JP6113504B2 - 非誘導体化非代謝化ビタミンdの質量分析法による決定 - Google Patents
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Description
質量分析法による分析のための調製において、ビタミンDは、サンプル(例えば、タンパク質)中の1つ又はそれ以上の他の成分と比較して、例えば、液体クロマトグラフィー、濾過、遠心分離、薄層クロマトグラフィー(TLC)、キャピラリー電気泳動法を含む電気泳動法、免疫親和性分離を含む親和性分離法、酢酸エチル若しくはメタノール抽出を含む抽出法及びカオトロピック剤の使用又は上記のいずれかの組み合わせなどを含む当分野において公知の様々な方法によって濃縮することができる。
様々な実施形態では、誘導体化ビタミンDは、当業者には公知の任意の方法によってイオン化することができる。質量分析法は、分別されたサンプルをイオン化し、その後の分析のために荷電分子を作り出すためのイオン源を含む質量分析計を用いて実施される。例えば、サンプルのイオン化は、電子イオン化、化学イオン化、エレクトロスプレーイオン化(ESI)、光子イオン化、大気圧化学イオン化(APCI)、光イオン化、大気圧光イオン化(APPI)、レーザーダイオード熱脱離(LDTD)、高速原子衝撃法(FAB)、液体二次イオン化(LSI)、マトリックス支援レーザー脱離イオン化(MALDI)、電場イオン化、電場脱離、サーモスプレー/プラズマスプレーイオン化、表面増強レーザー脱離イオン化(SELDI)、誘導結合プラズマ(ICP)及び粒子ビームイオン化によって実施することができる。当業者であれば、イオン化法の選択は、測定対象の分析物、サンプルのタイプ、検出器のタイプ、正対負のモードの選択などに基づいて決定することができることを理解する。
[実施例]
以下の自動複合型タンパク質沈殿法/液−液抽出法は、患者血清サンプルを対象に実施した。ゲル−バリヤ血清(即ち、血清分離剤チューブ内に収集された血清)並びにEDTA血漿及びヘパリン血漿も、このアッセイのために許容されることが確定されている。
サンプル注入は、Aria OS V1.5.1若しくはそれ以降のソフトウエアを使用してCohesive Technologies Aria TX−4 TFLCシステムを用いて実施した。
MS/MSは、上記で生成されたサンプルを対象にFinnigan TSQ Quantum Ultra MS/MSシステム(Thermo Electron Corporation社)を使用して実施した。全部がThermo Electron社製である以下のソフトウエアプログラムを本明細書に記載した実施例において使用した:Quantum Tune Master V1.5又はそれ以降、Xcalibur V2.07又はそれ以降、LCQuan V2.56(Thermo Finnigan社)又はそれ以降及びARIA OS v1.5.1(Cohesive Technologies社)又はそれ以降。分析カラムから出た液体溶媒/分析物はMS/MSアナライザーのネブライザー界面へ流動した。溶媒/分析物混合液は、界面のチュービング内で蒸気に変換された。噴霧化された溶媒の分析物は、APCIによってイオン化された。
定量下限(LLOQ)は、測定値が定量的に有意となるポイントである。このLLOQでの分析物の反応は、20%より大きい精度(即ち、変動係数(CV))及び80%から120%の正確性を備えて同定可能、個別的及び再現性である。LLOQは、公知の分析物濃度(2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、20ng/mL、40ng/mL及び60ng/mL)を備えるサンプルを実施例1から3の方法によって4例ずつ5回アッセイし、再現性を評価することによって決定した。収集されたデータの分析は、2ng/mL未満の濃度を備えるサンプルが両方の分析物について20%未満のCVを産生することを示している。従って、各分析物のLLOQは、<2ng/mLであると決定された。PTAD−ビタミンD2及びPTAD−ビタミンD3のLLOQを決定するために生成されたデータは、各々表4及び5に示す。両方の分析物に対するCV対濃度のグラフ表示は図3に示す。
アッセイ間変動はアッセイ内のサンプルの再現性であると規定されており、実施例1から3の方法に従って3つのQCプール各々からのサンプルを20回ずつアッセイすることによって決定した。これらの分析から収集したデータは、ビタミンD2及びビタミンD3各々について表8及び9に示す。QCプール内の分析物の濃度は、ビタミンD2については6.6ng/mL、20.6ng/mL及び52.6ng/mL、ビタミンD3については4.9ng/mL、20.5ng/mL及び48.6ng/mLであると決定された。結果について実施した統計学的検定は、3つのQCプールに関してビタミンD2については5.1%、4.6%及び3.9%、並びにビタミンD3については6.4%、4.0%及び4.5%の再現性を生じた。
溶血干渉:実施例1から3に記載したアッセイにおける溶血の作用は、上昇したビタミンD2及びビタミンD3を含有する血清プール中にヘモグロビンをスパイクすることによって評価した。新鮮血液サンプルを遠心して濃縮赤血球を産生した。血球を脱イオン水中で再構成し、細胞溶解を達成するために冷凍した。次にこの粗ヘモグロビン溶液をプール内へスパイクすると、軽度(100mg/dL)及び中等度(500mg/dL)に溶血したサンプルが生成された。試料は、実施例1から3の方法に従って2回ずつ分析し、コントロールプールの結果と比較し、相違率(%)を計算した。データは、ヘモグロビンスパイクがいずれも、いずれの分析物に対してもコントロールと15%を超えて相違しなかったことを証明している。このため、軽度から中等度の溶血試料は許容される。生データについては表13を参照されたい(相違率(%)=(スパイク−非スパイク)/非スパイク×100%)。
試料は、10種の起源から4つの異なるVacutainer(登録商標)容器内に収集した。使用したVacutainerは、Red−Top(シリコンコーティング血清用チューブ)、SST(ゲル−バリヤ血清を生じさせる血清分離剤チューブ)、EDTAチューブ及びヘパリンナトリウムチューブであった。
ビタミンD2、ビタミンD2−[6,19,19]−2H3及びビタミンD2−[26,26,26,27,27,27]−2H6のタンデム質量分析法による分析からの典型的なQ1スキャンスペクトルは、各々図5A、6A及び7Aに示す。これらの分析は、対象の分析物を含有する標準溶液をFinnigan TSQ Quantum Ultra MS/MSシステム(Thermo Electron Corporation社)内に直接的に注入することによって実施した。液体クロマトグラフィー移動相は、800μL/分の80%アセトニトリル、0.1%ギ酸を含む20%の水を分析物導入の上流でHPLCカラムに通過させることによってシミュレーションした。分析物は、上述したようにAPCIによってイオン化した。スペクトルは、約300から450のm/z範囲に渡ってQ1をスキャンすることによって収集した。
ビタミンD2、ビタミンD2−[6,19,19]−2H3、ビタミンD2−[26,26,26,27,27,27]−2H6、ビタミンD3、ビタミンD3−[6,19,19]−2H3及びビタミンD3−[26,26,26,27,27,27]−2H6のPTAD誘導体は、各分析物のストック溶液のアリコートをアセトニトリル中のPTADで処理することによって調製した。誘導体化反応はおよそ1時間に渡り進行させ、反応混合液に水を加えることによってクエンチさせた。次に誘導体化分析物は、上記の実施例2から3で説明した手順に従って分析した。
Claims (25)
- サンプル中の非誘導体化ビタミンD 2 の量をタンデム質量分析法によって決定するための方法であって、
(i)サンプル由来の非誘導体化ビタミンD2を379.2±0.5の質量対電荷比(m/z)を含む1つ又はそれ以上の前駆体イオンを生成するために適合する条件下でイオン化源に曝露させる工程、
(ii)少なくとも1つの前記前駆体イオンを、質量分析法によって検出可能な1つ又はそれ以上のフラグメントイオンを生成するためにフラグメント化する工程であって、前記フラグメントイオンが283.2±0.5、187.3±0.5、175.2±0.5及び159.0±0.5のm/zを備えるイオン(複数)からなる群から選択される1つ又はそれ以上のイオンを含み、
(iii)工程(ii)において生成された1つ又はそれ以上の前記フラグメントイオンの量を質量分析法によって決定する工程、及び、
(iv)工程(iii)において決定された非誘導体化ビタミンD2イオンの存在を前記サンプル中の非誘導体化ビタミンD2の存在と関連付ける工程、
を含む、前記方法。 - サンプル中の非誘導体化ビタミンD 3 の量をタンデム質量分析法によって決定するための方法であって、
(i)サンプル由来の非誘導体化ビタミンD 3 を367.2±0.5の質量対電荷比(m/z)を含む1つ又はそれ以上の前駆体イオンを生成するために適合する条件下でイオン化源に曝露させる工程、
(ii)少なくとも1つの前記前駆体イオンを、質量分析法によって検出可能な1つ又はそれ以上のフラグメントイオンを生成するためにフラグメント化する工程であって、前記フラグメントイオンが172.2±0.5、145.0±0.5、及び119.1±0.5のm/zを備えるイオン(複数)からなる群から選択される1つ又はそれ以上のイオンを含み、
(iii)工程(ii)において生成された1つ又はそれ以上の前記フラグメントイオンの量を質量分析法によって決定する工程、及び、
(iv)工程(iii)において決定された非誘導体化ビタミンD 3 イオンの存在を前記サンプル中の非誘導体化ビタミンD 3 の存在と関連付ける工程、
を含む、前記方法。 - 前記サンプルは、イオン化の前に抽出カラムにかけられる、請求項1または2に記載の方法。
- 前記抽出カラムは、固相抽出(SPE)カラムである、請求項3に記載の方法。
- 前記抽出カラムは、乱流液体クロマトグラフィー(TFLC)カラムである、請求項3に記載の方法。
- 前記サンプルは、イオン化の前にさらに分析カラムにかけられる、請求項1または2に記載の方法。
- 前記分析カラムは、高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)カラムである、請求項6に記載の方法。
- 前記抽出及び分析カラム並びに工程(i)の前記イオン化源は、オンライン方式で接続される、請求項6に記載の方法。
- 前記イオン化源は、大気圧化学イオン化(APCI)源である、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記タンデム質量分析法は、多重反応モニタリング、前駆体イオンスキャニング又は生成物イオンスキャニングとして実施される、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記サンプル中で非誘導体化ビタミンD3を検出する工程をさらに含み、ここで前記非誘導体化ビタミンD2及び非誘導体化ビタミンD3は同時にイオン化する、請求項1に記載の方法。
- 前記サンプル中で非誘導体化ビタミンD2を検出する工程をさらに含み、ここで前記非誘導体化ビタミンD2及び非誘導体化ビタミンD3は同時にイオン化する、請求項2に記載の方法。
- 前記サンプルが、生物学的サンプルを含み、ここで
前記生物学的サンプルはヒト由来であり、前記サンプル中で決定された非誘導体化ビタミンD2の量は、前記ヒトから採取されたときに前記サンプル中に存在した量である、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。 - 前記サンプルは、血清又は血漿を含んでいる、請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。
- サンプル中の非誘導体化ビタミンD2及び非誘導体化ビタミンD3の量をタンデム質量分析法によって決定するための方法であって、
(i)前記サンプル中の非誘導体化ビタミンD2及び非誘導体化ビタミンD3を379.2±0.5の質量対電荷比(m/z)を備える1つ又はそれ以上の非誘導体化ビタミンD2前駆体イオン、並びに367.2±0.5の質量対電荷比(m/z)を備える1つ又はそれ以上の非誘導体化ビタミンD3前駆体イオンを生成するために適合する条件下でイオン化源に曝露させる工程、
(ii)少なくとも1つの前記非誘導体化ビタミンD2前駆体イオンを、質量分析法に
よって検出可能な1つ又はそれ以上の非誘導体化ビタミンD2フラグメントイオンを生成
するためにフラグメント化する工程であって、
ここで、前記非誘導体化ビタミンD2フラグメントイオンが283.2±0.5、187.3±0.5、175.2±0.5及び159.0±0.5のm/zを備えるイオン(複数)からなる群から選択される1つ又はそれ以上のイオンを含む工程、
(iii)少なくとも1つの前記非誘導体化ビタミンD3前駆体イオンを、質量分析法によって検出可能な1つ又はそれ以上の非誘導体化ビタミンD3フラグメントイオンを生成するためにフラグメント化する工程であって、
ここで、前記非誘導体化ビタミンD3フラグメントイオンは、172.2±0.5、145.0±0.5及び119.1±0.5のm/zを備えるイオン(複数)からなる群から選択される1つ又はそれ以上のイオンを含む工程、
(iv)工程(i)、(ii)及び(iii)において生成された1つ又はそれ以上の前記非誘導体化ビタミンD2及び非誘導体化ビタミンD3イオンの量を質量分析法によって決定する工程、及び
(v)工程(vi)で決定された非誘導体化ビタミンD2及び非誘導体化ビタミンD3イオンの量を前記サンプル中の非誘導体化ビタミンD2及び非誘導体化ビタミンD3の量と関連付ける工程、
を含む前記方法。 - 前記サンプルは、イオン化の前に抽出カラムにかけられる、請求項15に記載の方法。
- 前記抽出カラムは、固相抽出(SPE)カラムである、請求項16に記載の方法。
- 前記抽出カラムは、乱流液体クロマトグラフィー(TFLC)カラムである、請求項16に記載の方法。
- 前記サンプルは、イオン化の前にさらに分析カラムにかけられる、請求項16に記載の方法。
- 前記分析カラムは、高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)カラムである、請求項19に記載の方法。
- 前記抽出及び分析カラム並びに工程(i)の前記イオン化源は、オンライン方式で接続される、請求項19に記載の方法。
- 前記イオン化源は、大気圧化学イオン化(APCI)源である、請求項15から21のいずれか一項に記載の方法。
- 前記タンデム質量分析法は、多重反応モニタリング、前駆体イオンスキャニング又は生成物イオンスキャニングとして実施される、請求項15から22のいずれか一項に記載の方法。
- 前記サンプルが、生物学的サンプルを含み、ここで
前記生物学的サンプルはヒト由来であり、前記サンプル中で決定された非誘導体化ビタミンD2の量は、前記ヒトから採取されたときに前記サンプル中に存在した量である、請求項15から23のいずれか一項に記載の方法。 - 前記サンプルは、血清又は血漿を含んでいる、請求項15から24のいずれか一項に記載の方法。
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