direcionada a métodos e composições para identificar os micro-organismos específicos presentes em uma poção particular de um processo de fabricação de papel. o método envolve a obtenção de uma amostra a partir do processo que é tal que pouco ou nenhum exemplo vivo do micro-organismo permanece. entretanto, porque o dna a partir dos organismos ainda está presente, uma análise que identifica porções de dna específico ao organismo particular identificará corretamente o micro-organismo presente. isto permite a análise de infestações presente em feltros ou folhas de papel que tipicamente já não têm muitos micro-organismos vivos neles quando amostras são tiradas para análise.

Description

Referência Cruzada aos Pedidos Relacionados Não Aplicável.

[001] Declaração Considerando a Pesquisa Federalmente Patrocinada ou Desenvolvimento

Não Aplicável. Antecedente da Invenção

[002] A presente invenção geralmente refere-se às composições do material, mecanismos e métodos úteis na detecção e identificação de micro-organismos causando ou presentes em feltros de máquina e em defeitos de papel.

[003] Como descrito, por exemplo, em Patentes US 7.306.702 e 5.928.875, o papel é produzido de uma maneira contínua a partir de uma suspensão fibrosa (fornecimento da fornece) geralmente feita de água e fibras de celulose. Um processo industrial de papel típico consiste em 3 estágios: formação, compressão e secagem. No estágio de formação, o fornecimento da polpa diluída é direcionado em um arame ou entre 2 arames. A maioria da água é escoada a partir do fornecimento da polpa, pelo arame, criando uma teia de papel úmido. No estágio de compressão, a teia de papel entra em contato com um ou geralmente mais Feltros de Máquina porosos que são usados para extrair muita água restante da teia. Frequentemente, o feltro de imantação é o primeiro feltro que a teia de papel úmida contata, que é usado para remover a teia de papel a partir do arame, por meio de um rolo de imantação de sucção posicionado atrás do feltro, e em seguida transportar a teia de papel ao restante da seção de compressão. A teia de papel em seguida geralmente atravessa uma ou mais compressões cada qual consistindo em rolos de compressão giratórios e/ou elementos estacionários tais como sapatas de compressão que são posicionadas em proximidade íntima entre si formando, o que é geralmente referido como, um estreitamento de compressão. Em cada estreitamento, a teia de papel entra em contato com qualquer um ou dois Feltros de Máquina onde a água é forçada a partir da teia de papel e no feltro de compressão por meio de pressão e / ou vácuo. Nos estreitamentos de compressão de feltro único entra em contato com o rolo de compressão em um lado e o feltro no outro. Em estreitamentos de compressão de feltro duplo, a teia de papel passa entre os dois feltros. Depois da seção de compressão, a teia de papel é secada para remover a água restante, normalmente tecendo por uma série de latas secadoras aquecidas à vapor.

[004] Os feltros de máquina consistem frequentemente geralmente de tecido base de lã ou fibra sintética feito de 1 a 4 camadas individuais de filamentos organizadas em um padrão de textura. Uma membrana ou malha polimérica extrusada pode da mesma forma ser incluída como uma ou mais camadas de tecido base. As fibras de Batt, de diâmetro menor que os filamentos de tecido base, são costuradas na base de ambos os lados que dão ao feltro uma aparência semelhante à manta grossa. Os feltros de máquina são projetados para rapidamente absorver em água a partir da teia de papel no estreitamento e manter a água de forma que não reabsorva novamente na folha como o papel e o feltro saia do estreitamento de compressão. O feltros de máquina normalmente estão passando por uma alça interminável que circula continuamente entre os estágios de contato da folha e estágios de retorno. A água puxada no feltro a partir da teia de papel ao estreitamento é geralmente removida a partir do feltro por secagem à vácuo durante o estágio de retorno do feltro na, que é referida frequentemente como, caixa uhle.

[005] Os sistemas de preparação de papel utilizam várias matérias-primas que introduzem os micro-organismos no sistema de máquina. Isto inclui a fibra de madeira virgem, fibra reciclada, água doce, goma, tinturas, e outros aditivos químicos. Os micro-organismos proliferam-se em muitos ou todos os ambientes quentes, ricos em nutrientes presentes dentro de sistemas de fabricação de papel e diversas comunidades microbianas resultam-se. O controle inadequado do crescimento microbiano permite a formação de depósitos de superfície que mudam, levando a defeitos e tamponamento do bico e feltro (por exemplo, manchas ou buracos) ou se rompem na folha.

[006] Os micro-organismos podem proliferar-se da mesma forma nos feltros e tecidos de máquina, negativamente impactando-se a remoção de água e a eficiência da máquina ou operacional.

[007] O crescimento microbiano em sistemas de fabricação de papel pode ser bastante prejudicial e caro. O crescimento de micro-organismos em superfícies do equipamento pode levar à formação de depósitos que mudam e contribuem para os defeitos da folha e buracos. Tratamentos com água de chuva contaminada ou água de processo podem levar ao crescimento de micróbios nos feltros que geralmente resultam na formação de tampões nos feltros. Estes tampões, por sua vez, causam vários problemas, mais notavelmente o prejuízo da remoção de água a partir da teia de papel. Como um resultado, o crescimento microbiano pode resultar em uma necessidade excessiva e cara de múltiplas limpezas prévias e limpezas de feltros ou outro equipamento de fabricação de papel. Estes problemas podem ser compostos quando uma determinação incorreta da qual os micro-organismos acontecem, por causa disto pode resultar em um tratamento que também degrada a qualidade do papel, também impacta o equipamento de processo e/ou nem mesmo pode controlar a infestação microbiana subjacente. Além disso, a distinção incorreta entre os problemas biologicamente causados e problemas mecanicamente ou quimicamente causados podem também resultar em esforços inadequados, devastadores, e possivelmente contra-produtivos.

[008] Vários métodos da técnica anterior são conhecidos para identificar quais micro-organismos estão presentes em um sistema de fabricação de papel.Estes métodos são, entretanto, particularmente deficientes quando aplicados em feltros ou folhas de papel. Alguns dos métodos da técnica anterior tais como Patentes US 8.012.758, 7.981.679, e 7.949.432 detectam vários efeitos nos fluidos do sistema de fabricação de papel produzidos por organismos microbiológicos vivos. Outros métodos tal como US 5.281.537 dependem da obtenção de uma amostra de contaminante de micro-organismo vivo e desenvolvê-la mais para realizar várias análises. No contexto das folhas de papel e feltros, entretanto, estes métodos são particularmente inadequados quando as amostras de tempo do feltro ou papel que eles são retirados já não contêm mais organismos vivos (ou quaisquer) suficientes para cultivar ou quaisquer dos produtos químicos que eles produzem. Da mesma forma, itens do sistema de fabricação de papel (tais como folhas de papel e feltros) que estão a jusantes das seções de aquecimento ou de secagem terão tido todos os defeitos que fazem os micro-organismos morrerem depois que eles já causaram os defeitos. Métodos alternativos que não dependem da presença de organismos vivos da mesma forma tendem a ser deficientes porque eles produzem frequentemente falsos positivos. Por exemplo, ninidrina (que é usada para detectar as aminas primárias ou secundárias) e espectroscopia de IR produzem frequentemente falsos positivos ou negativos porque elas detectam materiais que podem ter origens não biológicas (tais como aditivos químicos ou contaminação).

[009] Desse modo, está claro que há utilidade clara nos novos métodos e composições para a própria identificação de micro-organismos presentes em feltros de máquina e folhas de papel. Não é pretendido que a técnica descrita nesta seção constitua uma admissão que qualquer patente, publicação ou outras informações referidas aqui sejam a "Técnica Anterior" com respeito a esta invenção, a menos que especificamente designado como tal. Além disso, esta seção não deveria ser interpretada para significar que uma procura foi feita ou que nenhuma outra informação pertinente como definido em 37 CFR § 1.56(a) existe.

Breve Resumo da Invenção

[010] Pelo menos uma modalidade da invenção é direcionada a um método de identificar uma infestação de micro-organismo em um processo de fabricação de papel. O método compreende as etapas de: 1) notar um defeito em um item associado com um processo de fabricação de papel, 2) conduzir pelo menos uma análise de PCR em pelo menos uma amostra tirada do item, a análise de PCR utilizando iniciadores alvejados para sequências de nucleotídeo conhecidas por estarem associadas com pelo menos um tipo de organismo, 3) se um resultado positivo for indicado, determinar se uma concentração medida de organismos excede um limiar pré-determinado, 4) se a concentração medida exceder o limiar, pelo menos uma análise de PCR adicional é feita para determinar organismos específicos que estão presentes na amostra, 5) se a concentração medida de cada organismo detectada excede um limiar pré-determinado, em seguida este defeito é pelo menos em parte devido a uma infestação daquele organismo.

[011] O item pode ser um feltro. O defeito pode ser um ou mais tampões no feltro. O item pode ser uma folha de papel produzida pelo processo de fabricação de papel e o defeito pode ser um ou mais dentre buracos, descoloração, riscos, manchas, manchas translúcidas, e qualquer combinação dos mesmos na folha de papel. O método pode também compreender a etapa de registrar o organismo identificado em um formato que pode ser armazenado e/ou transmitido. O método pode também compreender a etapa de conduzir um programa de biocida associado com a remediação do organismo identificado. A análise de PCR pode ser uma análise de qPCR. O limiar da análise de PCR pode ser 104células por ml ou 104 células por grama. O item pode ser dessecado assim que não houver nenhum organismo vivo no item que pode ter causado o defeito.

[012] As condições do item podem diferir-se muito dos fluidos que o item encontra durante o processo de fabricação de papel visto que os organismos que habitam os itens diferem-se daqueles nos fluidos e a determinação dos habitantes dos fluidos produzirá uma identificação incorreta dos organismos no item que causa o defeito. O método pode também compreender a etapa de aplicar tipos suficientes de iniciadores em amostras do item tal que a presença de quaisquer organismos sobre o limiar pode ser determinada. O método pode também compreender a etapa de identificar o defeito como sendo não biologicamente baseado se a análise de PCR não indicar que quaisquer organismos excedem o limiar. O método pode também compreender a etapa de aplicar um remédio para contaminação química não biológica ao processo de fabricação de papel. A análise de PCR pode determinar a quantidade de organismos que infestam a amostra. O item pode ter passado por uma seção de calor ou de secagem do processo de fabricação de papel antes do defeito ser notado e, portanto, os organismos que causaram o defeito podem ter sido mortos. Breve Descrição dos Desenhos

[013] Uma descrição detalhada da invenção é descrita a seguir com referência específica sendo feita aos desenhos em que:

[014] FIG. 1 contém três gráficos que ilustram os resultados das amostras da invenção que foram aplicados.

[015] FIG. 2 ilustram um gráfico da carga bacteriana total das amostras da invenção que foi aplicado.

[016] FIG. 3 é um gráfico da carga bacteriana total das amostras da invenção que foi aplicado.

[017] FIG. 4 ilustram gráficos em setores denotando a diversidade microbiana variada em amostras de DNA coletadas a partir de feltros de máquina a partir de dois moinhos de papel diferentes.

Descrição Detalhada da Invenção

[018] As seguintes definições são fornecidas para determinar como os termos usados neste pedido, e em particular como as reivindicações, devem ser interpretadas. A organização das definições é apenas para conveniência e não é pretendida limitar quaisquer das definições em qualquer categoria particular.

[019] "Defeito"significa um atributo indesejado de um item associado com um processo de fabricação de papel. Inclui, porém, não está limitado a um ou mais tampões em um feltro, e tais atributos de folha de papel como buracos, descoloração, riscos, manchas, manchas translúcidas, e qualquer combinação dos mesmos.

[020] "Feltro"significa um feltro feito de lã entrelaçada ou qualquer outra fibra usada em um processo de fabricação de papel que funciona como um transportador de materiais em que as fibras entrelaçadas definem uma pluralidade de lúmens pelo qual água ou outros fluidos podem passar. Feltros podem da mesma forma fornecer o acolchoamento entre rolos de compressão e podem ser da mesma forma ser um meio para remover a água dos materiais de fabricação de papel. Feltros incluem, porém, não são limitados feltros inferiores, feltros de quadro inferior, feltros úmidos de tecido cilíndrico, feltros mais secos, feltros intermináveis, feltros de imantação, feltros de imantação de sucção, feltros superiores de Harper, e feltros superiores.

[021] "Produto de Papel ou Folha de Papel"significa qualquer produto final de estrutura fibrosa formada de um processo de fabricação de papel tradicionalmente, porém não necessariamente, compreendendo fibras de celulose. Exemplos de tais produtos finais incluem, porém, não estão limitados a tecido facial, tecido de banho, guardanapos de mesa, papel de cópia, papel de impressora, papel de escrever, papel de caderno, jornal, papel-cartão, papel de cartaz, papel de impressão, papelão, e similares.

[022] "Processo de Preparação de Papel" significa um ou mais processos para converter matérias-primas em produtos de papel e que inclui, porém, não está limitado a uma ou mais de tais etapas como polpagem, digestão, refinamento, secagem, calandragem, compressão, crepeing, desidratação, e branqueamento.

[023] "Análise de PCR"significa análise de reação cadeia da polimerase.

[024] "Tampão"significa um sólido, semissólido, viscoso, e/ou outro depósito de material posicionado dentro dos lúmens de um feltro. Tampões podem inibir o fluxo de material pelos lúmens e/ou podem prejudicar qualquer outra funcionalidade de um feltro.

[025] "Iniciador"significa uma composição de matéria, tipicamente um filamento curta de nucleotídeos, conhecidos por serem complementares às seções específicas de DNA e servirem como um ponto de partida para síntese de uma cadeia de nucleotídeo complementar ao DNA adjacente à seção específica de DNA.

[026] "Sonda"significa uma composição de matéria construída e organizada para ligar-se a uma seção alvejada de DNA e que pode ser detectada facilmente quando desse modo ligada e assim ser usado para indicar a presença ou ausência da seção alvejada de DNA.

[027] "Análise de qPCR"significa análise da reação em cadeia da polimerase quantitativa e/ou qualitativa.

[028] "Micro-organismos"significam qualquer organismo pequeno o bastante para se insinuar dentro, adjacente a, no topo de, ou ligado ao equipamento usado em um processo de fabricação de papel, estes incluem, porém não estão limitados àqueles organismos tão pequenos que eles não podem ser vistos sem a ajuda de um microscópio, coleções ou colônias de tais organismos pequenos que podem ser vistos por olho nu, porém, que compreendem vários organismos individuais que são muito pequeno para serem vistos por olho nu, bem como um ou mais organismos que podem ser vistos por olho nu, incluem porém não estão limitados a qualquer organismo cujo a presença, de algum modo prejudica o processo de fabricação de papel tal como formação de tampões dentro de feltros e/ou causa de defeitos dentro das folhas de papel.

[029] No evento em que as definições anteriores ou uma descrição declarada em outro lugar neste pedido são incompatíveis com um significado (explícito ou implícito) que é geralmente usado, em um dicionário, ou declarado em uma fonte incorporada em particular por referência neste pedido, o pedido e os termos da reivindicação, em particular, são entendidos para serem interpretados de acordo com a definição ou descrição neste pedido, e não de acordo com a definição comum, definição de dicionário, ou a definição que foi incorporada por referência. Levando em conta o anterior, no evento que um termo só pode ser entendido se for interpretado por um dicionário, se o termo for definido pela Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology,5aEdição, (2005), (Publicado por Wiley, John & Sons, Inc.) esta definição controlará como o termo deve ser definido nas reivindicações.

[030] Em pelo menos uma modalidade, um método de detecção altamente sensível e rápida é fornecido para micro-organismos localizados em folhas de papel e feltros de máquina. O método inclui a análise de DNA presente em extratos de amostras. As próprias amostras são fragmentos de um feltro ou uma folha de papel. Estas amostras são altamente dessecadas e contêm pouca ou nenhuma amostra viva dos micro-organismos contaminadores. Alguns métodos da técnica anterior de utilizar a análise de DNA incluem WO 2004/042082 que descreve um método in situ utilizando sondas para determinar a presença ou ausência de um micro-organismo. Métodos in situ, entretanto, não é aplicável às folhas de papel ou feltros visto que eles são secados quando testados. Da mesma forma o método in situ envolve aplicar as sondas durante a divisão celular dos micro-organismos que não são possíveis em folhas de papel ou feltros com pouco ou nenhum organismo vivo neles. Em pelo menos uma modalidade, a análise com base no DNA envolve o uso de sondas.

[031] Em pelo menos uma modalidade, a análise com base no DNA envolve o uso de iniciadores de PCR para detectar a presença ou ausência de microorganismos. Patente US 5.928.875 descreve o uso de iniciadores de PCR para detectar a presença ou ausência do esporo que forma bactérias. Em pelo menos uma modalidade, o iniciador é alvejado para uma parte de um filamento de DNA que é altamente conservado entre um grupo de organismos. Como resultado, a detecção da presença daquela parte particular do DNA é prova definitiva da presença de um organismo específico. A análise de PCR é de uso particular na análise de feltros e folhas de papel devido à dificuldade de identificar corretamente seus microorganismos contaminadores porque eles necessitam de organismos viáveis para métodos de semeadura tradicionais ou medidas de ATP.

[032] Em pelo menos uma modalidade, a análise de PCR envolve a utilização de um ou mais dos métodos descritos no Artigo Primer Directed Enzymatic Amplification of DNA with a Thermostable DNA Polymerase, por Randall Saiki et al, Science, Volume 239, pp. 487-491 (1988). Em pelo menos uma modalidade, a análise de PCR envolve a utilização de um ou mais dos métodos descritos no Artigo Specific Synthesis of DNA in Vitro via a Polymerase-Catalysed Chain Reaction, por Kary Mullis et al, Methods In Enzymology, Volume 155, pp. 335-350 (1987).

[033] Em pelo menos uma modalidade, a análise de PCR é uma análise de qPCR como descrito em Trade Brochure qPCR, prefaciado por Jo Vandesompele, (como carregado da website http://www.eurogentec.com/file-browser.html on January 19, 2012). Em pelo menos uma modalidade, o método é uma análise de qPCR quantitativa. Em pelo menos uma modalidade, o método é uma análise de qPCR qualitativa.

[034] Como ilustrado na FIG. 1, em pelo menos uma modalidade, a reação em cadeia da polimerase (PCR) é um método para alvejar as sequências de ácido nucleico (DNA ou RNA) e aumentar o número de cópia da sequência alvo para obter as quantidades úteis de ácido nucléico para análise a jusante. Este método pode ser aplicado à detecção de micro-organismos em uma variedade de amostras que incluem, porém não estão limitadas a, feltros de máquina, defeitos da folha, depósitos de máquina, etc.

[035] Como ilustrado em pelo menos uma modalidade, logo que o DNA é extraído da amostra, usando quaisquer dos kits de extração de DNA comercialmente disponíveis, este pode ser analisado em tempo real usando uma abordagem de PCR tal como uma abordagem de PCR Quantitativa. PCR quantitativa utiliza a mesma metodologia como PCR, porém inclui um componente quantitativo em tempo real. Nesta técnica, os iniciadores são usados para alvejar uma sequência de DNA de interesse com base na identidade do organismo ou função de um gene específico. Alguns formas de detecção tal como fluorescência pode ser usada para detectar o DNA resultante ou 'amplicon de DNA'. A mudança na fluorescência é diretamente proporcional à mudança na quantidade do DNA alvo. O número de ciclos exigidos para alcançar o limiar de fluorescência pré-determinado é comparado a um padrão que corresponde ao alvo de DNA específico. Um padrão é tipicamente o gene alvo que é puro e de quantidade conhecida em concentrações que transpõem vários logs. O número de cópias de DNA alvo presente na amostra é calculado usando a curva padrão. O número de cópia por amostra é em seguida usado para determinar o número de células por amostra.

[036] Em pelo menos uma modalidade, um conjunto de iniciador é usado, o qual alveja as sequências de DNA a partir de bactérias usando uma abordagem conservadora para quantificar as bactérias totais. Em pelo menos uma modalidade, um conjunto de iniciador é usado, o qual alveja as bactérias formadoras de biopelícula primárias, incluindo Meiothermus, Pseudoxanthomonas, e Deinococcus. Em pelo menos uma modalidade, um conjunto de iniciador é usado para alvejar uma biopelícula formadora adaptável que pertence à família Sphingomonadacea de bactérias. Em pelo menos uma modalidade, o formador de biolpelícula adaptável exibiu tolerância mais alta aos programas de biocontrole com base em oxidante em comparação a outra biopelícula e micro-organismos planctônicos. Em pelo menos uma modalidade, o iniciador é usado para distinguir entre infestações fúngicas e bacterianas.

[037] Feltros de máquina geralmente passam dentro e fora de correntes de chuveiro e bacias líquidas contendo vários micro-organismos a partir dos quais podem ser facilmente obtidas amostras vivas. Entretanto, o estado dinâmico do feltro (mudando rapidamente de condições úmidas para secas, a passagem rápida através de ar e líquidos, e o substrato macio que curva-se, dobra-se e enrola-se) frequentemente significa que a população de organismos que habita o feltro diferirá daquela presente dentro das correntes de chuveiro e bacia líquida que contata. Como resultado, uma análise típica das correntes de chuveiro e bacias líquidas não identificará corretamente que micro-organismos estão presentes dentro do feltro. Uma análise de PCR de uma amostra de feltro que leva em conta os tipos de organismos que são conhecidos serem capazes de habitar feltros, entretanto permite uma análise verdadeiramente precisa de contaminações de feltro.

[038] Em pelo menos uma modalidade, a análise com base em DNA da amostra envolve descontar a possibilidade da presença de micro-organismos conhecidos por não habitar feltros de máquina e/ou folhas de papel de produto final. Em pelo menos uma modalidade, o método envolve limitar os iniciadores usados àqueles associados com organismos conhecidos por habitar feltros de máquina e/ou folhas de papel de produto final.

[039] Em pelo menos uma modalidade, o método envolve distinguir entre DNA ao nível do reino biológico. A vida biológica pode ser categorizada de acordo com cinco reinos: Monera, Protista, Planta, Animal e Fungo. Estes organismos têm o DNA imensamente discrepante, e um protocolo que foca na identificação do DNA do organismo ao nível de reino é imensamente mais simples do que as determinações mais específicas. Porque com feltros, os organismos de diferentes reinos são frequentemente melhor tratados diferentemente, uma tal forma simples de identificação pode ser usada para identificar com precisão o regime específico melhor alvejado ao contaminante particular.

[040] Em pelo menos uma modalidade, mais de um iniciador é usado para identificar organismos que têm mais de uma sequência de nucleotídeo exclusivamente reconhecível. Em pelo menos uma modalidade, a análise por PCR é usada para detectar sequências de genoma associadas com enzimas únicas ou quase únicas a organismos específicos.

[041] Em pelo menos uma modalidade, o método envolve detectar um defeito e em seguida, utilizar a análise por PCR para corretamente associar a fonte do defeito. Em pelo menos uma modalidade, o método determina se o defeito é totalmente com base biológica, totalmente com base química não biológica, ou resultante de uma combinação de fontes com base química não biológica, mecânica e biológica.

[042] Em pelo menos uma modalidade, o defeito é um ou mais tampões em um feltro. Em pelo menos uma modalidade, o defeito é uma folha de papel que tem pelo menos um ou mais de: um buraco, um buraco com uma auréola descolorida ao redor de pelo menos uma porção disto, um risco de descoloração, uma mancha, uma mancha translúcida, e qualquer combinação dos mesmos.

[043] Em pelo menos uma modalidade, um nível de valor limiar é a metodologia usada para descontar falsos positivos. Às vezes, a análise por PCR detecta traços de organismos, que ao mesmo tempo que presentes não são causas de um defeito particular. Em pelo menos uma modalidade, o método envolve descontar a presença de qualquer organismo detectada a uma concentração mais baixa do que um nível pré-determinado conhecido por um ou mais organismos particulares. Em pelo menos uma modalidade, o método envolve descontar a presença de qualquer organismo detectada a nível mais baixo do que 104células por grama (do defeito). Em pelo menos uma modalidade, o método envolve descontar a presença de qualquer organismo detectada a nível mais baixo do que 104células por ml.

[044] Em pelo menos uma modalidade, os resultados da análise são usados para aumentar o programa de biocontrole determinando-se quantos, que tipo e com que frequência, uma ou mais composições biocidas são adicionadas a um ou mais locais dentro de um sistema de fabricação de papel. Em pelo menos uma modalidade, qualquer e todas as modalidades acima e abaixo são aplicadas a um sistema de água de processo ou sistema industrial diferente de um processo de fabricação de papel.

[045] Em pelo menos uma modalidade, o método pode detectar microorganismos que não seriam detectados de outro modo por métodos da técnica anterior. Por exemplo, em casos onde a incrustação é causada por uma infestação de organismos anaeróbios ou de redução de sulfato, métodos tal como detecção de ORP não identificariam a fonte de incrustação corretamente como biológica, e portanto sugestionariam incorretamente aplicar uma abordagem química, não uma antibiológica. A utilização da abordagem de DNA, entretanto sempre corretamente indicaria uma infestação biológica, porque toda vida contém DNA.

[046] Em pelo menos uma modalidade, um método é usado para avaliar a diversidade microbiana. Isto pode incluir micro-organismos problemáticos encontrados nos depósitos de máquina, defeitos de folha, produtos acabados, feltros, etc. O método está baseado na análise de ácidos nucleicos em extratos de amostra. Mais especificamente, utiliza PCR tal como porém não limitado a, qPCR para a detecção de organismos totais tais como bactérias; espécies de Sphingomonas; espécies de Erythrobacter; espécies de Pseudomonas;

[047] Espécies de Burkholderia; espécies de Haliscomenobacter; espécies de Saprospira; espécies de Schlegelella; espécies de Leptothrix; Sphaerotilus natans; espécies de Bacillus; espécies de Anoxybacillus; membros do filo de Cytophaga-Flavobacterium-Bacteroides; bactérias de não enxofre verdes, incluindo Herpetosiphon, membros do filo de Deinococcus-Thermus, inclusive espécies de Meiothermus; bactérias produtoras de catalase, bactérias produtoras de amilase, bactérias produtoras de urease, fungos, etc. Estas técnicas utilizam iniciadores e pares padrão que permitem detecção e quantificação de organismos alvo com base nas sequências conservadas. Os iniciadores alvejam regiões no genoma microbiano, que são altamente conservadas por evolução, ao mesmo tempo que iniciadores para filos específicos ou gêneros alvejam regiões mais variáveis do genoma.

[048] Ser capaz de quantificar com precisão um organismo de interesse presente em uma amostra, torna possível expressar aquele organismo como uma porcentagem da carga bacteriana total na amostra. Dado o grande número de organismos que podem ser detectados, uma foto instantânea da diversidade da população microbiana na amostra pode ser determinada (Figura 1). Esta foto instantânea é chamada de índice de diversidade. O índice de diversidade pode da mesma forma ser expresso quantitativamente como a abundância relativa de vários organismos alvos. O índice de diversidade para qualquer parte de um processo pode ser medido às vezes quando as máquinas ou processos estão funcionando bem, desse modo criando uma referência. O índice de diversidade medido às vezes do desempenho do processo ou de máquina inferior pode ser comparado à referência para procurar flutuações em populações microbianas e determinar quais grupos bacterianos são responsáveis por problemas no processo. O índice de diversidade pode da mesma forma ser quantificado quanto à facilidade de comparação usando o cálculo do índice de diversidade de Shannon para comparar os dados de monitoramento entre os locais de amostra ou em relação a uma referência. Estratégias de tratamento e pontos de alimento podem em seguida ser alterados consequentemente para combater o problema.

[049] Um índice de diversidade com base na quantificação de DNA mede a presença e diversidade de organismos em um processo, independente de sua viabilidade. Ácido ribonucleico (RNA), especificamente o RNA mensageiro (mRNA), é uma molécula que é produzida apenas por organismos vivos, e tem propriedades tal que, dependendo do alvo, são únicas a um filo específico ou gêneros de bactérias. Amplificando-se as sequências de mRNA que únicas aos organismos listadas acima, torna-se possível determinar quais bactérias estão presentes em sua forma viável. A detecção precisa de organismos viáveis pode em seguida ser usada como uma ferramenta para avaliar a eficácia de estratégias de tratamento de águas de processo. Isto pode ser realizado por comparação do índice de diversidade ao índice de viabilidade.

[050] Este método quantificaria a quantidade e tipo de bactérias viáveis presentes em amostras de processo. O método de reação em cadeia da polimerase quantitativa (tempo real) pode ser aplicado para detectar ácidos nucleicos ribossômicos mensageiros (mRNA). mRNA é o DNA transcrito que é enviado ao ribossoma para servir como um modelo para síntese de proteína em um processo conhecido como translação. O mRNA só é produzido por células vivas. O RNA de células vivas pode ser isolado com o uso de kits comercialmente disponíveis. A detecção de mRNA requer uma etapa extra na reação em cadeia da polimerase quantitativa. Transcriptase reversa é adicionada ao coquetel de reação para transcrever o mRNA em seu DNA complementar (cDNA). Dois conjuntos de iniciadores são requeridos para esta experiência. Os primeiros alvos em mRNA específico, enquanto o segundo é usado para amplificar o cDNA resultante produzido pela reação de transcriptase reversa.

EXEMPLOS

[051] Os antecedendes podem ser melhores entendidos por referência aos seguintes exemplos, que são apresentados para propósitos de ilustração e não são destinados a limitar o escopo da invenção.

[052] Um moinho de folha livre revestido experimentou a deposição persistente em uma das caixas de entrada de máquina, que acreditou ser a causa de defeitos no produto final. Micro-organismos foram assumidos ser a causa subjacente do problema. Entretanto, as técnicas de monitoramento tradicionais (por exemplo, contagens de placa padrão e níveis de ATP) não indicaram níveis elevados de atividade microbiana.

[053] As amostras de depósito da caixa de entrada foram analisadas no curso de vários meses usando técnicas de qPCR. Resultados de qPCR iniciais a partir da análise de depósitos da caixa de entrada exibiram níveis altos de carregamento microbiano, bem como densidades elevadas de formadores de biopelícula primários e adaptáveis (Figura 1). A estratégia de tratamento foi aumentada com a adição de biocidas igualmente à polpa e ao silo rompido. A taxa de alimento do programa de biocontrole com base em oxidante foi da mesma forma aumentada. A análise de depósitos coletados depois de um mês depois, pouca alteração detectada na carga bacteriana total dos depósitos de caixa de entrada (Figura 1A). O número de formadores de biopelícula primários diminuiu um log, enquanto a densidade de formadores de biopelícula adaptáveis diminuiu quatro logs (Figura 1B e 1C). A quantidade de depósitos da caixa de entrada e frequência de defeitos da folha continuaram a permanecerem inalteradas. A semeadura tradicional e análise de ATP do sistema de água de processo e matéria-prima indicaram pouca atividade biológica. Os valores de contagem de placa e ATP foram calculados a média a menos de 100 RLU e 100 unidades formadoras de colônia por grama (CFU/g), respectivamente.

[054] A estratégia de tratamento foi também otimizada pela adição de cloro não estabilizado e biocidas ao silo rompido e à polpa. Depois que a implementação do último conjunto de alterações, amostras adicionais foram coletadas e analisadas. A carga bacteriana total do depósito mostrou uma diminuição de quase um log (Figura 1A). O conjunto final de amostras de depósito mostrou uma diminuição de quase dois logs na densidade dos formadores de biopelícula primários (Figura 1B). Formadores de biopelícula adaptáveis permaneceram em níveis próximos à base (Figura 1C). Novamente, apesar do controle melhorado da população microbiana, a frequência do defeito, a natureza dos defeitos, e a deposição da caixa de entrada permaneceram inalterados.

[055] Os defeitos da folha deste moinho foram analisados usando a mesma abordagem com base em qPCR. É impossível determinar o teor bacteriano em defeitos usando a semeadura tradicional e métodos de ATP porque muitas bactérias que estão presentes no defeito são exterminadas pelas temperaturas altas da seção de secagem. A análise química não fornece uma resposta definitiva a cerca das bactérias presentes na folha visto que depende do manchamento com ninidrina manchar. Esta abordagem é não específica e propensa aos resultados falso positivos e falso negativos. A análise de DNA dos buracos da folha a partir deste moinho detectou densidade bacteriana muito baixa (Figura 2, Amostras 1-5). Formadores de biopelícula primários e adaptáveis não foram detectados nos defeitos de folha analisados a partir deste moinho.

[056] Portanto, o lodo bacteriano provavelmente não estava contribuindo para os defeitos e questões de qualidade neste moinho. Em comparação, um moinho passando por deposição biológica significante teve defeitos contendo carregamento microbiano muito mais alto (Figura 2, Amostra 6). Além disso, espécies bacterianas similares foram identificadas nos depósitos e defeitos. O manchamento com ninidrina destes defeitos resultou em uma reação positiva indicando a presença de micro-organismos. Em outro caso, as bactérias foram detectadas nos defeitos da folha em níveis precisamente acima da densidade mínima exigida para ser considerada um defeito biológico. Entretanto, a reação de ninidrina foi negativa indicando que o defeito não continha micro-organismos (Figura 2, Amostra 7). Exame de qPCR quantitativo de depósitos da caixa de entrada demonstrou reduções nos formadores de biopelícula primários e adaptáveis seguindo cada qual a modificação para a estratégia de tratamento. O fato que havia uma diminuição drástica nestes organismos alvo e nenhuma diminuição na quantidade de deposição ou frequência de defeito, indica que as bactérias provavelmente não são responsáveis por problemas de defeito neste sistema de máquina. Formadores de biopelícula primários colonizam as superfícies da máquina e criam um ambiente favorável para ligação e proliferação de outros tipos de organismo. Sem a presença destes organismos, as bactérias podem unir-se às superfícies da máquina seguindo a deposição de resíduos químicos que podem servir como um bom médio de crescimento. É provável que aditivos químicos e fibra sejam depositados dentro da caixa de entrada, resultando em um microambiente adequado para colonização microbiana. Como a análise dos defeitos da folha revelou a presença microbiana negligente, os micro-organismos foram excluídos como a fonte primária de deposição na caixa de entrada e efeitos adversos na qualidade do produto. Esforços para melhorar o desempenho da máquina foram focalizados longe do biocontrole e para o controle mecânico melhor do sistema para permitir condições operacionais e qualidade do produto melhoradas.

[057] Um moinho de folha livre revestido utilizou um programa de biocontrole com base em oxidante competitivo durante vários anos. O controle do crescimento microbiano foi percebido como adequado; entretanto, houve uma oportunidade para também reduzir as quebras de folha para eficiência de processo melhorada. O programa foi implementado e otimizado em várias fases. A densidade bacteriana ao longo do processo permaneceu baixa e uma redução nas quebras de folha foi documentada. O número médio de fraturas por dia diminuiu de uma média de 1,2 quebra por dia para 0,42 fratura por dia.

[058] Aproximadamente dois anos depois da implementação do programa otimizado, foi observado que condições de processo tinham se tornado mais variáveis e concentrações crescentes de produtos de biocontrole foram exigidas para manter o mesmo nível de controle. Uma pesquisa de sistema usando ferramentas de monitoramento tradicionais tais como contas de placa e medidas de ATP, indicou que a densidade bacteriana no sistema de água de processo permaneceu baixa e nenhum ou pouco aumento foi observado na caixa de entrada e sistema interrompido. Entretanto, o moinho foi sofrendo uma erupção severa de buracos e defeitos. Enquanto as técnicas de monitoramento tradicionais não indicaram nenhuma alteração no desempenho do programa de biocontrole, o monitor de atividade on-line detectou atividade microbiana crescente (Figura 3).

[059] A análise de qPCR quantitativa de defeitos de máquina e defeitos de folha todos confirmaram a presença de formadores de biopelícula primários e adaptáveis. A densidade de bactérias totais nos defeitos foi de aproximadamente 1,8x107células por grama (Figura 3). Esta evidência indica o papel dos microorganismos nas questões de defeito e qualidade. A máquina sofreu um boilout cáustico depois de que, o monitor de atividade on-line demonstrou uma redução na atividade microbiana e um valor de ORP mais estável indicando desempenho de programa melhorado e resiliência. A quantidade de micro-organismos em defeitos de folha diminuiu de 107 a 105células/g seguindo o boilout (Figura 3). Isto confirma que qPCR pode detectar a contribuição microbiana aos defeitos da folha que não podem ser detectados usando as técnicas tradicionais. Além disso, qPCR pode ser usada para avaliar a eficácia do programa de biocontrole no produto final.

[060] Amostras de feltro de dois moinhos de papel que estavam experimentando as questões de desempenho, que se manifestaram como depósitos em-máquina e defeitos da folha, foram analisadas usando qPCR. Cada amostra foi testada quanto a presença de micro-organismos. Logo que foi determinado que cada amostra continha quantidades altas de bactérias, as amostras foram em seguida analisadas quanto a presença de formadores de biopelícula adaptáveis e primário, que incluíram Sphingomonadaceae fm., Meiothermus, Geothermus, e Pseudoxanthomonas que foram conhecidos por contribuírem para problemas com eficiência de máquina e qualidade de produto. Ambos moinhos continham níveis normais de formadores de biopelícula adaptável, entretanto, o Moinho 1 teve duas vezes tanto os formadores de biopelícula primários quanto o Moinho 2 (Figura 4). O nível de formadores de biopelícula adaptáveis foi determinado ser normal quando seus níveis estavam na faixa que indicou não estar provavelmente contribuindo para o problema. O nível de formadores de biopelícula primários no Moinho 2 estava em um nível base próximo. Níveis altos de formadores de biopelícula primários no Moinho 2 sugeriram a formação de biopelícula em feltros que levam ao tamponamento do feltro e remoção de água reduzida da folha. A presença da biopelícula nos feltros pode levar à deposição aumentada de outra matéria que pode em seguida redepositar sobre a folha. Níveis elevados de formadores de biopelícula primários no Moinho 1 sugeriram que a análise adicional de outras partes do processo tal como água de chuva, aditivos, caixas de armazenamento, etc. foram necessários para determinar onde estes organismos foram originados.

[061] O resultado destes exemplos demonstra que técnicas de semeadura convencionais e resíduos oxidantes podem indicar a dosagem de biocida adequada e controle de crescimento microbiano, enquanto a deposição, defeitos e rupturas permanecem prevalecentes. A utilização de métodos de PCR e qPCR fornece informação mais precisa considerando o crescimento microbiano e formação de biopelícula em sistemas de água industriais. Estas estratégias permitem a análise rápida da contribuição de micro-organismos para depositar a formação e podem ser usadas para determinar rapidamente se ou não os depósitos que contêm micro- organismos estão contribuindo para os defeitos.

[062] Técnicas de qPCR quantitativas permitem a análise rápida de defeitos de folha determinar a contribuição de micro-organismos em questões de qualidade. Esta nova abordagem foi demonstrada para permitir um diagnóstico mais pró-ativo de problemas que levam à eficiência de máquina melhorada e qualidade do produto.

[063] Enquanto esta invenção pode ser incorporada em muitas formas diferentes, é descrito em detalhes aqui as modalidades preferidas específicas da invenção. A presente descrição é uma exemplificação dos princípios da invenção e não é pretendido limitar a invenção às modalidades particulares ilustradas. Todas as patentes, pedidos de patente, documentos científicos, e quaisquer outros materiais referenciados mencionados aqui estão incorporados por referência em sua totalidade.

[064] Além disso, a invenção abrange qualquer possível combinação de algumas ou todas as várias modalidades descritas aqui e/ou incorporadas aqui. Além disso, a invenção abrange qualquer possível combinação que da mesma forma especificamente exclui qualquer uma ou algumas das várias modalidades descritas aqui e/ou incorporadas aqui.

[065] A descrição anterior é pretendida ser ilustrativa e não exaustiva. Esta descrição sugestionará muitas variações e alternativas a alguém de experiência ordinária nesta técnica. Todas estas alternativas e variações são pretendidas ser incluídas dentro do escopo das reivindicações onde o termo "compreendendo" significa "incluindo, porém não limitado". Aqueles familiares com a técnica podem reconhecer outros equivalentes às modalidades específicas descritas aqui, em que os equivalentes são pretendidos da mesma forma serem abrangidos pelas reivindicações.

[066] Todas as faixas e parâmetros descritos aqui são entendidos abrangerem quaisquer e todas as subfaixas nisto, e todos os números entre os pontos finais. Por exemplo, uma faixa declarada de "1 a 10" deveria ser considerada para incluir quaisquer e todas as subfaixas entre (e incluindo de) o valor mínimo de 1 e o valor máximo de 10; isto é, todas as subfaixas que começam com um valor mínimo de 1 ou mais, (por exemplo, 1 a 6,1), e finalizando com um valor máximo de 10 ou menos, (por exemplo, 2,3 a 9,4, 3 a 8, 4 a 7), e finalmente para cada número 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, e 10 contidos dentro da faixa.

[067] Isto completa a descrição das modalidades preferidas e alternadas da invenção. Aqueles versados na técnica podem reconhecer outros equivalentes à modalidade específica descrita aqui, em que os equivalentes são pretendidos ser abrangidos pelas reivindicações ligadas até aqui.

Claims (12)

1. Método de identificar uma infestação de micro-organismo formador de biopelícula em um processo de fabricação de papel, o método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as etapas de: notar um defeito em um item associado com um processo de fabricação de papel, conduzir pelo menos uma análise de PCR em pelo menos uma amostra tirada do item, a análise de PCR utilizando iniciadores alvejados para sequências de nucleotídeo conhecidas por serem associadas com pelo menos um tipo de organismo, se um resultado positivo for indicado, determinar se uma concentração medida de organismos excede um limiar pré-determinado, se a concentração medida exceder o limiar, pelo menos uma análise de PCR adicional é feita para determinar os organismos específicos que estão presentes na amostra, em que a pelo menos uma análise de PCR adicional é feita para determinar formadores de biopelícula primários como organismos específicos, se a concentração medida de cada organismo específico detectado exceder um limiar pré-determinado, então aquele defeito é pelo menos em parte devido a uma infestação daquele organismo específico.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos uma análise de PCR adicional é feita para determinar formadores de biopelícula primários e adaptáveis como organismos específicos.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos um tipo de organismo é bactéria.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o item é um feltro e o defeito é um ou mais tampões no feltro.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o item é uma folha de papel produzida pelo processo de fabricação de papel e o defeito é um ou mais buracos, descoloração, riscos, manchas, manchas translúcidas, e qualquer combinação dos mesmos na folha de papel.

6. Método de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda a etapa de registrar o organismo identificado em um formato que pode ser armazenado e/ou transmitido.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda a etapa de conduzir um programa biocida associado com a remediação do organismo identificado.

8. Método de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a análise de PCR é uma análise de qPCR.

9. Método de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o limiar da análise de PCR é 104células por ml ou 104células por grama do item.

10. Método de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o item é tão dessecado que há pouco ou nenhum organismo vivo no item que pode ter causado o defeito.

11. Método de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a análise de PCR determina a quantidade de organismos que infestam a amostra.

12. Método de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o item passou por uma seção de calor ou de secagem do processo de fabricação de papel antes do defeito ser notado e, portanto, os organismos que causaram o defeito foram mortos.

Images