JP6290145B2 - 非誘導体化非代謝化ビタミンdの質量分析法による決定 - Google Patents
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Description
代謝化ビタミンDのタンデム質量分析法により定量的に測定するための方法に関する。
学的役割を備える必須栄養素である。ビタミンDは、太陽光を浴びることによって皮内で
新しく(de novo)生成でき、又は飲食物から吸収することができる。ビタミンDには2
つの形態:ビタミンD2(エルゴカルシフェロール)及びビタミンD3(コレカルシフェ
ロール)がある。ビタミンD3は、動物によって新しく合成される形態である。ビタミン
D3は、さらに米合衆国内で製造される乳製品及び特定の食品に添加される一般的補助食
品である。食事性及び内因性で合成されるビタミンD3はどちらも、生物活性代謝産物を
生成するためには代謝活性化を受けなければならない。ヒトにおいては、ビタミンD3活
性化の初期工程は、主として肝臓内で発生し、中間代謝産物である25−ヒドロキシコレ
カルシフェロール(カルシフェジオール;25OHD3)を形成するためのヒドロキシル
化を含んでいる。カルシフェジオールは、循環中のビタミンD3の主要な形態である。循
環中25OHD3は、次に腎臓によって変換されて1,25−ジヒドロキシビタミンD3
(カルシトリオール;1,25(OH)2D3)を形成するが、これは一般にはビタミン
D3の最高生物活性を備える代謝産物であると考えられている。
カルシフェロール(ビタミンD3)ではなくエルゴカルシフェロール(ビタミンD2)を
含有している。Drisdolは、米合衆国内で入手できるビタミンDの唯一の高力価処
方薬であり、エルゴカルシフェロールを用いて製造される。ビタミンD2は、ヒトにおい
てはビタミンD3と類似の代謝活性化経路を経て、代謝産物である25OHD2及び1,
25(OH)2D2を形成する。ビタミンD2及びビタミンD3は、長年に渡りヒトにお
いて生物学的に等価であると考えられてきた。しかし近年の報告は、これら2種の形態の
ビタミンDの生物活性及びバイオアベイラビリティには差がある可能性を示唆している(
Armas et. al., (2004) J. Clin. Endocrinol. Metab. 89: 5387-5391)。
。むしろ、25−ヒドロキシビタミンD3、25−ヒドロキシビタミンD2、及び全25
−ヒドロキシビタミンD(「25OHD」)の血清中濃度が、ビタミンDの栄養状態及び
特定のビタミンDアナログの有効性の有用な指標である。25OHDの測定は、カルシウ
ムの代謝障害の診断及び管理において一般に使用される。この点において、低濃度の25
OHDは、疾患、例えば低カルシウム血症、低リン血症、続発性甲状腺機能亢進症、アル
カリホスファターゼ値上昇、成人における骨軟化症及び小児におけるくる病と関連するビ
タミンD欠乏症の徴候である。ビタミンD中毒が疑われる患者においては、25OHDの
濃度上昇は、この障害を高カルシウム血症を誘発する他の障害から識別する。
25(OH)2Dの循環中濃度によって反映される可能性があり、例えば腎疾患及び腎不
全は結果として低濃度の1,25(OH)2Dを生じさせることが多い。1,25(OH
)2Dの上昇した濃度は、過剰な副甲状腺ホルモンの徴候となることがあり、又は特定の
疾患、例えばサルコイドーシス又は特定タイプのリンパ腫の徴候となることがある。
HD3に対して共特異的な抗体を用いて実施されてきた。現行の免疫学に基づくアッセイ
では25OHD2及び25OHD3を別個に分解(resolve)できないために、ビタミン
Dのあらゆる栄養欠乏症の起源を他の試験に頼らずに決定することはできない。特異的ビ
タミンD代謝産物を検出するために質量分析法を使用する方法を開示する報告書が公開さ
れている。一部の報告書では、ビタミンD代謝産物が質量分析法を受ける前に誘導体化さ
れるが、他の報告書では誘導化されない。例えば、2007年12月28日に出願された
Holmquist, et al.、米国特許出願第11/946765号明細書、Yeung B, et al., J
Chromatogr. 1993, 645 (1): 115-23、Higashi T, et al., Steroids. 2000, 65 (5): 28
1-94、Higashi T, et al., Biol Pharm Bull. 2001, 24 (7): 738-43、Higashi T, et al
., J Pharm Biomed Anal. 2002, 29 (5): 947-55、Higashi T, et al., Anal. Biochanal
Chem, 2008, 391: 229-38及びAronov, et al., Anal Bioanal Chem, 2008, 391: 1917-3
0は、質量分析法の前に代謝産物を誘導体化することにより、様々なビタミンD代謝産物
を検出する方法を開示している。非誘導体化ビタミンD代謝産物を検出するための方法は
、Clarke, et al.により2005年4月6日に出願された米国特許出願第11/101,
166号明細書及び2006年3月21日に出願された同第11/386,215号明細
書、並びにSingh, et al.により2004年10月24日に出願された米国特許出願第1
0/977,121号明細書の中に報告されている。クックソン型試薬、特に4−フェニ
ル−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(PTAD)及び4−[2−(6,7−
ジメトキシ−4−メチル−3−オキソ−3,4−ジヒドロキノキサリル)エチル]−1,
2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(DMEQ−TAD)を用いたビタミンD3の誘
導体化を開示している報告書も公表されている。Aberhart, J, et al., J. Org. Chem. 1
976, 41 (12): 2098-2102及びKamao, M, et al., J Chromatogr. B 2007, 859: 192-200
を参照されたい。
デム質量分析法を含む質量分析法によって検出するための方法を提供する。1つの態様で
は、サンプル由来のビタミンDは、質量分析法による分析の前に誘導体化される。第2態
様では、サンプル由来のビタミンDは、質量分析法による分析の前に誘導体化されない。
ビタミンDを質量分析法によって検出可能な1つ又はそれ以上の前駆体イオンを生成する
ために適合する条件下でイオン化源に曝露させる工程、(ii)少なくとも1つの該前駆
体イオンを、質量分析法によって検出可能な1つ又はそれ以上のフラグメントイオンを生
成するためにフラグメント化する工程、(iii)該前駆体及びフラグメントイオンの1
つ又はそれ以上の量を質量分析法によって決定する工程、及び(iv)工程(iii)に
おいて決定されたイオンの量を該サンプル中のビタミンDの量と関連付ける工程を含んで
いる。これらの方法では、サンプルは、工程(i)の前にクックソン型誘導体化ビタミン
Dを生成するために十分な条件下でクックソン型誘導体化試薬に曝露される。一部の実施
形態では、クックソン型誘導体化ビタミンDは、イオン化の前に抽出カラム及び分析カラ
ムにかけられる。関連する実施形態では、分析カラムは、高性能液体クロマトグラフィー
(HPLC)カラムであってよい。
ィー(TFLC)にかける工程、(ii)該サンプル由来のクックソン型誘導体化ビタミ
ンDを質量分析法によって検出可能な1つ又はそれ以上のイオンを生成するために適合す
る条件下でイオン化源に曝露させる工程、(iii)1つ又はそれ以上の該クックソン型
誘導体化ビタミンDイオンの量を質量分析法によって決定する工程、及び(iv)工程(
iii)において決定されたクックソン型誘導体化ビタミンDイオンの量を該サンプル中
のビタミンDの量と関連付ける工程を含んでいる。これらの実施形態では、サンプルは、
クックソン型誘導体化試薬に、工程(i)の前に該サンプル中でクックソン型誘導体化ビ
タミンDを生成するために十分な条件下で曝露される。一部の実施形態では、サンプルは
、工程(i)の後であるが工程(ii)の前に高性能液体クロマトグラフィー(HPLC
)にかけられる。
アゾリン−3,5−ジオン(PTAD)である。これらの実施形態の一部では、1つ又は
それ以上の前駆体イオンは、572.4±0.5及び560.4±0.5の質量/電荷比
(m/z)を備えるイオン(複数)からなる群から選択される1つ又はそれ以上のイオン
を含んでいる。これらの実施形態の一部では、1つ又はそれ以上のフラグメントイオンは
、298.1±0.5の質量/電荷比(m/z)を備えるイオンを含んでいる。
体化ビタミンDイオンは、572.3±0.5の質量/電荷比(m/z)を備える前駆体
イオン及び298.1±0.5の質量/電荷比(m/z)を備えるフラグメントイオンを
含むことができる。ビタミンDがビタミンD3を含む実施形態では、1つ又はそれ以上の
クックソン型誘導体化ビタミンDイオンは、560.3±0.5の質量/電荷比(m/z
)を備える前駆体イオン及び298.1±0.5の質量/電荷比(m/z)を備えるフラ
グメントイオンを含むことができる。ビタミンDがビタミンD2及びビタミンD3を含む
実施形態では、1つ又はそれ以上の前駆体イオンは572.4±0.5の質量/電荷比(
m/z)を備えるビタミンD2前駆体イオン及び560.4±0.5のm/zを備えるビ
タミンD3前駆体イオンを含むことができ、及び1つ又はそれ以上のフラグメントイオン
は、298.1±0.5のm/zを備えるビタミンD2フラグメントイオン及び298.
1±0.5のm/zを備えるビタミンD3フラグメントイオンを含むことができる。
量分析法によって誘導体化ビタミンDのイオン化及び検出を行わずに決定する方法を提供
する。一部の実施形態では、ビタミンDは、ビタミンD2を含んでいる。これらの方法は
:サンプル由来のビタミンD2を397.2±0.5又は379.2±0.5の質量対電
荷比(m/z)を備えるイオン(複数)からなる群から選択される質量分析法によって検
出可能な1つ又はそれ以上の前駆体イオンを生成するために適合する条件下でイオン化源
に曝露させる工程、少なくとも1つの該前駆体イオンを、質量分析法によって検出可能な
1つ又はそれ以上のフラグメントイオンを生成するためにフラグメント化する工程、(i
ii)工程(i)及び(ii)において生成された1つ又はそれ以上のイオンの量を質量
分析法によって決定する工程、及び(iv)工程(iii)において決定されたビタミン
D2イオンの存在を該サンプル中のビタミンD2の存在と関連付ける工程を含んでいる。
これらの方法では、フラグメント化前駆体イオンが397.2±0.5のm/zを備える
イオンを含む場合は、該フラグメントイオンは、159.0±0.5、146.9±0.
5、133.1±0.5及び121.0±0.5のm/zを備えるイオン(複数)からな
る群から選択される1つ又はそれ以上のイオンを含んでいる。これらの方法では、フラグ
メント化前駆体イオンが379.2±0.5のm/zを備えるイオンを含む場合は、該フ
ラグメントイオンは、283.2±0.5、187.3±0.5、175.2±0.5及
び159.0±0.5のm/zを備えるイオン(複数)からなる群から選択される1つ又
はそれ以上のイオンを含んでいる。一部の実施形態では、サンプル由来のビタミンD2は
、イオン化の前に抽出カラム、例えば固相抽出(SPE)カラム又は乱流液体クロマトグ
ラフィー(THLC)カラムにかけることができる。一部の実施形態では、サンプル由来
のビタミンD2は、イオン化の前に分析カラム、例えば高性能液体クロマトグラフィー(
HPLC)カラムにさらにかけられる。
法は:(i)サンプル由来のビタミンD3を385.2±0.5又は367.2±0.5
の質量対電荷比(m/z)を備えるイオン(複数)からなる群から選択される質量分析法
によって検出可能な1つ又はそれ以上の前駆体イオンを生成するために適合する条件下で
イオン化源に曝露させる工程、(ii)少なくとも1つの該前駆体イオンを、質量分析法
によって検出可能な1つ又はそれ以上のフラグメントイオンを生成するためにフラグメン
ト化する工程、(iii)工程(i)及び(ii)において生成された1つ又はそれ以上
のイオンの量を質量分析法によって決定する工程、及び(iv)工程(iii)において
決定されたビタミンD3イオンの存在を該サンプル中のビタミンD3の存在と関連付ける
工程を含んでいる。これらの方法では、フラグメント化前駆体イオンが385.2±0.
5のm/zを備えるイオンを含む場合は、該フラグメントイオンは、159.0±0.5
、147.0±0.5、133.1±0.5及び107.1±0.5のm/zを備えるイ
オン(複数)からなる群から選択される1つ又はそれ以上のイオンを含んでいる。フラグ
メント化前駆体イオンが367.2±0.5のm/zを備えるイオンを含む場合は、該フ
ラグメントイオンは、172.2±0.5、145.0±0.5及び119.1±0.5
のm/zを備えるイオン(複数)からなる群から選択される1つ又はそれ以上のイオンを
含んでいる。一部の実施形態では、サンプル由来のビタミンD3は、イオン化の前に抽出
カラム、例えば固相抽出(SPE)カラム又は乱流液体クロマトグラフィー(THLC)
カラムへかけることができる。一部の実施形態では、サンプル由来のビタミンD3は、イ
オン化の前に分析カラム、例えば高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)カラムへさ
らにかけられる。
デム質量分析法を利用する実施形態では、タンデム質量分析法は、例えば、多重反応モニ
タリング、前駆体イオンスキャニング、又はプロダクトイオンスキャニングを含む当分野
において公知の任意の方法によって実施することができる。
ば乱流液体クロマトグラフィー(TFLC)カラムであってよい。抽出カラム、分析カラ
ム及びイオン化源の2つ又はそれ以上を利用する一部の実施形態では、利用される構成要
素は、自動サンプル処理及び分析を可能にするオンライン方式で結合することができる。
4−トリアゾリン−3,5−ジオン(PTAD)、4−メチル−1,2,4−トリアゾリ
ン−3,5−ジオン(MTAD)、4−[2−(6,7−ジメトキシ−4−メチル−3−
オキソ−3,4−ジヒドロキノキサリル)エチル]−1,2,4−トリアゾリン−3,5
−ジオン(DMEQTAD)、4−(4−ニトロフェニル)−1,2,4−トリアゾリン
−3,5−ジオン(NPTAD)及び4−フェロセニルメチル−1,2,4−トリアゾリ
ン−3,5−ジオン(FMTAD)、並びに同位体で標識されたそれらの変種からなる群
から選択することができる。好ましい実施形態では、クックソン型誘導体化試薬は、4−
フェニル−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(PTAD)又は同位体で標識さ
れたそれらの変種である。特定の好ましい実施形態では、クックソン型誘導体化試薬は、
4−フェニル−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(PTAD)又は同位体で標
識されたそれらの変種である。
上の天然型又は合成アナログのビタミンDを意味する。これは、代謝中に発生する特異的
化学修飾(例えば、25−ヒドロキシビタミンD及び1α,25−ジヒドロキシビタミン
D)によって同定されるビタミンD代謝産物とは対照的である。非代謝化ビタミンDは、
さらに代謝化形態から識別するために「栄養的」ビタミンDと言及することもできる。代
謝化形を特定しないビタミンDへの言及は、非代謝化形への言及である。
する工程を意味する。従って、誘導体化剤は、他の物質と反応すると物質を誘導体化する
ことのできる物質である。例えば、4−フェニル−1,2,4−トリアゾリン−3,5−
ジオン(PTAD)は、ビタミンDと反応するとPTAD−誘導体化ビタミンDを形成す
ることのできる誘導体化試薬である。
含んでいる。例えば、ビタミンD2のPTAD誘導体は、PTAD−ビタミンD2(又は
PTAD−誘導体化ビタミンD2)と表示される。
ン−3,5−ジオン化合物である。典型的なクックソン型誘導体化剤には、4−フェニル
−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(PTAD)、4−メチル−1,2,4−
トリアゾリン−3,5−ジオン(MTAD)、4−[2−(6,7−ジメトキシ−4−メ
チル−3−オキソ−3,4−ジヒドロキノキサリル)エチル]−1,2,4−トリアゾリ
ン−3,5−ジオン(DMEQTAD)、4−(4−ニトロフェニル)−1,2,4−ト
リアゾリン−3,5−ジオン(NPTAD)及び4−フェロセニルメチル−1,2,4−
トリアゾリン−3,5−ジオン(FMTAD)が含まれる。さらに、一部の実施形態にお
いてはクックソン型誘導体化剤の同位体で標識された変種を使用できる。例えば、13C
6−PTAD同位体変種は、標準PTADより6質量単位重く、一部の実施形態において
使用することができる。クックソン型試薬によるビタミンD代謝産物の誘導体化は、任意
の適切な方法によって実施できる。例えば、2007年12月28日に出願されたHolmqu
ist, et al.による米国特許出願第11/946765号明細書、Yeung B, et al., J Ch
romatogr. 1993, 645 (1): 115-23、Higashi T, et al., Steroids. 2000, 65 (5): 281-
94、Higashi T, et al., Biol Pharm Bull. 2001, 24 (7): 738-43、Higashi T, et al.,
J Pharm Biomed Anal. 2002, 29 (5): 947-55、Higashi T, et al., Anal. Biochanal C
hem, 2008, 391: 229-38及びAronov, et al., Anal Bioanal Chem, 2008, 391: 1917-30
を参照されたい。
ビタミンD3を意味することができる。サンプルがビタミンDの複数の形態を含む実施形
態では、ビタミンDの複数の形態を同時にイオン化することができる。例えば、一部の実
施形態では、ビタミンD2及びビタミンD3の量は、同一サンプル内で決定される。これ
らの実施形態では、(誘導体化又は非誘導体化)ビタミンD2及びビタミンD3は、同時
にイオン化することができる。
「同時の」は、同一サンプル注入から該サンプル中の2つ又はそれ以上の分析物の量を反
映するデータを獲得することを意味する。各分析物についてのデータは、使用される器械
技術に依存して、連続的又は並行して獲得できる。例えば、2つの分析物を含有する単一
サンプルをHPLCカラム内に注入することができ、次にこれは各分析物を順々に溶出さ
せ、結果として質量分析計内への分析物の連続的な導入を生じさせることができる。これ
ら2つの分析物各々の量を決定する工程は、本明細書の目的のためには、両方の分析物が
HPLC内への同一サンプル注入の結果として生じるので、同時に行われる。
物が生成することができる。従って、サンプルは、例えば患者、つまり生きている、男性
又は女性の疾患又は状態の診断、予後診断、若しくは治療を受けるために医療環境にやっ
てきたヒトから入手できる。好ましいサンプルは、生物学的サンプル、特に生物学的流体
サンプル、例えば血清又は血漿であってよい。本明細書に提示した方法は、ヒトから採取
された場合にサンプル中に存在するビタミンDの量を決定するために使用できる。
で実施される。又は、質量分析法は、負イオンモードで実施される。例えば大気圧化学イ
オン化法(APCI)、レーザーダイオード熱脱離法(LDTD)又はエレクトロスプレ
ーイオン化法(ESI)を含む様々なイオン化源は、本発明の実施形態において使用でき
る。特定の好ましい実施形態では、ビタミンD代謝産物は、正イオンモードでAPCI又
はLDTDを用いて測定される。
提供され、これらの量もサンプル中で決定される。これらの実施形態では、サンプル中に
存在する対象の分析物及び内部標準の両方の全部又は一部分が、質量分析計において検出
可能な複数のイオンを生成するためにイオン化され、各々から生成された1つ又はそれ以
上のイオンが質量分析法によって検出される。好ましくは、内部標準は、ビタミンD2−
[6,19,19]−2H3、ビタミンD2−[26,26,26,27,27,27]
−2H6、ビタミンD3−[6,19,19]−2H3及びビタミンD3−[26,26
,26,27,27,27]−2H6の内の1つ又はそれ以上である。
理(適合する場合)又は該サンプルからの分析物の任意の精製前にサンプル内に提供する
ことができる。これらの実施形態では、1つ又はそれ以上の内部標準は、内因性ビタミン
Dと共に誘導体化及び/又は精製を受けることができ、その場合には該誘導体化及び/又
は精製された内部標準のイオンが質量分析法によって検出される。これらの実施形態では
、対象の分析物から生成されたイオンの存在又は量を該サンプル中の対象の分析物の存在
又は量と関連付けることができる。一部の実施形態では、内部標準はビタミンDの同位体
標識形、例えばビタミンD2−[6,19,19]−2H3、ビタミンD2−[26,2
6,26,27,27,27]−2H6、ビタミンD3−[6,19,19]−2H3及
びビタミンD3−[26,26,26,27,27,27]−2H6であってよい。
いて生成することができる。数種の典型的な内部標準について生成された典型的スペクト
ルについては、実施例8及び9において考察し、図6から7、9から10、12から13
及び15から16に示す。
分子と比較して標識分子内では質量シフトを生成する。適切な標識の例には、ジュウテリ
ウム(2H)、13C及び15Nが含まれる。例えば、ビタミンD2−[6,19,19
]−2H3及びビタミンD3−[6,19,19]−2H3は、各々ビタミンD2及びビ
タミンD3より約3質量単位高い質量を有する。同位体標識は、該分子の1つ又はそれ以
上の位置で組み込むことができ、及び1つ又はそれ以上の種類の同位体標識を同一の同位
体で標識された分子上で使用できる。
することによって決定することができる。典型的な外部参照標準には、1つ又はそれ以上
のビタミンD2−[6,19,19]−2H3、ビタミンD2−[26,26,26,2
7,27,27]−2H6、ビタミンD3−[6,19,19]−2H3及びビタミンD
3−[26,26,26,27,27,27]−2H6でスパイクされたブランク血漿又
は血清が含まれる。外部標準は、通常は誘導体化ビタミンDが検出される実施形態におい
て質量分析法の前に1つ又はそれ以上のクックソン型試薬を用いた処理を含む、分析対象
の任意の他のサンプルと同一の処理及び分析を受けることになる。
他の実施形態では、本方法は、サンプル中のビタミンD 2 の量をタンデム質量分析法によって決定するための方法であって、(i)サンプル由来のビタミンD 2 を397.2±0.5又は379.2±0.5の質量対電荷比(m/z)を備えるイオン(複数)からなる群から選択される質量分析法によって検出可能な1つ又はそれ以上の前駆体イオンを生成するために適合する条件下でイオン化源に曝露させる工程、(ii)少なくとも1つの前駆体イオンを、質量分析法によって検出可能な1つ又はそれ以上のフラグメントイオンを生成するためにフラグメント化する工程、(iii)工程(i)及び(ii)において生成された1つ又はそれ以上のイオンの量を質量分析法によって決定する工程、及び(iv)工程(iii)において決定されたビタミンD 2 イオンの存在をサンプル中のビタミンD 2 の存在と関連付ける工程を含み、ここで、フラグメント化前駆体イオンが397.2±0.5のm/zを備えるイオンを含む場合は、フラグメントイオンが159.0±0.5、146.9±0.5、133.1±0.5及び121.0±0.5のm/zを備えるイオン(複数)からなる群から選択される1つ又はそれ以上のイオンを含み、及びフラグメント化前駆体イオンが379.2±0.5のm/zを備えるイオンを含む場合は、フラグメントイオンが283.2±0.5、187.3±0.5、175.2±0.5及び159.0±0.5のm/zを備えるイオン(複数)からなる群から選択される1つ又はそれ以上のイオンを含む方法であってもよい。フラグメント化前駆体イオンは、397.2±0.5のm/zを備えるイオンであってもよく、379.2±0.5のm/zを備えるイオンであってもよい。また、サンプルは、イオン化の前に抽出カラムにかけられてもよい。抽出カラムは、固相抽出(SPE)カラムであってもよく、抽出カラムは、乱流液体クロマトグラフィー(TFLC)カラムであってもよい。サンプルは、イオン化の前にさらに分析カラムにかけられてもよい。そして、分析カラムは、高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)カラムであってもよい。抽出及び分析カラム並びに工程(i)のイオン化源は、オンライン方式で接続されてもよい。イオン化源は、大気圧化学イオン化(APCI)源であってもよい。タンデム質量分析法は、多重反応モニタリング、前駆体イオンスキャニング又は生成物イオンスキャニングとして実施されてもよい。本方法は、サンプル中でビタミンD 3 を検出する工程をさらに含んでもよい。ビタミンD 2 及びビタミンD 3 は、同時にイオン化されてもよい。サンプルは、生物学的サンプルを含んでもよい。生物学的サンプルはヒト由来であり、サンプル中で決定されたビタミンD 2 の量はヒトから採取された場合はサンプル中に存在する量であってもよい。サンプルは、血清又は血漿を含んでもよい。
他の実施形態では、本方法は、サンプル中のビタミンD 3 の量をタンデム質量分析法によって決定するための方法であって、(i)サンプル由来のビタミンD 3 を385.2±0.5又は367.2±0.5の質量対電荷比(m/z)を備えるイオン(複数)からなる群から選択される質量分析法によって検出可能な1つ又はそれ以上の前駆体イオンを生成するために適合する条件下でイオン化源に曝露させる工程、(ii)少なくとも1つの前駆体イオンを、質量分析法によって検出可能な1つ又はそれ以上のフラグメントイオンを生成するためにフラグメント化する工程、(iii)工程(i)及び(ii)において生成された1つ又はそれ以上のイオンの量を質量分析法によって決定する工程、及び(iv)工程(iii)において決定されたビタミンD 3 イオンの存在をサンプル中のビタミンD 3 の存在と関連付ける工程を含み、ここで、フラグメント化前駆体イオンが385.2±0.5のm/zを備えるイオンを含む場合は、フラグメントイオンが159.0±0.5、147.0±0.5、133.1±0.5及び107.1±0.5のm/zを備えるイオン(複数)からなる群から選択される1つ又はそれ以上のイオンを含み、及びフラグメント化前駆体イオンが367.2±0.5のm/zを備えるイオンを含む場合は、フラグメントイオンが172.2±0.5、145.0±0.5及び119.1±0.5のm/zを備えるイオン(複数)からなる群から選択される1つ又はそれ以上のイオンを含む方法であってもよい。フラグメント化前駆体イオンは、385.2±0.5のm/zを備えるイオンであってもよく、367.2±0.5のm/zを備えるイオンであってもよい。サンプルは、イオン化の前に抽出カラムにかけられてもよい。抽出カラムは、固相抽出(SPE)カラムであってもよく、乱流液体クロマトグラフィー(TFLC)カラムであってもよい。サンプルは、イオン化の前にさらに分析カラムにかけられてもよい。分析カラムは、高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)カラムであってもよい。抽出及び分析カラム並びに工程(i)のイオン化源は、オンライン方式で接続されてもよい。イオン化源は、大気圧化学イオン化(APCI)源であってもよい。タンデム質量分析法は、多重反応モニタリング、前駆体イオンスキャニング又は生成物イオンスキャニングとして実施されてもよい。本方法は、サンプル中でビタミンD 2 を検出する工程をさらに含んでもよい。ビタミンD 2 及びビタミンD 3 は、同時にイオン化されてもよい。サンプルは、生物学的サンプルを含んでもよい。生物学的サンプルはヒト由来であり、サンプル中で決定されたビタミンD 3 の量はヒトから採取された場合にサンプル中に存在する量であってもよい。サンプルは、血清又は血漿を含んでもよい。
他の実施形態では、本方法は、サンプル中のビタミンD 2 及びビタミンD 3 の量をタンデム質量分析法によって決定するための方法であって、(i)サンプル中のビタミンD 2 及びビタミンD 3 を397.2±0.5及び379.2±0.5の質量対電荷比(m/z)を備えるイオンの群から選択される質量分析法によって検出可能な1つ又はそれ以上のビタミンD 2 前駆体イオン、並びに385.2±0.5及び367.2±0.5の質量対電荷比(m/z)を備えるイオンの群から選択される質量分析法によって検出可能な1つ又はそれ以上のビタミンD 3 前駆体イオンを生成するために適合する条件下でイオン化源に曝露させる工程、(ii)少なくとも1つのビタミンD 2 前駆体イオンを、質量分析法によって検出可能な1つ又はそれ以上のビタミンD 2 フラグメントイオンを生成するためにフラグメント化する工程であって、ここで、フラグメント化ビタミンD 2 前駆体イオンが397.2±0.5のm/zを備えるイオンを含む場合は、ビタミンD 2 フラグメントイオンが159.0±0.5、146.9±0.5、133.1±0.5及び121.0±0.5のm/zを備えるイオン(複数)からなる群から選択される1つ又はそれ以上のイオンを含み、及びフラグメント化ビタミンD 2 前駆体イオンが379.2±0.5のm/zを備えるイオンを含む場合は、ビタミンD 2 フラグメントイオンが283.2±0.5、187.3±0.5、175.2±0.5及び159.0±0.5のm/zを備えるイオン(複数)からなる群から選択される1つ又はそれ以上のイオンを含む工程、(iii)少なくとも1つのビタミンD 3 前駆体イオンを、質量分析法によって検出可能な1つ又はそれ以上のビタミンD 3 フラグメントイオンを生成するためにフラグメント化する工程であって、ここで、フラグメント化ビタミンD 3 前駆体イオンが385.2±0.5のm/zを備えるイオンを含む場合は、ビタミンD 3 フラグメントイオンは、159.0±0.5、147.0±0.5、133.1±0.5及び107.1±0.5のm/zを備えるイオン(複数)からなる群から選択される1つ又はそれ以上のイオンを含み、及びフラグメント化ビタミンD 3 前駆体イオンが367.2±0.5のm/zを備えるイオンを含む場合は、ビタミンD 3 フラグメントイオンは、172.2±0.5、145.0±0.5及び119.1±0.5のm/zを備えるイオン(複数)からなる群から選択される1つ又はそれ以上のイオンを含む工程、(iv)工程(i)、(ii)及び(iii)において生成された1つ又はそれ以上のビタミンD 2 及びビタミンD 3 イオンの量を質量分析法によって決定する工程、及び (v)工程(vi)で決定されたビタミンD 2 及びビタミンD 3 イオンの量をサンプル中のビタミンD 2 及びビタミンD 3 の量と関連付ける工程を含む方法であってもよい。フラグメント化ビタミンD 2 前駆体イオンは、397.2±0.5のm/zを備えるイオンであってもよく、379.2±0.5のm/zを備えるイオンであってもよい。フラグメント化ビタミンD 3 前駆体イオンは、385.2±0.5のm/zを備えるイオンであってもよく、367.2±0.5のm/zを備えるイオンであってもよい。サンプルは、イオン化の前に抽出カラムにかけられてもよい。抽出カラムは、固相抽出(SPE)カラムであってもよく、乱流液体クロマトグラフィー(TFLC)カラムであってもよい。サンプルは、イオン化の前にさらに分析カラムにかけられてもよい。分析カラムは、高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)カラムであってもよい。抽出及び分析カラム並びに工程(i)のイオン化源は、オンライン方式で接続されてもよい。イオン化源は、大気圧化学イオン化(APCI)源であってもよい。タンデム質量分析法は、多重反応モニタリング、前駆体イオンスキャニング又は生成物イオンスキャニングとして実施されてもよい。サンプルは、生物学的サンプルを含んでもよい。生物学的サンプルはヒト由来であり、サンプル中で決定されたビタミンD 2 及びビタミンD 3 の量はヒトから採取された場合にサンプル中に存在する量であってもよい。サンプルは、血清又は血漿を含んでもよい。
その(the)」には複数形の言及が含まれる。従って、例えば「1つのタンパク質」とい
う言及には複数のタンパク質分子が含まれる。
ルから全物質を除去することを意味していない。その代りに、「精製」は、対象の分析物
の検出を妨害する可能性があるサンプル中の他の成分と比較した1つ又はそれ以上の対象
の分析物の量を濃縮する方法を意味する。様々な手段によるサンプルの精製は、1つ又は
それ以上の干渉物質、例えば質量分析法による選択された親又は娘イオンの検出を妨害す
る可能性がある、又は妨害しない可能性がある1つ又はそれ以上の物質の相対的減少を可
能にする。この用語のような相対的減少は、精製すべき材料中の対象の分析物とともに存
在する任意の物質が精製によって完全に除去されることを必要としない。
液が通過させられる固体(即ち、固相)に対する化学的混合物が、溶液(即ち、移動相)
中で溶解若しくは懸濁された成分の親和性の結果として成分に分離される方法を意味する
。一部の例では、移動相が固相の中若しくは周囲を通過するにつれて、該移動相の望まし
くない成分は、該固相によって保持され、該移動相内の分析物の精製を生じさせることが
できる。他の例では、分析物は固相によって保持することができ、移動相の望ましくない
成分が該固相の中若しくは周囲を通過することを可能にする。これらの例では、次に第2
移動相はそれ以上の加工処理又は分析のために保持された分析物を該固相から溶出させる
ために使用される。TFLCを含むSPEは、単一又は混合モード機序によって作動する
ことができる。混合モード機序は、同一カラム内でのイオン交換及び疎水性滞留を利用す
る。例えば、混合モードSPEカラムの固相は強アニオン交換及び疎水性滞留を示す可能
性があり、又は強カチオン交換及び疎水性滞留を示す可能性がある。
る化学的混合物が、それらが固定相液体若しくは固相の周囲若しくは上方を流れるにつれ
て化学実体の示差的分布の結果として複数の成分に分離される方法を意味する。
に微細物質のカラムを通して、又はキャピラリー路を通って浸透するに従う流体溶液の1
つ又はそれ以上の成分の選択的遅滞の方法を意味する。遅滞は、1つ又はそれ以上の固定
相とバルク液(即ち、移動相)との間の混合物の、この流体が固定相に対して移動するに
従う成分の分布の結果として生じる。「液体クロマトグラフィー」の例には、逆相液体ク
ロマトグラフィー(RPLC)、高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)及び乱流液
体クロマトグラフィー(TFLC)(高乱流液体クロマトグラフィー(HTLC)又は高
スループット液体クロマトグラフィーとして公知であることもある)が含まれる。
高圧液体クロマトグラフィー」として公知であることもある)は、移動相を圧力下で固定
相、通常は高密度に充填されたカラムに通して推し進めることによって分離度が増加する
液体クロマトグラフィーを意味する。
流液体クロマトグラフィー若しくは高スループット液体クロマトグラフィーとして公知で
あることもある)は、分離を実施するための基礎としてカラム充填を通して分析される物
質の乱流を利用するクロマトグラフィーの形態を意味する。TFLCは、質量分析法によ
る分析に先行して2つの不特定の薬物を含有するサンプルの調製において適用されてきた
。例えば、Zimmer et al., J Chromatogr A 854: 23-35 (1999)を参照されたい。さらに
、TFLCについて詳細に説明している米国特許第5,968,367号明細書、同第5
,919,368号明細書、同第5,795,469号明細書及び同第5,772,87
4号明細書も参照されたい。当業者であれば、「乱流」を理解している。流体が緩徐及び
平滑に流動する場合は、その流れは「層流」と呼ばれる。例えば、HPLCカラムを通し
て低流速で移動する流体は層流である。層流では、流体の粒子の運動は、概して直線で移
動する粒子に従順である。より高速では、水の慣性が流体の摩擦力に勝り、結果として乱
流が生じる。不規則な境界と接触していない流体は、摩擦によって緩徐化される、又は不
均一な表面によって偏向させられる流れを「追い越す」。流体が乱流として流動する場合
は、流れが層流の場合よりも「抗力」を伴って、流体は渦巻きながら流動する。流体の流
れが層流又は乱流であるかを決定する際に役立つ多数の参考文献を利用できる(例えば、
Turbulent Flow Analysis: Measurement and Prediction, P.S. Bernard & J.M. Wallace
, John Wiley & Sons, Inc.,(2000)、An Introduction to Turbulent Flow, Jean Mathie
u & Julian Scott, Cambridge University Press (2001))。
合物が気化させられ、液体若しくは粒子状固体から構成される固定層を含有するカラムを
通って移動するキャリヤガス流(窒素又はヘリウムとして)内に注入され、固定相のため
の化合物の親和性に従ってその成分化合物に分離されるクロマトグラフィーを意味する。
大きい平均粒径を含有するクロマトグラフィーカラムを意味する。
可能にするために十分なカラムから溶出する材料の分離を実行するために十分なクロマト
グラフィープレートを有するクロマトグラフィーカラムを意味する。好ましい実施形態で
は、分析カラムは、直径が約5μmの粒子を含有する。そのようなカラムは、その後の分
析のために精製されたサンプルを得るために保持されていない物質から保持された物質を
分離又は抽出するという一般的目的を有する「抽出カラム」とは識別されることが多い。
法」又は「オンライン抽出」で使用される用語は、オペレータが介入する必要を伴わずに
実施される手順を意味する。これとは対照的に、本明細書で使用する用語「オフライン」
は、オペレータの手作業による介入を必要とする手順を意味する。従って、サンプルが沈
殿させられ、次に上清がオートサンプラー内に手作業で充填される場合は、沈殿及び充填
工程はその後の工程からオフラインである。本方法の様々な実施形態では、1つ又はそれ
以上の工程は、オンライン自動法で実施することができる。
合物を同定するための分析技術を意味する。MSは、濾過し、検出し、及びそれらの質量
対電荷比若しくは「m/z」に基づいてイオンを測定する方法を意味する。MSテクノロ
ジーは、一般には(1)荷電化合物を形成するために化合物をイオン化する工程、及び(
2)該荷電化合物の分子量を検出して質量対電荷比を計算する工程を含んでいる。化合物
は、任意の適切な手段によってイオン化及び検出することができる。「質量分析計」は、
一般にはイオン化装置及びイオン検出器を含んでいる。一般に、対象の1つ又はそれ以上
の分子がイオン化され、該イオンは引き続いて質量分析器械内に導入され、そこで磁場と
電場の組み合わせのために、該イオンは質量(「m」)及び電荷(「z」)に依存する空
間内の経路を辿る。例えば、「Mass Spectrometry From Surfaces」と題する米国特許第
6,204,500号明細書、「Methods and Apparatus for Tandem Mass Spectrometry
」と題する同第6,107,623号明細書、「DNA Diagnostics Based On Mass Spectr
ometry」と題する同第6,268,144号明細書、「Surface-Enhanced Photolabile A
ttachment And Release For Desorption And Detection Of Analytes」と題する同第6,
124,137号明細書、Wright et al., Prostate Cancer and Prostatic Diseases 19
99, 2: 264-76及びMerchant and Weinberger, Electrophoresis 2000, 21: 1164-67を参
照されたい。
検出される質量分析法を意味する。本明細書で使用する用語「正のイオンモードで操作す
る」は、正のイオンが生成されて検出される質量分析法を意味する。
以上の電子単位と同等の正味電荷を有する分析物イオンを生成する方法を意味する。負の
イオンは、1つ又はそれ以上の電子単位の正味負電荷を有するイオンであり、一方、正の
イオンは1つ又はそれ以上の電子単位の正味正電荷を有するイオンである。
の対象の分析物が電子の流れと相互作用する方法を意味する。電子と分析物との衝撃は、
次に質量分析技術を受けさせることができる分析物イオンを生成する。
ンモニア)が電子衝撃に曝露され、分析物イオンが試薬ガスイオンと分析物分子との相互
作用によって形成される方法を意味する。
ビーム(Xe又はArであることが多い)が、非揮発性サンプルに衝撃を与え、該サンプ
ル中に含有される分子を脱離してイオン化する方法を意味する。試験サンプルは、様々な
液体マトリックス、例えば、グリセロール、チオグリセロール、m−ニトロベンジルアル
コール、18−クラウン−6クラウンエーテル、2−ニトロフェニルオクチルエーテル、
スルホラン、ジエタノールアミン及びトリエタノールアミン中に溶解される。化合物又は
サンプルにとって適切なマトリックスの選択は、経験に基づく方法である。
LDI」は、非揮発性サンプルが、光イオン化、プロトン化、脱プロトン化及びクラスタ
崩壊を含む様々なイオン化経路によって該サンプル中の分析物を脱離及びイオン化するレ
ーザー照射に曝露される方法を意味する。MALDIのためには、サンプルは、分析物分
子の脱離を促進するエネルギー吸収マトリックスと混合される。
は、非揮発性サンプルが、光イオン化、プロトン化、脱プロトン化及びクラスタ崩壊を含
む様々なイオン化経路によって該サンプル中の分析物を脱離及びイオン化するレーザー照
射に曝露される又別の方法を意味する。SELDIのためには、サンプルは、通常は1つ
又はそれ以上の対象の分析物を優先的に保持する表面に結合される。MALDIにおける
ものと同様に、この方法もイオン化を促進するためにエネルギー吸収材料を使用すること
ができる。
が長さの短いキャピラリーチューブに沿って通過させられ、その端部では正又は負の高電
位が印加される方法を意味する。キャピラリーチューブの端部に達した溶液は、溶媒蒸気
中の溶液の極めて小さな液滴のジェット又はスプレーに蒸気化(噴霧化)される。この液
滴のミストは、凝縮を防止して溶媒を蒸発させるために僅かに加熱される蒸発チャンバを
通って流動する。液滴がより小さくなるにつれて電気面電荷密度は、同電荷間の自然反発
力がイオン並びに中性分子を遊離させるようになる時点まで増加する。
似する質量分析法を意味するが、APCIは、大気圧下のプラズマ内で発生するイオン−
分子反応によってイオンを生成する。プラズマは、スプレーキャピラリーと対電極との間
の放電によって維持される。次にイオンは、通常は、1組の差動揚水スキマー段階の使用
によって質量分析装置内へ抽出される。向流の乾性及び予熱N2ガスを使用すると、溶媒
の除去を改善することができる。APCIにおける気相イオン化は、低極性種を分析する
ためにはESIより有効な可能性がある。
ン化のための機序が分子イオンM+を形成するための光子吸収及び電子放出であるイオン
化の形態を意味する。吸収された光子のエネルギーは、通常はイオン化電位より僅かに高
いために、分子イオンは解離されにくい。多くの場合に、クロマトグラフィーを必要とせ
ずにサンプルを分析することが可能であるので、時間及び費用を大きく節約することがで
きる。水蒸気又はプロトン性溶媒の存在下では、分子イオンはHを抽出してMH+を形成
することができる。これは、Mが高プロトン親和性を有する場合に発生する傾向がある。
これは、M+及びMH+の合計が一定であるために、定量正確性に影響を及ぼさない。プ
ロトン性溶媒中の薬物化合物は通常はMH+であると観察されるが、非極性化合物、例え
ばナフタレン又はテストステロンは、通常はM+を形成する。例えば、Robb et al., Ana
l. Chem. 2000, 72 (15): 3653-3659を参照されたい。
とんどの元素が霧化及びイオン化されるような十分に高温で不完全イオン化ガスと相互作
用する方法を意味する。
内への進入を意味する。レーザーダイオード熱脱離(LDTD)は、分析物を含有するサ
ンプルがレーザーパルスによって気相内へ熱により脱離される技術である。レーザーは、
金属基板を備える特別製作された96ウエルプレートの背部に衝突する。レーザーバルス
は該基板を加熱し、この熱はサンプルが気相内へ移動するのを誘発する。次に気相サンプ
ルは、イオン化源内へ引き入れられ、そこで気相サンプルは質量分析計内での分析の準備
においてイオン化される。LDTDを使用する場合は、気相サンプルのイオン化は、当分
野において公知の任意の適切な技術、例えばコロナ放電を用いる(例えば、APCIによ
る)イオン化によって実施することができる。
れ、強電場が分析物イオンを生成させるために使用される方法を意味する。
、通常は約1質量単位のイオンだけが検出される質量分析器械のための検出モードである
。
て公知でありこともあり、前駆体イオン及び1つ又はそれ以上のフラグメントイオンが選
択的に検出される質量分析器械のための検出モードである。
f quantitation)」若しくは「LLOQ」は、測定値が定量的に有意となるポイントを意
味する。このLOQでの分析物反応は、20%未満の相対標準偏差(RSD(%))及び
80%から120%の正確性で同定可能であり、個別的及び再現性である。
不確実性より大きいポイントである。LODは数値がその測定値と関連する不確実性を超
えているポイントであり、ゼロ濃度での平均値のRSDの3倍であると規定されている。
検出可能な分析物の質量を反映している絶対値を意味する。しかし、量は、さらに別の分
析物の量と比較した相対量も企図している。例えば、サンプル中の分析物の量は、該サン
プル中に通常存在する該分析物のコントロール若しくは正常レベルより大きい量であって
よい。
は、指示された数値±10%を意味する。質量分析器械は、特定の分析物の質量を決定す
る際に僅かに変動することがある。イオンの質量又はイオンの質量/電荷比の状況におけ
る用語「約」は、±0.50原子質量単位を意味する。
本発明の詳細な説明及び特許請求の範囲から明白になる。
プル中のビタミンDを検出及び定量するための質量分析法について記載する。本方法は、
クックソン型試薬、例えばPTADを使用して誘導体化ビタミンDを生成することができ
る。しかし一部の方法では誘導体化剤が使用されず、非誘導体化ビタミンD2及び/又は
ビタミンD3が質量分析法によって検出される。
実施するために抽出クロマトグラフィー技術、例えば、乱流液体クロマトグラフィー(T
FLC)を質量分析(MS)の方法と組み合わせて使用することができ、それによってサ
ンプル中のビタミンD2及び/又はビタミンD3を検出及び定量するための高スループッ
トアッセイシステムを提供する。又は、一部の方法では、抽出クロマトグラフィーを含む
クロマトグラフィーがサンプル分析のために必要とされない。これらの方法では、非誘導
体化又は誘導体化ビタミンD2及び/又はビタミンD3は、LDTDを用いてイオン化さ
れる。好ましい実施形態は、自動ビタミンD定量のための大規模臨床研究室において適用
するために特に良好に適合する。
る可能性がある任意の試験サンプルが含まれる。一部の好ましい実施形態では、サンプル
は、生物学的サンプル、即ち、任意の生物学的起源、例えば動物、細胞培養、臓器培養な
どから得られるサンプルである。特定の好ましい実施形態では、サンプルは、哺乳動物、
例えばイヌ、ネコ、ウマなどから入手される。特に好ましい哺乳動物は、霊長類、最も好
ましくはヒトの男性又は女性である。好ましいサンプルは、体液、例えば血液、血漿、血
清、唾液、脳脊髄液若しくは組織サンプル、好ましくは血漿(EDTA及びヘパリン血漿
を含む)及び血清、最も好ましくは血清を含んでいる。そのようなサンプルは、例えば、
患者、つまり生きている、男性又は女性の、疾患又は状態の診断、予後診断、若しくは治
療を受けるために医療環境に現れたヒトから入手できる。
ッセイのためのキットは、本明細書に提供した組成物を含むキットを含むことができる。
例えば、キットは、充填材料及び測定量のクックソン型試薬及び同位体標識された内部標
準を少なくとも1回のアッセイのために十分量で含むことができる。通常は、本キットは
、さらにビタミンD定量アッセイにおいて使用するための包装された試薬を使用するため
の(例えば、紙又は電子媒体に含有される)有形で記録された取扱説明書も含むことにな
る。
るサンプルマトリックスに類似するマトリックスを使用して調製される。
質量分析法による分析のための調製において、ビタミンDは、サンプル(例えば、タン
パク質)中の1つ又はそれ以上の他の成分と比較して、例えば、液体クロマトグラフィー
、濾過、遠心分離、薄層クロマトグラフィー(TLC)、キャピラリー電気泳動法を含む
電気泳動法、免疫親和性分離を含む親和性分離法、酢酸エチル若しくはメタノール抽出を
含む抽出法及びカオトロピック剤の使用又は上記のいずれかの組み合わせなどを含む当分
野において公知の様々な方法によって濃縮することができる。
を調製する1つの方法である。タンパク質精製法は、当分野において周知であり、例えば
、Polson et al., Journal of Chromatography B 2003, 785: 263-275は、本発明の方法
において使用するために適切なタンパク質沈殿法について記載している。タンパク質沈殿
法は、サンプルから大部分のタンパク質を除去して上清中にビタミンDを残すために使用
できる。サンプルは、遠心して液体上清を沈殿したタンパク質から分離することができる
。又は、サンプルは、濾過して沈殿したタンパク質を除去することができる。次に、残っ
ている上清若しくは濾液は、質量分析法による分析に直接に、又は、液体クロマトグラフ
ィー及びその後の質量分析法による分析にかけることができる。特定の実施形態では、サ
ンプル、例えば血漿若しくは血清は、ハイブリッドタンパク質沈殿/液−液抽出法によっ
て精製することができる。これらの実施形態では、サンプルは、メタノール、酢酸エチル
及び水と混合し、生じた混合液はボルテックスミキサーにかけて遠心させる。生じた上清
は取り出し、完全に乾燥させ、アセトニトリル中で再構成される。次に、精製されたビタ
ミンDは、任意のクックソン型試薬、好ましくはPTAD又はその同位体標識された変種
を用いて誘導体化することができる。
LC)である。HPLCを含む液体クロマトグラフィーの特定の方法は、比較的緩徐な層
流技術に依存している。伝統的なHPLC分析は、カラム充填に依存しており、このとき
該カラムを通るサンプルの層流が該サンプルから対象の分析物を分離するための基礎であ
る。当業者であれば、そのようなカラム内での分離が拡散方法であることを理解し、HP
LCを含むLC、誘導体化ビタミンDと共に使用するために適する器械及びカラムを選択
することができる。クロマトグラフィーカラムは、通常は、化学成分の分離(即ち、分別
)を促進するための媒質(即ち、充填材料)を含んでいる。媒質は微細粒子を含むことが
でき、又は多孔性チャネルを備えるモノリシック材料を含むことができる。媒質の表面は
、通常は、化学成分の分離を促進するために様々な化学成分と相互作用する接合面を含ん
でいる。1つの適切な接合面は、疎水性接合面、例えばアルキル接合面、シアノ接合面、
又は高純度シリカ表面である。アルキル接合面は、C−4、C−8、C−12、又はC−
18接合アルキル基を含むことができる。好ましい実施形態では、カラムは高純度シリカ
カラム(例えば、Thermo Hypersil Gold Aqカラム)である。ク
ロマトグラフィーカラムは、サンプルを受け入れるための入口ポート及び分別されたサン
プルを含む流出物を放出するための出口ポートを含んでいる。サンプルは、入口ポートへ
直接に、又は抽出カラム、例えばオンラインSPEカートリッジ若しくはTFLC抽出カ
ラムから供給することができる。
混合液と共に溶出させ、出口ポートで放出することができる。対象の分析物を溶出するた
めに様々な溶媒モードを選択することができる。例えば、液体クロマトグラフィーは、勾
配モード、アイソクラチックモード又は多型的(即ち、混合型)モードを用いて実施する
ことができる。クロマトグラフィー中、材料の分離は変量、例えば溶離液(「移動相」と
しても公知である)、溶出モード、勾配条件、温度などの選択によって実施できる。
によって可逆的に保持されるが1つ又はそれ以上の材料が保持されない条件下で適用する
ことによって精製できる。これらの実施形態では、対象の分析物がカラムによって保持さ
れる第1移動相条件を使用することができ、引き続いて、保持されなかった材料が洗い流
されると保持された材料をカラムから除去するために第2移動層条件を使用することがで
きる。又は、分析物は、サンプルをカラムへ、対象の分析物が1つ又はそれ以上の他の材
料と比較して示差的速度で溶出する移動相条件下で適用することによって精製できる。そ
のような手順は、対象の1つ又はそれ以上の分析物の量を該サンプルの1つ又はそれ以上
の他の成分と比較して濃縮することができる。
ーシステムを用いて実施される。特定の好ましい実施形態では、高純度シリカカラム(例
えば、Thermo Hypersil Gold Aqカラム)が使用される。特定の
好ましい実施形態では、HPLC及び/又はTFLCは、移動相AとしてHPLCグレー
ドの水及び移動相BとしてHPLCグレードのエタノールを使用して実施される。
ラフィーカラムを材料がいかなる手作業の工程も全く必要とせずに1つのカラムから次の
カラムへ通過するように必要に応じて接続することができる。好ましい実施形態では、バ
ルブ及び配管の選択は、必要な工程を実施するために前もってプログラムされたコンピュ
ータによって制御される。最も好ましくは、クロマトグラフィーシステムは、さらにオン
ライン方式で検出システム、例えばMSシステムへ接続される。従って、オペレータは、
サンプルのトレイをオートサンプラーへ配置することができ、残りの作業はコンピュータ
制御下で実施され、結果として選択された全サンプルの精製及び分析が行われる。
ために使用できる。そのような実施形態では、サンプルは、分析物を捕捉する抽出カラム
を用いて抽出し、次にイオン化の前に第2抽出カラム上又は分析用HPLCカラム上で溶
出させてクロマトグラフィーにかけることができる。例えば、TFLC抽出カラムを用い
たサンプル抽出は、粒径の大きな(50μm)充填カラムを用いて実施することができる
。このカラムから溶出されたサンプルは、次に質量分析法の前にさらに精製するためにH
PLC分析カラムへ移すことができる。これらのクロマトグラフィー法に含まれる工程は
自動方式で連結することができるので、分析物の精製中にオペレータが関与する要件は最
小限に抑えることができる。この特徴は、時間及び費用の節約を生じさせ、オペレータが
操作を間違える可能性を排除することができる。
の酢酸エチル/水による抽出を含む複合型タンパク質沈降法/液−液抽出法を用いて実施
される。結果として生じるビタミンD代謝産物は、抽出カラムにかける前に誘導体化する
ことができる。好ましくは、複合型タンパク質沈殿法/液−液抽出法及び抽出カラムはオ
ンライン方式で接続される。好ましい実施形態では、抽出カラムは、C−8抽出カラム、
例えばCohesive Technologies C8XLオンライン抽出カラム(
粒径:50μm、0.5×50mm)又は同等物である。次に抽出カラムからの溶離液は
、質量分析法による分析の前に、分析用LCカラム、例えばHPLCカラムへオンライン
方式で適用することができる。これらのクロマトグラフィー法に含まれる工程は自動方式
で連結することができるので、分析物の精製中にオペレータが関与する要件は最小限に抑
えることができる。この特徴は、時間及び費用の節約を生じさせ、オペレータが操作を間
違える可能性を排除することができる。
様々な実施形態では、誘導体化ビタミンDは、当業者には公知の任意の方法によってイ
オン化することができる。質量分析法は、分別されたサンプルをイオン化し、その後の分
析のために荷電分子を作り出すためのイオン源を含む質量分析計を用いて実施される。例
えば、サンプルのイオン化は、電子イオン化、化学イオン化、エレクトロスプレーイオン
化(ESI)、光子イオン化、大気圧化学イオン化(APCI)、光イオン化、大気圧光
イオン化(APPI)、レーザーダイオード熱脱離(LDTD)、高速原子衝撃法(FA
B)、液体二次イオン化(LSI)、マトリックス支援レーザー脱離イオン化(MALD
I)、電場イオン化、電場脱離、サーモスプレー/プラズマスプレーイオン化、表面増強
レーザー脱離イオン化(SELDI)、誘導結合プラズマ(ICP)及び粒子ビームイオ
ン化によって実施することができる。当業者であれば、イオン化法の選択は、測定対象の
分析物、サンプルのタイプ、検出器のタイプ、正対負のモードの選択などに基づいて決定
することができることを理解する。
誘導体化ビタミンDは、正イオンモードでAPCI又はLDTDを用いてイオン化される
。
た正又は負の荷電イオンを分析して質量対電荷比を決定することができる。質量対電荷比
を決定するために適するアナライザーには、四重極アナライザー、イオントラップアナラ
イザー及び飛行時間アナライザーが含まれる。典型的なイオントラップ法は、Bartolucci
, et al., Rapid Commun. Mass Spectrom. 2000, 14: 967-73に記載されている。
イオンは、即ち選択的イオンモニタリングモード(SIM)を使用して検出でき、又は衝
突誘起解離若しくは自然損失の結果として生じた質量変化は、例えば多重反応モニタリン
グ(MRM)又は選択された反応モニタリング(SRM)によって監視することができる
。好ましくは、質量対電荷比は、四重極アナライザーを使用して決定される。例えば、「
四重極」若しくは「四重極イオントラップ」機器では、振動無線周波数電磁場内のイオン
は電極間に印加されたDC電位に比例する力、RF信号の振幅及び質量/電荷比を経験す
る。電圧及び振幅は、特定質量/電荷比を有するイオンだけが四重極の全長を移動し、他
の全てのイオンは偏向させられるように選択することができる。従って、四重極機器は、
該機器内に注入されたイオンにとっての「質量フィルター」及び「質量検出器」の両方と
して機能できる。
によって強化することができる。この技術では、対象の分子から生成された前駆体イオン
(親イオンとも呼ばれる)はMS機器内で濾過することができ、該前駆体イオンは引き続
いて第2MS法において分析される1つ又はそれ以上のフラグメントイオン(娘イオン又
は生成物イオンとも呼ばれる)を産生するためにフラグメント化される。前駆体イオンの
注意深い選択によって、特定の分析物によって生成されたイオンだけがフラグメント化チ
ャンバへ通過させられ、そこでの不活性ガスの原子との衝突がフラグメントイオンを生成
する。前駆体イオン及びフラグメントイオンはどちらも所定セットのイオン化/フラグメ
ント化条件下で反復方法により生成されるので、MS/MS技術は極めて強力な分析用ツ
ールを提供することができる。例えば、濾過/フラグメント化の組み合わせは、干渉物質
を排除するために使用することができ、複雑なサンプル中、例えば生物学的サンプル中で
特に有用な可能性がある。
駆体イオンスキャニングが含まれる。これらの操作モードの説明については、例えば、E.
Michael Thurman, et al., Chromatographic-Mass Spectrometric Food Analysis for T
race Determination of Pesticide Residues, Chapter 8 (Amadeo R. Fernandez-Alba, e
d., Elsevier 2005) (387)を参照されたい。
の該分析物の量と関連付けることができる。例えば、サンプリング及び分析パラメータが
注意深く制御されていることを前提にすると、所定のイオンの相対存在量は、相対存在量
を原分子の絶対量へ変換する表と比較することができる。又は、サンプルと共に外部標準
をランし、それらの標準から生成されたイオンに基づいて標準曲線を構築することができ
る。そのような標準曲線を使用すると、所定のイオンの相対存在量を原分子の絶対量へ変
換することができる。特定の好ましい実施形態では、内部標準を使用して、ビタミンDの
量を計算するための標準曲線を作成する。そのような標準曲線を作成及び使用する方法は
当分野において周知であり、当業者であれば適切な内部標準を選択することができる。例
えば、好ましい実施形態では、1つ又はそれ以上の同位体標識されたビタミンD(例えば
、ビタミンD2−[6,19,19]−2H3及びビタミンD3−[6,19,19]−
2H3)を内部標準として使用できる。イオンの量を原分子の量へ関連付けるための他の
数多くの方法は、当業者には周知である。
の実施形態では、1つ又はそれ以上の精製工程はオンラインで実施され、より好ましくは
精製及び質量分析法工程の全部をオンライン方式で実施することができる。
めに単離され、衝突活性化解離(CAD)がその後の検出のためのフラグメントイオンを
生成するために使用されることが多い。CADでは、前駆体イオンは不活性ガスとの衝突
を通してエネルギーを獲得し、引き続いて「単分子分解」と呼ばれる方法によってフラグ
メント化する。前駆体イオン内には、該イオン内の特定の結合を増加した振動エネルギー
に起因して崩壊できるように十分なエネルギーが堆積させられなければならない。
用いて検出及び/又は定量される。サンプルは、最初にタンパク質沈殿法又は複合型タン
パク質沈殿/液−液抽出法によって精製される。次に、精製されたサンプル中のビタミン
Dは、場合によりクックソン型試薬、例えばPTADを用いて誘導体化される。次に、精
製されたサンプルは、液体クロマトグラフィーに、好ましくは抽出カラム(例えば、TF
LCカラム)、次の分析カラム(例えば、HPLCカラム)上でかけられる。クロマトグ
ラフィーカラムからの液体溶媒の流れは、MS/MSアナライザーのネブライザー界面に
進入し、及び溶媒/分析物混合液は、界面の加熱荷電チュービング内で蒸気に変換られる
。溶媒中に含有される分析物(例えば、誘導体化又は非誘導体化ビタミンD)は、溶媒/
分析物混合液へ大きな電圧を印加することによってイオン化される。分析物が界面の荷電
チュービングから出て行くにつれて、溶媒/分析物混合液は霧状になり、溶媒は蒸発し、
分析物イオンが残る。分析物イオン、例えば前駆体イオンは、器械の開口部を通過して第
1四重極に進入する。四重極1及び3(Q1及びQ3)は、質量フィルターであり、それ
らの質量対電荷比(m/z)に基づいてイオンの選択(即ち、Q1及びQ3における「前
駆体」イオン及び「フラグメント」イオン各々の選択)を可能にする。四重極2(Q2)
は、イオンがフラグメント化される衝突セルである。質量分析計の第1四重極(Q1)は
、対象の質量対電荷比を備えるイオンを選択する。正しい質量/電荷比を備える前駆体イ
オンは衝突チャンバ(Q2)を通過させられるが、一方、任意の他の質量/電荷比を備え
る望ましくないイオンは該四重極の側面に衝突し、排除される。Q2に進入する前駆体イ
オンは中性アルゴンガス分子及びフラグメントと衝突する。生成されたフラグメントイオ
ンは四重極3(Q3)内に通過させられ、そこで誘導体化又は非誘導体化ビタミンDフラ
グメントイオンが選択され、その他のイオンが排除される。
るMS/MSを含むことができる。当分野において周知の標準方法を用いると、当業者で
あれば、四重極3(Q3)において選択するために使用できる誘導体化ビタミンDの特定
前駆体イオンの1つ又はそれ以上のフラグメントイオンを同定することができる。
生成する。獲得されたデータは、コンピュータへ中継され、コンピュータは収集されたイ
オン対時間の計数をプロットする。結果として生じる質量クロマトグラムは、伝統的HP
LC−MS法において生成されたクロマトグラムに類似する。特定イオンに対応するピー
ク下の面積、又はそのようなピークの振幅を測定し、対象の分析物の量に関連付けること
ができる。特定の実施形態では、フラグメントイオン及び/又は前駆体イオンについての
曲線下面積、又はピークの振幅は、ビタミンDの量を決定するために測定される。上述し
たように、所定のイオンの相対存在量は、内部分子標準の1つ又はそれ以上のイオンのピ
ークに基づいて標準検量線を使用して原分析物の絶対量に変換することができる。
[実施例]
以下の自動複合型タンパク質沈殿法/液−液抽出法は、患者血清サンプルを対象に実施
した。ゲル−バリヤ血清(即ち、血清分離剤チューブ内に収集された血清)並びにEDT
A血漿及びヘパリン血漿も、このアッセイのために許容されることが確定されている。
a Tower ロボットを使用して以下の手順を自動化した。各サンプルについて、5
0μLの血清を96ウエルプレートのウエルに加えた。次に25μLの内部標準カクテル
(同位体標識されたビタミンD3−[6,19,19]−2H3を含有する)を各ウエル
に加え、プレートをボルテックスミキサーにかけた。次に75μLのメタノールを加え、
さらに追加してボルテックスミキサーにかけた。次に300μLの酢酸エチル及び75μ
Lの水を加え、追加してボルテックスミキサーにかけ、遠心し、生じた上清を新しい96
ウエルプレートに移した。
に乾燥させた。誘導体化は、各ウエルにアセトニトリル中のクックソン型誘導体化剤PT
ADの0.1mg/mL溶液100μLを加えることによって実施した。誘導体化反応を
およそ1時間に渡り進行させ、反応混合液に水100μLを加えることによってクエンチ
させた。
サンプル注入は、Aria OS V1.5.1若しくはそれ以降のソフトウエアを使
用してCohesive Technologies Aria TX−4 TFLCシ
ステムを用いて実施した。
hesive Technologies C8XLオンライン抽出カラム(粒径:50
μm、005×50mm、Cohesive Technologies社)内へ自動的
に注入した。サンプルは、抽出カラム内で乱流を作り出すために高流速で装填した。この
乱流は、カラム内での誘導体化ビタミンDの大粒子への最適な結合並びに廃棄するための
過剰な誘導体化試薬及び破片の通過を保証した。
ypersil Gold Aq分析カラム(粒径:5μm、50×2.1mm)へ溶出
させた。ビタミンDをサンプル中に含有される他の分析物から分離するために、HPLC
勾配を分析カラムへ適用した。移動相Aは水であり、移動相Bはエタノールであった。H
PLC勾配は、35%有機勾配で開始し、およそ65秒間で99%へ増加させた。
MS/MSは、上記で生成されたサンプルを対象にFinnigan TSQ Qua
ntum Ultra MS/MSシステム(Thermo Electron Cor
poration社)を使用して実施した。全部がThermo Electron社製
である以下のソフトウエアプログラムを本明細書に記載した実施例において使用した:Q
uantum Tune Master V1.5又はそれ以降、Xcalibur V
2.07又はそれ以降、LCQuan V2.56(Thermo Finnigan社
)又はそれ以降及びARIA OS v1.5.1(Cohesive Technol
ogies社)又はそれ以降。分析カラムから出た液体溶媒/分析物はMS/MSアナラ
イザーのネブライザー界面へ流動した。溶媒/分析物混合液は、界面のチュービング内で
蒸気に変換された。噴霧化された溶媒の分析物は、APCIによってイオン化された。
を各々備えるビタミンD2及びビタミンD3前駆体イオンを選択する第1四重極(Q1)
を通過した。四重極2(Q2)に進入したイオンはアルゴンガスと衝突してイオンフラグ
メントを生成し、これらのイオンフラグメントはその後の選択のために四重極3(Q3)
へ通過させられた。質量分析計の設定は表1に示す。同時に、同位体希釈質量分析法を用
いる同一方法を内部標準であるビタミンD3−[6,19,19]−2H3を用いて実施
した。正極性及び指示された衝突エネルギーでのバリデーション中の検出及び定量のため
に使用した質量変化は表2に示す。
19,19]−2H3(内部標準)の典型的なクロマトグラムは、各々図1A、1B及び
1Cに示す。
図2A及び2Bに示す。
定量下限(LLOQ)は、測定値が定量的に有意となるポイントである。このLLOQ
での分析物の反応は、20%より大きい精度(即ち、変動係数(CV))及び80%から
120%の正確性を備えて同定可能、個別的及び再現性である。LLOQは、公知の分析
物濃度(2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、20ng/m
L、40ng/mL及び60ng/mL)を備えるサンプルを実施例1から3の方法によ
って4例ずつ5回アッセイし、再現性を評価することによって決定した。収集されたデー
タの分析は、2ng/mL未満の濃度を備えるサンプルが両方の分析物について20%未
満のCVを産生することを示している。従って、各分析物のLLOQは、<2ng/mL
であると決定された。PTAD−ビタミンD2及びPTAD−ビタミンD3のLLOQを
決定するために生成されたデータは、各々表4及び5に示す。両方の分析物に対するCV
対濃度のグラフ表示は図3に示す。
アッセイ間変動はアッセイ内のサンプルの再現性であると規定されており、実施例1か
ら3の方法に従って3つのQCプール各々からのサンプルを20回ずつアッセイすること
によって決定した。これらの分析から収集したデータは、ビタミンD2及びビタミンD3
各々について表8及び9に示す。QCプール内の分析物の濃度は、ビタミンD2について
は6.6ng/mL、20.6ng/mL及び52.6ng/mL、ビタミンD3につい
ては4.9ng/mL、20.5ng/mL及び48.6ng/mLであると決定された
。結果について実施した統計学的検定は、3つのQCプールに関してビタミンD2につい
ては5.1%、4.6%及び3.9%、並びにビタミンD3については6.4%、4.0
%及び4.5%の再現性を生じた。
実施例1から3の方法に従って5回のアッセイに渡って評価したアッセイの報告可能範囲
に及ぶ3つのQCプールを使用して、これらのプールについてのアッセイ間変動(CV)
をビタミンD2及びビタミンD3について決定した。ビタミンD2については、CVは各
々6.5ng/mL、21.1ng/mL及び50.5ng/mLの平均濃度を用いて6
.7%、5.6%及び4.0%であると決定された。ビタミンD3については、CVは各
々4.7ng/mL、20.8ng/mL及び46.8ng/mLの平均濃度を用いて6
.5%、5.9%及び4.2%であると決定された。これらの分析から収集したデータは
、ビタミンD2及びビタミンD3について各々表10及び11に示す。全プールは、≦1
5% CVの許容される再現性要件を満たした。
溶血干渉:実施例1から3に記載したアッセイにおける溶血の作用は、上昇したビタミ
ンD2及びビタミンD3を含有する血清プール中にヘモグロビンをスパイクすることによ
って評価した。新鮮血液サンプルを遠心して濃縮赤血球を産生した。血球を脱イオン水中
で再構成し、細胞溶解を達成するために冷凍した。次にこの粗ヘモグロビン溶液をプール
内へスパイクすると、軽度(100mg/dL)及び中等度(500mg/dL)に溶血
したサンプルが生成された。試料は、実施例1から3の方法に従って2回ずつ分析し、コ
ントロールプールの結果と比較し、相違率(%)を計算した。データは、ヘモグロビンス
パイクがいずれも、いずれの分析物に対してもコントロールと15%を超えて相違しなか
ったことを証明している。このため、軽度から中等度の溶血試料は許容される。生データ
については表13を参照されたい(相違率(%)=(スパイク−非スパイク)/非スパイ
ク×100%)。
ンD2及びビタミンD3を含有する血清プール中にビリルビンをスパイクすることによっ
て評価した。次にビリルビンの濃縮溶液をプール内へスパイクして、軽度(10mg/d
L)及び中等度(50mg/dL)の黄疸性サンプルを生成した。試料は、実施例1から
3の方法に従って2回ずつ分析し、結果を非黄疸性プールの結果と比較し、正確性を計算
した。データは、どちらの分析物も黄疸による影響を受けないことを証明している(全数
値が85から115%の許容される正確性範囲内にある)。このため、黄疸性試料は許容
される。生データについては表14を参照されたい(相違率(%)=(スパイク−非スパ
イク)/非スパイク×100%)。
タミンD2及びビタミンD3を含有する血清プール中にブタ脳抽出物をスパイクすること
によって評価した。粉末状脂質サンプル(Avanti社製極性脂質)を各プール内に溶
解させ、軽度(400mg/dL)及び中等度(2000mg/dL)の脂血症試料を生
成した。試料は、実施例1から3の方法に従って2回ずつ分析し、結果をコントロールプ
ールの結果と比較し、正確性を計算した。データは、どちらの分析物も脂血症による影響
を受けないことを証明している(全数値が85から115%の許容される正確性範囲内に
ある)。生データについては表15を参照されたい(相違率(%)=(スパイク−非スパ
イク)/非スパイク×100%)。
びビタミンD3を含有する血清プール中にIntralipidエマルジョンをスパイク
することによって評価した。血清プールに、Intralipid(20%エマルジョン
)を加えて、軽度(400mg/dL)及び中等度(2000mg/dL)脂血症試料を
生成した。試料は、実施例1から3の方法に従って2回ずつ分析し、結果をコントロール
プールの結果と比較し、正確性を計算した。データは、どちらの分析物も脂血症による影
響を受けないことを証明している(全数値が85から115%の許容される正確性範囲内
にある)。生データについては表16を参照されたい。
症試料は許容される。
試料は、10種の起源から4つの異なるVacutainer(登録商標)容器内に収
集した。使用したVacutainerは、Red−Top(シリコンコーティング血清
用チューブ)、SST(ゲル−バリヤ血清を生じさせる血清分離剤チューブ)、EDTA
チューブ及びヘパリンナトリウムチューブであった。
いて分析した。比較結果は、図4に提示する。データは、全4種のサンプルタイプが分析
のために適合することを証明している。
ビタミンD2、ビタミンD2−[6,19,19]−2H3及びビタミンD2−[26
,26,26,27,27,27]−2H6のタンデム質量分析法による分析からの典型
的なQ1スキャンスペクトルは、各々図5A、6A及び7Aに示す。これらの分析は、対
象の分析物を含有する標準溶液をFinnigan TSQ Quantum Ultr
a MS/MSシステム(Thermo Electron Corporation社
)内に直接的に注入することによって実施した。液体クロマトグラフィー移動相は、80
0μL/分の80%アセトニトリル、0.1%ギ酸を含む20%の水を分析物導入の上流
でHPLCカラムに通過させることによってシミュレーションした。分析物は、上述した
ようにAPCIによってイオン化した。スペクトルは、約300から450のm/z範囲
に渡ってQ1をスキャンすることによって収集した。
,26,26,27,27,27]−2H6の各々についての2つの異なる前駆体イオン
から生成した典型的な生成物イオンスキャンは、各々図5BからC、6BからC及び7B
からCに示す。Q1において選択された前駆体イオン及びこれらの生成物イオンスペクト
ルを生成するために使用された衝突エネルギーは表20に示す。
る前駆体イオンから約159.0のm/zを備える生成物イオンへのフラグメント化、及
び約379.2のm/zを備える前駆体イオンから約158.9のm/zを備える生成物
イオンへのフラグメント化が含まれる。ビタミンD2−[6,19,19]−2H3を定
量するための典型的なMRM変化には、約400.2のm/zを備える前駆体イオンから
約147.0のm/zを備える生成物イオンへのフラグメント化、及び約382.2のm
/zを備える前駆体イオンから約312.2のm/zを備える生成物イオンへのフラグメ
ント化が含まれる。ビタミンD2−[26,26,26,27,27,27]−2H6を
定量するための典型的なMRM変化には、約403.2のm/zを備える前駆体イオンか
ら約159.1のm/zを備える生成物イオンへのフラグメント化、及び約385.2の
m/zを備える前駆体イオンから約159.0のm/zを備える生成物イオンへのフラグ
メント化が含まれる。しかし図5BからC、6BからC及び7BからCにおける生成物イ
オンスキャンから明らかなように、前駆体イオンがフラグメント化されると他の数種の生
成物イオンが生成される。追加の生成物イオンは、典型的なフラグメントイオンを置換又
は増強するために、図5BからC、6BからC及び7BからCに示されたイオンから選択
することができる。例えば、約397.2のm/zを備えるビタミンD2前駆体イオンの
フラグメント化によって生成された追加の生成物イオンには、約146.9、133.1
及び121.0のm/zを備えるイオンが含まれる。約379.2のm/zを備えるビタ
ミンD2前駆体イオンのフラグメント化によって生成された典型的な追加の生成物イオン
には、約283.2、187.3及び175.2のm/zを備えるイオンが含まれる。
,26,26,27,27,27]−2H6のタンデム質量分析法による分析からの典型
的なQ1スキャンスペクトルは、各々図8A、9A及び10Aに示す。これらの分析は、
対象の分析物を含有する標準溶液をFinnigan TSQ Quantum Ult
ra MS/MSシステム(Thermo Electron Corporation
社)内に直接的に注入することによって実施した。液体クロマトグラフィー移動相は、8
00μL/分の80%アセトニトリル、0.1%ギ酸を含む20%の水を分析物の導入の
上流でHPLCカラムに通過させることによってシミュレーションした。スペクトルは、
約300から450のm/z範囲に渡ってQ1をスキャンすることによって収集した。
,26,26,27,27,27]−2H6の各々についての2つの異なる前駆体イオン
から生成した典型的な生成物イオンスキャンは、各々図8BからC、9BからC及び10
BからCに示す。Q1において選択された前駆体イオン及びこれらの生成物イオンスペク
トルを生成するために使用された衝突エネルギーは表21に示す。
る前駆体イオンから約147.0のm/zを備える生成物イオンへのフラグメント化、及
び約367.2のm/zを備える前駆体イオンから約159.0のm/zを備える生成物
イオンへのフラグメント化が含まれる。ビタミンD3−[6,19,19]−2H3を定
量するための典型的なMRM変化には、約388.2のm/zを備える前駆体イオンから
約147.0のm/zを備える生成物イオンへのフラグメント化、及び約370.2のm
/zを備える前駆体イオンから約162.0のm/zを備える生成物イオンへのフラグメ
ント化が含まれる。ビタミンD3−[26,26,26,27,27,27]−2H6を
定量するための典型的なMRM変化には、約391.2のm/zを備える前駆体イオンか
ら約159.1のm/zを備える生成物イオンへのフラグメント化、及び約373.2の
m/zを備える前駆体イオンから約159.0のm/zを備える生成物イオンへのフラグ
メント化が含まれる。しかし図8BからC、9BからC及び10BからCにおける生成物
イオンスキャンから明らかなように、前駆体イオンがフラグメント化されると他の数種の
生成物イオンが生成される。追加の生成物イオンは、典型的なフラグメントイオンを置換
又は増強するために、図8BからC、9BからC及び10BからCに示されたイオンから
選択することができる。例えば、約385.2のm/zを備えるビタミンD3前駆体イオ
ンのフラグメント化によって生成された追加の生成物イオンには、約159.0、133
.1及び107.1のm/zを備えるイオンが含まれる。約367.2のm/zを備える
ビタミンD3前駆体イオンのフラグメント化によって生成された典型的な追加の生成物イ
オンには、約172.9、145.0及び119.1のm/zを備えるイオンが含まれる
。
トル
ビタミンD2、ビタミンD2−[6,19,19]−2H3、ビタミンD2−[26,
26,26,27,27,27]−2H6、ビタミンD3、ビタミンD3−[6,19,
19]−2H3及びビタミンD3−[26,26,26,27,27,27]−2H6の
PTAD誘導体は、各分析物のストック溶液のアリコートをアセトニトリル中のPTAD
で処理することによって調製した。誘導体化反応はおよそ1時間に渡り進行させ、反応混
合液に水を加えることによってクエンチさせた。次に誘導体化分析物は、上記の実施例2
から3で説明した手順に従って分析した。
PTAD−ビタミンD2−[26,26,26,27,27,27]−2H6を含有する
サンプルの分析からの典型的なQ1スキャンスペクトルは、各々図11A、12A及び1
3Aに示す。これらの分析は、対象の分析物を含有する標準溶液をFinnigan T
SQ(商標)Quantum Ultra MS/MSシステム(Thermo Ele
ctron Corporation社)内に直接的に注入することによって実施した。
液体クロマトグラフィー移動相は、800μL/分の80%アセトニトリル、0.1%ギ
酸を含む20%の水を分析物導入の上流でHPLCカラムに通過させることによってシミ
ュレーションした。分析物は、上述したようにAPCIによってイオン化した。スペクト
ルは、約500から620のm/z範囲に渡ってQ1をスキャンすることによって収集し
た。
PTAD−ビタミンD2−[26,26,26,27,27,27]−2H6の各々につ
いて前駆体イオンから生成した典型的な生成物イオンスキャンは、各々図11B、12B
及び13Bに示す。Q1において選択された前駆体イオン及びこれらの生成物イオンスペ
クトルを生成するために使用された衝突エネルギーは表22に示す。
/zを備える前駆体イオンから約297.9のm/zを備える生成物イオンへのフラグメ
ント化が含まれる。PTAD−ビタミンD2−[6,19,19]−2H3を定量するた
めの典型的なMRM変化には、約575.2のm/zを備える前駆体イオンから約301
.0のm/zを備える生成物イオンへのフラグメント化が含まれる。PTAD−ビタミン
D2−[26,26,26,27,27,27]−2H6を定量するための典型的なMR
M変化には、約578.2のm/zを備える前駆体イオンから約297.9のm/zを備
える生成物イオンへのフラグメント化が含まれる。しかし図11B、12B及び13Bに
おける生成物イオンスキャンから明らかなように、前駆体イオンがフラグメント化される
と他の数種の生成物イオンが生成される。追加の生成物イオンは、典型的なフラグメント
イオンを置換又は増強するために、図11B、12B及び13Bに示されたイオンから選
択することができる。例えば、約572.2のm/zを備えるPTAD−ビタミンD2前
駆体イオンのフラグメント化によって生成された追加の生成物イオンには、約280.1
のm/zを備えるイオンが含まれる。
PTAD−ビタミンD3−[26,26,26,27,27,27]−2H6を含有する
サンプルの分析からの典型的なQ1スキャンスペクトルは、各々図14A、15A及び1
6Aに示す。これらの分析は、対象の分析物を含有する標準溶液をFinnigan T
SQ Quantum Ultra MS/MSシステム(Thermo Electr
on Corporation社)内に直接的に注入することによって実施した。液体ク
ロマトグラフィー移動相は、800μL/分の80%アセトニトリル、0.1%ギ酸を含
む20%の水を分析物導入の上流でHPLCカラムに通過させることによってシミュレー
ションした。スペクトルは、約500から620のm/z範囲に渡ってQ1をスキャンす
ることによって収集した。
PTAD−ビタミンD3−[26,26,26,27,27,27]−2H6の各々につ
いての前駆体イオンから生成した典型的な生成物イオンスキャンは、各々図14B、15
B及び16Bに示す。Q1において選択された前駆体イオン及びこれらの生成物イオンス
ペクトルを生成するために使用された衝突エネルギーは表23に示す。
/zを備える前駆体イオンから約298.0のm/zを備える生成物イオンへのフラグメ
ント化が含まれる。PTAD−ビタミンD3−[6,19,19]−2H3を定量するた
めの典型的なMRM変化には、約563.2のm/zを備える前駆体イオンから約301
.0のm/zを備える生成物イオンへのフラグメント化が含まれる。PTAD−ビタミン
D3−[26,26,26,27,27,27]−2H6を定量するための典型的なMR
M変化には、約566.2のm/zを備える前駆体イオンから約298.0のm/zを備
える生成物イオンへのフラグメント化が含まれる。しかし図14B、15B及び16Bに
おける生成物イオンスキャンから明らかなように、前駆体イオンがフラグメント化される
と他の数種の生成物イオンが生成される。追加の生成物イオンは、典型的なフラグメント
イオンを置換又は増強するために、図14B、15B及び16Bに示されたイオンから選
択することができる。例えば、約560.2のm/zを備えるPTAD−ビタミンD3前
駆体イオンのフラグメント化によって生成された追加の生成物イオンには、約280.0
のm/zを備えるイオンが含まれる。
的に入手できる情報の内容は、各個別刊行物が参照により組み入れられると特別及び個別
に指示された場合と同程度まで全体として参照により組み入れられる。出願人らは、いず
れかのそのような論文、特許、特許出願、又は他の物理的及び電子的文献からのありとあ
らゆる材料及び情報を本出願に物理的に組み入れる権利を留保する。
素、限度の非存在下で適切に実施することができる。従って例えば、用語「含む(compri
sing)」、「含む(including)」、「含有する(containing)」などは、拡張的に、及
び制限なく読まれるべきである。さらに、本明細書で使用した用語及び表現は、制限する
ためではなく説明の用語として使用されていて、そのような用語及び表現の使用において
は図示及び記載した特徴又はそれらの部分のあらゆる同等物を排除することは意図されて
いない。様々な修飾が本明細書で要求した本発明の範囲内において可能であることが認識
されている。従って、本発明を好ましい実施形態及び任意の特徴によって詳細に開示して
きたが、本明細書で開示したその中で実施される本発明の修飾及び変形は当業者であれば
用いることができること、及びそのような修飾及び変形は本発明の範囲内に含まれると見
なされることを理解されたい。
い種及び亜属分類の各々も本方法の一部を形成する。これには、切除材料が本明細書に特
異的に列挙されているか否かとは無関係に、属からいずれかの主題を取り除く条件又は消
極的限定を備える本方法の一般的説明が含まれる。
マーカッシュ群によって記載されている場合は、当業者であれば、本発明がマーカッシュ
群の任意の個別構成員又は構成員の部分群によっても記載されることを理解する。
Claims (24)
- サンプル中の非誘導体化ビタミンD 2 をタンデム質量分析法によって決定するための方法であって、
(I)
(i)生物学的サンプルを乱流液体クロマトグラフィー(TFLC)カラムにかける工程、
(ii)サンプル由来の非誘導体化ビタミンD2を379.2±0.5の質量対電荷比(m/z)を含む1つ又はそれ以上の前駆体イオンを生成するために適合する条件下でイオン化源に曝露させる工程、
(iii)少なくとも1つの前記前駆体イオンを、質量分析法によって検出可能な1つ又はそれ以上のフラグメントイオンを生成するためにフラグメント化する工程であって、前記フラグメントイオンが283.2±0.5、187.3±0.5、及び175.2±0.5のm/zを備えるイオン(複数)からなる群から選択される1つ又はそれ以上のイオンを含み、
(iv)工程(iii)において生成された1つ又はそれ以上の前記フラグメントイオンの量を質量分析法によって決定する工程、及び、
(v)工程(iv)において決定された非誘導体化ビタミンD2イオンの存在を前記サンプル中の非誘導体化ビタミンD2の存在と関連付ける工程、
を含む、前記方法。 - 前記サンプルは、イオン化の前に抽出カラムにかけられる、請求項1に記載の方法。
- 前記抽出カラムは、固相抽出(SPE)カラムである、請求項2に記載の方法。
- 前記抽出カラムは、乱流液体クロマトグラフィー(TFLC)カラムである、請求項2に記載の方法。
- 前記サンプルは、イオン化の前にさらに分析カラムにかけられる、請求項1に記載の方法。
- 前記分析カラムは、高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)カラムである、請求項5に記載の方法。
- 前記抽出及び分析カラム並びに工程(ii)の前記イオン化源は、オンライン方式で接続されてもよい、請求項5に記載の方法。
- 前記イオン化源は、大気圧化学イオン化(APCI)源である、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記タンデム質量分析法は、多重反応モニタリング、前駆体イオンスキャニング又は生成物イオンスキャニングとして実施される、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記サンプル中で非誘導体化ビタミンD3を検出する工程をさらに含み、ここで前記非誘導体化ビタミンD2及び非誘導体化ビタミンD3は同時にイオン化する、請求項1に記載の方法。
- 前記非誘導体化ビタミンD3を検出する工程は、172.2±0.5、145.0±0.5、及び119.1±0.5のm/zを備えるイオン(複数)からなる群から選択される1つ又はそれ以上のフラグメントイオンの量を決定する工程を含む、請求項10に記載の方法。
- 前記サンプルが、生物学的サンプルを含み、ここで
前記生物学的サンプルはヒト由来であり、前記サンプル中で決定された非誘導体化ビタミンD2の量は、前記ヒトから採取されたときに前記サンプル中に存在した量である、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。 - 前記サンプルは、血清又は血漿を含んでいる、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。
- サンプル中の非誘導体化ビタミンD2及び非誘導体化ビタミンD3の量をタンデム質量分析法によって決定するための方法であって、
(i)前記サンプル中の非誘導体化ビタミンD2及び非誘導体化ビタミンD3を379.2±0.5の質量対電荷比(m/z)を備える1つ又はそれ以上の非誘導体化ビタミンD2前駆体イオン、並びに367.2±0.5の質量対電荷比(m/z)を備える1つ又はそれ以上の非誘導体化ビタミンD3前駆体イオンを生成するために適合する条件下でイオン化源に曝露させる工程、
(ii)少なくとも1つの前記非誘導体化ビタミンD2前駆体イオンを、質量分析法によって検出可能な1つ又はそれ以上の非誘導体化ビタミンD2フラグメントイオンを生成するためにフラグメント化する工程であって、
ここで、前記非誘導体化ビタミンD2フラグメントイオンが283.2±0.5、187.3±0.5、及び175.2±0.5のm/zを備えるイオン(複数)からなる群から選択される1つ又はそれ以上のイオンを含む工程、
(iii)少なくとも1つの前記非誘導体化ビタミンD3前駆体イオンを、質量分析法によって検出可能な1つ又はそれ以上の非誘導体化ビタミンD3フラグメントイオンを生成するためにフラグメント化する工程であって、
ここで、前記非誘導体化ビタミンD3フラグメントイオンは、172.2±0.5、145.0±0.5及び119.1±0.5のm/zを備えるイオン(複数)からなる群から選択される1つ又はそれ以上のイオンを含む工程、
(iv)工程(i)、(ii)及び(iii)において生成された1つ又はそれ以上の前記非誘導体化ビタミンD2及び非誘導体化ビタミンD3イオンの量を質量分析法によって決定する工程、及び
(v)工程(vi)で決定された非誘導体化ビタミンD2及び非誘導体化ビタミンD3イオンの量を前記サンプル中の非誘導体化ビタミンD2及び非誘導体化ビタミンD3の量と関連付ける工程、
を含む前記方法。 - 前記サンプルは、イオン化の前に抽出カラムにかけられる、請求項14に記載の方法。
- 前記抽出カラムは、固相抽出(SPE)カラムである、請求項15に記載の方法。
- 前記抽出カラムは、乱流液体クロマトグラフィー(TFLC)カラムである、請求項15に記載の方法。
- 前記サンプルは、イオン化の前にさらに分析カラムにかけられる、請求項15に記載の方法。
- 前記分析カラムは、高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)カラムである、請求項18に記載の方法。
- 前記抽出及び分析カラム並びに工程(i)の前記イオン化源は、オンライン方式で接続されてもよい、請求項18に記載の方法。
- 前記イオン化源は、大気圧化学イオン化(APCI)源である、請求項14から20のいずれか一項に記載の方法。
- 前記タンデム質量分析法は、多重反応モニタリング、前駆体イオンスキャニング又は生成物イオンスキャニングとして実施される、請求項14から21のいずれか一項に記載の方法。
- 前記サンプルが、生物学的サンプルを含み、ここで
前記生物学的サンプルはヒト由来であり、前記サンプル中で決定された非誘導体化ビタミンD2の量は、前記ヒトから採取されたときに前記サンプル中に存在した量である、請求項14から22のいずれか一項に記載の方法。 - 前記サンプルは、血清又は血漿を含んでいる、請求項14から23のいずれか一項に記載の方法。
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