ES2711881T3 - Detección y cuantificación de ácidos nucleicos para valorar la biomasa microbiana en los defectos del papel y en los fieltros de máquina - Google Patents

Abstract

Un método para identificar una infección por organismos formadores de biopelícula en un procedimiento de fabricación de papel, en donde el método comprende las etapas de: observar un defecto sobre un artículo asociado a un procedimiento de fabricación de papel, llevar a cabo al menos un análisis por PCR en al menos una muestra tomada del artículo, el análisis por PCR con el uso de cebadores que se hibridan selectivamente con las secuencias nucleotídicas que se sabe que están asociadas a al menos un tipo de organismo, si se indica un resultado positivo, determinar si la medición de una concentración de microorganismos excede un umbral predeterminado, si la concentración medida excede el umbral, se realiza al menos un análisis adicional por PCR para determinar los organismos específicos que están presentes en la muestra, en los que se realiza al menos un análisis adicional por PCR para determinar los organismos formadores de biopelícula primarios como organismos específicos, si la concentración medida de cada organismo específico detectado excede un umbral predeterminado, entonces ese defecto se debe al menos en parte a una infección de dicho organismo específico.

Description

DESCRIPCION

Deteccion y cuantificacion de acidos nucleicos para valorar la biomasa microbiana en los defectos del papel y en los fieltros de maquina

Antecedentes de la invencion

La presente invencion se refiere en terminos generales a composiciones de materia, aparatos y metodos utiles para detectar e identificar microorganismos que causan o estan presentes en los fieltros de maquina y en los defectos del papel.

Tal y como se describe, por ejemplo, en las patentes de los EE. UU. n.os 7,306,702 y 5,928,875, el papel se produce de una manera continua a partir de una suspension fibrosa (pasta de pulpa) que suele estar hecha de agua y fibras de celulosa. Un procedimiento de fabricacion de papel tlpico consiste en 3 etapas: formacion, prensado y secado. En la etapa de formacion, la pasta de pulpa diluida se dirige sobre una tela o entre 2 telas. La mayorla del agua se drena desde la pasta de pulpa, a traves de la tela, lo que crea una banda de papel humedo. En la etapa de prensado, la banda de papel entra en contacto con uno o por lo general mas fieltros de maquina porosos que se utilizan para extraer la mayor parte del agua que queda en la banda. A menudo, el fieltro de captacion es el primer fieltro con el que entra en contacto la banda de papel humedo, que se utiliza para retirar de la tela la banda de papel, a traves de un rodillo de captacion por succion colocado por detras del fieltro y, a continuacion, se transporta la banda de papel al resto de la seccion de prensado. A continuacion, la banda de papel se suele hacer pasar a traves de una o varias prensas, cada una de las cuales consiste en rodillos de prensa rotatorios y/o artlculos estacionarios, tales como zapatas de prensa que estan colocadas muy cerca unas de otras, con lo que forman lo que se suele denominar una llnea de contacto de la prensa. En cada llnea de contacto, la banda de papel entra en contacto con uno cualquiera o los dos fieltros de maquina, en donde se hace salir el agua de la banda de papel y entrar en el fieltro de la prensa mediante presion y/o vaclo. En las llneas de contacto de la prensa con un solo fieltro, la banda de papel esta en contacto con el rodillo de la prensa por un lado y con el fieltro por el otro. En las llneas de contacto de la prensa con doble fieltro, la banda de papel pasa entre los dos fieltros. Despues de la seccion de prensado, la banda de papel se seca para retirar el agua que le queda, normalmente por ondulaciones a traves de una serie de tambores se secado calentados con vapor.

Los fieltros de maquina a menudo consisten en un tejido de lana o nilon que suele estar hecho de 1 a 4 capas individuales de filamentos dispuestos en un patron de ligamento. Una malla o membrana polimerica extrudida tambien se puede incluir entre las una o varias capas de tejido de base. Las fibras para guata, con un diametro mas pequeno que los filamentos del tejido de base, estan prendidas en la base a ambos lados, lo que da al fieltro una apariencia gruesa similar a una manta. Los fieltros de maquina estan disenados para incorporar con rapidez el agua desde la banda de papel en la llnea de contacto y quedarse con el agua, de tal modo que no se reabsorba de vuelta hacia la hoja a medida que el papel y el fieltro salen de la llnea de contacto de la prensa. Los fieltros de maquina suelen ser un cinturon que pasa por un bucle sin fin que circula continuamente entre las etapas de contacto de la hoja y las etapas de regreso. El agua empujada hacia el fieltro desde la banda de papel en la llnea de contacto se suele retirar del fieltro con vaclo durante la etapa de regreso del fieltro en lo que se denomina con frecuencia la caja Uhle.

Los sistemas de fabricacion de papel utilizan varios materiales brutos que introducen microorganismos en el sistema de la maquina. Esto incluye fibras de madera virgen, fibra reciclada, agua dulce, almidon, colorantes y otros aditivos qulmicos. Los microorganismos proliferan en muchos o todos los entornos calientes ricos en nutrientes que se encuentran presentes dentro de los sistemas de fabricacion de papel y dan lugar a diversas comunidades microbianas. El control inadecuado del crecimiento microbiano permite la formacion de depositos en la superficie que luego se desprenden, lo que conduce al taponamiento de filtros o de boquillas y a defectos (p. ej., manchas u orificios) o roturas en la hoja. Los microorganismos tambien pueden proliferar en los fieltros y en los tejidos de la maquina, lo que impacta negativamente en la retirada del agua y la eficacia de funcionamiento o de la maquina.

El crecimiento microbiano en los sistemas de fabricacion de papel puede ser realmente perjudicial y costoso. El crecimiento de microorganismos en las superficies del equipo puede conducir a la formacion de depositos que se desprenden y contribuyen a los defectos de la hoja y a orificios. La contamination de los tratamientos con aguas del rociador o del agua de tratamiento puede conducir al crecimiento de microbios en los fieltros, lo que suele dar lugar a la formacion de tapones en los fieltros. A su vez, estos tapones provocan una serie de problemas, sobre todo una peor retirada del agua desde la banda de papel. El resultado final es que el crecimiento microbiano puede dar lugar a que sean necesarias demasiadas y costosas repeticiones de hervidos y limpiezas de los fieltros u otro equipo de fabricacion de papel. Estos problemas pueden agravarse cuando se produce una determination incorrecta de los microorganismos ya que esto puede dar lugar a un tratamiento que degrade adicionalmente la calidad del papel, que repercuta adicionalmente en el equipo del procedimiento, y/o que pueda incluso no controlar la infection microbiana subyacente. Ademas, la distincion incorrecta entre los problemas de origen biologico y los problemas de origen mecanico o qulmico puede dar lugar ademas a que se le dediquen unos recursos inadecuados, inutiles y posiblemente contraproducentes.

Se conocen una serie de metodos de la tecnica anterior para identificar que microorganismos estan presentes en un sistema de fabricacion de papel. Sin embargo, estos metodos son particularmente deficientes cuando se aplican a hojas de papel o fieltros. Algunos de los metodos de la tecnica anterior, tales como las patentes de los EE. UU. n.os 8,012,758, 7,981,679 y 7,949,432 detectan diferentes efectos en los liquidos del sistema de fabricacion de papel producidos por los organismos microbiologicos vivos. Otros metodos, tales como la patente de los EE. u U. n.° 5,281,537, se basan en la obtencion de una muestra del microorganismo vivo contaminante y hacerlo crecer mas para realizar diferentes analisis. En el contexto de las hojas de papel y los fieltros, sin embargo, estos metodos son particularmente inadecuados puesto que, cuando se recogen las muestras de fieltro o de papel, ya no contienen suficientes (o ninguno) organismos vivos para cultivar, ni ninguno de los productos quimicos que generan. De igual forma, en los articulos del sistema de fabricacion de papel (tales como las hojas de papel y los fieltros) que actuan despues de las secciones de calentamiento o de secado ya se habran destruido todos los microorganismos causantes de los defectos una vez que ya han provocado los defectos. Los metodos alternativos que no se basan en la presencia de organismos vivos tambien tienden a ser deficientes porque producen positivos falsos. Por ejemplo, la ninhidrina (que se utiliza para detectar aminas primarias o secundarias) y la espectroscopia de RI a menudo producen positivos o negativos falsos porque detectan materiales que pueden tener origenes no biologicos (tales como aditivos quimicos o contaminacion).

Asi pues, esta claro que tendran una clara utilidad los metodos y composiciones nuevos para la identificacion adecuada de los microorganismos presentes en los fieltros de maquina y en las hojas de papel.

Breve compendio de la invencion

La invencion se refiere a un metodo de identificacion de una infeccion por microorganismos en el procedimiento de fabricacion de papel de acuerdo con la reivindicacion 1.

El articulo puede ser un fieltro. El defecto puede ser uno o varios tapones en el fieltro. El articulo puede ser una hoja de papel producida por el procedimiento de fabricacion de papel y el defecto puede ser uno o varios orificios, discromia, rayas, manchas, manchas traslucidas y cualquier combinacion de los mismos sobre la hoja de papel. El metodo puede ademas comprender la etapa de registrar el organismo identificado en un formato que se pueda almacenar y/o transmitir. El metodo puede ademas comprender la etapa de llevar a cabo un programa biocida asociado a la remediacion del microorganismo identificado. El analisis por PCR puede ser un analisis de qPCR. El umbral del analisis por PCR puede ser de 104 celulas por mililitro o de 104 celulas por gramo. El articulo puede estar tan desecado que en el articulo no haya organismos vivos de los que pudieron haber provocado el defecto.

Las condiciones del articulo pueden diferir tantisimo de los liquidos que el articulo encuentra durante el procedimiento de fabricacion de papel, que los microorganismos que pueblan los articulos difieren de los encontrados en los liquidos, y la determinacion de los pobladores de los liquidos producira una identificacion incorrecta de los microorganismos que provocan el defecto sobre el articulo. El metodo puede ademas comprender la etapa de aplicar suficientes clases de cebadores a las muestras del articulo, de tal manera que se puede determinar la presencia de cualquier organismo por encima del umbral. El metodo puede ademas comprender la etapa de identificar si el defecto no tiene origen biologico basandose en si el analisis por PCR no indica que ningun organismo supera el umbral. El metodo puede ademas comprender la etapa de aplicar un remedio para la contaminacion quimica no biologica al procedimiento de fabricacion de papel. El analisis por PCR puede determinar la cantidad de organismos que infectan la muestra. El articulo puede haber pasado a traves de una seccion de calor o secado del procedimiento de fabricacion de papel antes de detectar el defecto y, por lo tanto, los microorganismos que provocan el efecto podrian haber sido destruidos.

Breve descripcion de las figuras

A continuacion, se describe una descripcion detallada de la invencion con referencia especifica a las figuras en las que:

La figura 1 contiene tres graficos que ilustran los resultados de las muestras a las que se les aplico la invencion.

En la figura 2 se ilustra un grafico de la carga bacteriana total de las muestras a las que se les aplico la invencion.

En la figura 3 hay un grafico de la carga bacteriana total de las muestras a las que se les aplico la invencion.

En la figura 4 se ilustra un diagrama circular que representa la variation de la diversidad microbiana en las muestras de ADN recogidas de los fieltros de maquina de dos fabricas de papel diferentes.

Descripcion detallada de la invencion

Las siguientes definiciones se dan a conocer para determinar como se han de interpretar los terminos utilizados en esta solicitud y, en particular, las reivindicaciones. La organization de las definiciones es solo por comodidad y no se pretende que limite ninguna de las definiciones a ninguna categoria en concreto.

«Defecto» significa un atributo indeseado de un articulo que esta asociado a un procedimiento de fabricacion de papel. Incluye, pero sin limitarse a ellos, uno o varios tapones en un fieltro, y atributos de la hoja de papel tales como orificios, discromia, rayas, manchas, manchas traslucidas y cualquier combinacion de los mismos.

«Fieltro» significa una cinta hecha de lana entrelazada, o cualquier otra fibra utilizada en un procedimiento de fabricacion de papel, que funciona como un transportador de materiales, en donde las fibras entrelazadas definen numerosas luces a traves de las cuales pueden pasar el agua u otros llquidos. Los fieltros tambien pueden proporcionar la amortiguacion entre los rodillos de prensa y puede ser tambien un medio utilizado para retirar agua de los materiales de fabricacion de papel. Los fieltros incluyen, pero sin limitarse a ellos, fieltros de la parte inferior, fieltros del tablero inferior, fieltros humedos de tejido cillndricos, fieltros de secado, fieltros sin fin, fieltros de captation, fieltros de captacion por suction, fieltros Harper de la parte superior y fieltros de la parte superior.

«Papel producido u hoja de papel» significa cualquier producto final con estructura fibrosa formado de un procedimiento de fabricacion de papel que comprende tradicionalmente, pero no necesariamente, fibras de celulosa. Los ejemplos de tales productos finales incluyen, pero sin limitarse a ellos, toallitas faciales, papel de bano, servilletas de papel, papel de imprenta, papel para impresora, papel para escribir, papel de libreta, papel de periodico, carton, papel para carteles, papel para tltulos, cartulina y similares.

«Procedimiento de fabricacion de papel» significa uno o varios procedimientos para convertir materiales brutos en productos de papel y que incluye, pero sin limitation, una o varias de etapas, tales como conversion en pulpa, digestion, refinado, secado, calandrado, prensado, crespado, extraction de agua y blanqueo.

«Analisis por PCR» significa el analisis mediante una reaction en cadena de la polimerasa.

«Tapon» significa un deposito de material solido, semisolido, viscoso y/o de otro tipo colocado dentro de la luz de un fieltro. Los tapones pueden inhibir el flujo de material a traves de las luces y/o pueden deteriorar cualquier otra funcionalidad de un fieltro.

«Cebador» significa una composition de materia, tlpicamente una hebra corta de nucleotidos, que se sabe que es complementaria a segmentos especlficos de ADN y sirven como punto de partida para la slntesis de una cadena nucleotldica complementaria al ADN adyacente al segmento especlfico de ADN.

«Sonda» significa una composicion de materia construida y dispuesta para fijarse a un segmento deseado de ADN y que se puede detectar con facilidad cuando esta fijado as! y, gracias a ello, se utiliza para indicar la presencia o ausencia del segmento de ADN deseado.

«Analisis por qPCR» significa el analisis cuantitativo y/o cualitativo mediante la reaccion en cadena de la polimerasa.

«Microorganismos» significa cualquier organismo lo suficientemente pequeno para insinuarse por si mismo dentro, adyacente a, en la parte superior de, o unido a, un equipo utilizado en un procedimiento de fabricacion de papel, incluye, pero sin limitacion, los organismos tan pequenos que no se pueden ver sin la ayuda de un microscopio, colecciones o colonias de tales organismos pequenos que se pueden ver a simple vista, pero que comprenden una serie de organismos individuales que son demasiado pequenos para observarse a simple vista, as! como uno o varios organismos que se pueden observar a simple vista, incluye, pero sin limitarse a ellos, cualquier organismo cuya presencia, de algun modo, deteriora el procedimiento de fabricacion de papel, tal como la formation de tapones dentro de los fieltros y/o la provocation de defectos dentro de las hojas de papel.

En el caso de que las definiciones anteriores o una description mencionada en cualquier lugar en esta solicitud sea incoherente con un significado (expllcito o impllcito) que se utiliza corrientemente o en un diccionario, se entiende en concreto que la solicitud y los terminos de las reivindicaciones se han de interpretar de acuerdo con la definition o la descripcion en esta solicitud, y no de acuerdo con la definicion habitual o la definicion del diccionario. En vista de lo anterior, en el caso de que un termino solo se pueda entender si se interpreta mediante un diccionario, si el termino se define mediante la Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, 5.a edition, (2005) (publicada por Wiley, Jonh & Sons, Inc.), esta definicion debera controlar como se define el termino en las reivindicaciones.

Se da a conocer un metodo muy sensible y rapido de detection de los microorganismos localizados en hojas de papel y fieltros de maquina. El metodo incluye el analisis del ADN presente en los extractos de las muestras. Las muestras por si mismas son fragmentos de un fieltro o de una hoja de papel. Estas mismas muestras estan muy desecadas y contienen poca o ninguna muestra con vida de los microorganismos contaminantes. Algunos metodos de la tecnica anterior del uso del analisis del ADN incluyen la solicitud de patente internacional WO 2004/042082 que describe un metodo in situ que utiliza sondas para determinar la presencia o la ausencia de un microorganismo. Sin embargo, los metodos in situ no son aplicables a las hojas de papel ni a los fieltros, ya que estan secos cuando se toman las muestras. De igual forma, el metodo in situ implica la aplicacion de las sondas durante la division celular de los microorganismos, lo que no es posible en las hojas de papel o en los fieltros con pocos o ningun organismo vivo en ellos. El analisis basado en el ADN puede implicar el uso de sondas.

El analisis del ADN implica el uso de cebadores de PCR para detectar la presencia o la ausencia de microorganismos. En la patente de los EE. UU. n.° 5,928,875 se describe el uso de cebadores de PCR para detectar la presencia o la ausencia de bacterias formadoras de esporas. El cebador puede dirigirse selectivamente hacia una parte de una hebra de ADN que esta muy conservada entre un grupo de microorganismos. Como resultado, la deteccion de la presencia de esa parte concreta del ADN es la prueba definitiva de la presencia de un organismo especlfico. El analisis por PCR encuentra un uso particular en el analisis de fieltros y hojas de papel debido a la dificultad de identificar correctamente sus microorganismos contaminantes porque carecen de organismos viables para los metodos de siembra en placa tradicionales o para las mediciones de ATP.

El analisis por PCR puede implicar la utilization de uno o mas de los metodos descritos en el artlculo «Primer Directed Enzymatic Amplification of DNA with a Thermostable DNA Polymerase», de Randall Saiki et al., Science, volumen 239, pags. 487-491 (1988). El analisis por PCR puede implicar la utilizacion de uno o varios de los metodos descritos en el artlculo «Specific Synthesis of DNA in Vitro via a Polymerase-Catalyzed Chain Reaction», de Kary Mullis et al., Methods in Enzymology, volumen 155, pags. 335-350 (1987). El analisis por PCR puede ser un analisis por qPCR tal y como se describe en el folleto comercial qPCR guide, con prologo de Jo Vandesompele (descargable de la pagina en internet http://www.eurogentec.com/file-browser.html el 19 de enero de 2012). El metodo puede ser un analisis cuantitativo por qPCR. El metodo puede ser un analisis cualitativo por qPCR.

Tal y como se ilustra en la figura 1, la reaction en cadena de la polimerasa (PCR) es un metodo que actua selectivamente sobre secuencias de acido nucleico (ADN o ARN) e incrementa el numero de copias de la secuencia destinataria para obtener cantidades utiles de acido nucleico para los posteriores analisis. Este metodo se puede aplicar a la detection de microorganismos en una serie de muestras que incluyen, pero sin limitation, fieltros de maquina, defectos de la hoja, depositos en la maquina, etc.

Tal y como se ilustra, una vez que se extrae el ADN de la muestra, con el uso de cualquiera de los kits de extraction de ADN disponibles en el mercado, se puede analizar en tiempo real con el uso del metodo de PCR, tal como el metodo de la PCR cuantitativa. La PCR cuantitativa utiliza la misma metodologla que la PCR, pero incluye un componente cuantitativo en tiempo real. En esta tecnica, los cebadores se utilizan para actuar selectivamente sobre una secuencia de ADN de interes basandose en la identidad del organismo o en la funcion de un gen especlfico. Para detectar el ADN resultante o el 'amplicon de ADN' se puede utilizar alguna forma de deteccion, tal como la fluorescencia. El cambio de la fluorescencia es directamente proporcional al cambio de cantidad del ADN destinatario. El numero de ciclos necesarios para alcanzar el umbral de fluorescencia predeterminado se compara con un estandar que corresponde a la diana especlfica del ADN. Un estandar es tlpicamente el gen diana que esta puro y en una cantidad conocida a concentraciones que abarcan varios logaritmos. El numero de copias del ADN diana presente en la muestra se calcula con el uso de la curva estandar. El numero de copias por muestra se utiliza a continuation para determinar el numero de celulas por muestra.

Se puede utilizar un conjunto de cebadores que actua selectivamente sobre las secuencias de ADN de bacterias con el uso de un metodo conservativo para cuantificar las bacterias totales. Se puede utilizar un conjunto de cebadores que actua de manera selectiva y sobre todo sobre las bacterias formadoras de biopellcula, entre ellas Meiothermus, Pseudoxanthomonas y Deinococcus. Se puede utilizar un conjunto de cebadores para actuar selectivamente sobre una bacteria formadora de biopellcula adaptativa que pertenece a la familia de bacterias Sphingomonadacea. La bacteria formadora de biopellcula adaptativa puede mostrar mayor tolerancia a los programas de control biologico basados en oxidantes en comparacion con otros microorganismos de biopellculas y planctonicos. El cebador se puede utilizar para diferenciar entre las infecciones fungicas y las bacterianas.

Los fieltros de maquina entran y salen con frecuencia de los chorros del rociador y de las arquetas de llquido que contienen diferentes microorganismos de los cuales se pueden obtener con facilidad las muestras vivas. Sin embargo, el estado dinamico del fieltro (que cambia rapidamente de las condiciones humedas a las secas, que pasa con rapidez por el aire y por los llquidos, y el sustrato blando que se dobla, flexiona y enrolla) a menudo significa que la poblacion de microorganismos que habitan el fieltro diferira de la que esta presente dentro de los chorros del rociador y de las arquetas de llquido con los que entra en contacto. Como resultado, un analisis tlpico de los chorros del rociador y de las arquetas de llquido no identificara correctamente que microorganismos estan presentes dentro del fieltro. Un analisis por PCR de una muestra de fieltro que tiene en cuenta las clases de microorganismos que se sabe que son capaces de poblar los fieltros tiene en cuenta, no obstante, un analisis realmente exacto de las contaminaciones de los fieltros.

El analisis basado en el ADN de la muestra puede implicar que se pase por alto la posible presencia de microorganismos que se sabe que no pueblan los fieltros de maquina ni las hojas de papel del producto final. El metodo puede implicar la limitacion de los cebadores utilizados a los asociados a los microorganismos que se sabe que pueblan los fieltros de maquina y/o las hojas de papel del producto final.

El metodo puede implicar la distincion entre los ADN a nivel de reino biologico. La vida biologica se puede clasificar de acuerdo con cinco reinos: monera, protista, vegetal, animal y de los hongos. Estos organismos tienen un ADN enormemente diferente, y un protocolo que se centre en la identification del ADN del organismo a nivel de reino es inmensamente mas simple que las determinaciones mas especlficas. Debido a los fieltros, los microorganismos de los diferentes reinos a menudo se tratan mejor de maneras diferentes, tal forma simple de identificacion se puede utilizar para identificar de manera exacta el tratamiento especlfico que se dirigira selectivamente mejor sobre el contaminante en concreto.

Se puede utilizar mas de un cebador para identificar organismos que tienen mas de una secuencia de nucleotidos reconocible y unica. El analisis por PCR se puede utilizar para detectar secuencias de genomas asociadas a enzimas unicas o casi unicas de determinados organismos.

El metodo puede implicar la deteccion de un defecto y a continuacion utilizar el analisis por PCR para asociarlo adecuadamente con el origen del defecto. El metodo puede determinar si el defecto tiene una base totalmente biologica, una base totalmente qulmica no biologica, o es el resultado de una combinacion de fuentes con una base qulmica no biologica, mecanica y biologica.

El defecto puede ser uno o mas tapones en un fieltro. El defecto puede ser una hoja de papel que tiene al menos uno o varios de: un orificio, un orificio con un halo de otro color en torno al menos a una porcion de el, una raya de otro color, una macha, una mancha translucida y cualquier combinacion de los mismos.

Un nivel umbral se puede utilizar desde el punto de vista metodologico para descontar los positivos falsos. Algunas veces, el analisis por PCR detecta trazas de organismos que, aunque esten presentes, no ocasionan ningun defecto en concreto. El metodo puede implicar el descuento de la presencia de cualquier organismo detectado a una concentracion inferior que el nivel predeterminado conocido por uno o varios organismos en particular. El metodo puede implicar el descuento de la presencia de cualquier organismo detectado a un nivel por debajo de 104 celulas por gramo (del defecto). El metodo puede implicar el descuento de la presencia de cualquier organismo detectado a un nivel por debajo de 104 celulas por mililitro.

Los resultados del analisis se pueden utilizar para aumentar el programa de control biologico mediante la determinacion de cuanto, que clase y con que frecuencia una o mas composiciones biocidas se anaden a una o varias posiciones dentro de un sistema de fabricacion de papel.

El metodo es capaz de detectar microorganismos que, si no, no se detectarlan mediante los metodos de la tecnica anterior. Por ejemplo, en los casos en los que el atorante tiene su origen en una infeccion de microorganismos anaerobios o reductores de sulfato, los metodos tales como la deteccion de potencial de oxidorreduccion no identificarlan correctamente la fuente del atorante como biologica y, por lo tanto, se sugerirla incorrectamente la aplicacion de un metodo qulmico y no uno antibiologico. Sin embargo, la utilizacion del metodo del ADN indicarla correctamente siempre que la infeccion es biologica porque toda la vida contiene ADN.

El metodo se puede utilizar para valorar la diversidad microbiana. Esto puede incluir los microorganismos problematicos que se hallan en los depositos de la maquina, defectos de la hoja, productos acabados, fieltros, etc. El metodo se basa en el analisis de acidos nucleicos en los extractos de las muestras. Mas especlficamente, utiliza la PCR, tal como entre otras la qPCR, para la deteccion de organismos totales, tales como bacterias; especies de Sphingomonas; especies de Erythrobactep especies de Pseudomonas; especies de Burkholderia, especies de Haliscomenobacter; especies de Saprospira; especies de Schlegelella; especies de Leptothrix; Sphaerotilus natans; especies de Bacillus; especies de Anoxybacillus; miembros del filo Cytophaga-Flavobacterium-Bacteroides; bacterias verdes que no son del azufre, entre ellas Herpetosiphon, miembros del filo Deinococcus-Thermus, que incluye las especies de Meiothermus; bacterias productoras de catalasa, bacterias productoras de amilasa, bacterias productoras de ureasa, hongos, etc. Estas tecnicas utilizan cebadores y parejas estandares que permiten detectar y cuantificar los microorganismos deseados basandose en las secuencias conservadas. Los cebadores se dirigen selectivamente a las regiones del genoma microbiano que estan muy conservadas a lo largo de la evolucion, mientras que los cebadores especlficos del filo o del genero se dirigen selectivamente a las regiones mas variables del genoma.

La capacidad de cuantificar con exactitud un organismo de interes presente en una muestra hace que se pueda expresar ese organismo como un porcentaje de la carga bacteriana total en la muestra. Dado el gran numero de organismos que se pueden detectar, se puede determinar una fotografla de la diversidad de la poblacion microbiana en la muestra (figura 1). Esta fotografla se denomina el Indice de diversidad. El Indice de diversidad tambien se puede expresar cuantitativamente como la abundancia relativa de varios microorganismos deseados. El Indice de diversidad para cualquier parte de un procedimiento se puede medir en los momentos en los que las maquinas o los procedimientos estan funcionando bien, lo que crea una llnea basal. El Indice de diversidad medido en los momentos de un mal funcionamiento de la maquina o del procedimiento se puede comparar, entonces, con el nivel basal para buscar fluctuaciones en las poblaciones microbianas y determinar que grupos de bacterias son responsables de los problemas del procedimiento. El Indice de diversidad tambien se puede cuantificar para facilitar la comparacion mediante el uso del calculo del Indice de diversidad de Shannon para comparar los datos de seguimiento entre las localizaciones de las muestras o con respecto al nivel basal. Las estrategias de tratamiento y los puntos de alimentacion se pueden alterar entonces en consonancia para combatir el problema.

Un Indice de diversidad basado en la cuantificacion del ADN mide la presencia y la diversidad de los organismos en un procedimiento, con independencia de su viabilidad. El acido ribonucleico (ARN), en concreto el ARN mensajero (ARNm), es una molecula que se produce solo en los organismos vivos y tiene propiedades tales que, segun la diana, son unicas para un filo o genero de bacterias especlfico. Con la amplificacion de las secuencias de ARNm que son unicas en los organismos enumerados mas arriba, es posible determinar que bacterias estan presentes en su forma viable. La deteccion precisa de los organismos viables se puede utilizar entonces como una herramienta para la valoracion de la eficacia de las estrategias de tratamiento de las aguas tratadas. Esto se puede llevar a cabo mediante la comparacion del Indice de diversidad con el Indice de viabilidad.

Este metodo cuantificarla la cantidad y el tipo de bacterias viables que estan presentes en las muestras del procedimiento. El metodo de la reaccion en cadena de la polimerasa cuantitativa (en tiempo real) se puede aplicar para detectar los acidos nucleicos ribosomicos mensajeros (ARNm). El ARNm es ADN transcrito que se envla al ribosoma para servir de gula para la slntesis de protelnas en un procedimiento conocido como traduccion. El ARNm lo producen solo las celulas vivas. El ARN de las celulas vivas se puede aislar con el uso de kits disponibles en el mercado. La detection del ARNm requiere una etapa adicional en la reaction en cadena de la polimerasa cuantitativa. La transcriptasa inversa se anade a la mezcla de reaccion para transcribir el ARNm en su ADN complementario (ADNc). Se necesitan dos conjuntos de cebadores para este experimento. El primero actua selectivamente sobre el ARNm especlfico, mientras que el segundo se utiliza para amplificar el ADNc resultante producido por la reaccion de la transcriptasa inversa.

Ejemplos

Lo anterior se podrla entender mejor por referencia a los ejemplos que vienen a continuation, que se presentan con el proposito de ilustrar y no se pretende que limiten el alcance de la invention.

En una fabrica de hojas de papel sin revestimiento se padecio el deposito persistente en una de las cajas de cabeza de maquina, que se crela que era la causa de los defectos en el producto final. Se supuso que los microorganismos eran la causa subyacente del problema. Sin embargo, las tecnicas de seguimiento tradicionales (p. ej., recuentos estandares en placa y cantidad de ATP) no indicaban un aumento de los niveles de actividad microbiana.

Las muestras de los depositos de las cajas de cabeza se analizaron durante el transcurso de varios meses mediante el uso de tecnicas de qPCR. Los resultados iniciales de la qPCR a partir del analisis de los depositos en las cajas de cabeza de maquina mostraban una gran cantidad de carga microbiana, as! como una elevation de la densidad de microorganismos formadores de biopellcula primarios y adaptativos (figura 1). La estrategia de tratamiento se aumento con la adicion de biocidas tanto al desfibrador como al silo de papel averiado. Tambien se incremento el ritmo de alimentation del programa de control biologico basado en oxidantes. El analisis de los depositos recogidos un mes despues detecto pocos cambios en la carga bacteriana total de los depositos de las cajas de cabeza de maquina (figura 1A). El numero de microorganismos formadores de biopellcula primarios disminuyo un logaritmo, mientras que la densidad de los microorganismos formadores de biopellcula adaptativos disminuyo cuatro logaritmos (figuras 1B y 1C). La magnitud de los depositos de las cajas de cabeza de maquina y la frecuencia de los defectos de la hoja de papel segulan sin cambiar. La siembra en placa tradicional y el analisis del ATP en el sistema de aguas de tratamiento y de reserva indico poca actividad biologica. Los valores de ATP y de recuento en las placas estaban de promedio por debajo de 100 ULR y 100 unidades formadoras de colonias por gramo (UFC/g), respectivamente.

La estrategia de tratamiento se optimizo aun mas mediante la adicion de biocidas y cloro sin estabilizar al silo de papel averiado y al desfibrador. Despues de la aplicacion de la ultima serie de cambios, se recogieron mas muestras y se analizaron. La carga bacteriana total del deposito mostro una disminucion de casi un logaritmo (figura 1A). El conjunto final de muestras de depositos mostro una disminucion de casi dos logaritmos para la densidad de los microorganismos formadores de biopellcula primarios (figura 1B). Los microorganismos formadores de biopellcula adaptativos permanecieron en una cantidad casi basal (figura 1C). De nuevo, a pesar del mejor control de la poblacion microbiana, la frecuencia de los defectos, la naturaleza de los defectos y los depositos en las cajas de cabeza de maquina permaneclan inalterados.

Los defectos de las hojas de esta fabrica de papel se analizaron con la misma estrategia basada en la qPCR. Es imposible determinar el contenido bacteriano de los defectos mediante el uso de la siembra en placa y los metodos de ATP tradicionales, ya que muchas de las bacterias que podlan haber estado presentes en el defecto mueren por la elevada temperatura de la section del secador. El analisis qulmico no da a conocer una respuesta definitiva sobre las bacterias presentes en la hoja, que se basa en la tincion con ninhidrina. Este metodo es inespeclfico y propenso a los resultados positivos y negativos falsos. El analisis del ADN de los orificios y de los defectos de las hojas de esta fabrica de papel detecto una densidad bacteriana muy baja (figura 2, muestras 1 a 5). Los microorganismos formadores de biopellcula primarios y adaptativos no se detectaron en los defectos de las hojas analizados para esta fabrica de papel. Por lo tanto, el lodo bacteriano no contribula probablemente ni a los defectos ni a los problemas de calidad de esta fabrica. En comparacion, una fabrica en la que se padecla un deposito biologico significativo tenia defectos que contenian una carga microbiana mucho mas elevada (figura 2, muestra 6). Ademas, se identificaron especies bacterianas similares en los depositos y en los defectos. La tincion con ninhidrina de estos defectos no dio lugar a ninguna reaccion positiva, lo que indicaba la presencia de microorganismos. En otro caso, las bacterias se detectaron en defectos de las hojas en una cantidad justo por encima de la densidad minima necesaria para considerarse un defecto biologico. No obstante, la reaccion con ninhidrina dio negativo, lo que indicaba que el defecto no contenia microorganismos (figura 2, muestra 7). El examen cuantitativo por qPCR de los depositos en las cajas de cabeza de maquina demostro que, despues de cada modification de la estrategia de tratamiento, se reducian tanto los microorganismos formadores de biopellcula primarios como los adaptativos. El hecho de que haya una disminucion drastica de estos organismos diana y ninguna disminucion en la cantidad de depositos ni en la frecuencia de los defectos indicaba que las bacterias probablemente no eran las responsables de los problemas de los defectos en este sistema de maquinas. Los microorganismos formadores de biopellcula primarios colonizan las superficies de la maquina y crean un entorno favorable para la adhesion y la proliferation de otros tipos de microorganismos. Sin la presencia de estos microorganismos, las bacterias pueden adherirse a las superficies de la maquina siguiendo el deposito de desechos quimicos que pueden servir como un buen medio de crecimiento. Es probable que los aditivos quimicos y las fibras se depositen dentro de las cajas de cabeza de maquina, lo que da lugar a un microentorno idoneo para la colonizacion microbiana. Ya que el analisis de los defectos en la hojas revelo una presencia microbiana desatendida, los microorganismos se descartaron como la fuente primaria de los depositos en la caja de cabeza de maquina y de los efectos adversos en la calidad del producto. Los intentos de mejorar el funcionamiento de la maquina dejaron de centrarse en el control biologico y se dirigieron hacia un mejor control mecanico del sistema, para permitir una mejora de las condiciones operativas y de la calidad del producto.

En una fabrica de hojas de papel sin revestimiento se utilizo un programa de control biologico competitivo basado en oxidantes durante varios anos. El control del crecimiento microbiano se percibio que era el adecuado; sin embargo, existla la posibilidad de reducir aun mas las roturas de las hojas para mejorar la eficacia del procedimiento. Se implanto el programa y se optimizo en varias fases. La densidad bacteriana a lo largo del procedimiento permanecio baja y se documento una reduccion en las roturas de las hojas. El numero medio de roturas por dla disminuyo desde una media de 1,2 roturas al dla a 0,42 roturas al dla.

Aproximadamente dos anos despues de la aplicacion del programa optimizado, se observo que las condiciones del procedimiento se hablan vuelto mas variables y que se requerlan concentraciones crecientes de los productos de control biologico para mantener el mismo nivel de control. Un estudio del sistema mediante el uso de herramientas de seguimiento tradicionales, tales como recuento en placa y las mediciones de ATP, indico que la densidad bacteriana en el sistema de aguas de tratamiento permanecla baja y no se observo ningun incremento, o bien este era pequeno, en la caja de cabeza de maquina y en el sistema de papel averiado. Sin embargo, en la fabrica de papel se estaba produciendo un brote grave de orificios y defectos. Mientras que las tecnicas de seguimiento tradicionales no indicaban ningun cambio en el funcionamiento del programa de control biologico, la vigilancia de la actividad en llnea detecto un incremento de la actividad microbiana (figura 3).

El analisis cuantitativo por qPCR de los depositos de la maquina y de los defectos en las hojas confirmo la presencia de microorganismos formadores de biopellcula primarios y adaptativos. La densidad total de las bacterias en los defectos era aproximadamente de 1,8 x 107 celulas por gramo (figura 3). Esta prueba pone en evidencia el papel de los microorganismos en los defectos y en los problemas de calidad. La maquina se sometio a un hervido caustico tras el cual la vigilancia de la actividad en llnea mostro una reduccion en la actividad microbiana y un valor de potencial de oxidorreduccion mas estable, lo que indica una mejora del rendimiento del programa y de la resiliencia. La cantidad de microorganismos en los defectos de las hojas disminuyo de 107 a 105 celulas/g despues del hervido (figura 3). Esto confirma que la qPCR puede detectar la contribucion microbiana a los defectos en las hojas que no se pueden detectar con el uso de las tecnicas tradicionales. Ademas, la qPCR se puede utilizar para valorar la eficacia del programa de control biologico sobre el producto final.

Las muestras de fieltro de dos fabricas de papel que experimentaban problemas de funcionamiento, que se manifestaban como depositos en la maquina y defectos en las hojas de papel, se analizaron por qPCR. A cada muestra se le analizo la presencia de microorganismos. Una vez que se determino que cada muestra contenla una gran cantidad de bacterias, se analizo entonces en las muestras la presencia de microorganismos formadores de biopellcula adaptativos y primarios, que inclulan la familia Sphingomonadaceae, Meiothermus, Geothermus y Pseudoxanthomonas que se sabe que contribuyen a dar problemas con la eficacia de la maquina y con la calidad del producto. Ambas fabricas de papel contenlan una cantidad normal de microorganismos formadores de biopellcula adaptativos, aunque la fabrica 1 tenia el doble de microorganismos formadores de biopellcula primarios que la fabrica 2 (figura 4). La cantidad de microorganismos formadores de biopellcula adaptativos se determino que era normal, ya que esta cantidad estaba en el margen que indicaba que es probable que no contribuyan al problema. La cantidad de microorganismos formadores de biopellcula primarios en la fabrica 2 estaba en un nivel casi basal. La elevada cantidad de microorganismos formadores de biopellcula primarios en la fabrica 2 sugeria que en los fieltros se habian formado biopeliculas, lo que conducia a taponamiento de los fieltros y a la reduccion de la retirada de agua de la hoja de papel. La presencia de la biopellcula en los fieltros puede conducir a un incremento del deposito de otra materia que a continuacion se puede volver a depositar en la hoja. La elevada cantidad de microorganismos formadores de biopellcula primarios en la fabrica 1 sugeria que era necesario un analisis adicional de otras partes del procedimiento, tales como agua del rociador, aditivos, tinas de almacenamiento, etc., para determinar donde se originaban estos organismos.

El resultado de estos ejemplos demuestra que las tecnicas de siembra en placa convencionales y los residuos oxidantes pueden indicar una dosificacion de biocidas adecuada y un control del crecimiento microbiano, mientras que prevalecen el deposito, los defectos y las roturas. La utilizacion de metodos por PCR y qPCR da a conocer una informacion mas precisa en cuanto al crecimiento microbiano y a la formacion de biopeliculas en los sistemas de aguas industriales. Estas estrategias permiten un analisis rapido de la contribucion de los microorganismos a la formacion de depositos y se pueden utilizar para determinar con rapidez si los depositos que contienen microorganismos contribuyen o no a los defectos.

Las tecnicas cuantitativas por qPCR permiten el analisis rapido de los defectos de las hojas para determinar la contribucion de los microorganismos a los problemas de calidad. Se ha demostrado que este nuevo metodo permite un diagnostico mas proactivo de los problemas, lo que conduce a una mejora de la eficacia de la maquina y de la calidad del producto.

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Un metodo para identificar una infeccion por organismos formadores de biopellcula en un procedimiento de fabrication de papel, en donde el metodo comprende las etapas de:

observar un defecto sobre un artlculo asociado a un procedimiento de fabricacion de papel,

llevar a cabo al menos un analisis por PCR en al menos una muestra tomada del artlculo, el analisis por PCR con el uso de cebadores que se hibridan selectivamente con las secuencias nucleotldicas que se sabe que estan asociadas a al menos un tipo de organismo,

si se indica un resultado positivo, determinar si la medicion de una concentration de microorganismos excede un umbral predeterminado,

si la concentracion medida excede el umbral, se realiza al menos un analisis adicional por PCR para determinar los organismos especlficos que estan presentes en la muestra, en los que se realiza al menos un analisis adicional por PCR para determinar los organismos formadores de biopellcula primarios como organismos especlficos, si la concentracion medida de cada organismo especlfico detectado excede un umbral predeterminado, entonces ese defecto se debe al menos en parte a una infeccion de dicho organismo especlfico.

2. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el al menos un analisis adicional por PCR se hace para determinar los organismos formadores de biopellcula primarios y adaptativos como organismos especlficos.

3. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, en el que al menos un tipo de organismo es bacteria.

4. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el artlculo es un fieltro y el defecto es uno o varios tapones en el fieltro.

5. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el artlculo es una hoja de papel producida mediante el procedimiento de fabricacion de papel y el defecto es uno o varios orificios, discromla, rayas, manchas, manchas translucidas, y cualquier combination de los mismos en la hoja de papel.

6. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, que ademas comprende la etapa de grabar el organismo identificado en un formato que se puede almacenar y/o transmitir.

7. Un metodo para remediar una infeccion por microorganismos en un procedimiento de fabricacion de papel, que comprende la identification de un microorganismo formador de biopellcula de acuerdo con el metodo de la reivindicacion 1, que ademas comprende la etapa de la realization de un programa biocida asociado a la remediation del organismo identificado.

8. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el analisis por PCR es un analisis por qPCR.

9. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el umbral del analisis por PCR es 104 celulas por mililitro o 104 celulas por gramo del artlculo.

10. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el artlculo esta tan desecado que sobre el artlculo hay pocos o ningun organismo vivo de los que pudieron haber causado el defecto.

11. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el analisis por PCR determina la cantidad de organismos que infectan la muestra.

12. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el artlculo ha pasado a traves de una section de calentamiento o de secado del procedimiento de fabricacion de papel antes de observar el defecto y, por lo tanto, se han destruido los organismos que han causado el defecto.