JP6253987B2 - 抗メソテリン抗体及びイムノコンジュゲート - Google Patents

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Description

関連出願
本出願は２０１０年１２月２０日に出願された米国仮出願番号６１／４５９９６２の３５ ＵＳＣ １１９（ｅ）に基づく利益を主張し、その内容は参照により本明細書に援用される。
配列表
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂ経由でＡＳＣＩＩフォーマットで提出された配列表を含み、その全体が本明細書中で参照することにより援用される。２０１１年１１月２９日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーはＰ４５３２Ｒ１−ＷＯ.ｔｘｔと命名され、５３，１６９バイトの大きさである。
発明の分野
本発明は、抗メソテリン抗体とイムノコンジュゲート及び同じものを使用する方法に関する。
背景
メソテリンは、通常は中皮（腹膜、心膜、及び胸膜）に限定される発現を有する細胞表面糖タンパク質である。しかし、メソテリンは様々な腫瘍タイプにおいて有意に過剰発現される。メソテリンはＭＵＣ１６（ＣＡ１２５も呼ばれる）、以前に卵巣腫瘍抗原として同定されたムチン様糖タンパク質と相互作用する。ＭＵＣ１６は、少なくとも１４，０００残基を含む細胞外ドメインを持っており、ムチン反復呼ばれる各々１５６アミノ酸のタンデムリピートにより特徴づけられる。（例えば、O'Brien et al., Tumour Biol. 22:348-366 (2001); Yin et al., J. Biol. Chem. 276:27371-27375 (2001)を参照。）メソテリンとＭＵＣ１６の間の相互作用はヘテロタイプの細胞接着および転移に重要な役割を果たすと考えられている。（例えば、Rump et al., J. Biol. Chem. 279:9190-9198 (2004)を参照）。
メソテリンは７１ｋＤａの前駆体タンパク質として合成され、その成熟部分は、細胞表面上に発現される。その前駆体タンパク質は、フューリンによって３１ｋＤａの脱落成分（ｓｈｅｄ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）および４０ｋＤａのメソテリン成分（巨核球増強因子、またはＭＰＦとも呼ばれる）にタンパク質分解性に切断される。後者の成分は、ＧＰＩ結合を介して細胞表面に会合したままであり得るが、またタンパク質分解機構を介して脱落され得る。
当該分野において、癌のようなメソテリン関連症状の診断および治療のためにメソテリンを標的とする薬剤に対する必要性がある。本発明は、その必要性を満たし、他の利点を提供する。
概要
本発明は、抗メソテリン抗体とイムノコンジュゲート及び同じものを使用する方法を提供する。
一態様において、メソテリンに結合する単離された抗体が提供され、その抗体は、以下から選択される：（ｉ）Ｅ１５３及びＤ１７４を含む配列番号４３のエピトープに結合し、任意で以下の特徴の一以上を有する抗体：（ａ）メソテリンのグリコシル化型に対する結合の減少を示さず；（ｂ）ＭＵＣ１６に対するメソテリンの結合を遮断せず；及び（ｃ）５ｎＭ以下の親和性でメソテリンに結合する；（ｉｉ）Ｅ２１１を含む配列番号４３のエピトープに結合し、任意で以下の特徴の一以上を有する抗体：（ａ）ＭＵＣに対するメソテリンの結合を遮断せず；及び（ｂ）５ｎＭ以下の親和性でメソテリンに結合する；及び配列番号４３のアミノ酸１〜１３１内のエピトープに結合し、５ｎＭ以下の親和性でメソテリンに結合する抗体。ある態様では、抗体は、モノクローナル抗体である。ある実施態様において、抗体はヒト、ヒト化、又はキメラ抗体である。ある実施態様において、抗体はメソテリンに結合する抗体断片である。ある実施態様において、メソテリンは、配列番号４３のヒトメソテリンである。
ある実施態様において、抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、及び（ｉｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｂ）（ｉ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｉｉ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、及び（ｉｉｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；又は（ｃ）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１１４６４を有するバイブリドーマ１９Ｃ３により産生される抗体のＨＶＲ−Ｈ３、ＨＶＲ−Ｌ３、及びＨＶＲ−Ｈ２を含む。ある実施態様において、抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｂ）（ｉ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；又は（ｃ）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１１４６４を有するバイブリドーマ１９Ｃ３により産生される抗体のＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。そのような実施態様において、抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｉｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｉｖ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（ｂ）（ｉ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｉｉｉ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｉｖ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；又は（ｃ）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１１４６４を有するバイブリドーマ１９Ｃ３により産生される抗体のＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、ＨＶＲ−Ｈ３、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３を含む。更なる実施態様において、抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｉｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｉｖ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；又は（ｃ）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１１４６４を有するバイブリドーマ１９Ｃ３により産生される抗体のＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、及びＨＶＲ−Ｈ３を含み、かつ更に、配列番号２５のフレームワークＦＲ配列及び配列番号２７のＦＲ３配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。
ある実施態様において、抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（ｂ）（ｉ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；又は（ｃ）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１１４６４を有するバイブリドーマ１９Ｃ３により産生される抗体のＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３を含む。そのような実施態様において、抗体は、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含み、更に、配列番号２５のフレームワークＦＲ２配列及び配列番号２７のＦＲ３配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。
ある実施態様において、抗体は、（ａ）配列番号８のアミノ酸配列に少なくとも９５％配列同一性を有するＶＨ配列；（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列に少なくとも９５％配列同一性を有するＶＬ配列；（ｃ）（ａ）のＶＨ配列及び（ｂ）のＶＬ配列；（ｄ）配列番号１６のアミノ酸配列に少なくとも９５％配列同一性を有するＶＨ配列；（ｅ）配列番号１２のアミノ酸配列に少なくとも９５％配列同一性を有するＶＬ配列；（ｆ）（ｄ）のＶＨ配列及び（ｅ）のＶＬ配列；（ｇ）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１１４６４を有するバイブリドーマ１９Ｃ３により産生される抗体のＶＨ配列のアミノ酸配列に少なくとも９５％配列同一性を有するＶＨ配列；（ｈ）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１１４６４を有するバイブリドーマ１９Ｃ３により産生される抗体のＶＬ配列のアミノ酸配列に少なくとも９５％配列同一性を有するＶＬ配列；又は（ｉ）（ｇ）のＶＨ配列及び（ｈ）のＶＬ配列を含む。そのような実施態様において、抗体は、配列番号８のＶＨ配列、配列番号１６のＶＨ配列、又はＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１１４６４を有するバイブリドーマ１９Ｃ３により産生される抗体のＶＨ配列を含む。別のそのような実施態様において、抗体は、配列番号４のＶＬ配列、配列番号１２のＶＬ配列、又はＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１１４６４を有するバイブリドーマ１９Ｃ３により産生される抗体のＶＬ配列を含む。
更なる態様において、本発明は、（ａ）配列番号８のＶＨ配列及び配列番号４のＶＬ配列；（ｂ）配列番号１６のＶＨ配列及び配列番号１２のＶＬ配列；（ｃ）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１１４６４を有するバイブリドーマ１９Ｃ３により産生される抗体のＶＨ配列及びＶＬ配列を含む抗体；又は（ｄ）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１１４６４を有するバイブリドーマ１９Ｃ３により産生される抗体を提供する。
ある実施態様において、上記実施態様の何れかに記載の抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ又はＩｇＧ２ｂ抗体である。
更なる態様において、本発明は上記実施態様の何れかに記載の抗体をコードする単離された抗体を提供する。一実施態様において、核酸分子を含む宿主細胞が提供される。別の実施態様において、抗体を産生する方法が提供され、該方法は抗体が産生されるように宿主細胞を培養することを含む。
更なる態様において、式Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）ｐを有するイムノコンジュゲートが提供され、
（ａ）Ａｂは上記実施態様の何れかにある抗体であり；
（ｂ）Ｌはリンカーであり；
（ｃ）Ｄは式ＤＥの薬物であり
かつ、Ｒ２ 及びＲ６ の各々はメチルであり、Ｒ３ 及びＲ４ の各々はイソプロピルであり、Ｒ５ はＨ、Ｒ７ はｓｅｃ−ブチルであり、各Ｒ８はＣＨ３， Ｏ−ＣＨ３， ＯＨ， 及びＨから独立に選択され； Ｒ９はＨであり； かつＲ１８は−Ｃ（Ｒ８）２−Ｃ（Ｒ８）２−アリールであり；
（ｄ）ｐは１〜８の範囲である。
一実施態様において、薬物はアウリスタチンである。そのような実施態様において、薬物はＭＭＡＥである。別の実施態様において、リンカーはプロテアーゼにより切断可能である。そのような実施態様において、リンカーはｖａｌ−ｃｉｔジペプチドを含む。
更なる実施態様において、イムノコンジュゲートは式を有し：
ここでＳは硫黄原子である。そのような実施態様において、ｐは２〜５の範囲である。別のそのような実施態様において、抗体は、（ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｉｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｉｖ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｖ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｖｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。別のそのような実施態様において、抗体は、（ｉ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｉｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｉｉｉ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｉｖ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｖ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｖｉ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。別のそのような実施態様において、抗体は、（ａ）配列番号８のＶＨ配列、及び配列番号４のＶＬ配列を含む。別のそのような実施態様において、抗体は、（ｂ）配列番号１６のＶＨ配列、及び配列番号１２のＶＬ配列を含む。
更なる態様において、本発明は、上記実施態様の何れかにあるイムノコンジュゲート及び薬学的に許容可能な担体を含む、薬学的製剤を提供する。一実施態様において、薬学的製剤は付加的治療薬を更に含む。一つのそうした態様において、付加的治療薬は、ゲムシタビンである。別のそのような実施態様において、付加的治療薬は、細胞傷害性薬物に結合した抗ＭＵＣ１６抗体である。
更なる態様において、本発明は、医薬として使用のための上記実施態様の何れかにあるイムノコンジュゲートを提供する。ある実施態様において、本発明は、メソテリン陽性癌の治療において使用のための上記実施態様の何れかにあるイムノコンジュゲートを提供する。そのような実施態様において、メソテリン陽性癌は、膵臓癌、卵巣癌、肺癌、子宮内膜癌、中皮腫から選択される。別のそのような実施態様において、メソテリン陽性癌は二重陽性癌である。
更なる態様において、本発明は、医薬の製造において、上記実施態様の何れかにあるイムノコンジュゲートの使用を提供する。一実施態様において、本医薬はメソテリン陽性癌の治療のためのものである。そのような実施態様において、メソテリン陽性癌は、膵臓癌、卵巣癌、肺癌、子宮内膜癌、中皮腫から選択される。別のそのような実施態様において、メソテリン陽性癌は二重陽性癌である。
別の態様において、メソテリン陽性癌を有する個体を治療する方法が提供され、該方法は上記実施態様の何れかにあるようなイムノコンジュゲートの有効量を個体に投与することを含む。一実施態様において、メソテリン陽性癌は、膵臓癌、卵巣癌、肺癌、子宮内膜癌、中皮腫から選択される。別の実施態様において、メソテリン陽性癌は二重陽性癌である。別の実施態様において、本方法は、付加的治療薬を個体へ投与することを更に含む。一つのそうした態様において、付加的治療薬は、ゲムシタビンである。別のそのような実施態様において、付加的治療薬は、細胞傷害性薬物に結合した抗ＭＵＣ１６抗体である。
別の態様において、メソテリン陽性細胞の増殖を阻害する方法が提供され、該方法は、細胞の表面上のメソテリンに対するイムノコンジュゲートの結合を許容する条件下で、上記実施態様の何れかにあるようなイムノコンジュゲートに細胞を曝露することを含み、それにより細胞の増殖を阻害することを含む。一実施態様において、細胞は、膵臓、卵巣、肺、中皮腫、又は子宮内膜の細胞である。別の実施態様において、宿主細胞は、二重陽性細胞である。
別の態様において、本発明は上記実施態様の何れかにある抗体を提供し、該抗体は標識にコンジュゲートしている。一実施態様において、標識は陽電子放射体である。そのような実施態様において、陽電子放射体は８９Ｚｒである。
別の態様において、生物学的サンプル中のヒトメソテリンを検出する方法が提供され、該方法は、天然に生じるヒトメソテリンに対する抗メソテリン抗体の結合を許容する条件下で、生物学的サンプルを上記実施態様の何れかにある抗メソテリン抗体と接触させることを含み、生物学的サンプル中で抗メソテリン抗体と天然に生じるヒトメソテリンの間に複合体が形成されるかを決定することを含む。一実施態様において、抗メソテリン抗体は、（ａ）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１１４６４を有するバイブリドーマ１９Ｃ３により産生される抗体のＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、ＨＶＲ−Ｈ３、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３；（ｂ）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１１４６４を有するバイブリドーマ１９Ｃ３により産生される抗体のＶＨ配列及びＶＬ配列；又は（ｄ）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１１４６４を有するバイブリドーマ１９Ｃ３により産生される抗体を含む。別の実施態様において、生物学的サンプルは、膵臓癌サンプル、卵巣癌サンプル、肺癌サンプル、子宮内膜癌サンプル、又は中皮腫サンプルである。別の実施態様において、本方法は、組織切片上で免疫組織化学法を実行することを含む。別の実施態様において、生物学的サンプルは血清である。
更なる態様において、メソテリン陽性癌を検出する方法が提供され、該方法は標識された抗メソテリン抗体を、メソテリン陽性癌を有するか又は有することが疑われる被験体に投与することを含み、ここでは該抗メソテリン抗体は上記実施態様の何れかにあり、そして被験体において標識された抗メソテリン抗体を検出し、ここでは標識された抗メソテリン抗体の検出は被験体におけるメソテリン陽性癌を示す。一実施態様において、標識された抗メソテリン抗体は、陽電子放出体にコンジュゲートした抗メソテリン抗体を含む。そのような実施態様において、陽電子放射体は８９Ｚｒである。
図１は、メソテリンが前駆体タンパク質の、３１ｋＤａの脱落成分（ｓｈｅｄ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）および４０ｋＤａのメソテリン成分（巨核球増強因子、またはＭＰＦとも呼ばれる）へのタンパク質性分解により生成されることを示す。後者の成分は、細胞表面に会合したままであり得るが、また脱落され得る。「ＣＨＯ」は４つのグリコシル化部位を示し、１つはＭＰＦに、３つはメソテリンにある。 図２は、実施例Ａに記載されるように、様々な組織におけるヒトメソテリン遺伝子のレベルの図解を示す。 図３は、実施例Ｂに記載されるように、単離された抗メソテリンモノクローナル抗体の特性を示す。 図４は、マウス抗体７Ｄ９（ｍｕ７Ｄ９）及びそのヒト化変異体（７Ｄ９．ｖ１及び７Ｄ９．ｖ３）の可変軽鎖領域配列のアラインメントを示す。 図５は、マウス抗体７Ｄ９（ｍｕ７Ｄ９）及びそのヒト化変異体（７Ｄ９．ｖ１及び７Ｄ９．ｖ３）の可変重鎖領域配列のアラインメントを示す。 図６は、実施例Ｃに記載されるように、７Ｄ９のキメラ及びヒト化変異体の特性を示す。 図７は、マウス抗体２２Ａ１０（２２Ａ１０）及びそのヒト化変異体（ｈｕ２２Ａ１０移植片及び２２Ａ１０．ｖ８３）の可変軽鎖領域配列のアラインメントを示す。 図８は、マウス抗体２２Ａ１０（２２Ａ１０）及びそのヒト化変異体（ｈｕ２２Ａ１０移植片及び２２Ａ１０．ｖ８３）の可変重鎖領域配列のアラインメントを示す。 図９Ａは、実施例Ｃに記載されるように、安定的にメソテリンでトランスフェクトされたＢＪＡＢ細胞における２２Ａ１０のヒト化変異体のスキャッチャード分析を示す。 図９Ｂは、実施例Ｃに記載されるように、同様に安定的にトランスフェクトされたＢＪＡＢ細胞由来の２２Ａ１０のヒト化変異体によるメソテリンの免疫沈降を示す。 図１０Ａは、７Ｄ９のヒト化変異体の超可変領域及びフレームワーク領域の配列を示す。 図１０Ｂは、２２Ａ１０のヒト化変異体の超可変領域及びフレームワーク領域の配列を示す。 図１１は、実施例Ｄに記載されるように、異なる種由来のメソテリン間の配列相同性を示す。図１１は、出現順に、配列番号４３及び４６〜４８をそれぞれ開示する。 図１２は、実施例Ｄに記載されるように、異なる種由来のメソテリンとのｈ７Ｄ９．ｖ３及びｈ２２Ａ１０．ｖ８３の交差反応性を示す。 図１３は、実施例Ｅに記載されるように、安定的にメソテリンを発現するトランスフェクトされた細胞株及び内因性メソテリンを発現する細胞株のスキャッチャード解析により決定される場合のヒト化抗メソテリン抗体の親和性を示す。 図１４は、実施例Ｆに記載されるように、抗体７Ｄ９又は２２Ａ１０及び図３にリストされた他のモノクローナル抗体の間の拮抗アッセイの結果を示す。 図１５は、実施例Ｇに記載されるように、エピトープマッピングに使用されるキメラメソテリンのコンストラクト（縮尺通りに素描）を示す。図１５は、配列番号５１〜５３の「ＥＶＥＫ」、「ＤＡＥＱ」及び「ＤＶＥＲ」をそれぞれ開示する。 図１６は、実施例Ｇに記載されるように、キメラメソテリンを発現する細胞に対する７Ｄ９と２２Ａ１０の結合を評価するＦＡＣＳの結果を示す。 図１７は、実施例Ｇに記載されるように、ｈ７Ｄ９．ｖ３及びｈ２２Ａ１０．ｖ８３が結合するアミノ酸を同定するための変異戦略を示す。図１７は、配列番号５１として「ＥＶＥＫ」、配列番号５４〜５７としてそれぞれ「ヒト１３２−２１２」、「カニクイザル１３２−２１２」、「ラット１３２−２１２」及び「マウス１３２−２１２」を、配列番号５８〜７３としてそれぞれヒトとマウスの「ＭＵＴ１」、「ＭＵＴ３」、「ＭＵＴ６」、「ＭＵＴ７」、「ＭＵＴ９」、「ＭＵＴ１０」、「ＭＵＴ１３」、及び「ＭＵＴ１５」を、及び配列番号７３と７４としてそれぞれ「ＳＴＫＤ」と「ＳＶＫＤ」を開示する。 図１８Ａは、実施例Ｇに記載されるように、ヒトメソテリン変異体を発現する細胞に対するｈ７Ｄ９．ｖ３とｈ２２Ａ１０．ｖ８３の結合を評価するＦＡＣＳの結果を示す。 図１８Ｂは、実施例Ｇに記載されるように、カニクイザルメソテリン変異体を発現する細胞に対するｈ７Ｄ９．ｖ３の結合を評価するＦＡＣＳの結果を示す。 図１９は、実施例Ｇに記載されるように、７Ｄ９／ｈ７Ｄ９．ｖ３と２２Ａ１０／ｈ２２Ａ１０．ｖ８３が結合するエピトープ無いの鍵となるアミノ酸を示す。図１９は、出現順に、配列番号５４〜５７をそれぞれ開示する。 図２０は、実施例Ｈに記載されるように、グリコシル化されたメソテリンに対するｈ７Ｄ９．ｖ３の結合を示す。 図２１は、実施例Ｉに記載されるように、抗体１９Ｃ３，７Ｄ９及び２２Ａ１０がＭＵＣ１６に対するメソテリンの結合を阻害するか及びその逆も同様かを決定する２つのアッセイの結果を示す。 図２２は、実施例Ｊに記載されるように、免疫組織化学法（ＩＨＣ）による膵管腺癌におけるメソテリンの発現を示す。 図２３は、実施例Ｊに記載されるように、免疫組織化学法（ＩＨＣ）による卵巣漿液性腺癌腫瘍におけるメソテリンの発現を示す。 図２４は、実施例Ｊに記載されるように、免疫組織化学法（ＩＨＣ）による非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）腺癌におけるメソテリンの発現を示す。 図２５は、実施例Ｊに記載されるように、免疫組織化学法（ＩＨＣ）によるカニクイザル由来組織におけるメソテリンの発現（右パネル）を示す。 図２６は、実施例Ｌに記載されるように、イムノコンジュゲートｈ７Ｄ９．ｖ３−ｖｃＭＭＡＥは、ＨＰＡＣ膵臓異種移植片における有効性を実証することを示す。 図２７は、実施例Ｍに記載されるように、イムノコンジュゲートｈ７Ｄ９．ｖ３−ｖｃＭＭＡＥは、原発性膵臓異種移植片における有効性を実証することを示す。 図２８は、実施例Ｎに記載されるように、イムノコンジュゲートｈ７Ｄ９．ｖ３−ｖｃＭＭＡＥは、卵巣腫瘍異種移植片における有効性を実証することを示す。 図２９は、実施例Ｏに記載されるように、イムノコンジュゲートｈ７Ｄ９．ｖ３−ｖｃＭＭＡＥは、肺扁平上皮癌の異種移植モデルにおける有効性を実証することを示す。 図３０は、実施例Ｐに記載されるように、イムノコンジュゲートｈ７Ｄ９．ｖ３−ｖｃＭＭＡＥのヒトメソテリンに対する有効性が、トランスフェクトされたＢＪＡＢ異種移植腫瘍モデルにおけるカニクイザルメソテリンに対するイムノコンジュゲートｈ２２Ａ１０．ｖ８３−ｖｃＭＭＡＥのそれに似ていることを示す。 図３１は、実施例Ｐに記載されるように、イムノコンジュゲートｈ７Ｄ９．ｖ３−ｖｃＭＭＡＥの有効性が、中皮腫及び卵巣腫瘍モデルにおけるイムノコンジュゲートｈ２２Ａ１０．ｖ８３−ｖｃＭＭＡＥのそれに似ていることを示す。 図３２は、実施例Ｑに記載されるように、ＭＵＣ１６はメソテリンと複合体を形成し、２つのタンパク質が二重陽性細胞株から共脱落されることを示す。 図３３は、７Ｄ９でなく、１９Ｃ３が予め結合したＭＵＣ１６をメソテリンから外すことを示す。
本発明の実施態様の詳細な記述
Ｉ．定義
本明細書における目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」とは、下記に定義されるように、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークから得られる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワーク又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含有するフレームワークである。ヒト免疫グロブリンのフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク”に由来する”アクセプターヒトフレームワークは、その同一のアミノ酸配列を含んでもよく、又はそれはアミノ酸配列の変化を含み得る。幾つかの実施態様において、アミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、又は２以下である。幾つかの実施態様において、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、Ｖはヒト免疫グロブリンのフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列に、配列が同一である。
「親和性」とは、分子（例えば、抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有結合相互作用の総和の強度を指す。本明細書で使用する場合、特に断らない限り、「結合親和性」は、結合対（例えば、抗体と抗原）のメンバー間の１：１の相互作用を反映している本質的な結合親和性を指す。そのパートナーＹに対する分子Ｘの親和性は、一般的に解離定数（Ｋｄ）で表すことができる。親和性は、本明細書に記載したものを含む、当技術分野で知られている一般的な方法によって測定することができる。結合親和性を測定するための具体的な例示であって典型的な実施態様は、以下で説明される。
「親和性成熟」抗体とは、その改変を有していない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性に改良を生じせしめる、その一又は複数の超可変領域（ＨＶＲ）において一又は複数の改変を持つものである。
用語「抗メソテリン抗体」及び「メソテリンに結合する抗体」は、メソテリンを標的とし、診断薬剤及び／又は治療的薬剤として有用であるように、十分な親和性でメソテリンに結合することができる抗体を指す。一実施態様において、抗メソテリン抗体の、無関係な、非メソテリンタンパク質への結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって測定される場合、抗体のメソテリンへの結合の約１０％未満である。ある実施態様において、メソテリンへ結合する抗体は、解離定数（Ｋｄ）が、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ未満、例えば、１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍから１０−１３Ｍ）を有する。ある実施態様において、抗メソテリン抗体は、異なる種由来のメソテリン間で保存されているメソテリンのエピトープに結合する。
用語「抗体」は本明細書において最も広い意味で用いられ、様々な抗体構造を包含し、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及び、所望の抗原結合活性を示す限り、抗体断片を含む。
「抗体断片」は、インタクトな抗体の一部を含み、かつインタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨは、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、直鎖状抗体、単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）、及び抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。
参照抗体として「同一のエピトープに結合する抗体」とは、競合アッセイにおいて５０％以上、参照抗体のその抗原への結合をブロックする抗体、逆に競合アッセイにおいて５０％以上、その抗体のその抗原への結合をブロックするその参照抗体を指す。典型的な競合アッセイが、本明細書において提供される。
用語「癌」及び「癌性」は、無秩序な細胞成長／細胞増殖を典型的に特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を記述する。癌の例には、限定されないが、癌腫、リンパ腫（例えば、ホジキンリンパ腫と非ホジキンリンパ腫）、芽細胞腫、肉腫、及び白血病を含む。そのような癌のより具体的な例は、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺がん、肺腺癌、肺扁平上皮癌、腹膜癌、肝細胞癌、消化器癌、膵臓癌、神経膠腫を含む、子宮頚癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜、子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌、白血病、及びその他のリンパ増殖性疾患、及び様々な型の頭頸部癌を包含する。
用語「キメラ」抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部分が特定の起源又は種から由来し、一方重鎖及び／又は軽鎖の残りが異なる起源又は種から由来する抗体を指す。
抗体の「クラス」は、その重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域のタイプを指す。抗体の５つの主要なクラスがあり：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ、及びこれらのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２に、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩＧＡ１、及びＩｇＡ２に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
本明細書で用いられる「細胞傷害性薬物」という用語は、細胞の機能を阻害又は阻止し及び／又は細胞死又は破壊を生ずる物質を指す。細胞傷害性薬物は、限定されないが、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体）：化学療法剤又は薬物（例えば、メトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシンまたは他の挿入剤）、成長阻害剤、酵素及びその断片、例えば核酸分解酵素など、抗生物質、小分子毒素などの毒素、又は細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素（それらの断片及び／又はその変異体を含む）、及び以下に開示される様々な抗腫瘍剤又は抗癌剤を包含する。
用語「二重陽性癌」は、メソテリン−及びＭＵＣ１６陽性の両方である細胞を含む癌を指す。
用語「二重陽性細胞」は、その表面上でメソテリンとＭＵＣ１６の両方を発現する細胞を指す。
「エフェクター機能」とは、抗体のアイソタイプにより変わる、抗体のＦｃ領域に起因する生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞障害（ＡＤＣＣ）、貪食、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）のダウンレギュレーション、及びＢ細胞の活性化を含む。
薬剤、例えば、薬学的製剤の「有効量」とは、所望の治療的又予防的結果を達成するために必要な用量及び期間での、有効な量を指す。
用語「エピトープ」は、抗体が結合する抗原分子上の特定の部位を指す。
用語「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。その用語は、天然配列Ｆｃ領域と変異体Ｆｃ領域を含む。一実施態様において、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域はＣｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端まで伸長する。しかし、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は存在しているか、又は存在していない場合がある。本明細書に明記されていない限り、Ｆｃ領域又は定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991に記載されるように、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般的に４つのＦＲのドメイン、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４で構成される。従って、ＨＶＲ及びＦＲ配列は一般にＶＨ（又はＶＬ）の以下の配列に現れる：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４。
用語「完全長抗体」、「インタクトな抗体」及び「全抗体」は、本明細書中で互換的に使用され、天然型抗体構造と実質的に類似の構造を有するか、又は本明細書で定義されるＦｃ領域を含む重鎖を有する抗体を指す。
用語「メソテリンのグリコシル化形態」は、糖鎖残基の付加により翻訳後修飾されるメソテリンの天然に生じる形態を指す。
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養」は互換的に使用され、外因性の核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含める。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換された細胞」を含み、継代の数に関係なく、それに由来する一次形質転換細胞及び子孫が含まれる。子孫は親細胞と核酸含量が完全に同一ではないかもしれないが、突然変異が含まれる場合がある。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングまたは選択されたものと同じ機能又は生物活性を有する変異型子孫が本明細書において含まれる。
「ヒト抗体」は、ヒト又はヒト細胞により産生されるか、又はヒト抗体のレパートリー又は他のヒト抗体をコードする配列を利用した非ヒト起源に由来する抗体のそれに対応するアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除外する。
「ヒトコンセンサスフレームワーク」とは、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選択において最も一般的に存在するアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般的には、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからのものである。一般的には、配列のサブグループは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3にあるサブグループである。一実施態様において、ＶＬについて、サブグループは上掲のＫａｂａｔらにあるサブグループカッパＩである。一実施態様において、ＶＨについて、サブグループは上掲のＫａｂａｔらにあるサブグループＩＩＩである。
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基、及びヒトＦＲ由来アミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。所定の実施態様において、ヒト化抗体は、少なくとも一つ、典型的には２つの可変ドメインの全てを実質的に含み、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）の全て又は実質的に全てが、非ヒト抗体のものに対応し、全てまたは実質的にＦＲの全てが、ヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、任意で、ヒト抗体由来の抗体定常領域の少なくとも一部を含んでもよい。抗体の「ヒト化型」、例えば、非ヒト抗体は、ヒト化を遂げた抗体を指す。
本明細書で使用される用語「超可変領域」又は「ＨＶＲ」は、配列が超可変であるか、及び／又は構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成する抗体可変ドメインの各領域を指す。一般的に、天然型４鎖抗体は、ＶＨ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）に３つ、及びＶＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）に３つの６つのＨＶＲを含む。ＨＶＲは、一般的に超可変ループ由来及び／又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）由来のアミノ酸残基を含み、後者は、最高の配列可変性であり、及び／又は抗原認識に関与している。典型的な超可変ループはアミノ酸残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）、９１−９６（Ｌ３）、２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）、及び９６−１０１（Ｈ３）で生じる。(Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))。典型的なＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３）は、アミノ酸残基Ｌ１の２４−３４、Ｌ２の５０−５６、Ｌ３の８９−９７、Ｈ１の３１−３５Ｂ、Ｈ２の５０−６５、及びＨ３の９５−１０２に生じる。(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))。ＶＨのＣＤＲ１の例外を除いて、ＣＤＲは一般的に超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。ＣＤＲは、抗原に接触する残基である「特異性決定残基」又は「ＳＤＲ」を含む。ＳＤＲは、略称（ａｂｂｒｅｖｉａｔｅｄ−）ＣＤＲ、又はａ−ＣＤＲと呼ばれる、ＣＤＲの領域内に含まれている。典型的なａ−ＣＤＲ（ａ−ＣＤＲ−Ｌ１、ａ−ＣＤＲ−Ｌ２、ａ−ＣＤＲ−Ｌ３、ａ−ＣＤＲ−Ｈ１、ａ−ＣＤＲ−Ｈ２、及びａ−ＣＤＲ−Ｈ３）は、アミノ酸残基Ｌ１の３１−３４、Ｌ２の５０−５５、Ｌ３の８９−９６、Ｈ１の３１−３５Ｂ、Ｈ２の５０−５８、及びＨ３の９５−１０２に生じる。(Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)を参照）；特に断らない限り、可変ドメイン内のＨＶＲ残基及び他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、上掲のＫａｂａｔらに従い、本明細書において番号が付けられる。
「イムノコンジュゲート」は、１つ以上の異種分子にコンジュゲートした抗体であり、限定されないが、細胞傷害性薬物を含む。
「個体」又は「被検体」は、哺乳動物である。哺乳動物は、限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ）、霊長類（例えば、ヒト、サルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、げっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含む。ある実施態様において、個体又は被検体はヒトである。
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から分離されたものである。幾つかの実施態様において、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー（例えば、イオン交換又は逆相ＨＰＬＣ）により決定されるように、９５％以上または９９％の純度に精製される。抗体純度の評価法の総説としては、例えばFlatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)を参照のこと。
「単離された核酸」は、その自然環境の成分から分離された核酸分子を指す。単離された核酸は、核酸分子を通常含む細胞に含まれる核酸分子を含むが、しかし、その核酸分子は、染色体外又はその自然の染色体上の位置とは異なる染色体位置に存在している。
「抗メソテリン抗体をコードする単離された核酸」は、抗体の重鎖及び軽鎖（又はその断片）をコードする一以上の核酸分子を指し、単一のベクター又は別個のベクター内のそのような核酸分子、及び宿主細胞の一以上の位置に存在するそのような核酸分子を含む。
用語「メソテリン」は本明細書で使用される場合、細胞無いでメソテリン前駆体タンパク質のプロセシングから生じる任意の天然の成熟したメソテリンを指す。その用語は、任意の脊椎動物起源由来のメソテリンを含み、特に明記しない限り、例えば霊長類（例えばヒト及びカニクイザル）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む。その用語はまた、天然に存在する標的の変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体を包含する。典型的なヒトメソテリン前駆体タンパク質のアミノ酸配列が配列番号４２に示され、典型的なヒトメソテリンが配列番号４３に示される。更なる典型的なメソテリンの配列が本明細書に記述される。
用語「メソテリン陽性癌」は、細胞上にメソテリンを発現する細胞を含む癌を指す
用語「メソテリン陽性細胞」は、その表面上でメソテリンを発現する細胞を指す。
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味し、すなわち、例えば、天然に生じる変異を含み、又はモノクローナル抗体製剤の製造時に発生し、一般的に少量で存在している変異体などの、可能性のある変異体抗体を除き、集団を構成する個々の抗体は同一であり、及び／又は同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を一般的に含む、ポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。従って、修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするものとして解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、限定されないが、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含むトランスジェニック動物を利用する方法を含む様々な技術によって作成され、モノクローナル抗体を作製するためのそのような方法及び他の例示的な方法は、本明細書に記載されている。
用語「ＭＵＣ１６陽性癌」は、細胞上にＭＵＣ１６を発現する細胞を含む癌を指す。
用語「ＭＵＣ１６陽性細胞」は、その表面上でＭＵＣ１６を発現する細胞を指す。
「ネイキッド抗体」とは、異種の部分（例えば、細胞傷害性部分）又は放射性標識にコンジュゲートしていない抗体を指す。ネイキッド抗体は薬学的製剤中に存在してもよい。
「天然型抗体」は、天然に生じる様々な構造をとる免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然型ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合している２つの同一の軽鎖と２つの同一の重鎖から成る約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端に、各重鎖は、可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）を有し、３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）が続く。同様に、Ｎ末端からＣ末端に、各軽鎖は、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）を有し、定常軽鎖（ＣＬ）ドメインが続く。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）とラムダ（λ）と呼ばれる、２つのタイプのいずれかに割り当てることができる。
用語「パッケージ挿入物」は、効能、用法、用量、投与、併用療法、禁忌についての情報、及び／又はそのような治療用製品の使用に関する警告を含む、治療用製品の商用パッケージに慣習的に含まれている説明書を指すために使用される。
参照ポリペプチド配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入した後、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、参照ポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列をアラインするための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性の値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を使用することによって生成される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテック社によって作製され、ソースコードは米国著作権庁、ワシントンＤ．Ｃ．，２０５５９に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２もまた、ジェネンテック社、サウスサンフランシスコ、カリフォルニアから公的に入手可能であり、又はそのソースコードからコンパイルすることができる。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸのＶ４．０Ｄを含む、ＵＮＩＸオペレーティングシステム上での使用のためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され変動しない。
アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ−２が用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（或いは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して所定の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：

分率Ｘ／Ｙの１００倍

ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２により、ＡとＢのそのプログラムのアラインメントにおいて同一と一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。特に断らない限り、本明細書で使用されるすべての％アミノ酸配列同一性値が、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを使用し、直前の段落で説明したように得られる。
用語「薬学的製剤」は、その中に有効で含有される活性成分の生物学的活性を許容するような形態であって、製剤を投与する被検体にとって許容できない毒性である他の成分を含まない調製物を指す。
「薬学的に許容される担体」は、被検体に非毒性であり、有効成分以外の製剤処方中の成分を指す。薬学的に許容される担体は、限定されないが、緩衝剤、賦形剤、安定剤、又は保存剤を含む。
本明細書で用いられるように、「治療」（及び「治療する（ｔｒｅａｔ）」または「治療している（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」など文法上の変形）は、治療されている個体の自然経過を変えようと試みる臨床的介入を指し、予防のために、または臨床病理の過程においてのいずれかで実行できる。治療の望ましい効果は、限定されないが、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の緩和、疾患の直接的または間接的な病理学的帰結の縮小、転移を予防すること、疾患の進行の速度を遅らせること、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善を含む。幾つかの実施態様において、本発明の抗体は、疾患の発症を遅延させるか又は疾患の進行を遅くするために使用される。
用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の抗原への結合に関与する抗体の重鎖または軽鎖のドメインを指す。天然型抗体の可変重鎖ドメイン及び軽鎖（それぞれＶＨおよびＶＬ）は、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む各ドメインを持ち、一般的に似たような構造を有する。（例えば、Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., 91頁(2007)を参照）。単一のＶＨ又はＶＬドメインが、抗原結合特異性を付与するのに十分であり得る。更に、特定の抗原に結合する抗体は、相補的なＶＬ又はＶＨドメインのそれぞれのライブラリーをスクリーニングするために、抗原に特異的に結合する抗体由来のＶＨ又はＶＬドメインを用いて単離することができる。例えば、Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)を参照。
本明細書で使用される、用語「ベクター」は、それがリンクされている別の核酸を伝播することができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、並びにそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。ある種のベクターは、それらが動作可能なようにリンクされている核酸の発現を指示することができる。このようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と言う。
ＩＩ．組成物及び方法
一態様において、本発明は、メソテリンに結合する抗体及びそのような抗体を含むイムノコンジュゲートに一部が基づく。本発明の抗体とイムノコンジュゲートは、例えば、メソテリン陽性癌の診断又は治療のために、有用である。
Ａ．典型的な抗メソテリン抗体
一態様において、本発明は、メソテリンに結合する単離された抗体を提供する。細胞内でメソテリン前駆体タンパク質の切断から得られる天然に生じるメソテリンは、図１に示されるようにメソテリンと巨核球増強因子（ＭＰＦ）を生成する。メソテリンは前駆体タンパク質に対してＣ末端の切断を含む。そのような切断はＧＰＩアンカーの付着を可能にし得る。細胞培養物又は動物の血清中において、メソテリンは細胞表面に例えばＧＰＩアンカーを介して結合したままであり得、又はメソテリンは細胞から遊離され得（例えば、ＧＰＩアンカーが未だ同定されていない酵素により切断され得）、脱落メソテリンを生産する。
典型的な天然に生じるヒトメソテリン前駆体タンパク質の配列が配列番号４２に与えられ、対応するメソテリンの配列が配列番号４３（対応するアミノ酸は配列番号４２の２９６〜５８０）に示される。別のメソテリン配列は配列番号４２のアミノ酸２９６〜５９８に対応する。配列番号４４は配列番号４２の天然に生じる変異体であり、そのプロセシングは配列番号４５の配列を有するメソテリンを生じる。配列番号４５は配列番号４３に比べてアミノ酸１１６で８つのアミノ酸挿入を含む。配列番号４５に示されるメソテリンの変異体形態は腫瘍細胞株において〜５％のメソテリン転写物を含むように見える。
ある実施態様において、抗メソテリン抗体は、以下の特徴の少なくとも一以上を任意の組み合わせで有する：
（ａ）（ｉ）Ｅ１５３及びＤ１７４又は（ｉｉ）Ｅ２１１を含む配列番号４３のエピトープに結合する；
（ｂ）メソテリンの別のグリコシル化形態に対する結合の変更又は減少を示すか又は示さない；
（ｃ）メソテリンのＭＵＣ１６に対する結合を遮断するか又は遮断しない；
（ｄ）５ｎＭ以下の親和性、又は代わりに１ｎＭ以下、又は代わりに０．５ｎＭ以下、又は代わりに０．１ｎＭ以下、及び任意で０．０００１ｎＭ以上の親和性でメソテリンに結合する。
上記実施態様の何れかにおいて、ＭＵＣ１６に対するメソテリンの結合を遮断しない抗体は、ＭＵＣ１６に対するメソテリンの結合を増強する抗体である。
一実施態様において。抗メソテリン抗体は、Ｅ１５３とＤ１７４を含む配列番号４３のエピトープへ結合する。そのような実施態様において、抗メソテリン抗体は、以下の特徴の少なくとも一以上を任意の組み合わせで更に有する：
（ａ）メソテリンのグリコシル化形態に対する結合の減少を示さない；
（ｂ）メソテリンのＭＵＣ１６に対する結合を遮断しない；
（ｃ）５ｎＭ以下の親和性、又は代わりに１ｎＭ以下、又は代わりに０．５ｎＭ以下、及び任意で０．０００１ｎＭ以上の親和性でメソテリンに結合する。
そのような実施態様において、ＭＵＣ１６に対するメソテリンの結合を遮断しない抗体は、ＭＵＣ１６へのメソテリンの結合を増強し、及び／又はその抗体は１ｎＭ以下の親和性で結合する。上記特徴を有する典型的な抗体は７Ｄ９及びそのヒト化変異体、例えば本明細書に開示されるｈ７Ｄ９．ｖ３である。上記実施態様の何れかにおいて、抗メソテリン抗体に結合するメソテリンはヒトメソテリンである。
別の実施態様において。抗メソテリン抗体は、Ｅ２１１を含む配列番号４３のエピトープへ結合する。そのような実施態様において、抗メソテリン抗体は、以下の特徴の少なくとも一以上を更に有する：
（ａ）メソテリンのＭＵＣ１６に対する結合を遮断しない；
（ｂ）５ｎＭ以下の親和性、又は代わりに１ｎＭ以下、又は代わりに０．５ｎＭ以下、及び任意で０．０００１ｎＭ以上の親和性でメソテリンに結合する。
そのような実施態様において、ＭＵＣ１６に対するメソテリンの結合を遮断しない抗体は、ＭＵＣ１６へのメソテリンの結合を増強し、及び／又はその抗体は１ｎＭ以下の親和性で結合する。上記特徴を有する典型的な抗体は２２Ａ１０及びそのヒト化変異体、例えば本明細書に開示される２２Ａ１０．ｖ８３である。上記実施態様の何れかにおいて、抗メソテリン抗体に結合するメソテリンはヒトメソテリン、カニクイザルメソテリン及び／又はラットメソテリンである。
別の実施態様において、抗メソテリン抗体：
（ａ）配列番号４３のアミノ酸１〜１３１内のエピトープに結合し；及び
（ｂ）５ｎＭ以下の親和性、又は代わりに１ｎＭ以下、又は代わりに０．５ｎＭ以下、又は代わりに０．１ｎＭ以下、及び任意で０．０００１ｎＭ以上の親和性でメソテリンに結合する。
そのような実施態様において、抗体はＭＵＣ１６に対するメソテリンの結合を遮断し、及び／又は配列番号４３のアミノ酸１〜６４又は１〜７０内のエピトープに結合する。そのような実施態様において、抗体はメソテリンに結合したＭＵＣ１６と置換する。上記特徴を有する典型的な抗体は本明細書に開示される１９Ｃ３である。上記実施態様の何れかにおいて、抗メソテリン抗体に結合するメソテリンはヒトメソテリンである。
アッセイ
抗メソテリン抗体が、「Ｅ１５３及びＤ１７４を含む配列番号４３のエピトープに結合する」か又は「Ｅ２１１を含む配列番号４３のエピトープに結合する」かを決めるために、それらの残基が配列番号４３を含むポリペプチド中で変異され、そして２９３細胞で発現される変異ポリペプチドに対する抗体の結合が、実施例Ｇに記載されるようにＦＡＣＳにより試験され、ここで、変異ポリペプチドに対する抗体の結合の実質的な減少（７０％以上の減少）又は消失は、抗体がＥ１５３及びＤ１７４を含む又はＥ２１１を含む配列番号４３のエピトープに結合することを示している。
抗メソテリン抗体が「メソテリンのグリコシル化形態に対する結合の減少を示さない」かどうかを決定するために、実施例Ｈに記載されるように、タグ付きヒトメソテリンがＣＨＯ細胞内で発現され、（タグを手段として）精製され、ＭｏｎｏＳカラムの電荷により、メソテリンのグリコシル化が高（画分Ａ１１）、中間（Ａ１２）、低（Ｂ１）及び低から無（Ｂ５）に更に分離される。各画分を事前に結合した抗メソテリン抗体を含むチップ上に流し、オンとオフの割合が各分画に対して測定される。各画分についての親和性が互いに２５％以内であれば、それは抗体がメソテリンのグリコシル化形態に対する結合の低下を提示していないことを示している。
抗メソテリン抗体が「ＭＵＣ１６に対するメソテリンの結合を遮断する」、「ＭＵＣ１６に対するメソテリンの結合を遮断しない」又は「ＭＵＣ１６に対するメソテリンの結合を増強する」かを決定するために、次のようにＭＵＣ１６結合アッセイが行われる。具体的には、ＭＵＣ１６のビオチン化断片（ムチン反復のうち３つを包含する）が抗メソテリン抗体の有無によらずメソテリンを安定的に発現するＡ４３１細胞とインキュベートし、ＭＵＣ１６−ビオチン結合のレベルがストレプトアビジン−ＰＥでＦＡＣＳによって決定される。メソテリンのＭＵＣ１６の結合部位は、暫定的にメソテリンの最初の６４個のアミノ酸にマッピングされている(Kaneko et al., J. Biol Chem. 284:3739-49 (2009))。逆に、安定的にＭＵＣ１６を発現するＰＣ３細胞を、抗メソテリン抗体とプレインキュベートされた精製メソテリン−ｈｉｓ８（配列番号４９として開示された「ｈｉｓ８」）と共にインキュベートし、精製メソテリン−ｈｉｓ８：抗体複合体のＭＵＣ１６発現細胞に対する結合がＡｌｅｘａ−６４７がコンジュゲートした抗Ｈｉｓ６抗体（配列番号５０として開示された「Ｈｉｓ６」）を使用してＦＡＣＳにより決定される。上記アッセイの何れかにおいて、ＦＡＣＳシグナルが抗メソテリン抗体の欠損よりも存在下において５０％以上低い場合、その抗体はＭＵＣ１６に対するメソテリンの結合を遮断すると考えられる。上記アッセイの何れかにおいて、ＦＡＣＳシグナルが抗メソテリン抗体の存在下において５０％以上減少しない場合、その抗体はＭＵＣ１６に対するメソテリンの結合を遮断しないと考えられる。上記アッセイの後者において、ＦＡＣＳシグナルが抗メソテリン抗体の欠損よりも存在下において増加する場合、その抗体はＭＵＣ１６に対するメソテリンの結合を増強すると考えられる。
抗メソテリン抗体が、「５ｎＭ以下の親和性、又は代わりに１ｎＭ以下の親和性、又は代わりに０．５ｎＭ以下の親和性、又は代わりに０．１ｎＭ以下の親和性」で結合するかどうか、親和性が本明細書中のセクションＩＩ．Ａ．１に記載されるようにＢｉａｃｏｒｅアッセイに従って決定される。具体的には、〜１０反応単位（ＲＵ）で固定した抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃でのＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−２０００又はＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いる表面プラズモン共鳴アッセイを使用してＫｄを測定する。簡単に言うと、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５，ＢＩＡｃｏｒｅ Ｉｎｃ．）を、提供者の指示書に従ってＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）で活性化した。使用されるべき抗原は、実施例Ｂに記載されるように大腸菌から産生され単離されたメソテリンである。抗原を１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で５μｇ／ｍｌ（〜０．２μＭ）に希釈し、結合したタンパク質の反応単位（ＲＵ）がおよそ１０を達成するように５μｌ／分の流速で注入する。抗原の注入後、反応しない群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入する。動力学的な測定のために、Ｆａｂの２倍の段階希釈（０．７８ｎＭから５００ｎＭ）を、２５℃で、およそ２５μｌ／分の流速で、０．０５％ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ２０ＴＭ）界面活性剤（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳに注入した。会合及び解離のセンサーグラムを同時にフィットさせることによる単純一対一ラングミュア結合モデル（ｓｉｍｐｌｅ ｏｎｅ−ｔｏ−ｏｎｅ Ｌａｎｇｍｕｉｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｅｌ）（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアバージョン３．２）を用いて、会合速度（ｋｏｎ）と解離速度（ｋｏｆｆ）を算出した。平衡解離定数（Ｋｄ）をｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出した。例えば、Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)を参照。上記の表面プラスモン共鳴アッセイによる結合速度が１０６Ｍ−１ｓ−１を上回る場合、分光計、例えば、流動停止を備えた分光光度計（ｓｔｏｐ−ｆｌｏｗ ｅｑｕｉｐｐｅｄ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｍｅｔｅｒ）（Ａｖｉｖ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）又は撹拌キュベットを備えた８０００シリーズ ＳＬＭ−ＡＭＩＮＣＯＴＭ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）で測定される、漸増濃度の抗原の存在下にて、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中、２５℃の、２０ｎＭの抗抗原抗体（Ｆａｂ型）の蛍光放出強度（励起＝２９５ｎｍ；放出＝３４０ｎｍ、帯域通過＝１６ｎｍ）における増加又は減少を測定する蛍光消光技術を用いて結合速度を測定することができる。
抗体７Ｄ９及び他の実施態様
一態様において、本発明は、（ａ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一、二、三、四、五、又は六のＨＶＲを含む抗メソテリン抗体を提供する。
一態様において、本発明は、（ａ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される、少なくとも一つのＶＨ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＨ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。一実施態様において、抗体は、配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。その他の実施態様において、抗体は、配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、及び配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。更なる実施態様において、抗体は、配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、及び配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２を含む。更なる実施態様において、抗体は、（ａ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。
その他の態様において、本発明は、（ａ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；（ｃ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一つのＶＬ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＬ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。一実施態様において、抗体は、（ａ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
その他の態様において、本発明の抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも一つのＶＨ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＨ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含むＶＨドメイン、及び（ｂ）（ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも一つのＶＬ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＬ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を含むＶＬドメインを含む。
その他の態様において、本発明は、（ａ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む抗体を提供する。
上記実施態様の何れかにおいて、抗メソテリン抗体はヒト化されている。一実施態様において、抗メソテリン抗体は、上記実施態様の何れかにおけるＨＶＲを含み、更に、ヒトアクセプターフレームワーク、例えばヒト免疫グロブリンのフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークを含む。ある実施態様において、ヒトアクセプターフレームワークは、ヒトＶＬカッパＩコンセンサス（ＶＬＫＩ）フレームワーク及び／又はＶＨフレームワークＶＨＡＴＡであり、それは３箇所：Ｒ７１Ａ，Ｎ７３Ｔ，及びＬ７８ＡでヒトＶＨサブグループＩＩＩコンセンサス（ＶＨＩＩＩ）と異なる(Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285 (1992))。別の実施態様において、抗メソテリン抗体は、上記実施態様の何れかにあるＨＶＲを含み、更に、配列番号２５のフレームワークＦＲ２配列と配列番号２７のＦＲ３配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。そのような実施態様において、軽鎖可変ドメインフレームワークは、配列番号２５のＦＲ２配列と配列番号２７のＦＲ３配列を有する修飾されたヒトＶＬカッパＩコンセンサス（ＶＬＫＩ）フレームワークである。
別の態様において、抗メソテリン抗体は、配列番号８のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％，９９％、又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む。ある実施態様において、少なくとも９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％、又は９９％の同一性を有するＶＨ配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、その配列を含む抗メソテリン抗体はメソテリンへ結合する能力を保持する。ある実施態様において、配列番号８において、合計１から１０のアミノ酸が、置換、挿入及び／又は欠失している。ある実施態様において、置換、挿入、又は欠失は、ＨＶＲ外の（すなわちＦＲ内の）領域で生じる。任意で、抗メソテリン抗体は、配列番号８のＶＨ配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。特定の実施態様において、ＶＨは、（ａ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される一、二、又は三のＨＶＲを含む。
その他の態様において、配列番号４のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％，９９％、又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む、抗メソテリン抗体が提供される。ある実施態様において、少なくとも９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％、又は９９％の同一性を有するＶＬ配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、その配列を含む抗メソテリン抗体はメソテリンへ結合する能力を保持する。ある実施態様において、配列番号４において、合計１から１０のアミノ酸が、置換、挿入及び／又は欠失している。ある実施態様において、置換、挿入、又は欠失は、ＨＶＲ外の（すなわちＦＲ内の）領域で生じる。任意で、抗メソテリン抗体は、配列番号４のＶＬ配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。特定の実施態様において、ＶＬは、（ａ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される一、二、又は三のＨＶＲを含む。
その他の態様において、抗メソテリン抗体が提供され、その抗体は、上記に与えられた実施態様の何れかにあるＶＨ、及び上記に与えられた実施態様の何れかにあるＶＬを含む。一実施態様において、抗体は、配列番号８及び配列番号４のそれぞれＶＨとＶＬを、それらの配列の翻訳後修飾を含み含む。
更なる態様において、本発明は、本明細書に与えられた抗メソテリン抗体と同一エピトープに結合する抗体を提供する。例えば、ある実施態様において、配列番号８のＶＨ配列及び配列番号４のＶＬ配列を含む抗メソテリン抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される。ある実施態様において、配列番号４３のアミノ酸配列１５２〜１７５から、アミノ酸配列１５２〜１７５以内、又はアミノ酸配列１５２〜１７５と重複するエピトープに結合する抗体が提供される。ある実施態様において。Ｅ１５３とＤ１７４を含む配列番号４３のエピトープへ結合する抗体が提供される。そのような実施態様において、抗体はアミノ酸残基Ｅ１５３とＤ１７４に結合する。
本発明の更なる態様では、上記実施態様のいずれかに記載の抗メソテリン抗体は、キメラ、ヒト化又はヒト抗体を含むモノクローナル抗体である。一実施態様において、抗メソテリン抗体は、抗体断片、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、又はＦ（ａｂ’）２断片である。その他の態様において、抗体は、全長抗体、例えば、ＩｇＧ１抗体、又は本明細書において定義された他の抗体クラス又はアイソタイプである。
更なる態様にて、以下のセクション１−７で説明されるように、上記実施態様のいずれかに記載の抗メソテリン抗体は、単独または組み合わせで、任意の特徴を組み込むことができる：
抗体２２Ａ１０及び他の実施態様
一態様において、本発明は、（ａ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号３８又は３９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一、二、三、四、五、又は六のＨＶＲを含む抗メソテリン抗体を提供する。
一態様において、本発明は、（ａ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号３８又は３９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される、少なくとも一つのＶＨ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＨ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。一実施態様において、抗体は、配列番号３８又は３９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。その他の実施態様において、抗体は、配列番号３８又は３９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、及び配列番号３５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。更なる実施態様において、抗体は、配列番号３８又は３９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号３５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、及び配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２を含む。更なる実施態様において、抗体は、（ａ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号３８又は３９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。
その他の態様において、本発明は、（ａ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；（ｃ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一つのＶＬ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＬ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。一実施態様において、抗体は、（ａ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
その他の態様において、本発明の抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３８又は３９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも一つのＶＨ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＨ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含むＶＨドメイン、及び（ｂ）（ｉ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも一つのＶＬ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＬ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を含むＶＬドメインを含む。
その他の態様において、本発明は、（ａ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号３８又は３９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号３５から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む抗体を提供する。
上記実施態様の何れかにおいて、抗メソテリン抗体はヒト化されている。一実施態様において、抗メソテリン抗体は、上記実施態様の何れかにおけるＨＶＲを含み、更に、アクセプターヒトフレームワーク、例えばヒト免疫グロブリンのフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークを含む。ある実施態様において、ヒトアクセプターフレームワークは、ＶＬＫＩ及び／又はＶＨＩＩＩアクセプターフレームワークである。
別の態様において、抗メソテリン抗体は、配列番号１６のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％，９９％、又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む。ある実施態様において、少なくとも９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％、又は９９％の同一性を有するＶＨ配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、その配列を含む抗メソテリン抗体はメソテリンへ結合する能力を保持する。ある実施態様において、配列番号１６において、合計１から１０のアミノ酸が、置換、挿入及び／又は欠失している。ある実施態様において、置換、挿入、又は欠失は、ＨＶＲ外の（すなわちＦＲ内の）領域で生じる。任意で、抗メソテリン抗体は、配列番号１６のＶＨ配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。特定の実施態様において、ＶＨは、（ａ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号３８又は３９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される一、二、又は三のＨＶＲを含む。
その他の態様において、配列番号１２のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％，９９％、又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む、抗メソテリン抗体が提供される。ある実施態様において、少なくとも９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％、又は９９％の同一性を有するＶＬ配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、その配列を含む抗メソテリン抗体はメソテリンへ結合する能力を保持する。ある実施態様において、配列番号１２において、合計１から１０のアミノ酸が、置換、挿入及び／又は欠失している。ある実施態様において、置換、挿入、又は欠失は、ＨＶＲ外の（すなわちＦＲ内の）領域で生じる。任意で、抗メソテリン抗体は、配列番号１２のＶＬ配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。特定の実施態様において、ＶＬは、（ａ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される一、二、又は三のＨＶＲを含む。
その他の態様において、抗メソテリン抗体が提供され、その抗体は、上記に与えられた実施態様の何れかにあるＶＨ、及び上記に与えられた実施態様の何れかにあるＶＬを含む。一実施態様において、抗体は、配列番号１６及び配列番号１２のそれぞれＶＨとＶＬを、それらの配列の翻訳後修飾を含み含む。
更なる態様において、本発明は、本明細書に与えられた抗メソテリン抗体と同一エピトープに結合する抗体を提供する。例えば、ある実施態様において、配列番号１６のＶＨ配列及び配列番号１２のＶＬ配列を含む抗メソテリン抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される。ある実施態様において、配列番号４３のアミノ酸配列２１１〜３２７から、アミノ酸配列２１１〜３２７以内、又はアミノ酸配列２１１〜３２７と重複するエピトープに結合する抗体が提供される。ある実施態様において。Ｅ２１１を含む配列番号４３のエピトープへ結合する抗体が提供される。そのような実施態様において、抗体はアミノ酸残基Ｅ２１１に結合する。
本発明の更なる態様では、上記実施態様のいずれかに記載の抗メソテリン抗体は、キメラ、ヒト化又はヒト抗体を含むモノクローナル抗体である。一実施態様において、抗メソテリン抗体は、抗体断片、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、又はＦ（ａｂ’）２断片である。その他の態様において、抗体は、全長抗体、例えば、ＩｇＧ１抗体、又は本明細書において定義された他の抗体クラス又はアイソタイプである。
更なる態様にて、以下のセクション１−７で説明されるように、上記実施態様のいずれかに記載の抗メソテリン抗体は、単独または組み合わせで、任意の特徴を組み込むことができる：
抗体１９Ｃ３及び他の実施態様
一態様において、本発明は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１１４６４を有するバイブリドーマ１９Ｃ３により産生される抗体の少なくとも一、二、三、四、五又は六のＨＶＲを含む抗メソテリン抗体を提供する。このセクションの目的のために、ＨＶＲは、本明細書に定義されるように、ＣＤＲに対応するアミノ酸領域により説明される。
一態様において、本発明は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１１４６４を有するバイブリドーマ１９Ｃ３により産生される抗体の少なくとも一、少なくとも二、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。一実施態様において、抗体は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１１４６４を有するバイブリドーマ１９Ｃ３により産生される抗体のＨＶＲ−Ｈ３を含む。別の実施態様において、抗体は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１１４６４を有するバイブリドーマ１９Ｃ３により産生される抗体のＨＶＲ−Ｈ３及びＨＶＲ−Ｌ３を含む。更なる実施態様において、抗体は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１１４６４を有するバイブリドーマ１９Ｃ３により産生される抗体のＨＶＲ−Ｈ３、ＨＶＲ−Ｌ３及びＨＶＲ−Ｈ２を含む。更なる実施態様において、抗体は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１１４６４を有するバイブリドーマ１９Ｃ３により産生される抗体のＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含む。
別の態様において、本発明は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１１４６４を有するバイブリドーマ１９Ｃ３により産生される抗体の少なくとも一、少なくとも二、又は三つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。一実施態様において、抗体は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１１４６４を有するバイブリドーマ１９Ｃ３により産生される抗体のＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３を含む。
別の態様において、本発明の抗体は、（ａ）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１１４６４を有するバイブリドーマ１９Ｃ３により産生される抗体の少なくとも一、少なくとも二、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含むＶＨドメイン；及び（ｂ）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１１４６４を有するバイブリドーマ１９Ｃ３により産生される抗体の少なくとも一、少なくとも二、又は三つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を含むＶＬドメインを含む。
別の態様において、本発明は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１１４６４を有するバイブリドーマ１９Ｃ３により産生される抗体のＨＶＲ−Ｈ１，ＨＶＲ−Ｈ２，ＨＶＲ−Ｈ３，ＨＶＲ−Ｌ１，ＨＶＲ−Ｌ２，及びＨＶＲ−Ｌ３を含む抗体を提供する。
上記実施態様の何れかにおいて、抗メソテリン抗体はヒト化されている。そのような実施態様において、抗体は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１１４６４を有するバイブリドーマ１９Ｃ３により産生される抗体のヒト化形態である。更なる実施態様において、抗メソテリン抗体は、上記実施態様の何れかにおけるＨＶＲを含み、更に、アクセプターヒトフレームワーク、例えばヒト免疫グロブリンのフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークを含む。
別の態様において、抗メソテリン抗体は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１１４６４を有するバイブリドーマ１９Ｃ３により産生される抗体のＶＨに対して、少なくとも９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％，９９％、又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む。ある実施態様において、ＶＨ配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、その配列を含む抗メソテリン抗体はメソテリンへ結合する能力を保持する。所定の実施態様において、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１１４６４を有するバイブリドーマ１９Ｃ３により産生される抗体のＶＨにおいて、合計１から１０のアミノ酸が、置換、挿入及び／又は欠失している。ある実施態様において、置換、挿入、又は欠失は、ＨＶＲ外の（すなわちＦＲ内の）領域で生じる。任意で、抗メソテリン抗体は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１１４６４を有するバイブリドーマ１９Ｃ３により産生される抗体のＶＨ配列を、その配列の翻訳後修飾を含んで含む。特定の実施態様において、ＶＨは、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１１４６４を有するバイブリドーマ１９Ｃ３により産生される抗体のＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも一、二又は三つのＨＶＲを含む。
別の態様において、抗メソテリン抗体が与えられ、該抗体は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１１４６４を有するバイブリドーマ１９Ｃ３により産生される抗体のＶＬに対して、少なくとも９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％，９９％、又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列を含む。ある実施態様において、少なくとも９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％、又は９９％の同一性を有するＶＬ配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、その配列を含む抗メソテリン抗体はメソテリンへ結合する能力を保持する。所定の実施態様において、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１１４６４を有するバイブリドーマ１９Ｃ３により産生される抗体のＶＬにおいて、合計１から１０のアミノ酸が、置換、挿入及び／又は欠失している。ある実施態様において、置換、挿入、又は欠失は、ＨＶＲ外の（すなわちＦＲ内の）領域で生じる。任意で、抗メソテリン抗体は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１１４６４を有するバイブリドーマ１９Ｃ３により産生される抗体のＶＬ配列を、その配列の翻訳後修飾を含んで含む。特定の実施態様において、ＶＬは、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１１４６４を有するバイブリドーマ１９Ｃ３により産生される抗体のＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも一、二又は三つのＨＶＲを含む。
その他の態様において、抗メソテリン抗体が提供され、その抗体は、上記に与えられた実施態様の何れかにあるＶＨ、及び上記に与えられた実施態様の何れかにあるＶＬを含む。一実施態様において、抗体は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１１４６４を有するバイブリドーマ１９Ｃ３により産生される抗体のＶＨ及びＶＬ配列を、その配列の翻訳後修飾を含んで含む。
更なる態様において、本発明は、本明細書に与えられた抗メソテリン抗体と同一エピトープに結合する抗体を提供する。例えば、ある実施態様において、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１１４６４を有するバイブリドーマ１９Ｃ３により産生される抗体と同じエピトープに結合する抗体が与えられる。
本発明の更なる態様では、上記実施態様のいずれかに記載の抗メソテリン抗体は、キメラ、ヒト化又はヒト抗体を含むモノクローナル抗体である。一実施態様において、抗メソテリン抗体は、抗体断片、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、又はＦ（ａｂ’）２断片である。その他の態様において、抗体は、全長抗体、例えば、ＩｇＧ２ｂ抗体、又は本明細書において定義された他の抗体クラス又はアイソタイプである。
更なる態様にて、以下のセクション１−７で説明されるように、上記実施態様のいずれかに記載の抗メソテリン抗体は、単独または組み合わせで、任意の特徴を組み込むことができる：
１．抗体親和性
所定の実施態様において、本明細書において与えられる抗体は、解離定数（Ｋｄ）が、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ、及び任意で≧１０−１３Ｍ（例えば、１０−８Ｍ未満、例えば、１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍから１０−１３Ｍ）を有する。
一実施態様において、以下のアッセイにより説明されるように、Ｋｄは、目的の抗体のＦａｂ型とその抗原を用いて実施される放射標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）により測定される。非標識抗原の滴定系列の存在下で、最小濃度の（１２５Ｉ）−標識抗原にてＦａｂを均衡化して、抗Ｆａｂ抗体コートプレートと結合した抗原を捕獲することによって抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性を測定する（例としてChen, et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)を参照）。アッセイの条件を決めるために、ＭＩＣＲＯＴＩＴＥＲ（登録商標）マルチウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を５μｇ／ｍｌの捕獲抗Ｆａｂ抗体（Ｃａｐｐｅｌ Ｌａｂｓ）を含む５０ｍＭ炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）にて一晩コートして、その後２％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミンを含むＰＢＳにて室温（およそ２３℃）で２〜５時間、ブロックする。非吸着プレート（Ｎｕｎｃ ＃２６９６２０）に、１００ｐＭ又は２６ｐＭの［１２５Ｉ］抗原を段階希釈した目的のＦａｂと混合する（例えば、Presta et al, (1997) Cancer Res. 57: 4593-4599の抗ＶＥＧＦ抗体、Ｆａｂ−１２の評価と一致する）。ついで目的のＦａｂを一晩インキュベートする；しかし、インキュベーションは平衡状態に達したことを確認するまでに長時間（例えばおよそ６５時間）かかるかもしれない。その後、混合物を捕獲プレートに移し、室温で（例えば１時間）インキュベートする。そして、溶液を取り除き、プレートを０．１％のポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標））を含むＰＢＳにて８回洗浄する。プレートが乾燥したら、１５０μｌ／ウェルの閃光物質（ＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴ−２０ＴＭ；Ｐａｃｋａｒｄ）を加え、プレートをＴＯＰＣＯＵＮＴＴＭγ計測器（Ｐａｃｋａｒｄ）にて１０分間計測する。最大結合の２０％か又はそれ以下濃度のＦａｂを選択してそれぞれ競合結合測定に用いる。
他の実施態様に従って、〜１０反応単位（ＲＵ）の固定した抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃のＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−２０００又はＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いる表面プラズモン共鳴アッセイを使用してＫｄを測定する。簡単に言うと、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５，ＢＩＡｃｏｒｅ Ｉｎｃ．）を、提供者の指示書に従ってＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）で活性化した。抗原を１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で５μｇ／ｍｌ（〜０．２μＭ）に希釈し、結合したタンパク質の反応単位（ＲＵ）がおよそ１０になるように５μｌ／分の流速で注入する。抗原の注入後、反応しない群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入する。動力学的な測定のために、Ｆａｂの２倍の段階希釈（０．７８ｎＭから５００ｎＭ）を、２５℃で、およそ２５μｌ／分の流速で、０．０５％ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ２０ＴＭ）界面活性剤（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳに注入した。会合及び解離のセンサーグラムを同時にフィットさせることによる単純一対一ラングミュア結合モデル（ｓｉｍｐｌｅ ｏｎｅ−ｔｏ−ｏｎｅ Ｌａｎｇｍｕｉｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｅｌ）（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアバージョン３．２）を用いて、会合速度（ｋｏｎ）と解離速度（ｋｏｆｆ）を算出した。平衡解離定数（Ｋｄ）をｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出した。例えば、Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)を参照。上記の表面プラスモン共鳴アッセイによる結合速度が１０６Ｍ−１ｓ−１を上回る場合、分光計、例えば、流動停止を備えた分光光度計（ｓｔｏｐ−ｆｌｏｗ ｅｑｕｉｐｐｅｄ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｍｅｔｅｒ）（Ａｖｉｖ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）又は撹拌キュベットを備えた８０００シリーズ ＳＬＭ−ＡＭＩＮＣＯＴＭ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）で測定される、漸増濃度の抗原の存在下にて、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中、２５℃の、２０ｎＭの抗抗原抗体（Ｆａｂ型）の蛍光放出強度（励起＝２９５ｎｍ；放出＝３４０ｎｍ、帯域通過＝１６ｎｍ）における増加又は減少を測定する蛍光消光技術を用いて結合速度を測定することができる。
２．抗体断片
所定の実施態様において、本明細書で提供される抗体は、抗体断片である。抗体断片は、限定されないが、Ｆａｂ，Ｆａｂ’，Ｆａｂ’−ＳＨ，Ｆ（ａｂ’）２，Ｆｖ，及びｓｃＦｖ断片、及び下記の他の断片を含む。所定の抗体断片の総説については、Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003)を参照。ｓｃＦｖ断片の総説については、例えば、Pluckthuen, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)を参照；また、国際公開第９３／１６１８５号；及び米国特許第５，５７１，８９４号及び第５，５８７，４５８号も参照。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、かつインビボ半減期を増加させたＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の議論については、米国特許第５８６９０４６号を参照のこと。
ダイアボディは２価または二重特異性であり得る２つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、欧州特許第４０４，０９７号；国際公開第１９９３／０１１６１号；Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); 及びHollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)を参照。トリアボディ及びテトラボディもまた Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)に記載されている。
単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全て又は一部、又は軽鎖可変ドメインの全て又は一部を含む抗体断片である。所定の実施態様において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ；例えば、米国特許第６，２４８，５１６ Ｂ１号を参照）。
抗体断片は様々な技術で作成することができ、限定されないが、本明細書に記載するように、インタクトな抗体の分解、並びに組換え宿主細胞（例えば、大腸菌又はファージ）による生産を含む。
３．キメラ及びヒト化抗体
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、キメラ抗体である。所定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号、及びMorrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984))に記載されている。一例において、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、又はサル等の非ヒト霊長類由来の可変領域）及びヒト定常領域を含む。更なる例において、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスが親抗体のものから変更された「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合断片を含む。
所定の実施態様において、キメラ抗体は、ヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、ヒトに対する免疫原性を低減するために、親の非ヒト抗体の特異性と親和性を保持したまま、ヒト化されている。一般に、ヒト化抗体は、ＨＶＲ、例えば、ＣＤＲ（またはその一部）が、非ヒト抗体から由来し、ＦＲ（またはその一部）がヒト抗体配列に由来する、一以上の可変ドメインを含む。ヒト化抗体はまた、任意で、ヒト定常領域の少なくとも一部をも含む。所定の実施態様において、ヒト化抗体の幾つかのＦＲ残基は、抗体特異性又は親和性を回復もしくは改善するめに、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基が由来する抗体）由来の対応する残基で置換されている。
ヒト化抗体およびそれらの製造方法は、例えば、Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)に総説され、更に、Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989);米国特許第５，８２１，３３７，７，５２７，７９１，６，９８２，３２１，及び７，０８７，４０９；Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005)（ＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）グラフティングを記述）； Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) （「リサーフェシング」を記述）；Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005)（「ＦＲシャッフリング」を記述）；及びOsbourn et al., Methods 36:61-68 (2005)及びKlimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) （ＦＲのシャッフリングへの「誘導選択」アプローチを記述）に記載されている。
ヒト化に用いられ得るヒトフレームワーク領域は、限定されないが、「ベストフィット」法を用いて選択されるフレームワーク領域（例えば、Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993))；軽鎖または重鎖の可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列由来のフレームワーク領域（例えば、Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)；及びPresta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)を参照）；ヒト成熟（体細胞変異）フレームワーク領域またはヒト生殖細胞系フレームワーク領域（例えば、Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)を参照）；及びＦＲライブラリスクリーニング由来のフレームワーク領域（例えば、Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997)及び Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)を参照）を含む。
４．ヒト抗体
所定の実施態様において、本明細書で提供される抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当技術分野で公知の様々な技術を用いて生産することができる。ヒト抗体は一般的にvan Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) 及びLonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)に記載されている。
ヒト抗体は、抗原チャレンジに応答して、インタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を持つ又はインタクトな抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に、免疫原を投与することにより調製することができる。このような動物は、典型的には、内因性免疫グロブリン遺伝子座を置換するか、又は染色体外に存在するかもしくは動物の染色体にランダムに組み込まれている、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全てまたは一部を含む。このようなトランスジェニックマウスでは、内因性免疫グロブリン遺伝子座は、一般的に不活性化される。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の総説については、Lonberg,Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)を参照。また、例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥＴＭ技術を記載している、米国特許第６，０７５，１８１号及び６，１５０，５８４号；ＨｕＭａｂ（登録商標）技術を記載している米国特許第５，７７０，４２９号；Ｋ−Ｍ ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載している米国特許第７，０４１，８７０号及び、ＶｅｌｏｃｉＭｏｕｓｅ（登録商標）技術を記載している米国特許出願公開第２００７／００６１９００号）を参照。このような動物で生成されたインタクトな抗体由来のヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることにより、更に改変される可能性がある。
ヒト抗体は、ハイブリドーマベース法によって作成することができる。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ細胞株が記載されている。（例えば、Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987);及びBoerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)を参照）ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されたヒト抗体はまた、Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)に記載されている。更なる方法は、例えば、米国特許第７，１８９，８２６号（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生を記載している）及びNi, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) （ヒト−ヒトハイブリドーマを記載している）に記載されたものを含む。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）もまた、Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) 及びVollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)に記載される。
ヒト抗体はまた、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーから選択されたＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することによって生成され得る。このような可変ドメイン配列は、次に所望のヒト定常ドメインと組み合わせてもよい。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択するための技術が、以下に説明される。
５．ライブラリー由来の抗体
本発明の抗体は、所望の活性または活性（複数）を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。例えば、様々な方法が、ファージディスプレイライブラリーを生成し、所望の結合特性を有する抗体についてのライブラリーをスクリーニングするために、当該技術分野で知られている。そのような方法は、例えば、Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)に総説され、更に、例えば、McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); 及びLee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)に記載されている。
所定のファージディスプレイ法において、ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーがポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により個別にクローニングされ、ファージライブラリーにランダムに再結合され、その後、Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)に記載されるように、抗原結合ファージについてスクリーニングすることができる。ファージは、通常、抗体断片を、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、またはＦａｂ断片のいずれかとして提示する。免疫された起源からのライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要性なしで免疫原に高親和性抗体を提供する。代わりに、Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993)に記載されるように、ナイーブなレパートリーが、任意の免疫感作無しで、広範囲の非自己抗原及び自己抗原に対して、抗体の単一起源を提供するために、（例えば、ヒトから）クローン化することができる。最後に、ナイーブなライブラリはまた、Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)に記載されるように、非常に可変なＣＤＲ３領域をコードし、インビトロで再構成を達成するために、幹細胞由来の未転位Ｖ遺伝子セグメントをクローニングし、ランダム配列を含むＰＣＲプライマーを使用することにより合成することができる。ヒト抗体ファージライブラリーを記述する特許公報は、例えば、米国特許第５，７５０，３７３号、及び米国特許出願公開第２００５／００７９５７４号、２００５／０１１９４５５号、２００５／０２６６０００号、２００７／０１１７１２６号、２００７／０１６０５９８号、２００７／０２３７７６４号、２００７／０２９２９３６号及び２００９／０００２３６０を含む。
ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体または抗体断片は、本明細書でヒト抗体またはヒト抗体の断片とみなされる。
６．多重特異性抗体
所定の実施態様において、本明細書で提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも二つの異なる部位に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある実施態様において、結合特異性の一つはメソテリンに対してであり、他は、任意の他の抗原に対してである。ある実施態様において、二重特異性抗体は、メソテリンの２つの異なるエピトープに結合することができる。二重特異性抗体はまたメソテリンを発現する細胞に対して細胞傷害性薬物を局在化させるために用いることができる。二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体断片として調製することができる。
多重特異性抗体を作製するための技術は、限定されないが、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の組換え共発現（Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)）、国際公開第９３／０８８２９号、及びTraunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)を参照）及び“ｋｎｏｂ−ｉｎ−ｈｏｌｅ”エンジニアリング（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号を参照）を含む。多重特異抗体はまた、抗体のＦｃ−ヘテロ２量体分子を作成するための静電ステアリング効果を操作すること（国際公開第２００９／０８９００４Ａ１号）、２つ以上の抗体又は断片を架橋すること（例えば米国特許第４，６７６，９８０号、及びBrennan et al., Science, 229: 81 (1985)を参照）、二重特異性抗体を生成するためにロイシンジッパーを使用すること（例えば、Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)を参照）、二重特異性抗体フラグメントを作製するため、「ダイアボディ」技術を使用すること（例えば、Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)を参照）、単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーを使用すること（例えば、Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)を参照）、及び、例えばTutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)に記載されているように、三重特異性抗体を調製することによって作成することができる。
「オクトパス抗体」を含む、３つ以上の機能性抗原結合部位を持つ改変抗体もまた本明細書に含まれる（例えば、米国特許出願公開第２００６／００２５５７６Ａ１号を参照）。
本明細書中の抗体又は断片はまた、メソテリン並びにその他の異なる抗原（例えば米国特許出願公開第２００８／００６９８２０号参照）に結合する抗原結合部位を含む、「２重作用（Ｄｕａｌ Ａｃｔｉｎｇ）ＦＡｂ」又は「ＤＡＦ」を含む。
７．抗体変異体
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体のアミノ酸配列変異体が企図される。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望まれ得る。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な改変を導入することにより、またはペプチド合成によって調製することができる。このような改変は、例えば、抗体のアミノ酸配列内における、残基の欠失、及び／又は挿入及び／又は置換を含む。最終コンストラクトが所望の特性、例えば、抗原結合を有していることを条件として、欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせが、最終コンストラクトに到達させるために作成され得る。
ａ）置換、挿入、および欠失変異体
ある実施態様において、一つ以上のアミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。置換突然変異の対象となる部位は、ＨＶＲとＦＲを含む。保存的置換は、表１の「望ましい置換」の見出しの下に示されている。より実質的な変更が、表１の「典型的な置換」の見出しの下に与えられ、アミノ酸側鎖のクラスを参照して以下に更に説明される。アミノ酸置換は、目的の抗体に導入することができ、その産物は、所望の活性、例えば、抗原結合の保持／改善、免疫原性の減少、又はＡＤＣＣ又はＣＤＣの改善についてスクリーニングされた。
アミノ酸は共通の側鎖特性に基づいてグループに分けることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン，Ｍｅｔ，Ａｌａ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ；
（２）中性の親水性：Ｃｙｓ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ａｓｎ，Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ，Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ，Ｌｙｓ，Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ，Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ，Ｔｙｒ，Ｐｈｅ．
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。
置換変異体の一つのタイプは、親抗体（例えば、ヒト化又はヒト抗体など）の一以上の高頻度可変領域残基の置換を含む。一般的には、さらなる研究のために選択され得られた変異体は、親抗体と比較して、特定の生物学的特性の改変（例えば、改善）（例えば、親和性の増加、免疫原性を減少）を有し、及び／又は親抗体の特定の生物学的特性を実質的に保持しているであろう。典型的な置換変異体は、親和性成熟抗体であり、例えば、本明細書に記載されるファージディスプレイベースの親和性成熟技術を用いて、簡便に生成され得る。簡潔に言えば、一つ以上のＨＶＲ残基が変異し、変異体抗体は、ファージ上に表示され、特定の生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。
変更（例えば、置換）は、例えば抗体の親和性を向上させるために、ＨＶＲで行うことができる。このような変更は、ＨＶＲの「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟過程中に高頻度で変異を受けるコドンにコードされた残基で（例えばChowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)を参照）、及び／又はＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）で行うことができ、得られた変異体ＶＨ又はＶＬが結合親和性について試験される。二次ライブラリから構築し選択し直すことによる親和性成熟が、例えばHoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)に記載されている。親和性成熟の幾つかの実施態様において、多様性が、種々の方法（例えば、変異性ＰＣＲ、鎖シャッフリング、又はオリゴヌクレオチド指定突然変異誘発）のいずれかにより、成熟のために選択された可変遺伝子中に導入される。次いで、二次ライブラリーが作成される。次いで、ライブラリーは、所望の親和性を持つ抗体変異体を同定するためにスクリーニングされる。多様性を導入するするもう一つの方法は、いくつかのＨＶＲ残基（例えば、一度に４から６残基）がランダム化されたＨＶＲ指向のアプローチを伴う。抗原結合に関与するＨＶＲ残基は、例えばアラニンスキャニング突然変異誘発、またはモデリングを用いて、特異的に同定され得る。ＣＤＲ−Ｈ３及びＣＤＲ−Ｌ３がしばしば標的にされる。
所定の実施態様において、置換、挿入、または欠失は、そのような改変が抗原に結合する抗体の能力を実質的に低下させない限りにおいて、一以上のＨＶＲ内で発生する可能性がある。例えば、実質的に結合親和性を低下させない保存的改変（例えば本明細書で与えられる保存的置換）をＨＶＲ内で行うことができる。このような改変は、ＨＶＲ「ホットスポット」又はＳＤＲの外側であってもよい。上記に与えられた変異体ＶＨ又はＶＬ配列の所定の実施態様において、各ＨＶＲは不変であるか、又はわずか１個、２個または３個のアミノ酸置換が含まれているかの何れかである。
突然変異誘発のために標的とすることができる抗体の残基又は領域を同定するための有用な方法は、Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085により説明されるように、「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。この方法では、標的残基の残基またはグループ（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ及びｇｌｕなどの荷電残基）が同定され、抗原と抗体との相互作用が影響を受けるかどうかを判断するために、中性または負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニンまたはポリアラニン）に置換される。更なる置換が、最初の置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸の位置に導入され得る。代わりに、又は更に、抗原抗体複合体の結晶構造が、抗体と抗原との接触点を同定するために用いられる。そのような接触残基及び隣接残基が、置換の候補として標的とされるか又は排除され得る。変異体はそれらが所望の特性を含むかどうかを決定するためにスクリーニングされ得る。
アミノ酸配列挿入は、一残基から百以上の残基を含有するポリペプチド長にわたるアミノ及び／又はカルボキシル末端融合、並びに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニン残基を有する抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変異体は、酵素に対する抗体のＮ末端またはＣ末端への融合（例えばＡＤＥＰＴの場合）、または抗体の血清半減期を増加させるポリペプチドへの融合を含む。
ｂ）グリコシル化変異体
所定の実施態様において、本明細書で提供される抗体は抗体がグリコシル化される程度を増加または減少するように改変される。抗体へのグリコシル化部位の付加または欠失は、一以上のグリコシル化部位が作成または削除されるようにアミノ酸配列を変えることによって簡便に達成することができる。
抗体がＦｃ領域を含む場合には、それに付着する糖を変えることができる。哺乳動物細胞によって生成された天然型抗体は、典型的には、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７にＮ−結合により一般的に付着した分岐鎖、二分岐オリゴ糖を含んでいる。例えばWright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997)を参照。オリゴ糖は、様々な炭水化物、例えば、二分岐糖鎖構造の「幹」のＧｌｃＮＡｃに結合した、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、シアル酸、並びにフコースを含み得る。幾つかの実施態様において、本発明の抗体におけるオリゴ糖の改変は一定の改善された特性を有する抗体変異型を作成するために行われ得る。
一実施態様において、抗体変異体は、Ｆｃ領域に（直接または間接的に）付着されたフコースを欠いた糖鎖構造を有して提供される。例えば、このような抗体のフコース量は、１％から８０％、１％から６５％、５％から６５％、または２０％から４０％であり得る。フコースの量は、例えば、国際公開第２００８／０７７５４６号に記載されているように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって測定されるＡｓｎ２９７に付着しているすべての糖構造の合計（例えば、コンプレックス、ハイブリッド及び高マンノース構造）に対して、Ａｓｎ２９７の糖鎖中のフコースの平均量を計算することによって決定される。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域（Ｆｃ領域残基のＥＵ番号付け）でおよそ２９７の位置に位置するアスパラギン残基を指し、しかし、Ａｓｎ２９７もまた位置２９７の上流または下流のおよそ±３アミノ酸に、すなわち抗体の軽微な配列変異に起因して、位置２９４と３００の間に配置され得る。このようなフコシル化変異体はＡＤＣＣ機能を改善させた可能性がある。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）；米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号（協和発酵工業株式会社）を参照。「フコース非修飾」又は「フコース欠損」抗体変異体に関連する出版物の例としては、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号、国際公開第２０００／６１７３９号、国際公開第２００１／２９２４６号、米国特許出願公開第２００３／０１１５６１４号、米国特許出願公開第２００２／０１６４３２８号、米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号、米国特許出願公開第２００４／０１３２１４０号、米国特許出願公開第２００４／０１１０７０４号、米国特許出願公開第２００４／０１１０２８２号、米国特許出願公開第２００４／０１０９８６５号、国際公開第２００３／０８５１１９号、国際公開第２００３／０８４５７０号、国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第２００５／０３５７７８号、国際公開第２００５／０５３７４２号、国際公開第２００２／０３１１４０号、Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)が含まれる。非フコシル化抗体を産生する能力を有する細胞株の例としては、タンパク質フコシル化を欠損しているＬｅｃ１３ ＣＨＯ細胞(Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)；米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８ Ａ１号，Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ；及び国際公開第２００４／０５６３１２ Ａ１号，Ａｄａｍｓら、特に実施例１１にて）、及びノックアウト細胞株、アルファ−１、６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞（例えば、Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)；及び国際公開第２００３／０８５１０７号を参照）を含む。
抗体変異体が、例えば、抗体のＦｃ領域に結合した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分されている二分オリゴ糖とともに更に与えられる。このような抗体変異体はフコシル化を減少させ、及び／又はＡＤＣＣ機能を改善している可能性がある。そのような抗体変異体の例は、例えば、国際公開第２００３／０１１８７８号（Ｊｅａｎ−Ｍａｉｒｅｔｔら）；米国特許第６，６０２，６８４号（Ｕｍａｎａら）；及び米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号（Ｕｍａｎａら）に記載されている。Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖内に少なくとも１つのガラクトース残基を持つ抗体変異体も提供される。このような抗体変異体はＣＤＣ機能を改善させた可能性がある。このような抗体変異体は、例えば、国際公開第１９９７／３００８７号（Ｐａｔｅｌら）；国際公開第１９９８／５８９６４号（Ｒａｊｕ，Ｓ．）；及び国際公開第１９９９／２２７６４号（Ｒａｊｕ，Ｓ．）に記載されている。
ｃ）Ｆｃ領域変異体
ある実施態様において、１つまたは複数のアミノ酸改変を、本明細書で提供される抗体のＦｃ領域に導入することができ、それによってＦｃ領域変異体を生成する。Ｆｃ領域の変異体は、１つまたは複数のアミノ酸位置においてアミノ酸修飾（例えば置換）を含むヒトＦｃ領域の配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のＦｃ領域）を含んでもよい。
ある実施態様において、本発明は、インビボにおける抗体の半減期が重要であるが、ある種のエフェクター機能（例えば補体およびＡＤＣＣなど）が不要または有害である用途のための望ましい候補とならしめる、全てではないが一部のエフェクター機能を有する抗体変異体を意図している。インビトロ及び／又はインビボでの細胞毒性アッセイを、ＣＤＣ活性及び／又はＡＤＣＣ活性の減少／枯渇を確認するために行うことができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイは、抗体がＦｃγＲ結合を欠くが（それゆえ、おそらくＡＤＣＣ活性を欠く）、ＦｃＲｎ結合能力を保持していることを確認するために行うことができる。ＡＤＣＣ、ＮＫ細胞を媒介する初代細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞におけるＦｃＲの発現は、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991）の４６４ページの表３に要約されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定的な例は、米国特許第５，５００，３６２号（例えば、Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)を参照）及びHellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); 5,821,337 (Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)を参照）に説明される。あるいは、非放射性アッセイ法を用いることができる（例えば、フローサイトメトリー用のＡＣＴＩＴＭ非放射性細胞傷害性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ；及びＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞毒性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を参照。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。あるいは、又は更に、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、Clynes et al., PNAS USA 95:652-656 (1998)に開示されるように、インビボで、例えば動物モデルにおいて評価することができる。Ｃ１ｑ結合アッセイはまた、抗体が体Ｃ１ｑを結合することができないこと、したがって、ＣＤＣ活性を欠いていることを確認するために行うことができる。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号のＣ１ｑおよびＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行うことができる（例えば、Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003)；及びCragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)を参照）。ＦｃＲｎ結合、及びインビボでのクリアランス／半減期の測定ではまた、当該分野で公知の方法を用いて行うことができる（例えば、Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)を参照）。
エフェクター機能が減少した抗体は、Ｆｃ領域の残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、３２９の一つ以上の置換を有するものが含まれる（米国特許第６７３７０５６号）。そのようなＦｃ変異体は、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有する、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含む、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７の２以上での置換を有するＦｃ変異体を含む（米国特許第７，３３２，５８１号）。
ＦｃＲへの改善又は減少させた結合を持つ特定の抗体変異体が記載されている。（例えば、米国特許第６，７３７，０５６号；国際公開第２００４／０５６３１２号、及びShields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)を参照）。
所定の実施態様において、抗体変異体はＡＤＣＣを改善する１つまたは複数のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の位置２９８、３３３、及び／又は３３４における置換（ＥＵの残基番号付け）を含む。
幾つかの実施態様において、改変された（すなわち改善されたか減少した）Ｃ１ｑ結合及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を生じる、Ｆｃ領域における改変がなされ、例えば、米国特許第６，１９４，５５１号、国際公開第９９／５１６４２号、及びIdusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)に説明される。
増加した半減期を持ち、胎仔への母性ＩｇＧの移送を担う、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合が改善された抗体（Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) 及びKim et al., J. Immunol. 24:249 (1994))が、米国特許出願公開第２００５／００１４９３４Ａ１号（Hinton et al.）に記載されている。これらの抗体は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を改善する一つまたは複数の置換を有するＦｃ領域を含む。このようなＦｃ変異体は、Ｆｃ領域の残基の１以上の置換を有するものが含まれる：２３８，２５６，２６５，２７２，２８６，３０３，３０５，３０７，３１１，３１２，３１７，３４０，３５６，３６０，３６２，３７６，３７８，３８０，３８２，４１３，４２４又は４３４、例えば、Ｆｃ領域の残基４３４の置換（米国特許第７，３７１，８２６号）。
Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988);米国特許第５，６４８，２６０号；米国特許第５，６２４，８２１号；及び、Ｆｃ領域の変異体の他の例に関しては国際公開第９４／２９３５１号も参照のこと。
ｄ）システイン改変抗体変異体
所定の実施態様において、抗体の１つ以上の残基がシステイン残基で置換されている、システイン改変抗体、例えば、「ｔｈｉｏＭＡｂｓ」を作成することが望まれ得る。特定の実施態様において、置換された残基は、抗体のアクセス可能な部位で起きる。それらの残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基は、それによって抗体のアクセス可能な部位に配置され、本明細書中でさらに記載されるように、イムノコンジュゲーを作成するために、例えば薬物部分またはリンカー−薬剤部分などの他の部分に抗体をコンジュゲートするために使用することができる。ある実施態様において、一以上の以下の残基がシステインで置換され得る：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔの番号付け）；重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）；及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）。システイン改変抗体は、例えば、米国特許第７５２１５４１号に記載のように生成され得る。
ｅ）抗体誘導体
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、当技術分野で知られ、容易に入手されている追加の非タンパク質部分を含むように更に改変することができる。抗体の誘導体化に適した部分としては、限定されないが、水溶性ポリマーを含む。水溶性ポリマーの非限定的な例は、限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキソラン、エチレン／無水マレイン酸共重合体、ポリアミノ酸（単独重合体又はランダム共重合体の何れか）及びデキストラン又はポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコール単独重合体、プロピレンオキシド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール及びこれらの混合物を包含する。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドはその水中での安定性のために製造上の利点を有し得る。ポリマーは何れかの分子量のものであってよく、そして分枝鎖又は未分枝鎖であってよい。抗体に結合するポリマーの数は変動してよく、そして、一以上の重合体が結合する場合は、それらは同じか又は異なる分子であることができる。一般的に、誘導体化に使用するポリマーの数及び／又は種類は、限定されないが、向上させるべき抗体の特定の特性又は機能、抗体誘導体が特定の条件下で治療に使用されるのか等を考慮しながら決定することができる。
その他の実施態様において、放射線への曝露によって選択的に加熱されてもよい抗体と非タンパク質部分とのコンジュゲートが、提供される。一実施態様において、非タンパク質部分はカーボンナノチューブである(Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)。放射線は、任意の波長であって良いが、限定されないものの、通常の細胞に害を与えないが、抗体−非タンパク質部分の近位細胞が死滅される温度に非タンパク質部分を加熱する波長が含まれる。
Ｂ．組換え方法及び組成物
抗体は、例えば米国特許第４，８１６，５６７号で説明したように、組換えの方法および組成物を用いて製造することができる。一実施態様において、本明細書に記載される抗メソテリン抗体をコードする単離された核酸が提供される。このような核酸は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列、及び／又は抗体のＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖及び／又は重鎖）をコードし得る。更なる実施態様において、そのような核酸を含む１つ以上のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。更なる実施態様において、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。一実施態様において、宿主細胞は以下を含む（例えば、以下で形質転換される）：（１）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列、及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、又は（２）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第一ベクター、及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第ニベクター。一実施態様において、宿主細胞は、真核生物、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。一実施態様において、抗メソテリン抗体を作る方法が提供され、その方法は、上記のように、抗体の発現に適した条件下で、抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養することを含み、および必要に応じて、宿主細胞（または宿主細胞培養培地）から抗体を回収することを含む。
抗メソテリン抗体の組換え生産のために、例えば上述したように、抗体をコードする核酸が単離され、宿主細胞内でのさらなるクローニングおよび／または発現のために１つ以上のベクターに挿入される。このような核酸は、容易に単離され、従来の手順を用いて（例えば、抗体の重鎖と軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）配列決定することができる。
抗体をコードするベクターのクローニング又は発現に適切な宿主細胞は、本明細書に記載の原核細胞又は真核細胞を含む。例えば、特に、グリコシル化およびＦｃエフェクター機能が必要ない場合には、抗体は、細菌で産生することができる。細菌における抗体断片およびポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５，６４８，２３７号、第５，７８９，１９９号及び第５，８４０，５２３号を参照。（また、大腸菌における抗体の発現を説明している、Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254も参照。）発現の後、抗体は可溶性画分において細菌の細胞ペーストから単離され得、更に精製することができる。
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、菌類や酵母菌株を含む抗体をコードするベクターのための、適切なクローニング宿主又は発現宿主であり、そのグリコシル化経路が、「ヒト化」されており、部分的または完全なヒトのグリコシル化パターンを有する抗体の生成をもたらす。Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004)、及びLi et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)を参照。
グリコシル化抗体の発現に適した宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物と脊椎動物）から派生している。無脊椎動物細胞の例としては、植物および昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株が同定され、これらは特にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と組み合わせて使用することができる。
植物細胞培養を宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５９５９１７７号、第６０４０４９８号、第６４２０５４８号、第７１２５９７８号及び第６４１７４２９号（トランスジェニック植物における抗体産生に関するＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＴＭ技術を記載）を参照。
脊椎動物細胞もまた宿主として用いることができる。例えば、懸濁液中で増殖するように適合されている哺乳動物細胞株は有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７）で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株、ヒト胚腎臓株（Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)に記載された２９３細胞又は２９３細胞、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスのセルトリ細胞（Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)に記載されるＴＭ４細胞）、サル腎細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６）、ヒト子宮頚癌細胞（ＨｅＬａ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）、マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２）、例えばMather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)に記載されるＴＲＩ細胞、ＭＲＣ５細胞、およびＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞(Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980))を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、及びＹ０、ＮＳ０およびＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株を含む。抗体産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞系の総説については、例えば、Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)を参照。
Ｃ．アッセイ
本明細書で提供される抗メソテリン抗体は、同定され、当技術分野で公知の様々なアッセイによってその物理的／化学的性質及び／又は生物学的活性についてスクリーニングされ、または特徴づけることができる。
一態様において、本発明の抗体は、例えばＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ又はウエスタンブロット法など公知の方法により、その抗原結合活性について試験される。
その他の態様において、競合アッセイが、メソテリンに対する結合について本明細書に記載される抗体の何れかと競合する抗体を同定するために用いることができる。所定の実施態様において、このような競合する抗体は、本明細書に記載される抗体により結合される同一のエピトープ（例えば、直鎖状又は立体構造エピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な典型的な方法が、Morris (1996) “Epitope Mapping Protocols," in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)に提供されている。
典型的な競合アッセイにおいて、固定化メソテリンは、メソテリンに結合する第一の標識された抗体（例えば本明細書に記載される何れかの抗体）、及びメソテリンへの結合について第一の抗体と競合する能力について試験された第二の未標識抗体を含む溶液中でインキュベートされる。第二抗体はハイブリドーマ上清中に存在してもよい。コントロールとして、固定化メソテリンが、第二の未標識の抗体でなく、第一の標識された抗体を含む溶液中でインキュベートされる。第一の抗体のメソテリンへの結合を許容する条件下でインキュベートした後、過剰の未結合の抗体が除去され、固定化されたメソテリンに結合した標識の量が測定される。もし、固定化メソテリンに結合した標識の量が、コントロールサンプルと比較して試験サンプル中で実質的に減少している場合、それは、第二抗体が、メソテリンへの結合に対して、第一の抗体と競合していることを示している。Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY）を参照。
Ｄ．イムノコンジュゲート
本発明はまた、化学療法剤又は薬物、成長抑制剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物、または動物起源の酵素活性毒素、又はそれらの断片）、又は放射性同位元素など、１つ以上の細胞傷害性薬物にコンジュゲートした本明細書中の抗メソテリン抗体を含むイムノコンジュゲートを提供する。
一実施態様において、イムノコンジュゲートは、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）であって、そこでは抗体は、限定されないが、メイタンシノイド（米国特許第５２０８０２０号、第５４１６０６４号及び欧州特許ＥＰ０ ４２５２３５ Ｂ１を参照）；モノメチルアウリスタチン薬物部分ＤＥ及びＤＦ（ＭＭＡＥ及びＭＭＡＦ）（米国特許第５６３５４８３号及び５７８０５８８号及び７４９８２９８号を参照）などのアウリスタチン；ドラスタチン、カリケアマイシン又はその誘導体（米国特許第５７１２３７４号、５７１４５８６号、５７３９１１６号、５７６７２８５号、５７７０７０１号、５７７０７１０号、５７７３００１号、及び５８７７２９６号を参照；Hinman et al., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993)；及びLode et al., Cancer Res. 58:2925-2928 (1998))；ダウノマイシン又はドキソルビシンなどのアントラサイクリン (Kratz et al., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006); Torgov et al., Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005); Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002); King et al., J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002)；及び米国特許第６，６３０，５７９号を参照）；メトトレキサート、ビンデシン、ドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセル、及びオルタタキセルなどのタキサン、トリコテセン、及びＣＣ１０６５を含む一つ以上の薬物とコンジュゲートしている。
その他の実施態様において、イムノコンジュゲートは、酵素的に活性な毒素又はその断片にコンジュゲートした、本明細書に記載の抗体を含み、限定されないが、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、（緑膿菌からの）外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）Ａ鎖、アルファ−サルシン、アレウリテス・フォーディ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、モモルディカ・チャランチア（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）インヒビター、クルシン（ｃｕｒｃｉｎ）、クロチン（ｃｒｏｔｉｎ）、サパオナリア・オフィシナリス（ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｉｃｉｎａｌｉｓ）インヒビター、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）及びトリコテセン（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅ）が含まれる。
その他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、放射性コンジュゲートを形成するために放射性原子にコンジュゲートした本明細書に記載されるような抗体を含む。様々な放射性同位体が放射性コンジュゲートの生産のために入手可能である。例としては、Ａｔ２１１，Ｉ１３１，Ｉ１２５，Ｙ９０，Ｒｅ１８６，Ｒｅ１８８，Ｓｍ１５３，Ｂｉ２１２，Ｐ３２，Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体を含む。検出のためにコンジュゲートを使用する場合は、それはシンチグラフィー試験のための放射性原子、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、又は核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像化（磁気共鳴画像化ｍｒｉとしても知られている）のためのスピン標識、例えば再び、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含んでよい。
抗体と細胞傷害性薬物のコンジュゲートは、様々な二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの２官能性誘導体（例えばジメチルアジピミデートＨＣｌ）、活性エステル（例えばジスクシンイミジルズベレート）、アルデヒド（例えばグルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えばビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビスジアゾニウム誘導体（例えばビス（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えばトルエン２，６−ジイソシアネート）及びビス活性フッ素化合物（例えば１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）など、を使って作成され得る。Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)に記載されるように、例えば、リシンイムノトキシンを調製することができる。カーボン−１４−標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体へのコンジュゲーションのためのキレート剤の例である国際公開第９４／１１０２６号を参照。リンカーは、細胞中に細胞毒性薬物の放出を容易にする「切断可能なリンカー」であり得る。例えば、酸に不安定なリンカー、ペプチダーゼ過敏性リンカー、光解離性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカー(Chari et al., Cancer Res. 52:127-131 (1992)；米国特許第５，２０８，０２０号）が使用され得る。
本明細書において、イムノコンジュゲート又はＡＤＣは、限定されないが、市販の（例えばＰｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ．，Ｕ．Ｓ．Ａからの）、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣ、及びスルホ−ＳＭＰＢ、ＳＶＳＢ（スクシンイミジル（４−ビニルスルホン）ベンゾエート）を含むクロスリンカー試薬を用いて調製されるコンジュゲートを特に熟考する。
アウリスタチンとドラスタチンを含むイムノコンジュゲート
幾つかの実施態様において、イムノコンジュゲートは、ドラスタチン又はドラスタチンペプチドアナログ又は、誘導体、例えばアウリスタチンにコンジュゲートした本発明の抗体を含む（米国特許第５６３５４８３号；第５７８０５８８号）。ドラスタチン及びアウリスタチンは、微小管動態、ＧＴＰの加水分解、及び核及び細胞分裂を妨害することが示されており（Woyke et al (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12):3580-3584)、かつ抗癌（米国特許第５６６３１４９号）及び抗真菌活性(Pettit et al (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965)を有する。ドラスタチン又はオーリスタチン薬剤部分は、ペプチド性薬剤部分のＮ（アミノ）末端又はＣ（カルボキシル）末端を介して抗体に結合することができる（国際公開第０２／０８８１７２号）。
典型的なアウリスタチンの実施形態は、Ｎ末端結合モノメチルオーリスタチン薬剤部分のＤＥとＤＦを含む。米国特許第７，６５９，２４１号、第７，４９８，２９８号及び同第７，７４５，３９４号を参照。
ペプチド性薬剤部分は以下の式ＤＥ及びＤＦから選択され得る。
ここで、ＤＥ及びＤＦの波線は、抗体又は抗体−リンカー成分に対する共有結合性付着部位を示す。
Ｒ２は、Ｈ及びＣ１−Ｃ８アルキルから選択される；
Ｒ３は、Ｈ，Ｃ１−Ｃ８アルキル，Ｃ３−Ｃ８炭素環，アリール，Ｃ１−Ｃ８アルキル−アリール，Ｃ１−Ｃ８アルキル−（Ｃ３−Ｃ８炭素環），Ｃ３−Ｃ８複素環及びＣ１−Ｃ８アルキル−（Ｃ３−Ｃ８複素環）から選択される；
Ｒ４は、Ｈ，Ｃ１−Ｃ８アルキル，Ｃ３−Ｃ８炭素環，アリール，Ｃ１−Ｃ８アルキル−アリール，Ｃ１−Ｃ８アルキル−（Ｃ３−Ｃ８炭素環），Ｃ３−Ｃ８複素環及びＣ１−Ｃ８アルキル−（Ｃ３−Ｃ８複素環）から選択される；
Ｒ５は、Ｈ及び、メチルから選択される；
又はＲ４とＲ５は、一緒に環状炭素を形成し、式（ＣＲａＲｂ）ｎ−を有し、ここでＲａとＲｂはＨ，Ｃ１−Ｃ８アルキル及びＣ３−Ｃ８炭素環から独立に選択され、ｎは２，３，４，５及び６から選択される。
Ｒ６は、Ｈ及びＣ１−Ｃ８アルキルから選択される；
Ｒ７は、Ｈ，Ｃ１−Ｃ８アルキル，Ｃ３−Ｃ８炭素環，アリール，Ｃ１−Ｃ８アルキル−アリール，Ｃ１−Ｃ８アルキル−（Ｃ３−Ｃ８炭素環），Ｃ３−Ｃ８複素環及びＣ１−Ｃ８アルキル−（Ｃ３−Ｃ８複素環）から選択される；
各Ｒ８は、Ｈ，ＯＨ，Ｃ１−Ｃ８アルキル，Ｃ３−Ｃ８炭素環及びＯ−（Ｃ１−Ｃ８アルキル）から独立に選択される；
Ｒ９は、Ｈ及びＣ１−Ｃ８アルキルから選択される；
Ｒ１０ はアリール又はＣ３−Ｃ８複素環から選択される；
Ｚは、Ｏ，Ｓ，ＮＨ，又はＮＲ１２であり、Ｒ１２はＣ１−Ｃ８アルキルである；
Ｒ１１はＨ，Ｃ１−Ｃ２０アルキル，アリール，Ｃ３−Ｃ８複素環，−（Ｒ１３Ｏ）ｍ−Ｒ１４，又は−（Ｒ１３Ｏ）ｍ−ＣＨ（Ｒ１５）２から選択される；
ｍは１から１０００の範囲の整数である；
Ｒ１３は、Ｃ２−Ｃ８アルキルである；
Ｒ１４は、Ｈ又はＣ１−Ｃ８アルキルから選択される；
Ｒ１５の各出現は、独立に、Ｈ，ＣＯＯＨ，−（ＣＨ２）ｎ−Ｎ（Ｒ１６）２，−（ＣＨ２）ｎ−ＳＯ３Ｈ，又は−（ＣＨ２）ｎ−ＳＯ３−Ｃ１−Ｃ８アルキルである；
Ｒ１６ の各出現は、独立にＨ，Ｃ１−Ｃ８アルキル，又は−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨである；
Ｒ１８は−Ｃ（Ｒ８）２−Ｃ（Ｒ８）２−アリール，−Ｃ（Ｒ８）２−Ｃ（Ｒ８）２−（Ｃ３−Ｃ８複素環），及び−Ｃ（Ｒ８）２−Ｃ（Ｒ８）２−（Ｃ３−Ｃ８炭素環）から選択され；及び
ｎは０から６の範囲の整数である。
一実施態様において、Ｒ３，Ｒ４及びＲ７は独立にイソプロピル又はｓｅｃ−ブチルであり、Ｒ５は−Ｈ又はメチルである。典型的な実施態様において、Ｒ３及びＲ４は各々イソプロピルであり、Ｒ５は−Ｈであり，及びＲ７はｓｅｃ−ブチルである。
更に別の実施態様において、Ｒ２及びＲ６は各々メチルであり，及びＲ９は−Ｈである。
更に別の実施態様において、Ｒ８の各出現は−ＯＣＨ３である。
典型的な実施態様において、Ｒ３及びＲ４は各々イソプロピルでありｌ，Ｒ２及びＲ６は各々メチルであり、Ｒ５は−Ｈであり、，Ｒ７はｓｅｃ−ブチルであり，Ｒ８の各出現は−ＯＣＨ３であり、及びＲ９は−Ｈである。
一実施態様において、Ｚは−Ｏ−又は−ＮＨ−である。
一実施態様において、Ｒ１０はアリールである。
典型的な実施態様において、Ｒ１０はフェニルである。
典型的な実施態様において、Ｚは−Ｏ−であり，Ｒ１１は−Ｈ，メチル又はｔ−ブチルである。
一実施態様において、Ｚは−ＮＨであり，Ｒ１１は−ＣＨ（Ｒ１５）２，であり、ここでＲ１５は−（ＣＨ２）ｎ−Ｎ（Ｒ１６）２であり、及びＲ１６は−Ｃ１−Ｃ８アリール又は−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨである。
別の実施態様において、Ｚは−ＮＨであり，Ｒ１１は−ＣＨ（Ｒ１５）２であり、ここでＲ１５は−（ＣＨ２）ｎ−ＳＯ３Ｈである。
式ＤＥの典型的なアウリスタチンの実施態様はＭＭＡＥ（モノメチルアウリスタチンＥ）であり、ここで波線は抗体−薬物コンジュゲートのリンカーへの共有結合性付着を示す：
式ＤＦの典型的なアウリスタチンの実施態様はＭＭＡＦ（モノメチルアウリスタチンＦ、アウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）の変異体で薬物のＣ末端にフェニルアラニンを持つ）であり、ここで波線は抗体−薬物コンジュゲートのリンカーへの共有結合性付着を示す（例えば、米国特許出願公開第２００５／０２３８６４９号及びDoronina et al. (2006) Bioconjugate Chem. 17:114-124を参照）：
一態様において、限定されないが、上記のようなトリエチレングリコールエステル（ＴＥＧ）を含む親水性基は、Ｒ１１において薬物部分に結合することができる。任意の特定の理論に拘束されることなく、親水性基は、薬物部分の内在化と非凝集を助ける。
アウリスタチン／ドラスタチン又はその誘導体を含む、ＡＤＣの例示的な実施態様は、米国特許出願公開第２００５／０２３８６４９ Ａ１号及びDoronina et al. (2006) Bioconjugate Chem. 17:114-124に記載されており、それは明示的に参照により本明細書に組み込まれる。ＭＭＡＥ又はＭＭＡＦ及び様々なリンカー成分を含む、ＡＤＣの例示的な実施態様は以下の構造を有し（ここで「Ａｂ」は抗体であり；ｐは薬物負荷（抗体あたりの薬物部分の平均数）であり約１から約８の範囲であり；「ｖｃ」は「ｖａｌ−ｃｉｔ」、即ちバリン−シトルリンジペプチドであり、及び「Ｓ」は硫黄原子である：
ＭＭＡＦ及び様々なリンカー成分を含むＡＤＣの典型的な実施態様は、Ａｂ−ＭＣ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦ及びＡｂ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦを含む。興味深いことに、タンパク質分解的に切断可能ではないリンカーによって抗体に結合したＭＭＡＦを含むイムノコンジュゲートは、タンパク質分解切断可能なリンカーによって抗体に結合したＭＭＡＦを含むイムノコンジュゲートと同等の活性を有することが示されている。Doronina et al. (2006) Bioconjugate Chem. 17:114-124を参照。このような場合、薬物放出は、細胞内での抗体の分解によってもたらされると考えられる。Ｉｄ．
典型的には、ペプチド系薬物部分は、２つ以上のアミノ酸及び／又はペプチド断片の間のペプチド結合を形成することにより調製することができる。そのようなペプチド結合は、例えば、ペプチド化学の分野で周知である液相合成法（E. Schroeder and K. Luebke, “The Peptides", volume 1, pp 76-136, 1965, Academic Pressを参照）により、調製することができる。アウリスタチン／ドラスタチン薬物部分は、米国特許出願公開第２００５／０２３８６４９ Ａ１号；米国特許第５６３５４８３号；米国特許第５７８０５８８号；Pettit et al (1989) J. Am. Chem. Soc. 111:5463-5465; Pettit et al (1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243-277; Pettit, G.R., et al. Synthesis, 1996, 719-725; Pettit et al (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 5:859-863; 及びDoronina (2003) Nat. Biotechnol. 21(7):778-784の方法に従って調製することができる。
特に、式ＤＦのアウリスタチン／ドラスタチン薬物部分、例えばＭＭＡＦ及びその誘導体は、米国特許出願公開第２００５／０２３８６４９ Ａ１号及びDoronina et al. (2006) Bioconjugate Chem. 17:114-124に記載される方法を用いて調製され得る。式ＤＥのアウリスタチン／ドラスタチン薬物部分、例えばＭＭＡＦは、Doronina et al. (2003) Nat. Biotech. 21:778-784に記載される方法を用いて調製され得る。薬物−リンカー部分のＭＣ−ＭＭＡＦ，ＭＣ−ＭＭＡＥ，ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦ，及びＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥは、簡便に常法により、例えば、Ｄoronina et al. (2003) Nat. Biotech. 21:778-784、及び米国特許出願公開第２００５／０２３８６４９ Ａ１号に記載されるように合成することができ、次いで目的の抗体にコンジュゲートされる。
Ｅ．診断及び検出のための方法および組成物
ある実施態様において、本明細書で提供される抗メソテリン抗体の何れかは、生物学的サンプル中のメソテリンの存在を検出するのに有用である。本明細書で使用する「検出」という用語は、定量的または定性的検出を包含する。「生物学的サンプル」は、例えば細胞又は組織（例えば、癌または潜在的癌性の膵臓、卵巣、肺、または子宮内膜組織、または中皮腫を含む生検材料）又は血清を含む。
一実施態様において、診断又は検出の方法に使用される抗メソテリン抗体が提供される。更なる態様において、生物学的サンプル中のメソテリンの存在を検出する方法が提供される。ある実施態様において、本方法は、抗メソテリン抗体のメソテリンへの結合を許容する条件下で、本明細書に記載のように抗メソテリン抗体と生物学的サンプルを接触させること、及び生物学的サンプル中で複合体が抗メソテリン抗体とメソテリンとの間に形成されているかどうかを検出することを含む。そのような方法は、インビトロ又はインビボでの方法であり得る。一実施態様において、例えばメソテリンが患者の選択のためのバイオマーカーであるなど、抗メソテリン抗体が抗メソテリン抗体による治療に適格な被検体を選択するために使用される。更なる実施態様において、生物学的サンプルは血清であり、例えば癌細胞から血清中へ脱落したメソテリンが検出される。
更なる実施態様において、例えば、癌を診断し、予後予測し、又は病期を分類し、治療の適切なコースを決定し、又は治療に対する癌の応答をモニタリングすることを目的として、例えばインビボでのイメージングにより、被験体のメソテリン陽性癌を検出するために、抗メソテリン抗体がインビボで使用される。インビボでの検出のために当該技術分野で知られた一方法は、例えばvan Dongen et al., The Oncologist 12:1379-1389 (2007) and Verel et al., J. Nucl. Med. 44:1271-1281 (2003)に記載される免疫陽電子放出断層撮影（イムノＰＥＴ）である。そのような実施態様において、被験体においてメソテリン陽性癌を検出する方法が提供され、該方法は標識された抗メソテリン抗体を、メソテリン陽性癌を有するか又は有することが疑われる被験体に投与することを含み、そして被験体において標識された抗メソテリン抗体を検出し、ここでは標識された抗メソテリン抗体の検出は被験体におけるメソテリン陽性癌を示す。そのような実施態様において、標識された抗メソテリン抗体は、例えば６８Ｇａ，１８Ｆ，６４Ｃｕ，８６Ｙ，７６Ｂｒ，８９Ｚｒ，及び１２４Ｉなどの陽電子放出体にコンジュゲートした抗メソテリン抗体を含む。特定の実施態様において、陽電子放射体は８９Ｚｒである。
更なる実施態様において、診断又は検出の方法は、基板（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）に固定した第一の抗メソテリン抗体を、メソテリンの存在について試験されるべき生物学的サンプルと接触させ、該基板を第二の抗メソテリン抗体に曝露し、生物学的サンプル中で第二の抗メソテリンが、第一の抗メソテリン抗体とメソテリンの間の複合体に結合するかどうかを検出することを含む。基板は、任意の支える媒体、例えば、ガラス、金属、セラミック、ポリマービーズ、スライド、チップ、および他の基板であってもよい。ある実施態様において、生物学的サンプルは細胞又は組織（例えば、癌または潜在的癌性の膵臓、卵巣、肺、または子宮内膜組織、または中皮腫を含む生検材料）又は血清、即ちメソテリンが脱落した血清を含む。ある実施態様において、第一又は第二の抗メソテリン抗体は、本明細書に記載される抗体の何れかである。そのような実施態様において、第二の抗メソテリン抗体は、本明細書に記載される１９Ｃ３又は１９Ｃ３から由来する抗体であり得る。
上記実施態様の何れかに従って診断され又は検出され得る典型的な疾患は、メソテリン陽性膵臓癌（膵管腺癌を含む）、メソテリン陽性の卵巣癌（卵巣漿液腺癌を含む）、メソテリン陽性肺癌（非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を含む）、中皮腫、及びメソテリン陽性子宮内膜癌などのメソテリン陽性癌が含まれる。一実施態様において、メソテリン陽性癌は、「０」より大きい抗メソテリン免疫組織化学法（ＩＨＣ）スコアを受ける癌であり、それは本明細書の実施例Ｊに記載される条件下で、腫瘍細胞の９０％超において非常に弱い染色又は無染色に対応する。別の実施態様において、メソテリン陽性癌は、本明細書の実施例Ｊに記載される条件下で定められる場合、メソテリンを１＋、２＋、又は３＋のレベルでメソテリンを発現する。上記実施態様の何れかに係るメソテリン陽性癌は、二重陽性癌であり得る。
ある実施態様において、標識された抗メソテリン抗体が提供される。標識は、限定されるものではないが、（例えば、蛍光標識、発色団標識、高電子密度標識、化学発光標識、放射性標識など）直接検出される標識又は部分、並びに、例えば、酵素反応又は分子間相互作用を介して間接的に検出される酵素又はリガンドのような部分が含まれる。典型的な標識は、限定されないが、ラジオアイソトープ３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、及び１３１Ｉ、フルオロフォア、例えば希土類キレート又はフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシェフェラーゼ、例えばホタルルシェフェラーゼ及び細菌ルシェフェラーゼ（米国特許第４７３７４５６号）、ルシェフェリン、２，３−ジヒドロフタルジネジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖オキシダーゼ、例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘテロサイクリックオキシダーゼ、例えばウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ、色素前駆体を酸化する過酸化水素を利用する酵素、例えばＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼ、又はマイクロペルオキシダーゼと共役したもの、ビオチン／アビジン、スピンラベル、バクテリオファージラベル、安定な遊離ラジカルなどが含まれる。別の実施態様において、標識は陽電子放射体である。陽電子放出体は、限定されないが、６８Ｇａ，１８Ｆ，６４Ｃｕ，８６Ｙ，７６Ｂｒ，８９Ｚｒ，及び１２４Ｉを含む。特定の実施態様において、陽電子放射体は８９Ｚｒである。
Ｆ．薬学的製剤
本明細書に記載の抗メソテリン抗体又はイムノコンジュゲートの薬学的処方物は、所望の程度の純度を有するその抗体又はイムノコンジュゲートと任意の薬学的に許容される担体（Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed.: Williams and Wilkins PA, USA (1980))とを、凍結乾燥製剤または水性溶液の形態で混合することによって調製される。薬学的に許容される担体は、使用される投薬量および濃度でレシピエントに毒性でなく、そしてこれには、限定しないが、リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸のような緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチオルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルまたはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリジン；マンノサッカライド、ジサッカライド、およびグルコース、マンノースまたはデキストリンを含む他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム、金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤が挙げられる。本明細書における典型的な薬学的に許容される担体は、介在性薬物分散剤、例えば、水溶性の中性アクティブヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）などのヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質を更に含む。所定の典型的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用法は、ｒＨｕＰＨ２０を含み、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号及び第２００６／０１０４９６８に開示されている。一態様において、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼなどの１つまたは複数の追加のグルコサミノグリカンと組み合わされる。
典型的な凍結乾燥抗体又はイムノコンジュゲート製剤は、米国特許第６２６７９５８号に記載されている。水性の抗体製剤又イムノコンジュゲート製剤は、米国特許第６１７１５８６号及び国際公開第２００６／０４４９０８号に記載されているものが含まれ、後者の製剤はヒスチジン−酢酸緩衝液を含む。
本明細書の製剤はまた、治療を受けている特定の徴候のために必要な一以上の活性成分、好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものが含まれる場合がある。例えば、例えばメソテリン陽性膵臓癌（膵臓腺癌）などのメソテリン陽性癌の治療のために、ゲムシタビンを更に提供することが望まれ得る。別の実施例において、例えば、メソテリン陽性卵巣癌（卵巣漿液腺）又は二重陽性卵巣癌などのメソテリン陽性癌又は二重陽性癌の治療のために、細胞傷害性薬物にコンジュゲートした抗ＭＵＣ１６抗体を更に提供することが望まれ得る。このような活性成分は、意図した目的のために有効な量で組み合わされ適切に存在する。
活性成分は、例えば、コアセルベーション技術又は界面重合法によって、例えばヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ（メチルメタクリレート（ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｙｌａｔｅ））マイクロカプセルのそれぞれによって、コロイド薬物送達系（例えばリポソーム、アルブミンミクロスフィア、ミクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）又はマクロ・エマルジョンなどの調製されたマイクロカプセルに封入されてもよい。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に開示される。
徐放性製剤が調製されてもよい。徐放性製剤の好適な例は、抗体又はイムノコンジュゲートを含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、そのマトリックスが成形品、例えばフィルムまたはマイクロカプセルの形をしている。
インビボ投与に使用される製剤は、一般的に無菌である。無菌性は、例えば、滅菌濾過膜を通して濾過することにより、達成することができる。
Ｇ．治療的方法及び組成物
本明細書で提供される抗メソテリン抗体又はイムノコンジュゲートのいずれかを、例えば治療方法などの方法で使用することができる。
一態様において、本明細書において提供される抗メソテリン抗体又はイムノコンジュゲートが、メソテリン陽性細胞の増殖を阻害する方法において使用され、該方法は、細胞の表面上でメソテリンに対する抗メソテリン抗体又はイムノコンジュゲートの結合を許容する条件下で、細胞を抗メソテリン抗体又はイムノコンジュゲートに曝露することを含み、それにより細胞の増殖を阻害することを含む。ある実施態様において、方法はインビトロ又はインビボの方法である。更なる実施態様において、細胞は、膵臓、卵巣、肺、中皮腫、又は子宮内膜の細胞である。更なる実施態様において、細胞は、二重陽性細胞である。
インビトロにおける細胞増殖の阻害は、プロメガ社（ウィスコンシン州マディソン）から市販されている、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−ＧｌｏＴＭ発光細胞生存率アッセイを使用してアッセイされ得る。そのアッセイは、代謝活性細胞の指標である存在するＡＴＰの定量に基づき、培養液中で生存細胞の数を決定する。See Crouch et al. (1993) J. Immunol. Meth. 160:81-88、米国特許第６６０２６７７号、Crouch et al (1993) J. Immunol. Meth. 160:81-88，米国特許第６６０２６７７号を参照。アッセイは、自動化ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）に適するように、９６穴形式又は３８４穴形式で行うことができる。Cree et al. (1995) AntiCancer Drugs 6:398-404.Cree et al (1995) AntiCancer Drugs 6:398-404を参照。アッセイ法では、直接培養細胞に単一試薬（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）試薬）を追加することを含む。これにより、細胞溶解とルシフェラーゼ反応により生成した発光シグナルの生成を生じる。発光シグナルは、培養中に存在する生存細胞の数に直接的に比例しているＡＴＰの存在量に比例する。データは、ルミノメーター又はＣＣＤカメラ撮像装置により記録することができる。発光出力は相対光単位（ＲＬＵ）として表される。
別の態様では、医薬として使用するための抗メソテリン抗体が提供される。更なる態様において、治療の方法に使用される抗メソテリン抗体が提供される。ある実施態様において、メソテリン陽性癌の治療の方法に使用される抗メソテリン抗体又はイムノコンジュゲートが提供される。ある実施態様において、本発明は、メソテリン陽性癌を有する個体を治療する方法における使用のための抗メソテリン抗体又はイムノコンジュゲートを提供し、該方法は個体に抗メソテリン抗体又はイムノコンジュゲートの有効量を投与することを含む。一つのそのような実施態様において、本方法は、例えば後述するように、少なくとも１つの付加的治療薬の有効量を個体に投与することを更に含む。
更なる態様にて、本発明は、医薬の製造又は調製における抗メソテリン抗体又はイムノコンジュゲートの使用を提供する。一実施態様において、本医薬はメソテリン陽性癌の治療のためのものである。更なる実施態様において、本医薬は、メソテリン陽性癌を治療する方法で使用するためのものであり、該方法はメソテリン陽性癌を有する個体に、医薬の有効量を投与することを含む。一つのそのような実施態様において、本方法は、例えば後述するように、少なくとも１つの付加的治療薬の有効量を個体に投与することを更に含む。
更なる態様にて、本発明は、メソテリン陽性癌を治療する方法を提供する。一実施態様において、本方法は、そうしたメソテリン陽性癌を有する個体に、抗メソテリン陽性抗体又はイムノコンジュゲートの有効量を投与することを含む。一つのそのような実施態様において、この方法は、後述するように、少なくとも１つのさらなる治療剤の有効量を個体に投与することを更に含む。
上記実施態様の何れかに従うメソテリン陽性癌は、例えば、メソテリン陽性膵臓癌（膵管腺癌を含む）、メソテリン陽性の卵巣癌（卵巣漿液腺癌を含む）、メソテリン陽性肺癌（非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を含む）、中皮腫、及びメソテリン陽性子宮内膜癌などのメソテリン陽性癌であり得る。一実施態様において、メソテリン陽性癌は、「０」より大きい抗メソテリン免疫組織化学法（ＩＨＣ）スコアを受ける癌であり、それは本明細書の実施例Ｊに記載される条件下で、腫瘍細胞の９０％超において非常に弱い染色又は無染色に対応する。別の実施態様において、メソテリン陽性癌は、本明細書の実施例Ｊに記載される条件下で定められる場合、メソテリンを１＋、２＋、又は３＋のレベルでメソテリンを発現する。上記実施態様の何れかに係るメソテリン陽性癌は、二重陽性癌であり得る。
上記実施態様の何れかに記載の「個体」は、ヒトであり得る。
更なる態様において、本発明は、例えば、上記の治療法のいずれかに使用される、本明細書で提供される抗メソテリン抗体又はイムノコンジュゲートのいずれかを含む薬学的製剤を提供する。一実施態様において、薬学的製剤は、本明細書で提供される抗メソテリン抗体又はイムノコンジュゲートいずれか、及び薬学的に許容される担体を含む。その他の実施態様において、薬学的製剤は、本明細書で提供される抗メソテリン抗体又はイムノコンジュゲートのいずれかと、少なくとも１つの更なる治療剤を、例えば後述するように含む。
本発明の抗体又はイムノコンジュゲートは、治療において、単独で、または他の薬剤と組み合わせて使用することができる。例えば、本発明の抗体又はイムノコンジュゲートは少なくとも１つの更なる治療剤と同時投与され得る。所定の実施態様において、更なる治療薬はゲムシタビンである。ある実施態様において、付加的治療薬は、細胞傷害性薬物に結合した抗ＭＵＣ１６抗体である。
上記のこうした併用療法は、併用投与（２つ以上の治療剤が、同一または別々の製剤に含まれている）、及び、本発明の抗体又はイムノコンジュゲートの投与が、追加の治療剤及び／又はアジュバントの投与の前、同時、及び／又はその後に起きうる分離投与を包含する。本発明の抗体又はイムノコンジュゲートはまた放射線治療と併用して用いることができる。
本発明の抗体又はイムノコンジュゲート（および任意の追加の治療剤）は、任意の適切な手段によって投与することができ、経口、肺内、および鼻腔内、及び局所治療が所望される場合、病巣内投与が含まれる。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下投与が含まれる。投薬は、その投与が短期間か又は長期であるかどうかに部分的に依存し、任意の適切な経路、例えば、静脈内または皮下注射などの注射により行うことができる。限定されないが、様々な時間点にわたる、単一または複数回投与、ボーラス投与、パルス注入を含む様々な投与スケジュールが本明細書で考えられている。
本発明の抗体又はイムノコンジュゲートは良好な医療行為に合致した方法で処方され、投与され、投薬される。この観点において考慮すべき要因は、治療すべき特定の障害、治療すべき特定の哺乳類、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤送達部位、投与方法、投与日程及び医療従事者が知る他の要因を包含する。抗体又はイムノコンジュゲートは、必要ではないが任意で、問題となる障害の予防又は治療のために、現在使用中の一又は複数の薬剤ともに処方される。そのような他の薬剤の有効量は製剤中に存在する抗体又はイムノコンジュゲートの量、障害又は治療の種類及び上記した他の要因に依存する。これらは一般的には本明細書に記載されるのと同じ用量及び投与経路において、又は、本明細書に記載された用量の１％から９９％で、又は経験的に／臨床的に妥当であると決定された任意の用量及び任意の経路により使用される。
疾患の予防又は治療のためには、本発明の抗体又はイムノコンジュゲートの適切な用量（単独で使用されるか、又は、一以上の更なる治療的薬剤との組み合わされる場合）は治療すべき疾患の種類、抗体の種類、疾患の重症度及び経過、抗体を予防又は治療目的のいずれにおいて投与するか、以前の治療、患者の臨床的履歴及び抗体に対する応答性、及び担当医の判断に依存する。抗体又はイムノコンジュゲートは、患者に対して、単回、又は一連の治療にわたって適切に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、例えば一回以上の別個の投与によるか、連続注入によるかに関わらず、抗体又はイムノコンジュゲートの約１μｇ／ｋｇから１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇ）が患者への投与のための初期候補用量となり得る。１つの典型的な一日当たり用量は上記した要因に応じて約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の範囲である。数日間以上に渡る反復投与の場合には、状態に応じて、治療は疾患症状の望まれる抑制が起こるまで持続するであろう。１つの例示される抗体又はイムノコンジュゲートの用量は約０．０５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。従って、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの１つ以上の用量（又はこれらの何れかの組み合わせ）を患者に投与してよい。このような用量は断続的に、例えば毎週又は３週毎（例えば患者が約２から約２０、例えば抗体の約６投与量を受けるように）投与してよい。初期の高負荷用量の後、１つ以上の低用量を投与してよい。しかしながら、他の用量用法も使用してよい。この治療法の進行は従来の手法及び試験により容易にモニタリングされる。
上記の製剤または治療方法の任意のものが、本発明のイムノコンジュゲート及び抗メソテリン抗体の両方を用いて実施され得ることが理解される。
Ｈ．製造品
本発明の他の実施態様において、上述した障害の治療、予防、及び／又は診断に有用な物質を含む製造品が提供される。製造品は、容器とラベルまたは容器上にあるまたは容器に付属するパッケージ挿入物を含む。好適な容器は、例としてボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ輸液バッグ等を含む。容器はガラス又はプラスチックなどの様々な物質から形成されうる。容器は、疾患の治療、予防、及び／又は診断に有効である、それ自体か、又はその他の組成物と併用される化合物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は皮下注射針による穴あきストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってよい）。組成物中の少なくとも一の活性剤は本発明の抗体又はイムノコンジュゲートである。ラベルまたはパッケージ挿入物は、組成物が特定の症状の治療のために使用されることを示している。更に、製造品は、（ａ）組成物が本発明の抗体又はイムノコンジュゲートを包含する組成物を含む第一の容器；および（ｂ）組成物が更なる細胞障害性又はその他の治療的薬剤を包含する組成物を含む第２の容器を含み得る。本発明の本実施態様における製造品は、組成物が特定の疾患を治療することに用いることができることを示すパッケージ挿入物をさらに含んでいてもよい。別法として、または加えて、製造品は、薬学的に許容されるバッファー、例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝化塩水、リンガー溶液又はデキストロース溶液を含む第二（または第三）の容器をさらに含んでもよい。これは、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、およびシリンジを含む、商業的およびユーザーの立場から望まれる他の物質のさらに含んでもよい。
Ｉ．生物材料の寄託
以下の生物学的材料が、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、１０８０１ ユニバーシティブールバード、マナサス、バージニア州２０１１０−２２０９，米国（ＡＴＣＣ）に寄託されている：
上記に参照される寄託されたハイブリドーマは本明細書に言及される１９Ｃ抗体を産生する。
この寄託は、特許手続及びその規制（ブダペスト条約）の目的のために微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定の下で行われた。これは、寄託日から３０年間の寄託したサンプルの供給の最近の要求から少なくとも５年間、生存可能な培養の維持を保証する。本寄託はブダペスト条約の条項のもとでＡＴＣＣにより利用可能になり、ジェネンテック社とＡＴＣＣの間の合意に従い、寄託材料の公への利用可能性に関して寄託者により課された全ての制限は、関連する米国特許の承諾の際に取消不能の形で削除されることを保証し、関連する米国特許の発行の際、又は任意の米国又は外国特許出願の公に対する公開の際に、いずれか早い方の時点で、公に対しての寄託物の培養物の子孫の永続的かつ無制限な利用可能性を保証し、かつ３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§ １２２及びそれに準拠した米国特許商標庁長官の規則に従って（８８６ ＯＧ ６３８に特に関連して３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ．§ １．１４を含み）、権利を付与された米国特許商標庁長官により決定される者に対する子孫の利用可能性を保証する。
ＩＩＩ．実施例
以下は本発明の方法および組成物の例である。上記提供される一般的な説明を前提として、他の様々な実施態様が実施され得ることが理解される。
Ａ．ヒトメソテリン遺伝子発現
ヒトメソテリン遺伝子発現は遺伝子発現情報を含む専有データベースを使用して分析した（ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓ（登録商標），Ｇｅｎｅ Ｌｏｇｉｃ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）。ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓ（登録商標）データベースのグラフィカル解析をマイクロアレイプロファイルビューアを使用して行った。図２は、左に一覧される様々な組織におけるヒトメソテリン遺伝子発現のグラフィック表示である。グラフの上部のスケールは、ハイブリダイゼーションシグナル強度に基づく遺伝子発現レベルを示す。点が、各々のリストされた組織に隣接する線の上下両方に表示される。線の上に現れる点は正常組織における遺伝子発現を示し、線の下に現れる点は腫瘍及び疾患組織における遺伝子発現を示す。図２は、所定の腫瘍又は疾患組織において、それらの正常カウンターパートと比較したメソテリン遺伝子発現の増加を示す。特に、メソテリンは、腺癌と中皮腫を含む卵巣癌、膵臓癌、子宮内膜、肺腫瘍において実質的な過剰発現を示している。ヒトメソテリンの発現は、正常中皮（腹膜、心膜、及び胸膜）を除いて、正常組織に本質的に存在しない。
Ｂ．抗体生成
ヒトメソテリンに対するモノクローナル抗体は、以下の手順を使用して生成された。各々Ｎ末端ユニザイムＨｉｓ（ＨＱ）タグに融合している、ヒトＭＰＦメソテリン（配列番号４２のアミノ酸３４−５８０）又はヒトメソテリン（配列番号４２のアミノ酸２９６−５８０）の何れかが大腸菌５８Ｆ３で発現され、ＮｉーＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎ）で精製され、その後以前に記載の通り（Kirchhofer et al., 2003）２０ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ６．０ ６ＭのＧｄｎＨＣｌ中でセファデックス２００カラムでゲル濾過し、１ｍＭのＨＣｌ中でー８０℃での貯蔵用に透析した。
５匹のＢａｌｂ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ）が、Ｒｉｂｉアジュバント中で２μｇの２つの抗原混合物で６回過免疫した（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＯ）。２匹の最良のマウスが直接ＥＬＩＳＡにより高い抗体力価に基づいて選択され、それらのＢ細胞はプールされ、以前に記載されたものと類似した改変プロトコールを使用して、マウスミエローマ細胞（Ｘ６３．Ａｇ８．６５３；Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）により融合された。（Koehler and Milstein, 1975; Hongo et al., 1995）。１０〜１２日後に、上清をハイブリドーマから回収し、直接ＥＬＩＳＡにより両方の抗原に対する結合について（別個に）スクリーングした。適切にフォールドし、グリコシル化された、細胞表面に発現したメソテリンの認識を確かめるために、ＥＬＩＳＡ陽性上清がｇＤメソテリントランスフェクトＳＶＴ２細胞上で更にＦＡＣＳによりスクリーニングされた（ｇＤは、抗ｇＤ抗体とともに陽性コントロールとして使用されるＮ−末端エピトープタグである）。陽性ハイブリドーマが限定希釈により２回サブクローニングされ、１１がスケールアップされ、抗体がプロテインＡクロマトグラフィーにより精製された。
図３は、以下に更に詳述される特性と共に、単離されたモノクローナル抗体を示す。
Ｃ．７Ｄ９と２２Ａ１０のヒト化
モノクローナル抗体７Ｄ９と２２Ａ１０は以下に記載されるようにヒト化された。残基番号はKabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 5th Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)に従う。
１．７Ｄ９のヒト化
ａ）マウス７Ｄ９可変ドメインのクローニング
全ＲＮＡを、標準的な方法を用いてマウス７Ｄ９を産生するハイブリドーマ細胞から抽出した。可変軽鎖（ＶＬ）及び可変重鎖（ＶＨ）ドメインが、重鎖および軽鎖に対する縮重プライマーによりＲＴ−ＰＣＲを用いて増幅された。順方向プライマーは、ＶＬおよびＶＨ領域のＮ末端アミノ酸配列に特異的であった。それぞれ、ＬＣおよびＨＣ逆方向プライマーは、種を超えて高度に保存されている定常軽鎖（ＣＬ）及び定常重鎖ドメイン１（ＣＨ１）の領域にアニーリングするように設計された。挿入物のポリヌクレオチド配列は通常の配列決定法を使用して決定された。７Ｄ９のＶＬとＶＨアミノ酸配列は図４と５にそれぞれ示される。
ｂ）アクセプターヒトコンセンサスフレームワーク上への直接的超可変領域の移植
７Ｄ９のヒト化の最中に構築された変異体はＩｇＧの形態で評価された。マウス７Ｄ９由来のＶＬ及びＶＨドメインはヒトＶＬカッパＩ（ＶＬＫＩ）及びヒトＶＨサブグループＩＩＩ（ＶＨＩＩＩ）コンセンサス配列に整列された。マウス７Ｄ９（ｍｕ７Ｄ９）抗体からの超可変領域は７Ｄ９．ｖ１を生成するためにＶＬＫＩ及びＶＨＡＴＡアクセプターフレームワーク中へ設計された。アクセプターＶＨフレームワークＶＨＡＴＡは、３つの位置：Ｒ７１Ａ，Ｎ７３Ｔ，及びＬ７８ＡでＶＨＩＩＩと異なる(Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285 (1992))。７Ｄ９のＶＬドメインから、位置２４−３４（Ｌ１），５０−５６（Ｌ２）及び８９−９７（Ｌ３）がＶＬＫＩへ移植された。７Ｄ９のＶＨドメインから、位置２６−３５（Ｈ１），４９−６５（Ｈ２）及び９５−１０２（Ｈ３）がＶＬＡＴＡへ移植された（図１及び２）。ＣＤＲの定義は、それらの配列の超可変性（Wu, T. T. & Kabat, E. A. (1970)）、それらの構造上の位置（Chothia, C. & Lesk, A. M. (1987)）及び抗原−抗体接触におけるそれらの関与（MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)）により定義される位置を含む。
直接移植片、７Ｄ９．ｖ１は各超可変領域に対して別個のオリゴヌクレオチドを使用して、クンケル変異誘発により生成された。重鎖あるいは軽鎖のどちらかに対して３つのリン酸化オリゴヌクレオチドが、最終容積が４０μｌで、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ７．５，１０ｍＭ ＭｇＣｌ２中の５７１ｎｇのクンケルテンプレートに加えられた。混合物は９０℃で２分間、５０℃で５分間アニールされ、次いで氷上で冷却された。１０μｌのアニールされたテンプレートは、室温で２時間、０．５μｌの１００ｍＭのＡＴＰ，０．５μｌの２５ｍＭのｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰの各々２５ｍＭ），１μｌの１００ｍＭのＤＴＴ，１μｌの１０ＸＴＭバッファー（０．５ＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．５，０．１ＭのＭｇＣｌ２），８０Ｕ Ｔ４リガーゼ及び４Ｕ Ｔ７ポリメラーゼを加えることにより総容積が１３．６μｌに充填された。１０μｌの充填され連結された生成物は次いでＸＬ１−ブルー細胞中へ形質転換された（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）。正しいクローンがＤＮＡ配列決定により同定され、ＩｇＧとして発現された。
ｃ）変異体の評価
７Ｄ９変異体はＣＨＯ一過性導入によりＩｇＧとして発現された。ＩｇＧをプロテインＧアフィニティークロマトグラフィーで精製した。ヒトメソテリンの各７Ｄ９ ＩｇＧ変異体の親和性は、ＢＩＡｃｏｒｅＴＭ−２０００を使用して表面プラズモン共鳴によって決定された。Ｂｉａｃｏｒｅの研究品質等級ＣＭ５チップが、Ｂｉａｃｏｒｅからのアミンカップリングキットを使用して組換えヒトメソテリン由来の大腸菌のおよそ１１０ＲＵで固定された。各７Ｄ９変異体の段階的２倍希釈物（０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ中に０．４８８から１０００ｎＭ）が３０μｌ／分の流速で注入された。各サンプルは５分間の会合と３〜５分間の解離により解析された。各注入の後、チップは１０ｍＭのグリシンｐＨ１．７を使用して再生された。結合応答は、同様の密度で固定化された無関係のＩｇＧとともにフローセルからＲＵを差し引くことにより補正された。ｋｏｎとｋｏｆｆの同時フィッティングの１：１Ｌａｎｇｕｉｒモデルが動力学的解析に用いられた。
ｄ）結果
７Ｄ９のヒト化に使用されたヒトアクセプターフレームワークは、ヒトＶＬカッパＩコンセンサス（ＶＬＫＩ）及びアクセプターＶＨフレームワーク ＶＨＡＴＡに基づいており、それは３箇所：Ｒ７１Ａ，Ｎ７３Ｔ，及びＬ７８ＡでヒトＶＨサブグループＩＩＩコンセンサス（ＶＨＩＩＩ）とは異なる(Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285 (1992))。マウス７Ｄ９のＶＬおよびＶＨドメインがヒトＶＬＫＩ及びＶＨＩＩＩドメインと整列され；超可変領域が同定されてヒトアクセプターフレームワークへ移植され、７Ｄ９．ｖ１を生成した（図４及び５）。ＩｇＧとして、７Ｄ９．ｖ１の親和性は、Ｂｉａｃｏｒｅにより評価されると、ｍｕ７Ｄ９（キメラ７Ｄ９としてフォーマットされる）に比べて〜２倍減少する（図６）。
７Ｄ９．ｖ１の結合親和性を改善するために、軽鎖の位置３６と８７及び重鎖の位置４８、６７、６９、７１、７３、７５、７６、７８及び８０がｍｕ７Ｄ９におけるこれらの位置で見いだされる残基へ変更された。これらの変更された軽鎖と重鎖と７Ｄ９．ｖ１からの鎖との組み合わせがＣＨＯ中へトランスフェクトされ、ＩｇＧとして発現され、Ｂｉａｃｏｒｅによりヒトメソテリンに対する結合について評価された（図６）。
変異体７Ｄ９．ｖ２と７Ｄ９．ｖ３は、その両方が変更された軽鎖を含み、キメラ７Ｄ９に匹敵する親和性を有していた。変異体７Ｄ９．ｖ３は軽鎖の２つの位置で７Ｄ９．ｖ１と異なっている。どちらの変化もｍｕ７Ｄ９のそれに匹敵する結合を改善するには十分でなかった（図６）。
ヒト化７Ｄ９．ｖ３についての変更の概要６匹のマウス７Ｄ９のＣＤＲ（位置２４−３４（Ｌ１），５０−５６（Ｌ２）及び８９−９７（Ｌ３），２６−３５（Ｈ１），４９−６５（Ｈ２）及び９３−１０２（Ｈ３）として定義される）がヒトコンセンサスＶＬＫＩ及びＶＨＡＴＡアクセプタードメイン中へ移植された。２つの付加的なフレームワーク残基の、軽鎖の３６と８７が元のマウスの残基へ変えられ、ｍｕ７Ｄ９に対して匹敵する親和性を持つ７Ｄ９．ｖ３をもたらした。
２．２２Ａ１０のヒト化
ａ）マウス２２Ａ１０可変ドメインのクローニング
全ＲＮＡを、標準的な方法を用いてマウス２２Ａ１０を産生するハイブリドーマ細胞から抽出した。可変軽鎖（ＶＬ）及び可変重鎖（ＶＨ）ドメインが、重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）に対する縮重プライマーによりＲＴ−ＰＣＲを用いて増幅された。順方向プライマーは、ＶＬおよびＶＨ領域のＮ末端アミノ酸配列に特異的であった。それぞれ、ＬＣおよびＨＣ逆方向プライマーは、種を超えて高度に保存されている定常軽鎖（ＣＬ）及び定常重鎖ドメイン１（ＣＨ１）の領域にアニーリングするように設計された。挿入物のポリヌクレオチド配列は通常の配列決定法を使用して決定された。２２Ａ１０のＶＬとＶＨアミノ酸配列は図７と８にそれぞれ示される。
ｂ）アクセプターヒトコンセンサスフレームワーク上への直接的超可変領域の移植
２２Ａ１０のヒト化の最中に構築された変異体は、ＩｇＧの形態で評価され、又はファージ上にＦａｂとして一価で提示された。この作業に使用されたファージミドは一価のＦａｂ−ｇ３提示ベクターであり、単一のｐｈｏＡプロモーターの制御下で２つのオープンリーディングフレームからなる。第一のオープンリーディングフレームは、アクセプター軽鎖のＶＬとＣＨ１ドメインに融合したｓｔＩＩシグナル配列からなり、第二はアクセプター重鎖のＶＨとＣＨ１ドメインに融合したｓｔＩＩシグナル配列からなり、マイナーファージコートタンパク質Ｐ３が続く。
マウス２２Ａ１０由来のＶＬ及びＶＨドメインがヒトＶＬカッパＩ（ＶＬＫＩ）及びヒトＶＨサブグループＩＩＩ（ＶＨＩＩＩ）コンセンサス配列に整列された。マウス２２Ａ１０（ｍｕ２２Ａ１０）抗体からの超可変領域は２２Ａ１０移植片を生成するためにＶＬＫＩ及びＶＨＩＩＩアクセプターフレームワーク中へ設計された。２２Ａ１０のＶＬドメインから、位置２４−３４（Ｌ１），５０−５６（Ｌ２）及び８９−９７（Ｌ３）がＶＬＫＩへ移植された。２２Ａ１０のＶＨドメインから、位置２６−３５（Ｈ１），４９−６５（Ｈ２）及び９５−１０２（Ｈ３）がＶＬＩＩＩへ移植された（図７及び８）。ＣＤＲの定義は、それらの配列の超可変性（Wu, T. T. & Kabat, E. A. (1970)）、それらの構造上の位置（Chothia, C. & Lesk, A. M. (1987)）及び抗原−抗体接触におけるそれらの関与（MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)）により定義される位置を含む。
２２Ａ１０移植片は各超可変領域に対して別個のオリゴヌクレオチドを使用して、クンケル変異誘発により生成された。重鎖あるいは軽鎖のどちらかに対して３つのリン酸化オリゴヌクレオチドが、最終容積が４０μｌで、５０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．５，１０ｍＭのＭｇＣｌ２中の５７１ｎｇのクンケルテンプレートに加えられた。混合物は９０℃で２分間、５０℃で５分間アニールされ、次いで氷上で冷却された。１０μｌのアニールされたテンプレートは、室温で２時間、０．５μｌの１００ｍＭのＡＴＰ，０．５μｌの２５ｍＭのｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰの各々２５ｍＭ），１μｌの１００ｍＭのＤＴＴ，１μｌの１０ＸＴＭバッファー（０．５ＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．５，０．１ＭのＭｇＣｌ２），８０Ｕ Ｔ４リガーゼ及び４Ｕ Ｔ７ポリメラーゼを加えることにより総容積が１３．６μｌに充填された。１０μｌの充填され連結された生成物は次いでＸＬ１−ブルー細胞中へ形質転換された（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）。正しいクローンがＤＮＡ配列決定により同定され、ＩｇＧとして発現された。
ｃ）超可変領域のソフトランダム化
２２Ａ１０移植片はソフトランダム化の戦略を使用して親和性成熟された。配列の多様性は、毒性オリゴヌクレオチド合成戦略を用いて、マウス可変領域配列に向かうバイアスが維持されるように、各超可変領域に別々に導入した(Gallop et al., J Med Chem 37:1233-51 (1994))。多様化した各位置において、野生型アミノ酸をコードするコドンは各位置における平均５０％突然変異率をもたらすヌクレオチドの７０−１０−１０−１０混合物で毒されている。配列の多様性は、クンケル突然変異誘発を使用して２２Ａ１０移植片の超可変領域に導入され、別々にソートされた６つのソフト無作為化ファージライブラリーを生成した。６つのライブラリーが作成され、各々は単一のソフト無作為超可変領域から成る。
ｄ）ファージライブラリーの生成
各超可変領域に多様性を導入するように設計されたオリゴヌクレオチドは、３７℃で１時間、６６０ｎｇのオリゴヌクレオチド、５０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．５，１０ｍＭのＭｇＣｌ２，１ｍＭのＡＴＰ，２０ｍＭのＤＴＴ、及び５Ｕポリヌクレオチドキナーゼを含有する２０μｌの反応物中に別々にリン酸化された。
各ライブラリーに対して、２μｌのリン酸化オリゴヌクレオチドが、最終容積が１０μｌで、５０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．５，１０ｍＭのＭｇＣｌ２中の３００ｎｇのクンケルテンプレートに加えられた。混合物は９０℃で２分間、５０℃で５分間アニールされ、次いで氷上で冷却された。アニールされたテンプレートは、室温で２時間、０．５μｌの１０ｍＭのＡＴＰ，０．５μｌの１０ｍＭのｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰの各々１０ｍＭ），１μｌの１００ｍＭのＤＴＴ，１μｌの１０ＸＴＭバッファー（０．５ＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．５，０．１ＭのＭｇＣｌ２），８０Ｕ Ｔ４リガーゼ及び４Ｕ Ｔ７ポリメラーゼを加えることにより総容積が２０μｌに充填された。次いで、これらの充填され連結された生成物は、各々ＸＬ１−ブルー細胞中に形質転換され、３７℃で２時間、５μｇの／ｍｌのテトラサイクリンとＭ１３／ＫＯ７ヘルパーファージ（ＭＯＩ１０）を含む０．５ｍｌの２ＹＴ中で増殖され、次いでプールされ５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含有する５００ｍｌの２ＹＴへ移され、３７℃で１６時間増殖された。
ｅ）ファージ選択
固体ファージセレクションにおいて、２９３由来のヒト又はカニクイザルメソテリンが、マキシソープマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）上の５０ｍＭの炭酸水素ナトリウムｐＨ９．６中において４℃で一晩固定化された。プレートをカゼインブロッカーを使用して少なくとも１時間ブロックした（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）。
ファージを培養上清から回収し、５％の粉ミルクと０．０５％のＴｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＢＴ）を含有するＰＢＳに懸濁した。ファージライブラリーを添加し、１時間インキュベートした後、マイクロタイターウェルを０．０５％のトゥイーン２０（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳで十分に洗浄し、結合したファージを、２０ｍＭのＨＣｌ、５００ｍＭのＫＣｌで３０分間ウェルをインキュベートすることにより溶出した。溶出したファージは、１ＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８を用いて中和し、ＸＬ１−ブルー細胞とＭ１３／ＫＯ７ヘルパーファージを使用して増幅し、２ＹＴ，５０μｇ／ｍｌのカルベニシリン中、３７℃で一晩増殖させた。標的を含有するウェルから溶出されたファージの力価を、濃縮度を評価するために、非標的物を含有するウェルから回収されたファージの力価と比較した。
溶液相ファージの選択については、２９３由来のヒト又はビオチン化カニクイザルのメソテリンが、５％粉ミルクおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＢＴ）を含むＰＢＳ中に懸濁させたファージに追加された。インキュベーション後に、ビオチン化メソテリンに結合したファージが、ストレプトアビジンでコートされたマイクロタイタープレート上にて５分間捕捉された。マイクロタイターウェルを０．０５％のトゥイーン２０（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳで十分に洗浄し、結合したファージを、２０ｍＭのＨＣｌ、５００ｍＭのＫＣｌで３０分間ウェルをインキュベートすることにより溶出した。溶出したファージは、１ＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８を用いて中和し、ＸＬ１−ブルー細胞とＭ１３／ＫＯ７ヘルパーファージを使用して増幅し、２ＹＴ，５０μｇ／ｍｌのカルベニシリン中、３７℃で一晩増殖させた。標的を含有するウェルから溶出されたファージの力価を、濃縮度を評価するために、非標的物を含有するウェルから回収されたファージの力価と比較した。
溶液相ファージの選択については、選択ストリンジェンシーを、溶液中で低下するビオチン化メソテリンの濃度に結合したファージを捕捉しその後１０分間ニュ−トラビジン上で捕捉すること（速度選択オン）、及び弱く結合したファージを洗い流すことができるように洗浄時間と温度を上昇させること（速度選択オフ）の両方により、徐々に増加させた(Fuh et al., J. Mol. Biol. 340:1073-1093 (2004))。
ｆ）ＩｇＧ産生
スクリーニング目的のために、ＩｇＧ変異体は最初に２９３細胞で産生された。ＶＬ及びＶＨ（２５μｇ）をコードするベクターをＦＵＧＥＮＥシステムを使用して２９３細胞にトランスフェクトした（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）。５００μｌのＦｕＧｅｎｅは、ＦＢＳを含有しない４．５ｍｌのＤＭＥＭ培地と混合され、室温で５分間インキュベートした。各鎖（２５μｇ）がこの混合物に対して添加され、室温で２０分間インキュベートし、次いで、５％のＣＯ２中３７℃で一晩のトランスフェクションのために、５本のＴ−１５０フラスコに移された。翌日、トランスフェクション混合物を含有する培地は除去され、０．１ｍｌ／Ｌの微量元素（Ａ０９３４）および１０ｍｇ／Ｌのインスリン（Ａ０９４０）を含む２３ｍｌのＰＳ０４培地で置換された。細胞を更に５日間インキュベートした後、培地を５分間の１０００ｒｐｍで回収し、０．２２μｍの低タンパク質結合フィルターを使用して滅菌濾過した。サンプルは、全ての１２５ｍｌ培地について２．５ｍｌの０．１％ＰＭＳＦを添加後に４℃で貯蔵することができた。ＩｇＧをプロテインＧアフィニティークロマトグラフィーで精製した。
ｇ）親和性決定
ヒト又はカニクイザルのメソテリンの２２Ａ１０ＩｇＧ変異体の親和性を、ＢＩＡｃｏｒｅＴＭ−２０００を使用して表面プラズモン共鳴によって決定した。Ｂｉａｃｏｒｅの研究品質等級ＣＭ５チップが、Ｂｉａｃｏｒｅからのアミンカップリングキットを使用して組換えヒト又はカニクイザルのメソテリン由来の大腸菌のおよそ１１０ＲＵで固定された。各２２Ａ１０変異体の段階的２倍希釈物（０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ中に０．４８８から１０００ｎＭ）が３０μｌ／分の流速で注入された。各サンプルは５分間の会合と３〜５分間の解離により解析された。各注入の後、チップは１０ｍＭのグリシンｐＨ１．７を使用して再生された。結合応答は、同様の密度で固定化された無関係のＩｇＧとともにフローセルからＲＵを差し引くことにより補正された。ｋｏｎとｋｏｆｆの同時フィッティングの１：１Ｌａｎｇｕｉｒモデルが動力学的解析に用いられた。
ｈ）結果
２２Ａ１０のヒト化のために使用したヒトアクセプターフレームワークはコンセンサスヒトカッパＩのＶＬドメイン及びコンセンサスヒトサブグループＩＩＩのＶＨドメインに基づいていた。ｍｕ２２Ａ１０のＶＬ及びＶＨドメインはヒトカッパＩ及びサブグループＩＩＩと整列され；各相補性決定領域（ＣＤＲ）が同定されてヒトアクセプターフレームワークへ移植され、ＩｇＧとして発現され得る又はファージ上にＦａｂとして呈示され得るＣＤＲグラフトを生成した（図７及び８）。
６つのソフトランダム化ライブラリが生成され、そこでは多様性が２２Ａ１０ ＣＤＲ移植片の各ＣＤＲに別々に導入された。ライブラリーが、ヒト及びカニクイザルのメソテリンに対して（２９３細胞由来、カニクイザル又はヒトメソテリンのグリコシル化形態への結合を改善する目的で）、固相及び溶液選別戦略の両方を使用してパンされた。非標識化標的の追加はより速い解離速度（ｏｆｆ ｒａｔｅｓ）を持つクローンを除去するために使用することができる一方で、溶液選別法はビオチン化標的濃度及びファージ捕捉時間の操作を通じて、高親和性クローンが選択されることを可能にする(Fuh et al. J. Mol. Biol. 340:1073-1093 (2004))。各ライブラリーの最後のラウンドからのクローンがＤＮＡ配列解析のために採取され、ＣＤＲ−Ｌ２及びＣＤＲ−Ｈ２を除いて各ＣＤＲで標的された配列の変化が明らかにされ、抗原結合を改善するための多くの可能なバ変形を示唆している。ヒト又はカニクイザルのどちらかのメソテリンで選択された幾つかのクローンは、ＣＤＲ−Ｈ２に変化があり、最も豊富なものは位置９９でチロシンからイソロイシンへの変化を有していた。この変異体は、幾つか他のと一緒に、ＩｇＧとして発現され、ビアコア及びキャッチャー解析によりメソテリンへの結合について特徴づけられた（図９Ａ）。いくつかのクローンは２２Ａ１０の移植片の親和性を超えていた。
ヒト化２２Ａ１０変異体が、安定的にメソテリンを発現する細胞株からメソテリンを免疫沈降するために使用された。異なる種のｇＤタグ付きメソテリンを安定的に発現するＢＪＡＢ細胞が、図９Ｂに示されるように、ヒト化２２Ａ１０変異体（Ｇｒ，移植片；ｖ１（１），ｖ１７（１７）及びｖ８３（８３））、又は比較のためにｈ７Ｄ９．ｖ３、ｈ５Ｂ６抗−ｇＤ又はｈＩｇＧ陰性コントロールと共に免疫沈降された。免疫沈降物が洗浄され、ｇＤ−メソテリンを検出するために、マウス抗−ｇＤ抗体でウエスタンブロットした。ｈ２２１０．ｖ８３は、３種のメソテリン全てを免疫沈降するその性能において最良のｈ２２Ａ１０変異体であった（カニクイザル、上；ヒト、中央；及びラット、下のブロット）。一番右のレーンは、全発現レベルの比較のために２０％の入力溶解物（免疫沈降せず）を示している。分子量マーカー（ｋＤａ）は左側に示されている。
ヒト化２２Ａ１０．ｖ８３についての変更の概要ヒトコンセンサスカッパＩのＶＬ及びサブグループＩＩＩのＶＨへの６つのマウス２２Ａ１０ ＣＤＲ（位置２４−３４（Ｌ１），５０−５６（Ｌ２），８９−９７（Ｌ３），２６−３５（Ｈ１），４９−６５（Ｈ２）及び９５−１０２（Ｈ３）として定義される）の移植片から開始して、ＣＤＲソフト無作為化が、ヒト及びカニクイザルのメソテリンへの結合を改善するＣＤＲ Ｈ３（Ｙ９９Ｉ）の変化を同定するために使用された。２２Ａ１０．ｖ８３は高親和性結合を示し、かつまた、他のヒト化変異体に比してより多くの結合部位を認識する能力を示した。
この出願を通じて、マウスモノクローナル抗体の７Ｄ９と２２Ａ１０は、別の方法では７Ｄ９、ｍ７Ｄ９又はｍｕ７Ｄ９；及び２２Ａ１０、ｍ２２Ａ１０又はｍｕ２２Ａ１０として言及される。ヒト化モノクローナル抗体の７Ｄ９．ｖ３及び２２Ａ１０．ｖ８３は、別の方法では、他に指定されない限り、７Ｄ９．ｖ３，ｈ７Ｄ９．ｖ３又はｈｕ７Ｄ９．ｖ３；及び２２Ａ１０．ｖ８３，ｈ２２Ａ１０．ｖ８３又はｈｕ２２Ａ１０．ｖ８３としてそれぞれ言及される。
Ｄ．種の交差反応性
モノクローナル抗体は、それらが、ヒト以外の種由来のメソテリンと交差反応するかどうかを決定するために試験した。図１１は、ヒト（配列番号４３）、カニクイザル（配列番号４６）、ラット（配列番号４７）及びマウス（配列番号４８）のメソテリンの間の配列相同性を示す。網掛け（ｓｈａｄｅｄ）残基は、少なくとも二つの種の間で同一である。網掛けの無い残基は、４種の少なくとも二つの間で異なる。図１２は、ｇＤエピトープタグ付きメソテリン（ヒト、カニクイザル、ラットまたはマウスメソテリン）で安定的にトランスフェクトされ；１０μｇ／ｍｌのｈ７Ｄ９．ｖ３，ｈ２２Ａ１０．ｖ８３又は抗ｇＤ ｈ５Ｂ６で染色され；Ａｌｅｘａ６４７抗ヒト抗体で検出された；２９３細胞のＦＡＣＳ解析の結果を示す。トランスフェクトされていない２９３細胞は、通常はメソテリンを発現しない（”ＷＴ”）。ｈ７Ｄ９．ｖ３はヒトメソテリンに特異的であるが、ｈ２２Ａ１０．ｖ８３は、ヒト、カニクイザルおよびラットメソテリンに結合するが、マウスメソテリンに結合しない。抗−ｇＤ染色はマウスメソテリンが実際に発現していることを検証した。
Ｅ．抗体親和性
ｈ７Ｄ９．ｖ３及びｈ２２Ａ１０．ｖ８３の相対的結合親和性を決定するために、スキャッチャード分析を標準的手順に従って(Holmes et al., Science 256:1205-1210 (1992))、簡単には、非標識化抗体濃度を増加させつつ、離脱細胞を［Ｉ１２５］で標識したｈ７Ｄ９．ｖ３又はｈ２２Ａ１０．ｖ８３とともに２時間室温でインキュベートし、洗浄し、シンチレーションカウンティングによって細胞に結合した放射能を定量することにより行った、データは、新しいリガンド（Ｎｅｗ Ｌｉｇａｎｄ）プログラムで非線形回帰曲線フィッティングにより分析し（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）、Ｋｄ値を見積もった(Munson et al., Anal. Biochem., 107 220-239 (1980))。
図１３に示されるように、ｈ７Ｄ９．ｖ３は、安定的にトランスフェクトされた２９３細胞株、ＢＪＡＢ細胞株及びＨＴ１０８０細胞株で発現されるｇＤタグ付きヒトメソテリンに対してそれぞれ０．２，０．２５及び０．９７ｎＭの親和性で結合した。これらのＫｄ値は、４つ膵臓と２つの卵巣細胞株において内因性メソテリンで見られる範囲を包含する（０．４１−１ｎＭ）。同じ安定な細胞株で発現されるヒトメソテリンに対するｈ２２Ａ１０．ｖ８３の親和性は、内因性ヒトメソテリンに対するその親和性（〜９−１０ｎＭ）に従って、それぞれ２．７，１．８及び６．２ｎＭであった。ｈ２２Ａ１０．ｖ８３は安定的にトランスフェクトされた２９３細胞とＢＪＡＢ細胞に発現されたラットメソテリンに、それぞれ７．３ｎＭ及び２．７ｎＭの親和性で結合し、これは正常な胸膜細胞株４／４−ＲＭ４で内因性のラットメソテリンに対して観察された６．２ｎＭでのＫｄに一致する(Aronson et al., InVitro 17: 61-70 (1981))。
Ｆ．エピトープ群
７Ｄ９と２２Ａ１０が図３に記載されている他の抗メソテリン抗体と同じエピトープを共有するかどうかを決定するために、モノクローナル抗体のエピトープマッピングが、標準的なクロス・ブロッキングＥＬＩＳＡにより実施された。９６穴のＮｕｎｃ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｐプレート（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ，ＵＳＡ）が、コーティングバッファー（５０ｍＭの炭酸ナトリウム、ｐＨ９．５）中の１μｇ／ｍＬのヒトメソテリン細胞外ドメインの１００μＬと共に４℃で一晩コーティングされた。続く全ての工程は室温で実施された。２００μＬの洗浄バッファー（０．０５％のＴｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４を含有するＰＢＳ）で３回洗浄後、プレートをＥＬＩＳＡバッファー（０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４を含有するＰＢＳ）で６０分間ブロックした。次いでマウスモノクローナル抗体７Ｄ９又は２２Ａ１０がＥＬＩＳＡバッファーに２０μｇ／ｍＬで２時間添加された（ウェルあたり１００μＬ）。洗浄無しで、全試験抗メソテリン抗体のビオチン化バージョンが最終濃度が１μｇ／ｍｌまで３０分間添加された。２００μＬの洗浄バッファーで３回洗浄後、任意のビオチン化抗体の結合が、ストレプトアビジン西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（Ｚｙｍｅｄ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を３０分間１：５０００の希釈度で添加することによって検出された。上記のように３回の洗浄後、１００μＬの発色性３，３’、５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質を５分間添加した（ＢｉｏＦＸ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｏｗｉｎｇｓ Ｍｉｌｌｓ，ＭＤ）。発色反応は１００μＬの停止試薬の添加により停止され（ＢｉｏＦＸ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、吸光度をウルトラマイクロプレートリーダーで６２０ｎｍで読み取った（Ｂｉｏｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ；Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）。ビオチン化抗体のそれぞれの可能な結合の最大の程度を、非ビオチン化抗体７Ｄ９と２２Ａ１０の欠損下でそれらをメソテリンとともにインキュベートすることにより並行して測定した。
結果を図１４に示す。９つのビオチン化抗メソテリン抗体のいずれかによるシグナル（＊）は、一次抗体をめぐる競合の欠如を示している（比較のために一次抗体の欠損下での各ビオチン化抗体による最大結合はまた、右の群に表示されている）。７Ｄ９（図１４で７Ｄ９．５．２として言及）は、７Ｄ９が存在するときには結合できない唯一の抗体であるが、一方、２２Ａ１０は通常は結合する（左の群における黒いバー）。逆に、２２Ａ１０が事前に結合されている場合、２２Ａ１０は結合できない（中央の群の最後のバー）が一方７Ｄ９および他の抗体は可能である。従って、７Ｄ９と２２Ａ１０は互いに競合しないだけでなく、各々は他の７つの抗体とは区別されるエピトープに結合する。７Ｄ９はそれ自身によって競合されるが、任意の別の抗体によってはされない（ＥＬＩＳＡコート抗体７Ｄ９又は２２Ａ１０の欠損下でプレート上のメソテリンに対する各々の抗体結合についての最大シグナルに対して各バーを比較せよ）。同様に、２２Ａ１０のみがそれ自身と競合するが、７Ｄ９を含む別の抗体とは競合しない。従って、７Ｄ９と２２Ａ１０はお互いに対して及び他の単離されたモノクローナル抗体に対して異なるエピトープを有する。
Ｇ．ヒト：マウス及びカニクイザル：ヒトメソテリンキメラを使用するエピトープマッピング及び変異解析
ｈ７Ｄ９．ｖ３を固定化ヒトメソテリンに結合させ、次いでこれらをトリプシンとインキュベートし、抗体で保護された残りのペプチドを溶出して質量分析により同定するトリプシンペプチドマッピング実験を実施した。それらの実験は、配列番号４３のアミノ酸１３３−１８３をｈ７Ｄ９．ｖ３結合部位として結びつけた。この領域を確認するために、我々は、マウスメソテリン（コンストラクト＃３８５）又はカニクイザルメソテリン（コンストラクト＃３８３）でなく、ヒトメソテリン（図１５に示されるコンストラクト＃３８７）のと７Ｄ９の反応をキメラを生成するために利用し、我々はそれを切断変異体よりも良好にフォールドするはずであると予測した。我々は、マウスのコンストラクトにヒトの配列を導入するために、アミノ酸１３１でのサイレントＭｆｅＩ部位（ＱＬをコードする）及びアミノ酸２１３でのサイレントＢｇｌＩＩ部位（ＤＬをコードする）を用いて、ヒト：マウスメソテリンキメラ（＃３９８及び＃３９９）を構築した。更に、カニクイザルのコンストラクト（＃４００）が作成され、そこではアミノ酸１３１−１７８がＭｆｅＩ部位を介してヒトメソテリンのそれらと置換された。各コンストラクトは発現を確認するためのＮ−末端のｇＤタグ（図示せず）を有していた。
図１５に示されるｇＤタグ付きのＧＰＩ固着されたメソテリンコンストラクトは一過性に２９３細胞で発現され、０．０２μｇ／ｍｌのマウス７Ｄ９、１μｇ／ｍｌのマウス２２Ａ１０，又は１μｇ／ｍｌの抗ｇＤタグにより染色された（発現差異レベルを標準化するため）。Ａｌｅｘａ４８８抗マウス抗体による検出後、サンプルが洗浄され、ＦＡＣＳにより解析され、蛍光強度データは、野生型２９３陰性コントロール細胞上の任意のバックグラウンド染色を差し引いた後で、抗−ｇＤシグナルに標準化した。図１６に示されるように、７Ｄ９はヒト：マウスキメラ＃３９９（ヒトアミノ酸１〜２１３を有する）に結合するが、全長マウスメソテリン＃３８５又は＃３９８（ヒトアミノ酸の１〜１３１からのみを有する）の何れにも結合せず、７Ｄ９がアミノ酸１３１と２１３の間のエピトープに結合することを示唆している。カニクイザル：ヒトのキメラ＃４００（ヒトアミノ酸１３１−１７８を有する）に結合するその能力、しかし全長カニクイザル（＃３８３）でなく、はアミノ酸１３１と１７８の間にエピトープを制限した。（２２Ａ１０よりも７Ｄ９で見られる比較的低い結合の％は５０倍低い７Ｄ９の抗体濃度によるものである）。
同じキメラが、ラット、カニクイザル及びヒト（ただし、マウスでなく）反応性２２Ａ１０エピトープをマッピングするために使用された。結合はキメラ＃３９９、しかし＃３９８でなく、を発現する細胞で観察された。従って、２２Ａ１０はアミノ酸１３１−２１３の間の決定的残基を持つエピトープに結合する。（図１６）。
７Ｄ９と２２Ａ１０はお互いに競合しないゆえ（図１３）、それらはおそらく、アミノ酸１３１から２１３内の異なるエピトープに結合する。それらの異なるエピトープを同定するために、ヒトのメソテリンの２−４アミノ酸伸張が、＃３９９キメラグラウンドにおいて対応するマウスのアミノ酸に変異された。４種の間でアミノ酸１３２−２１２のアラインメントが、１５の変異体の位置を示す番号付きボックスを付して図１７に示されている。図１７の下に表に一覧された１５の変異体の各々において、マウスの配列（下）に変異されたヒトの配列（上）が示されている。（記：変異１１は成功裏には生成されなかった。）
図１７から変異体１１を除く全変異体が２９３細胞に発現され、図１６にあるように、各抗体のヒト化バージョンｌ（即ち、ｈ７Ｄ９．ｖ３，ｈ２２Ａ１０．ｖ８３及びｈ５Ｂ６抗ｇＤタグ（陽性コントロール））の５μｇ／ｍが使用されたことを除き、検出のために使用されるＡｌｅｘａ４８８抗マウス抗体によりＦＡＣＳ解析を受けた。結果は発現レベルに対して正規化するために抗ｇＤシグナルの割合として示される蛍光データとともに図１８Ａに示される。（記：変異体＃１３は２９３細胞中で発現しなかったのでデータセットから削除されている）。ｈ７Ｄ９．ｖ３は＃６と＃９を除いて全変異体に結合したが、一方ｈ２２Ａ１０．ｖ８３は＃１５を除いて全変異体に結合した（矢印）。
異なる種のメソテリンのアラインメントにより、ｈ７Ｄ９．ｖ３エピトープにおいて鍵となる残基が、ヒト配列と非交差反応性カニクイザル配列の間で異なる２つのアミノ酸に特定された：変異体＃６のＥ１５３及び変異体＃９のＤ１７４。抗体結合のためのそれらの残基の重要性は、対応するヒト残基に対してカニクイザルのメソテリンで同等の残基を変異させることにより確認した（即ち、Ｒ１５３をＥ及びＧ１７４をＤ）。ｈ７Ｄ９．ｖ３、これは、それ以外の場合カニクイザルのメソテリンに結合しない、はカニクイザルのメソテリン変異体に結合することができた（図１８Ｂ）。ヒトメソテリンの配列の残基Ｅ１５２がＱに変異されたさらなる研究は、ｈ７Ｄ９．ｖ３結合の阻害をもたらし、残基Ｅ１５２が抗体結合において役割を果たしていることを示唆している。
最近予測されたメソテリンのアルマジロ様リピート構造に基づいて(Sathyanarayana et al., BMC Structural Biology 9:1 (2009))、７Ｄ９抗体は、おそらくメソテリンの内側ヘリックス４と外側ヘリックス５を架橋する可能性がある。同様に、ｈ２２Ａ１０．ｖ８３は、マウスではなく、ラットと交差反応するため、変異体＃１５の残基Ｅ２１１（上掲Sathyanarayanaらの外側ヘリックス６にある）はそのエピトープの重要な決定因子である可能性がある。図１９は、ｈ７Ｄ９．ｖ３とｈ２２Ａ１０．ｖ８３によって結合される残基を示している。
Ｈ．ｈ７Ｄ９．ｖ３の結合はグリコシル化により阻害されない。
ｈ７Ｄ９．ｖ３がグリコシル化メソテリンに結合するかを決定するために、Ｃ末端にＨｉｓタグを付けたヒトメソテリンがＣＨＯ細胞で発現され、精製され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上のクーマシーブルー染色により示されるように、ＭｏｎｏＳカラムの電荷に従って、高（画分Ａ１１）、中間（Ａ１２）、低（Ｂ１）及び低から無（Ｂ５）に更に分離された。（図２０、上段左）。各画分を事前に結合したｈ７Ｄ９．ｖ３でチップ上に流動させ、オンとオフの割合が測定され、各画分（図２０左下）に対しての同一の親和性（１．５ｎＭ）が明らかにされ、ｈ７Ｄ９．ｖ３の結合は、グリコシル化によって阻害されないことを示唆している。これらのデータは、ｈ７Ｄ９．ｖ３は、安定的にｇＤ−ヒトメソテリンを発現する（そのｇＤエピトープタグはグリコシル化部位を欠いている）ＨＴ１０８０細胞由来のヒト化抗−ｇＤ ｈ５Ｂ６抗体と同じバンドの全てを免疫沈降させることができることをを示すことによって確認され、ｈ７Ｄ９．ｖ３は、グリコシル化状態に関係なくヒトのメソテリンを免疫沈降することができることを示唆している。対照的に、ヒト化２２Ａ１０は優先的に低分子量（少なくともグリコシル化）の種を免疫沈降させ、２２Ａ１０の結合はグリコシル化により影響され得ないことを示唆している。（図２０、右）。
ｈ７Ｄ９．ｖ３と比較して、試験抗体のグリコシル化メソテリンへ結合する能力を評価するためにＦＡＣＳアッセイが実施され、そこではＯＶＣＡＲ３細胞への試験抗体の結合がＯＶＣＡＲ３細胞へのｈ７Ｄ９．ｖ３の結合と比較される。適切な２次抗体がＯＶＣＡＲ３細胞へのｈ７Ｄ９．ｖ３及び試験抗体の結合を検出するために使用された（例えば、Ａｌｅｘａ６４７抗ヒト抗体がｈ７Ｄ９．ｖ３の結合の検出に使用される）。
Ｉ．モノクローナル抗体１９Ｃ３はメソテリンに対するＭＵＣ１６の相互作用を遮断する
モノクローナル抗体は、それらがメソテリンに対するＭＵＣ１６の結合を遮断することができるかどうかを決定するために試験された。ＭＵＣ１６の精製ビオチン化断片（Ｍｕｃ１６−Ｂｔ、３回のムチン繰り返しを持つ）の、Ａ４３１細胞（通常はメソテリンを発現しない）上で安定的に発現されるメソテリンへの結合が図２１（「抗体無し（ｎｏ Ａｂ）」）、左パネルに示される。１９Ｃ３（しかし７Ｄ９ではない）の５倍モル比を用いた細胞のプレインキュベーションは、図２１、左パネルに示されているようにように、ストレプトアビジン−ＰＥによるＦＡＣＳによって検出されるように、メソテリンに対するＭＵＣ１６−Ｂｔの結合を阻害した。逆に、組換えＣ末端ｈｉｓ８タグ付きメソテリン（２９３細胞から精製）の安定的にＭＵＣ１６を発現するＰＣ３細胞への結合が、指定された抗メソテリン抗体の５倍モル過剰の非存在下又は存在下で評価され（図２１右パネル）、これらはＡｌｅｘａ６４７抗ｈｉｓ ６を抗体でＦＡＣＳにより検出した。１９Ｃ３（７Ｄ９または２２Ａ１０でなく）とメソテリンのプレインキュベーションは、ＭＵＣ１６発現細胞に対するにメソテリンの結合を阻害する（図２１、右パネル）。実際には、７Ｄ９と２２Ａ１０は、このアッセイにおいてＭＵＣ１６に対するメソテリンの結合を強化するように見える。
Ｊ．様々な癌のタイプにおけるヒトメソテリンの罹患率
種々の癌におけるヒトメソテリンの発現は、免疫組織化学法を用いて解析した。膵管腺癌（図２２）、卵巣漿液腺（図２３）及び非小細胞肺腺癌（図２４）のホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）腫瘍マイクロアレイ（腫瘍ごとに１ｍｍのコア）が、顕微鏡スライド上に切片化され、脱パラフィン処理され、希釈アルコール系を通して再水和された。スライドは、標的回復溶液（Ｄａｋｏ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用して抗原回復のために前処理され、反応停止し、ブロックされ、そしてダコの自動染色液上で６０分間、１０μｇの／ｍｌのマウス抗ヒトメソテリンモノクローナル抗体１９Ｃ３で染色された。洗浄後、１９３Ｃはビオチン化抗マウス抗体で、続いてＡＢＣ複合体（ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ ＡＢＣ Ｅｌｉｔｅ Ｋｉｔ，Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）で検出され、そしてＤＡＢ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を色素原として視覚化した。次いで、スライドをマイヤーズヘマトキシリンで対比染色し、アルコール及びキシレンの系列で脱水し、有機封入剤を使用してカバーガラスを装着した（ＰｅｒｍａＭｏｕｎｔ，Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）。
メソテリンの染色（茶色）は、強度（茶色染色の暗さ）並びに染色の幅を考慮して、以下の方式に従って訓練された病理学者によってスコア化された。各メソテリンスコアの代表例は、それぞれの腫瘍タイプに対して図２２−２４に示されている。
０（陰性）：腫瘍細胞の＞９０％で非常に弱いか又は全く染色無し
１ ＋（軽度）：優勢な染色パターンは弱い
２ ＋（中等度）：優勢な染色パターンは、腫瘍細胞の大部分（＞５０％）で適度に強い
３ ＋（強）：優勢な染色パターンは、腫瘍細胞の大部分（＞５０％）で強い
図２２は、膵管腺癌の７０％が、１＋、２＋又は３＋レベルでの染色を示し、メソテリン陽性であることを示しており、３３％は２＋又は３＋の染色を示している。図２３は、卵巣漿液腺癌９８％が、メソテリン陽性であり、７４％が２＋又は３＋のレベルでの染色を示している。また、卵巣漿液性腺癌からの８つの試験された転移の全てがメソテリン陽性であり、原発性卵巣腫瘍は転移後にメソテリンの発現を失わないことを示唆している。図２４は、４４％の非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ、腺癌のサブタイプ）が、メソテリン陽性であり、２６％が２＋又は３＋のレベルでの染色を示している。更に、メソテリン陽性原発性ＮＳＣＬＣ患者の腫瘍に由来する試験され適合した転移の８つのうち３つ（３８％）が、メソテリン陽性染色を保持していた。
メソテリンはまた、１９Ｃ３抗体を用いてＩＨＣにより決定されるように、中皮腫や子宮内膜癌で発現している。
カニクイザルにおけるメソテリンの発現も調べた。ヒト（ホルマリン固定パラフィン包埋切片）及びカニクイザル（凍結切片）からの肺胸膜と心臓心膜中皮の切片が切片化され、それぞれ、１９Ｃ３モノクローナル抗体又は２２Ａ１０モノクローナル抗体で染色された。ヒト中皮は、１９Ｃ３で特異的に染色し（図２５、左）、カニクイザル中皮は２２Ａ１０で特異的に染色した（図２５、右）。これらの結果は、２２Ａ１０は、ヒトと同様の分布を有する、内因性カニクイザルメソテリンを認識できることを示している。
Ｋ．抗メソテリン抗体薬物コンジュゲートの製造
抗メソテリン抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、ｈ７Ｄ９．ｖ３とｈ２２Ａ１０．ｖ８３を薬物リンカー部分ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥにコンジュゲートすることにより生成され、それは上のセクションＩＩ．Ｄに図示されている。便宜上、薬物リンカー部分ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥは、実施例及び図中において、「ｖｃＭＭＡＥ」又は「ＶＣＥ」として別に言及される。（例えば、ｈ７Ｄ９．ｖ３−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥはこれらの実施例において、及び図において、ｈ７Ｄ９．ｖ３−ｖｃＭＭＡＥ又はｈ７Ｄ９．ｖ３−ＶＣＥと言及される。）コンジュゲーションに先立って、抗体は、国際公開第２００４／０１０９５７ Ａ２号に記載された方法に従う標準的な方法を用いて、部分的にＴＣＥＰで還元した。部分的に還元された抗体は、Doronina et al. (2003) Nat. Biotechnol. 21:778-784 及び米国特許出願公開第２００５／０２３８６４９ Ａ１号に記載の方法に従い、標準的な方法を用いて薬物リンカー部分にコンジュゲートされた。簡単には、部分的に還元された抗体は、システイン残基への該部分のコンジュゲーションを可能にするために、薬物リンカー成分と結合された。コンジュゲーション反応を急冷し、ＡＤＣを精製した各ＡＤＣに対する薬物負荷（抗体当たりの薬物部分の平均数）を決定し、全ての場合において３．３３と４．０の間であった。
Ｌ．インビボＨＰＡＣモデルにおけるｈ７Ｄ９．ｖ３−ｖｃＭＭＡＥの有効性
ｈ７Ｄ９．ｖ３−ｖｃＭＭＡＥの有効性を膵臓腺癌異種移植モデルを用いて調べた。ＨＢＳＳ中の５００万個のＨＰＡＣ細胞（１９Ｃ３によるＩＨＣによりメソテリン陽性（２＋））をＳＣＩＤベージュ・マウスに皮下注射し、腫瘍に．１．１，２．７，５．５，１１，及び１６．４ｍｇ／ｋｇでｈ７Ｄ９．ｖ３−ｖｃＭＭＡＥを（３．５ＭＭＡＥ／抗体で），又は５，１０及び１５ｍｇ／ｋｇでｈ５Ｂ６抗ｇＤ−ｖｃＭＭＡＥを（抗体あたり３．３ＭＭＡＥとともに），又は１５ｍｇ／ｋｇのネイキッドｈ７Ｄ９．ｖ３を（ＭＭＡＥ無し）投与した。図２６に示されるように、実質的な腫瘍増殖阻害は５．５ｍｇ／ｋｇのｈ７Ｄ９．ｖ３−ｖｃＭＭＡＥで達成され、退縮は１１−１６ｍｇ／ｋｇのｈ７Ｄ９．ｖ３−ｖｃＭＭＡＥで達成されたが、有意な効果は１５ｍｇ／ｋｇのｇＤ−ｖｃＭＭＡＥ又はネイキッド抗体では観察されなかった。全体的な増殖率に基づいてモデル化されたカーブのフィットが示されている。図２６の右下のパネルは、ＦＡＣＳ解析、ＨＰＡＣ細胞におけるｈ７Ｄ９．ｖ３の内在化、ＩＨＣを示す。
Ｍ．原発性膵臓腺癌モデルにおけるｈ７Ｄ９．ｖ３−ｖｃＭＭＡＥの有効性
ｈ７Ｄ９．ｖ３−ｖｃＭＭＡＥの有効性が原発性膵臓腺癌モデルにおいて調査された（Ｏｎｃｏｔｅｓｔ，ＧＭＢＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。原発性ヒトメソテリン陽性膵腫瘍のかたまり（ＩＨＣによりメソテリンを１−２＋で発現する）を、５、１０及び２０ｍｇ／ｋｇのｈ７Ｄ９．ｖ３−ｖｃＭＭＡＥ（３．５ＭＭＡＥ／抗体）を投与された雌のＮＭＲＩヌードマウスに皮下移植した。平均腫瘍体積±標準偏差が図２７にプロットされている。有意な腫瘍増殖阻害はｈ７Ｄ９．ｖ３−ｖｃＭＭＡＥのすべての用量で見いだされた。原発性膵臓腫瘍のＩＨＣが右側に示される。
Ｎ．卵巣癌モデルにおけるｈ７Ｄ９．ｖ３−ｖｃＭＭＡＥの有効性
ｈ７Ｄ９．ｖ３−ｖｃＭＭＡＥの有効性を膵臓腺癌異種移植モデルを用いて調べた。１０００万個のＯｖＣａｒ３ｘ２．１細胞（１９Ｃ３によるＩＨＣによりメソテリン陽性（２−３＋））がＣＢ１７ ＳＣＩＤベージュマウスの乳腺脂肪体に注入され、続いて１，２．５，５，１０及び１５ｍｇ／ｋｇのｈ７Ｄ９．ｖ３−ｖｃＭＭＡＥ（３．５ＭＭＡＥ／抗体）又はｈ５Ｂ６抗ｇＤ−ｖｃＭＭＡＥ（３．３ＭＭＡＥ／抗体）が投与された。図２８に示されるように、中程度の活性が２．５ｍｇ／ｋｇのｈ７Ｄ９．ｖ３−ｖｃＭＭＡＥで見られ、退縮は５ｍｇ／ｋｇ以上で見られたが、抗ｇＤ−ｖｃＭＭＡＥは５ｍｇ／ｋｇ未満で活性を示さなかった（１０ｍｇ／ｋｇで中程度の活性を示すだけで１５ｍｇ／ｋｇでは腫瘍は静止した）。全体的な増殖率に基づいてモデル化されたカーブのフィットが示されている。図２８の右のパネルは、ＦＡＣＳ解析、ＯｖＣａｒ３ｘ２．１細胞におけるｈ７Ｄ９．ｖ３の内在化、ＩＨＣを示す。
Ｏ．肺癌モデルにおけるｈ７Ｄ９．ｖ３０−ｖｃＭＭＡＥの有効性
ｈ７Ｄ９．ｖ３−ｖｃＭＭＡＥの有効性を肺癌（扁平上皮癌）異種移植モデルを用いて調べた。５００万個のＨ２２６ｘ２細胞（ＩＨＣによりメソテリン陽性（３＋））が、ＣＢ１７ ＳＣＩＤマウスの脇腹にＨＢＳＳ：マトリゲルの５０：５０ミックスで注入された。平均腫瘍体積±標準偏差が図２９にプロットされる。ｈ７Ｄ９ｖ３−ｖｃＭＭＡＥ （３．５ＭＭＡＥ／抗体）は５ｍｇ／ｋｇで中程度の活性を示し、１０ｍｇ／ｋｇで腫瘍は静止したが、抗ｇＤ−ｖｃＭＭＡＥコンジュゲート：（３．９７ＭＭＡＥ／抗体）は両方の用量において有意な活性が無かった。図２９の右のパネルは、ＦＡＣＳ解析、Ｈ２２６ｘ２細胞におけるｈ７Ｄ９．ｖ３の内在化、ＩＨＣを示す。
Ｐ．ｈ７Ｄ９．ｖ３−ｖｃＭＭＡＥとｈ２２Ａ１０．ｖ８３−ｖｃＭＭＡＥは類似の有効性を有する。
ｈ２２Ａ１０．ｖ８３−ｖｃＭＭＡＥに比べたｈ７Ｄ９．ｖ３−ｖｃＭＭＡＥの有効性が調べられた。ｇＤヒトメソテリン（左）又はｇＤカニクイザルメソテリン（右）のどちらかを安定的に発現する２０００万個のＢＪＡＢ細胞を、ＨＢＳＳバッファー中でＣＢ１７ ＳＣＩＤマウスに皮下接種した。マウスは、（ＢＪＡＢ−ｇＤヒトメソテリンを接種されたマウスに）ｈ７Ｄ９．ｖ３−ｖｃＭＭＡＥ又は（ＢＪＡＢ−ｇＤカニクイザルメソテリンを接種されたマウスに）ｈ２２Ａ１０．ｖ８３−ｖｃＭＭＡＥを０．５又は２ｍｇ／ｋｇで投与され、又は陽性コントロールとして及び２種類の細胞株の間での発現の任意の相違に対する正規化群として使用される抗ｇＤ−ｖｃＭＭＡＥを２ｍｇ／ｋｇで投与された。平均腫瘍体積±標準偏差が図３０にプロットされている。ｈ７Ｄ９．ｖ３−ｖｃＭＭＡＥとｈ２２Ａ１０．ｖ８３−ｖｃＭＭＡＥの両方が、ＢＪＡＢ−ｇＤヒトメソテリン腫瘍及びＢＪＡＢ−ｇＤカニクイザルメソテリン腫瘍のそれぞれに対して、２ｍｇ／ｋｇで、ｇＤ−ｖｃＭＭＡＥコントロールよりも良好な活性を示した。この実験における陰性コントロールは、ｖｃＭＭＡＥにコンジュゲートした無関係であった抗体であり、それは有意な活性を示さなかった。
ｈ２２Ａ１０．ｖ８３−ｖｃＭＭＡＥの活性を更に評価するために、図２９のＨ２２６ｘ２腫瘍と図２８に説明されるように増殖したＯｖＣａｒ３ｘ２．１腫瘍に指定された濃度のｈ７Ｄ９．ｖ３−ｖｃＭＭＡＥ及びｈ２２Ａ１０．ｖ８３−ｖｃＭＭＡＥ（３．５３ＭＭＡＥ／抗体）、又は陰性コントロールとして抗ｇＤ−ｖｃＭＭＡＥが投与された。平均腫瘍体積±標準偏差が図３１にプロットされている。ｈ７Ｄ９．ｖ３と比較して、ＦＡＣＳによるこれらの細胞株の両方に対するネイキッドｈ２２Ａ１０．ｖ８３の著しく弱い結合にも関わらず、ｈ２２Ａ１０．ｖ８３−ｖｃＭＭＡＥは、Ｈ２２６ｘ２モデルにおいてｈ７Ｄ９．ｖ３−ｖｃＭＭＡＥと同様に効果的であり（左上パネル）、６ｍｇ／ｋｇを投与後の腫瘍の速い退縮によって示されるように、ＯｖＣａｒ３ｘ２．１モデルにおいてごくわずかに活性が小さかった（右上パネル）。
Ｑ．ＭＵＣ１６とメソテリンは「二重陽性」細胞株で複合体を形成する。
細胞株でのＭＵＣ１６とメソテリンとのの相互作用を調べた。メソテリンおよびＭＵＣ１６の両方を発現するＯｖＣａｒ３細胞を、１％のＮＰ４０緩衝液中で溶解した。図３２の左パネルに示されるように、溶解物をｍ７Ｄ９またはアイソタイプコントロールＩｇＧで免疫沈降させ、抗ＭＵＣ１６抗体（上ブロット）またはｈ７Ｄ９（下のブロット）でウエスタンブロットを行い、メソテリン：ＭＵＣ１６複合体又は全メソテリンをそれぞれ検出した。（２０％の非免疫沈降インプットが左レーンに示される。）ｍ７Ｄ９はＯｖＣａｒ３細胞溶解物からメソテリンとＭＵＣ１６を共免疫沈降することができた。その結果は、ＭＵＣ１６は、メソテリンおよびＭＵＣ１６の両方を発現する細胞株（すなわち、「二重陽性」細胞株）においてメソテリンと複合体を形成することを示している。
図３２、右パネルに示されるように、メソテリン又はＭＵＣ１６の何れかに対する抗体が、指定された細胞株が増殖する条件培地からそれらのタンパク質を免疫沈降させるために使用された。その細胞株は、メソテリンのみ（ＨＰＡＣＳ）、ＭＵＣ１６のみ（Ａ４３１）発現する、何れも発現しない（Ｈ５２０）、又は両方を発現する（ＯｖＣａｒ３，ＣＡＰＡＮ−２，ＥＫＶＸ及びＯｖＣａｒ４２９細胞）。抗メソテリンキメラ抗体ｃｈ７Ｄ９（上と下のパネル）又は抗ＭＵＣ１６のみ１６抗体（中央パネル）が免疫沈降に使用された。洗浄した免疫沈降物はマウス抗メソテリン抗体２Ｅ５（上）又はマウス抗ＭＵＣ１６Ｂドメイン（Ｍ１１様）抗体１．Ｂ．８２３でウエスタンブロット（ＷＢ）した（ＵＳ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｓｗａｍｐｓｃｏｔｔ，ＭＡ；中央と下のパネル）。従って、上のパネルはメソテリンを発現する細胞株からの免疫沈降したメソテリンを示し、中央パネルはＭＵＣ１６を発現する細胞株からの免疫沈降したＭＵＣ１６を示し、下のパネルは、両方のタンパク質を発現する細胞株（二重陽性細胞株）に特異的である、共免疫沈降したメソテリン：ＭＵＣ１６複合体を示す。これらの結果は、メソテリンはＭＵＣ１６に結合しつつ培地中に離脱することが可能であることを示唆している。従って、本発明の抗体および免疫複合体は、二重陽性の癌を含む、メソテリン陽性癌を治療するために有用である。
Ｒ．７Ｄ９でなく、１９Ｃ３はメソテリンから事前に結合したＭＵＣ１６を外す。
ＭＵＣ１６の存在下でメソテリンに対する１９Ｃ３の結合を調べた。ＭＵＣ１６ビオチン（１ｕｇ／ｍｌ又は９．２ｎＭ）を、メソテリンを発現するＨＴ１０８０細胞に事前に結合させた。１９Ｃ３（５ｕｇ／ｍｌ）が、事前に結合したＭＵＣ１６と置換するかどうかを決定するために添加された。ＭＵＣ１６−ビオチンをＳＡＰＥ検出試薬を用いて検出し、結合した抗体をＡｌｅｘａ４８８抗マウス抗体を用いて検出した。図３３は、１９Ｃ３が実際にＭＵＣ１６と置換し、メソテリンに結合することができたことを示している。ＭＵＣ１６結合部位の外側のメソテリンの領域に結合する抗体７Ｄ９（３３ｎＭ）が、陰性コントロールとして使用され、期待通りに、事前に結合したＭＵＣ１６を置換することができなかった。追加実験では、１９Ｃ３はまた、０．１ｕｇ／ｍｌでＭＵＣ１６を置換するが、一方抗体２Ｅ５は≧５ｕｇ／ｍｌでのみでＭＵＣ１６を置換することができる（データ非表示）ことを実証した。
前述の発明は、理解を明確にする目的のために例示および実施例によってある程度詳細に説明してきたが、説明や例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。すべての特許および本明細書に引用される科学文献の開示は、参照によりその全体が援用される。

Claims (31)

  1. メソテリンに結合する単離された抗体であって、（ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｉｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｉｖ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｖ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｖｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、を含む、抗体。
  2. モノクローナル抗体である、請求項１に記載の抗体。
  3. ヒト化、又はキメラ抗体である、請求項１に記載の抗体。
  4. メソテリンに結合する抗体断片である、請求項１に記載の抗体。
  5. メソテリンが配列番号４３のヒトメソテリンである、請求項１に記載の抗体。
  6. 配列番号４３の番号付けによるＥ１５３及びＤ１７４を含む配列番号４３のエピトープに結合し、任意で以下の特徴の一以上を有する：
    （ａ）メソテリンの非グリコシル化形態と比較して、メソテリンのグリコシル化形態に対する結合の減少を示さない；
    （ｂ）メソテリンのムチン１６（ＭＵＣ１６）に対する結合を遮断しない；及び／又は
    （ｃ）≦５ｎＭの親和性でメソテリンに結合する
    請求項１に記載の抗体。
  7. メソテリンのＭＵＣ１６に対する結合を遮断しない、請求項６に記載の抗体。
  8. メソテリンの非グリコシル化形態と比較して、メソテリンのグリコシル化形態のＭＵＣ１６に対する結合を遮断しない、請求項７に記載の抗体。
  9. メソテリンの非グリコシル化形態と比較してメソテリンのグリコシル化形態に対する結合の減少を示さない、請求項６に記載の抗体。
  10. 配列番号２５のフレームワークＦＲ２配列と配列番号２７のＦＲ３配列とを含む軽鎖可変ドメインを更に含む、請求項１に記載の抗体。
  11. 抗体が、
    （ａ）配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨ配列；
    （ｂ）配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬ配列；又は
    （ｃ）（ａ）のＶＨ配列及び（ｂ）のＶＬ配列
    を含む、請求項１に記載の抗体。
  12. 配列番号８のＶＨ配列を含む、請求項１に記載の抗体。
  13. 配列番号４のＶＬ配列を含む、請求項１に記載の抗体。
  14. メソテリンに結合する単離された抗体であって、配列番号８のＶＨ配列及び配列番号４のＶＬ配列を含む、抗体。
  15. ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ又はＩｇＧ２ｂ抗体である、請求項１に記載の抗体。
  16. 式Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）ｐを有するイムノコンジュゲートであって、
    （ａ）Ａｂは請求項１に記載の抗体であり；
    （ｂ）Ｌはリンカーであり；
    （ｃ）Ｄは式ＤＥの薬物であり
    かつ、Ｒ２及びＲ６の各々はメチルであり、Ｒ３及びＲ４の各々はイソプロピルであり、Ｒ５はＨ、Ｒ７はｓｅｃ−ブチルであり、各Ｒ８はＣＨ３，Ｏ−ＣＨ３，ＯＨ，及びＨから独立に選択され；Ｒ９はＨであり；かつＲ１８は−Ｃ（Ｒ８）２−Ｃ（Ｒ８）２−アリールであり；及び
    （ｄ）ｐは１〜８の範囲である
    イムノコンジュゲート。
  17. 薬物がアウリスタチンである、請求項１６に記載のイムノコンジュゲート。
  18. 薬物がモノメチルアウリスタチン（ＭＭＡＥ）である、請求項１７に記載のイムノコンジュゲート。
  19. リンカーがプロテアーゼにより切断可能である、請求項１６に記載のイムノコンジュゲート。
  20. リンカーがｖａｌ−ｃｉｔジペプチドを含む、請求項１９に記載のイムノコンジュゲート。
  21. Ｓが硫黄原子である式
    を有する、請求項１６に記載のイムノコンジュゲート。
  22. ｐが２〜５の範囲である、請求項２１に記載のイムノコンジュゲート。
  23. 請求項６の抗体を含む、請求項２１に記載のイムノコンジュゲート。
  24. 請求項１４の抗体を含む、請求項２１に記載のイムノコンジュゲート。
  25. 請求項１６に記載のイムノコンジュゲート及び薬学的に許容される担体を含む、薬学的製剤。
  26. 付加的治療薬を更に含む、請求項２５に記載の薬学的製剤。
  27. 付加的治療薬がゲムシタビンである、請求項２６に記載の薬学的製剤。
  28. 付加的治療薬は、細胞傷害性薬物にコンジュゲートした抗ＭＵＣ１６抗体である、請求項２６に記載の薬学的製剤。
  29. 標識にコンジュゲートした、請求項１に記載の抗体。
  30. 標識が陽電子放出体である、請求項２９に記載の抗体。
  31. 陽電子放出体が８９Ｚｒである、請求項３０に記載の抗体。
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