JP6152107B2 - クロストリジウム・ディフィシレの主要な外毒素ＴｃｄＡ及びＴｃｄＢに対する中和抗体 - Google Patents

クロストリジウム・ディフィシレの主要な外毒素ＴｃｄＡ及びＴｃｄＢに対する中和抗体 Download PDF

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Description

本発明は、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の外毒素、例えばＴｃｄＡ及びＴｃｄＢに対する抗体、これを含む医薬組成物、前記抗体及び組成物を生成するプロセス、並びに処置及び／又は予防、詳細には、クロストリジウム・ディフィシレ感染、偽膜性大腸炎、劇症型大腸炎及び／又は中毒性巨大結腸の処置又は予防におけるこの抗体及び組成物の使用に関する。
２種の主要な外毒素ＴｃｄＡ及びＴｃｄＢが、多くのインビトロ及びインビボ研究において、クロストリジウム・ディフィシレの主要な病原性決定因子として確立されている。非毒素生成株は、動物及びヒトに対して、病原性ではない（１、２）。現在までに、二元毒素の役割の明らかな理解は、未だ確立されていない（３）。
両毒素は、腸毒性且つ細胞毒性であるが、証拠のバランスは、ＴｃｄＡがＴｃｄＢよりも強力な腸毒素であり、一方で、典型的には、ＴｃｄＢは、ＴｃｄＡよりも約１０００倍以上高い細胞毒性が観察されることを示唆している（４）。両毒素とも炎症性応答を誘導することができるが、ＴｃｄＡは、より炎症性のＴｃｄＢが胃粘膜の中をより深くに移動するのを補助すると見られる（５）。
全体として、３０年以上にわたって作成されたデータの膨大なコレクションは、あるモデルを支持しており、そのモデルでは、両毒素がヒト疾患プロセスにおいて重要である可能性が高くなっている。恐らく、ＴｃｄＡは、タイトジャンクションの喪失及び絨毛の先端の破壊を通した初期（すなわち、ＴｃｄＢより前の）且つ迅速な（すなわち、１〜３時間）胃損傷、及びその後の、恐らくはアルブミン駆動の体液喪失を通した下痢を開始する。この胃の内壁の完全性の損傷は、ＴｃｄＢがその優れたモル力価（ＴｃｄＢは、代表的に、ＴｃｄＡよりも１０００倍以上細胞毒性であると言及される）をより迅速且つより効率的に（すなわち、組織、代替的な細胞標的及び有害な全身的に接近された器官内により深く）発揮することを可能にする。いずれの毒素も、インビトロでヒト又は動物の細胞及び組織上で、単独で有効であり得る。どちらの毒素も、他の誘発因子、例えば機械的損傷、障壁過負荷及び宿主特異的感受性に依存して、動物においてインビボで、単独で有効であり得る。現在、ハムスターにおいて、クロストリジウム・ディフィシレ胃感染によって送達された少なくともＴｃｄＡ又はＴｃｄＢのいずれか単独で、死をもたらし得ることは、明らかである（１）。Ａ−Ｂ＋株は、ヒトにおいて症状及び死をもたらし得ることは、十分に確立されている（６，７）。しかし、多く（約９５％）の臨床株は、Ａ＋Ｂ＋であり、従って、クロストリジウム・ディフィシレ感染（ＣＤＩ）を処置することを目的とする薬物は、効率的に両毒素の活性を中和し、そして除去できなければならない。
ＣＤＩは、高齢の患者又は合併併存症を有する患者の、最も代表的な院内感染である。しかし、市中感染の増大が注目されている。感染は、ほぼ常に、広スペクトルの抗生物質の使用に関連するか、又はこれによって誘導される。健康管理関連費用は、米国のみにおいて、年間１０億ドルを超えると推定される。これらの費用は、主に、長期間入院する患者に起因する。現在の治療は、胃内のクロストリジウム・ディフィシレ細胞を殺傷するクリンダマイシン、バンコマイシン又はフィダキソマイシンなどの抗生物質の使用を含む。現在の治療は、細菌感染には取り組むが、ＣＤＩ症状及び死亡率に対する主な原因であるＴｃｄＡ及びＴｃｄＢによって起こる重要な病因を直接的に対処することも、予防することもない。
ヒトにおけるＣＤＩ症状としては、軽度から重度の下痢、偽膜性大腸炎（ＰＭＣ）及び劇症型大腸炎又はいわゆる中毒性巨大結腸が挙げられる。死は、現在最善の手当を受ける患者の５〜１５％において起こる。従って、現時点で、患者に対し感染後のＣ．ディフィシレ毒素によって生じる損傷及び傷害を予防可能な特定の治療は存在しない。
ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体のワクチン接種及び非経口投与を通した抗体応答の惹起は、全て、下痢の症状及び死から動物を防御できることが示されている（８〜１５）。ハムスターにおける初期研究は、ＴｃｄＡに対する抗体だけで、防御のために十分であること示唆した。しかし、ＴｃｄＡ又はＴｃｄＢについて機能的に削除した株の使用は、どちらの毒素も、ハムスターにおいて疾患を引き起こし得るが、両毒素が一緒だと、より有効であることを実証した（１）。
治療適用のために、モノクローナル抗体（Ｍａｂ）は、血清由来ポリクローナル抗体又は血清由来過免疫血清をしのぐ効力、安全性、製造利益及び規制利益を提供し得る。これらの理由により、Ｍａｂは、通常、治療製品の好ましい選択肢である。
ＴｃｄＡ及びＴｃｄＢに対し、防御Ｍａｂを作製する多くの試みがあった。診療所におけるこの試みの最も高度なものは、ＴｃｄＡ及びＴｃｄＢそれぞれに対する２つのＩｇＧ１ Ｍａｂの混合物であって、はじめＣＤＡ１と呼ばれており、ＭＢＬ及びＭｅｄａｒｅｘによって開発されたＭＤＸ１３８８であった。これらが急性又は再発性の感染のモデルにおいてハムスターを完全に防御できないことが実証された（１５）。このＭａｂ組み合わせは、現在、Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｃ．により、ＭＫ３４１５Ａとして開発されている。ヒト第ＩＩ相試験において、疾患の再発において、ＭＫ３４１５Ａは、統計学的に有意な低下をもたらした（ｐ＝０．００６）（Lowy et al., NEJM (2010) 362: 197-205もまた参照されたい）が、下痢の持続期間／重症度及び死亡率には影響しなかった（１６）。このことは、これらの抗体は、感染の再発を予防するためにのみ有用であり得ることを意味し得る。感染の再発は、患者の約２５％で生じる。従って、これらの抗体が有効でない多くの患者集団が存在する可能性が高い。
下痢（例えば、ＴｃｄＡに起因する胃タイトジャンクションに対する急性損傷によるもの）及び死（例えば、長期に亘る貧しい栄養状態、脱水ストレス及び炎症カスケードの開始、胃の内壁に対する広範な解剖学的損傷及びＴｃｄＡよりも全身性毒素ＴｃｄＢに起因する遠位の器官に対する損傷の可能性からもたらされるもの）にはっきりと影響を及ぼすためには、Ｍａｂは、優れた親和性、毒素中和、ＴＥＥＲ（経上皮電気抵抗）の喪失の優れた予防、抗原装飾及び抗原免疫クリアランスを有する必要がある。
本発明は、インビトロ及びインビボで非常に高いレベルの効力を有するＭａｂ（単数又は複数）を提供し、このＭａｂは、クロストリジウム・ディフィシレ感染（ＣＤＩ）に罹患するヒトにおける下痢の持続期間及び重症度並びに死亡率に対し効果を有する潜在能力がある。
１つの実施形態において、抗原ＴｃｄＡ又はＴｃｄＢに特異的なモノクローナル抗体が提供され、この抗体は、標的抗原に対して高い親和性を有し、クロストリジウム・ディフィシレ感染を有するか又は前記感染の危険のある患者において下痢の持続期間及び重症度並びに罹患率を低下するために好適である。
１つの実施形態において、ＴｃｄＡ又はＴｃｄＢに特異的なＭａｂ、又は少なくとも１つがＴｃｄＡに対して特異的であり、少なくとも１つがＴｃｄＢに対して特異的である少なくとも２つのＭａｂの集団が提供され、ここで、その抗体、各抗体又は抗体の組み合わせのＥＣ５０は、２００ｎｇ／ｍｌ以下、例えば１５０ｎｇ／ｍｌ以下、例えば１００ｎｇ／ｍｌである。
本開示の抗体は、有用である。何故なら、これらは、疾患の症状の再発を予防するだけではなく、患者における一次感染の症状、例えば下痢の重症度及び持続期間を処置するか、又は死亡を予防する手段を提供する可能性が高いからである。
少なくともいくつかの実施形態において、本開示に従う抗体は、高濃度の毒素の存在下で、効力の低減は示さない。
ここで使用される場合、特異的は、特定の抗原のみを認識する抗体又は非特異的である抗原への結合と比較して特定の抗原に対して有意に高い結合親和性、例えば、５、６、７、８、９、１０倍高い結合親和性を有する抗体を意味する。
結合親和性は、標準的アッセイ、例えば表面プラスモン共鳴、例えばＢＩＡｃｏｒｅによって測定され得る。
１つの実施形態において、細胞培養アッセイ及び患者において、ＥＣ５０は、７５、７０、６０、６５、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１．５ｎｇ／ｍｌ未満のクロストリジウム・ディフィシレ感染である。これは、公知の抗体よりも有意に低く（より力価が高く）、本開示の抗体が処置を受けた患者の生存に対し有意且つ明らかな効果を有する主な要因であると考えられる。
ここで使用される場合、力価は、抗体が、所定の用量又は濃度において、適切な生物学的応答、例えば、有害な毒素効果の中和を誘発する能力である。力価の例としては、毒素活性の最大中和百分率（防御の程度）、抗原に対するＭａｂの最低相対濃度（例えば、ＥＣ５０）中和活性の速度及び耐久性が挙げられる。
細胞培養アッセイにおいて、中和は、以下の１つ又は複数によって観察され得る：細胞に対する毒素の結合の予防、溶液からの毒素の免疫沈降、細胞形態及び形状の喪失の予防、細胞骨格構造の喪失の予防、細胞単層タイトジャンクション及び経上皮電気抵抗の喪失の予防、細胞死、アポトーシス及び炎症促進性サイトカイン、例えばＴＮＦα、ＩＬ−１β、ＩＬ-６及びＭＩＰ１αの生成の予防。
組織切片及び外植片アッセイにおいて、中和は、例えば、壊死及び／又は水腫液蓄積の予防として観察され得る。
インビトロアッセイにおいて、中和は、以下の１つ又は複数によって観察され得る：結紮された回腸ループにおける液体の蓄積の予防及び胃組織壊死の予防、下痢、動物の死の偽膜形成。
従って、１つの実施形態において、ＣＤＲ、例えば以下から選択される１、２、３、４、５又は６つのＣＤＲを含む抗体（例えば、抗毒素Ａ抗体）が提供される：
１つの実施形態において、配列１〜３が抗体の軽鎖にある。
１つの実施形態において、配列４〜６が抗体の重鎖にある。
１つの実施形態において、配列番号１はＣＤＲ Ｌ１であり、配列番号２はＣＤＲ Ｌ２であり、配列番号３はＣＤＲ Ｌ３である。
１つの実施形態において、配列番号４はＣＤＲ Ｈ１であり、配列番号５はＣＤＲ Ｈ２であり、配列番号６はＣＤＲ Ｈ３である。
１つの実施形態において、配列番号１はＣＤＲ Ｌ１であり、配列番号２はＣＤＲ Ｌ２であり、配列番号３はＣＤＲ Ｌ３であり、配列番号４はＣＤＲ Ｈ１であり、配列番号５はＣＤＲ Ｈ２であり、配列番号６はＣＤＲ Ｈ３である。
１つの実施形態において、可変領域、例えば、以下の配列（抗体９２２ 抗毒素Ａ抗体；軽鎖可変領域配列）配列番号７を有する軽鎖可変領域が提供される：

ここで、ＣＤＲは下線を引かれており、構築物は、ここで９２２．ｇ１ ＶＫ（ｇＬ１）と呼ばれる。
配列番号７をコードするポリヌクレオチド配列は、図１及びその中の配列番号８において示される。
１つの実施形態において、可変領域、例えば、以下の配列（抗体９２２ 抗毒素Ａ抗体重鎖可変領域配列）配列番号９を有する重鎖可変領域が提供される：

ここで、ＣＤＲは下線を引かれており、構築物は、ここで９２２．ｇ１ ＶＨ（ｇＨ１）と呼ばれる。
配列番号９をコードするポリヌクレオチド配列は、図１及びその中の配列番号１０において示される。
１つの実施形態において、抗体は、配列番号７及び９に示される可変領域を含む。
従って、１つの実施形態において、ＣＤＲ、例えば以下から選択される１、２、３、４、５又は６つのＣＤＲを含む抗体（例えば、抗毒素Ａ抗体）が提供される：
１つの実施形態において、配列１１〜１３が抗体の軽鎖にある。
１つの実施形態において、配列１４〜１６が抗体の重鎖にある。
１つの実施形態において、配列番号１１はＣＤＲ Ｌ１であり、配列番号１２はＣＤＲ Ｌ２であり、配列番号１３はＣＤＲ Ｌ３である。
１つの実施形態において、配列番号１４はＣＤＲ Ｈ１であり、配列番号１５はＣＤＲ Ｈ２であり、配列番号１６はＣＤＲ Ｈ３である。
１つの実施形態において、配列番号１１はＣＤＲ Ｌ１であり、配列番号１２はＣＤＲ Ｌ２であり、配列番号１３はＣＤＲ Ｌ３であり、配列番号１４はＣＤＲ Ｈ１であり、配列番号１５はＣＤＲ Ｈ２であり、配列番号１６はＣＤＲ Ｈ３である。
１つの実施形態において、可変領域、例えば、以下の配列（抗体９２３ 抗毒素Ａ抗体；軽鎖可変領域配列）配列番号１７を有する軽鎖可変領域が提供される：

ここで、ＣＤＲは下線を引かれており、構築物は、ここでＣＡ９２３．ｇ１ ｇＬ１と呼ばれる。
配列番号１７をコードするポリヌクレオチド配列は、図１及びその中の配列番号１８において示される。
１つの実施形態において、可変領域、例えば、以下の配列（抗体９２３ 抗毒素Ａ抗体重鎖可変領域配列）配列番号１９を有する重鎖可変領域が提供される：

ここで、ＣＤＲは下線を引かれており、構築物は、ここでＣＡ９２３．ｇ１ ｇＨ１と呼ばれる。
配列番号１９をコードするポリヌクレオチド配列は、図２及びその中の配列番号２０において示される。
１つの実施形態において、本発明に従う抗体は、配列番号１７及び配列番号１９に示される可変領域を含む。
１つの実施形態において、ＣＤＲ、例えば以下から選択される１、２、３、４、５又は６つのＣＤＲを含む抗体（例えば、抗毒素Ａ抗体）が提供される：
１つの実施形態において、配列２１〜２３が抗体の軽鎖にある。
１つの実施形態において、配列２４〜２６が抗体の重鎖にある。
１つの実施形態において、配列番号２１はＣＤＲ Ｌ１であり、配列番号２２はＣＤＲ Ｌ２であり、配列番号２３はＣＤＲ Ｌ３である。
１つの実施形態において、配列番号２４はＣＤＲ Ｈ１であり、配列番号２５はＣＤＲ Ｈ２であり、配列番号２６はＣＤＲ Ｈ３である。
１つの実施形態において、配列番号２１はＣＤＲ Ｌ１であり、配列番号２２はＣＤＲ Ｌ２であり、配列番号２３はＣＤＲ Ｌ３であり、配列番号２４はＣＤＲ Ｈ１であり、配列番号２５はＣＤＲ Ｈ２であり、配列番号２６はＣＤＲ Ｈ３である。
１つの実施形態において、可変領域、例えば、以下の配列（抗体９９３ 抗毒素Ａ抗体；軽鎖可変領域配列）配列番号２７を有する軽鎖可変領域が提供される：

ここで、ＣＤＲは下線を引かれており、構築物は、ここでＣＡ９９３．ｇ１ ｇＬ１と呼ばれる。
配列番号２７をコードするポリヌクレオチド配列は、図２及びその中の配列番号２８において示される。
１つの実施形態において、可変領域、例えば、以下の配列（抗体９９３ 抗毒素Ａ抗体重鎖可変領域配列）配列番号２９を有する重鎖可変領域が提供される：

ここで、ＣＤＲは下線を引かれており、構築物は、ここでＣＡ９９３．ｇ１ ｇＨ１と呼ばれる。
配列番号２９をコードするポリヌクレオチド配列は、図２及びその中の配列番号３０において示される。
１つの実施形態において、本発明に従う抗体は、配列番号２７及び配列番号２９に示される可変領域を含む。
１つの実施形態において、ＣＤＲ、例えば以下から選択される１、２、３、４、５又は６つのＣＤＲを含む抗体（例えば、抗毒素Ａ抗体）が提供される：
１つの実施形態において、配列３１〜３３が抗体の軽鎖にある。
１つの実施形態において、配列３４〜３６が抗体の重鎖にある。
１つの実施形態において、配列番号３１はＣＤＲ Ｌ１であり、配列番号３２はＣＤＲ Ｌ２であり、配列番号３３はＣＤＲ Ｌ３である。
１つの実施形態において、配列番号３４はＣＤＲ Ｈ１であり、配列番号３５はＣＤＲ Ｈ２であり、配列番号３６はＣＤＲ Ｈ３である。
１つの実施形態において、配列番号３１はＣＤＲ Ｌ１であり、配列番号３２はＣＤＲ Ｌ２であり、配列番号３３はＣＤＲ Ｌ３であり、配列番号３４はＣＤＲ Ｈ１であり、配列番号３５はＣＤＲ Ｈ２であり、配列番号３６はＣＤＲ Ｈ３である。
１つの実施形態において、可変領域、例えば、以下の配列（抗体９９５ 抗毒素Ａ抗体；軽鎖可変領域配列）配列番号３７を有する軽鎖可変領域が提供される：

ここで、ＣＤＲは下線を引かれている。
配列番号３７をコードするポリヌクレオチド配列は、図３及びその中の配列番号３８において示される。
１つの実施形態において、可変領域、例えば、以下の配列（抗体９９５ 抗毒素Ａ抗体重鎖可変領域配列）配列番号３９を有する重鎖可変領域が提供される：

ここで、ＣＤＲは下線を引かれている。
配列番号３９をコードするポリヌクレオチド配列は、図３及びその中の配列番号４０において示される。
１つの実施形態において、本発明に従う抗体は、配列番号３７及び配列番号３９に示される可変領域を含む。
１つの実施形態において、ＣＤＲ、例えば以下から選択される１、２、３、４、５又は６つのＣＤＲを含む抗体（例えば、抗毒素Ａ抗体）が提供される：
１つの実施形態において、配列４１〜４３が抗体の軽鎖にある。
１つの実施形態において、配列４４〜４６が抗体の重鎖にある。
１つの実施形態において、配列番号４１はＣＤＲ Ｌ１であり、配列番号４２はＣＤＲ Ｌ２であり、配列番号４３はＣＤＲ Ｌ３である。
１つの実施形態において、配列番号４４はＣＤＲ Ｈ１であり、配列番号４５はＣＤＲ Ｈ２であり、配列番号４６はＣＤＲ Ｈ３である。
１つの実施形態において、配列番号４１はＣＤＲ Ｌ１であり、配列番号４２はＣＤＲ Ｌ２であり、配列番号４３はＣＤＲ Ｌ３であり、配列番号４４はＣＤＲ Ｈ１であり、配列番号４５はＣＤＲ Ｈ２であり、配列番号４６はＣＤＲ Ｈ３である。
１つの実施形態において、可変領域、例えば、以下の配列（抗体９９７ 抗毒素Ａ抗体；軽鎖可変領域配列）配列番号４７を有する軽鎖可変領域が提供される：

ここで、ＣＤＲは下線を引かれている。
配列番号４７をコードするポリヌクレオチド配列は、図３及びその中の配列番号４８において示される。
１つの実施形態において、可変領域、例えば、以下の配列（抗体９９７ 抗毒素Ａ抗体重鎖可変領域配列）配列番号４９を有する重鎖可変領域が提供される：

ここで、ＣＤＲは下線を引かれている。
配列番号４９をコードするポリヌクレオチド配列は、図４及びその中の配列番号５０において示される。
１つの実施形態において、本発明に従う抗体は、配列番号４７及び配列番号４９に示される可変領域を含む。
１つの実施形態において、ＣＤＲ、例えば以下から選択される１、２、３、４、５又は６つのＣＤＲを含む抗体（例えば、抗毒素Ａ抗体）が提供される：
１つの実施形態において、配列５１〜５３が抗体の軽鎖にある。
１つの実施形態において、配列５４〜５６が抗体の重鎖にある。
１つの実施形態において、配列番号５１はＣＤＲ Ｌ１であり、配列番号５２はＣＤＲ Ｌ２であり、配列番号５３はＣＤＲ Ｌ３である。
１つの実施形態において、配列番号５４はＣＤＲ Ｈ１であり、配列番号５５はＣＤＲ Ｈ２であり、配列番号５６はＣＤＲ Ｈ３である。
１つの実施形態において、配列番号５１はＣＤＲ Ｌ１であり、配列番号５２はＣＤＲ Ｌ２であり、配列番号５３はＣＤＲ Ｌ３であり、配列番号５４はＣＤＲ Ｈ１であり、配列番号５５はＣＤＲ Ｈ２であり、配列番号５６はＣＤＲ Ｈ３である。
１つの実施形態において、可変領域、例えば、以下の配列（抗体１０００ 抗毒素Ａ抗体；軽鎖可変領域配列）配列番号５７を有する軽鎖可変領域が提供される：

ここで、ＣＤＲは下線を引かれている。
配列番号５７をコードするポリヌクレオチド配列は、図４及びその中の配列番号５８において示される。
１つの実施形態において、可変領域、例えば、以下の配列（抗体１０００ 抗毒素Ａ抗体重鎖可変領域配列）配列番号５９を有する重鎖可変領域が提供される：

ここで、ＣＤＲは下線を引かれている。
配列番号５９をコードするポリヌクレオチド配列は、図４及びその中の配列番号６０において示される。
１つの実施形態において、本発明に従う抗体は、配列番号５７及び配列番号５９に示される可変領域を含む。
１つの実施形態において、ＣＤＲ、例えば以下から選択される１、２、３、４、５又は６つのＣＤＲを含む抗体（例えば、抗毒素Ｂ抗体）が提供される：
１つの実施形態において、配列６１〜６３が抗体の軽鎖にある。
１つの実施形態において、配列６４〜６６が抗体の重鎖にある。
１つの実施形態において、配列番号６１はＣＤＲ Ｌ１であり、配列番号６２はＣＤＲ Ｌ２であり、配列番号６３はＣＤＲ Ｌ３である。
１つの実施形態において、配列番号６４はＣＤＲ Ｈ１であり、配列番号６５はＣＤＲ Ｈ２であり、配列番号６６はＣＤＲ Ｈ３である。
１つの実施形態において、配列番号６１はＣＤＲ Ｌ１であり、配列番号６２はＣＤＲ Ｌ２であり、配列番号６３はＣＤＲ Ｌ３であり、配列番号６４はＣＤＲ Ｈ１であり、配列番号６５はＣＤＲ Ｈ２であり、配列番号６６はＣＤＲ Ｈ３である。
１つの実施形態において、可変領域、例えば、以下の配列（抗体９２６ 抗毒素Ｂ抗体；軽鎖可変領域配列）配列番号６７を有する軽鎖可変領域が提供される：

ここで、ＣＤＲは下線を引かれている。
配列番号６７をコードするポリヌクレオチド配列は、図５及びその中の配列番号６８において示される。
１つの実施形態において、可変領域、例えば、以下の配列（抗体９２６ 抗毒素Ｂ抗体重鎖可変領域配列）配列番号６９を有する重鎖可変領域が提供される：

ここで、ＣＤＲは下線を引かれている。
配列番号６９をコードするポリヌクレオチド配列は、図５及びその中の配列番号７０において示される。
１つの実施形態において、ＣＤＲ、例えば以下から選択される１、２、３、４、５又は６つのＣＤＲを含む抗体（例えば、抗毒素Ｂ抗体）が提供される：
１つの実施形態において、配列７１〜７３が抗体の軽鎖にある。
１つの実施形態において、配列７４〜７６が抗体の重鎖にある。
１つの実施形態において、配列番号７１はＣＤＲ Ｌ１であり、配列番号７２はＣＤＲ Ｌ２であり、配列番号７３はＣＤＲ Ｌ３である。
１つの実施形態において、配列番号７４はＣＤＲ Ｈ１であり、配列番号７５はＣＤＲ Ｈ２であり、配列番号７６はＣＤＲ Ｈ３である。
１つの実施形態において、配列番号７１はＣＤＲ Ｌ１であり、配列番号７２はＣＤＲ Ｌ２であり、配列番号７３はＣＤＲ Ｌ３であり、配列番号７４はＣＤＲ Ｈ１であり、配列番号７５はＣＤＲ Ｈ２であり、配列番号７６はＣＤＲ Ｈ３である。
１つの実施形態において、可変領域、例えば、以下の配列（抗体９２７ 抗毒素Ｂ抗体；軽鎖可変領域配列）配列番号７７を有する軽鎖可変領域が提供される：

ここで、ＣＤＲは下線を引かれている。
配列番号７７をコードするポリヌクレオチド配列は、図５及びその中の配列番号７８において示される。
１つの実施形態において、可変領域、例えば、以下の配列（抗体９２７ 抗毒素Ｂ抗体重鎖可変領域配列）配列番号７９を有する重鎖可変領域が提供される：

ここで、ＣＤＲは下線を引かれている。
配列番号７９をコードするポリヌクレオチド配列は、図５及びその中の配列番号８０において示される。
１つの実施形態において、本発明に従う抗体は、配列番号７７及び配列番号７９に示される可変領域を含む。
１つの実施形態において、ＣＤＲ、例えば以下から選択される１、２、３、４、５又は６つのＣＤＲを含む抗体（例えば、抗毒素Ｂ抗体）が提供される：
１つの実施形態において、配列８１〜８３が抗体の軽鎖にある。
１つの実施形態において、配列８４〜８６が抗体の重鎖にある。
１つの実施形態において、配列番号８１はＣＤＲ Ｌ１であり、配列番号８２はＣＤＲ Ｌ２であり、配列番号８３はＣＤＲ Ｌ３である。
１つの実施形態において、配列番号８４はＣＤＲ Ｈ１であり、配列番号８５はＣＤＲ Ｈ２であり、配列番号８６はＣＤＲ Ｈ３である。
１つの実施形態において、配列番号８１はＣＤＲ Ｌ１であり、配列番号８２はＣＤＲ Ｌ２であり、配列番号８３はＣＤＲ Ｌ３であり、配列番号８４はＣＤＲ Ｈ１であり、配列番号８５はＣＤＲ Ｈ２であり、配列番号８６はＣＤＲ Ｈ３である。
１つの実施形態において、可変領域、例えば、以下の配列（抗体１０９９ 抗毒素Ｂ抗体；軽鎖可変領域配列）配列番号８７を有する軽鎖可変領域が提供される：

ここで、ＣＤＲは下線を引かれている。
１つの実施形態において、配列番号８７の最後の２つのアミノ酸（ＲＴ）が、省かれる。
配列番号８７をコードするポリヌクレオチド配列は、図６及びその中の配列番号８８において示される。１つの実施形態において、最後の２つのアミノ酸（ＲＴ）をコードするコドンが、省かれる。
１つの実施形態において、可変領域、例えば、以下の配列（抗体１０９９ 抗毒素Ｂ抗体重鎖可変領域配列）配列番号８９を有する重鎖可変領域が提供される：

ここで、ＣＤＲは下線を引かれている。
配列番号８９をコードするポリヌクレオチド配列は、図６及びその中の配列番号９０において示される。
１つの実施形態において、本発明に従う抗体は、配列番号８７及び配列番号８９に示される可変領域を含む。
１つの実施形態において、ＣＤＲ、例えば以下から選択される１、２、３、４、５又は６つのＣＤＲを含む抗体（例えば、抗毒素Ｂ抗体）が提供される：
１つの実施形態において、配列９１〜９３が抗体の軽鎖にある。
１つの実施形態において、配列９４〜９６が抗体の重鎖にある。
１つの実施形態において、配列番号９１はＣＤＲ Ｌ１であり、配列番号９２はＣＤＲ Ｌ２であり、配列番号９３はＣＤＲ Ｌ３である。
１つの実施形態において、配列番号９４はＣＤＲ Ｈ１であり、配列番号９５はＣＤＲ Ｈ２であり、配列番号９６はＣＤＲ Ｈ３である。
１つの実施形態において、配列番号９１はＣＤＲ Ｌ１であり、配列番号９２はＣＤＲ Ｌ２であり、配列番号９３はＣＤＲ Ｌ３であり、配列番号９４はＣＤＲ Ｈ１であり、配列番号９５はＣＤＲ Ｈ２であり、配列番号９６はＣＤＲ Ｈ３である。
１つの実施形態において、可変領域、例えば、以下の配列（抗体１１０２ 抗毒素Ｂ抗体；軽鎖可変領域配列）配列番号９７を有する軽鎖可変領域が提供される：

ここで、ＣＤＲは下線を引かれている。
配列番号９７をコードするポリヌクレオチド配列は、図６及びその中の配列番号９８において示される。
１つの実施形態において、可変領域、例えば、以下の配列（抗体１１０２ 抗毒素Ｂ抗体重鎖可変領域配列）配列番号９９を有する重鎖可変領域が提供される：

ここで、ＣＤＲは下線を引かれている。
配列番号９９をコードするポリヌクレオチド配列は、図７及びその中の配列番号１００において示される。
１つの実施形態において、本発明に従う抗体は、配列番号９７及び配列番号９９に示される可変領域を含む。
１つの実施形態において、ＣＤＲ、例えば以下から選択される１、２、３、４、５又は６つのＣＤＲを含む抗体（例えば、抗毒素Ｂ抗体）が提供される：
１つの実施形態において、配列１０１〜１０３が抗体の軽鎖にある。
１つの実施形態において、配列１０４〜１０６が抗体の重鎖にある。
１つの実施形態において、配列番号１０１はＣＤＲ Ｌ１であり、配列番号１０２はＣＤＲ Ｌ２であり、配列番号１０３はＣＤＲ Ｌ３である。
１つの実施形態において、配列番号１０４はＣＤＲ Ｈ１であり、配列番号１０５はＣＤＲ Ｈ２であり、配列番号１０６はＣＤＲ Ｈ３である。
１つの実施形態において、配列番号１０１はＣＤＲ Ｌ１であり、配列番号１０２はＣＤＲ Ｌ２であり、配列番号１０３はＣＤＲ Ｌ３であり、配列番号１０４はＣＤＲ Ｈ１であり、配列番号１０５はＣＤＲ Ｈ２であり、配列番号１０６はＣＤＲ Ｈ３である。
１つの実施形態において、可変領域、例えば、以下の配列（抗体１１１４ 抗毒素Ｂ抗体；軽鎖可変領域配列）配列番号１０７を有する軽鎖可変領域が提供される：

ここで、ＣＤＲは下線を引かれている。
配列番号１０７をコードするポリヌクレオチド配列は、図７及びその中の配列番号１０８において示される。
１つの実施形態において、可変領域、例えば、以下の配列（抗体１１１４ 抗毒素Ｂ抗体重鎖可変領域配列）配列番号１０９を有する重鎖可変領域が提供される：

ここで、ＣＤＲは下線を引かれている。
配列番号１０９をコードするポリヌクレオチド配列は、図７及びその中の配列番号１１０において示される。
１つの実施形態において、本発明に従う抗体は、配列番号１０７及び配列番号１０９に示される可変領域を含む。
１つの実施形態において、ＣＤＲ、例えば以下から選択される１、２、３、４、５又は６つのＣＤＲを含む抗体（例えば、抗毒素Ｂ抗体）が提供される：
１つの実施形態において、配列１１１〜１１３が抗体の軽鎖にある。
１つの実施形態において、配列１１４〜１１６が抗体の重鎖にある。
１つの実施形態において、配列番号１１１はＣＤＲ Ｌ１であり、配列番号１１２はＣＤＲ Ｌ２であり、配列番号１１３はＣＤＲ Ｌ３である。
１つの実施形態において、配列番号１１４はＣＤＲ Ｈ１であり、配列番号１１５はＣＤＲ Ｈ２であり、配列番号１１６はＣＤＲ Ｈ３である。
１つの実施形態において、配列番号１１１はＣＤＲ Ｌ１であり、配列番号１１２はＣＤＲ Ｌ２であり、配列番号１１３はＣＤＲ Ｌ３であり、配列番号１１４はＣＤＲ Ｈ１であり、配列番号１１５はＣＤＲ Ｈ２であり、配列番号１１６はＣＤＲ Ｈ３である。
１つの実施形態において、可変領域、例えば、以下の配列（抗体１１１４ グラフト８抗毒素Ｂ抗体；軽鎖可変領域配列）配列番号１１７を有する軽鎖可変領域が提供される：

ここで、ＣＤＲは、下線を引かれている。
配列番号１１７をコードするポリヌクレオチド配列は、図８及びその中の配列番号１１８において示される。
１つの実施形態において、可変領域、例えば、以下の配列（抗体１１１４ グラフト８抗毒素Ｂ抗体重鎖可変領域配列）配列番号１１９を有する重鎖可変領域が提供される：

ここで、ＣＤＲは下線を引かれている。
配列番号１１９をコードするポリヌクレオチド配列は、図８及びその中の配列番号１２０において示される。
１つの実施形態において、本発明に従う抗体は、配列番号１１７及び配列番号１１９に示される可変領域を含む。
１つの実施形態において、ＣＤＲ、例えば以下から選択される１、２、３、４、５又は６つのＣＤＲを含む抗体（例えば、抗毒素Ｂ抗体）が提供される：
１つの実施形態において、配列１２１〜１２３が抗体の軽鎖にある。
１つの実施形態において、配列１２４〜１２６が抗体の重鎖にある。
１つの実施形態において、配列番号１２１はＣＤＲ Ｌ１であり、配列番号１２２はＣＤＲ Ｌ２であり、配列番号１２３はＣＤＲ Ｌ３である。
１つの実施形態において、配列番号１２４はＣＤＲ Ｈ１であり、配列番号１２５はＣＤＲ Ｈ２であり、配列番号１２６はＣＤＲ Ｈ３である。
１つの実施形態において、配列番号１２１はＣＤＲ Ｌ１であり、配列番号１２２はＣＤＲ Ｌ２であり、配列番号１２３はＣＤＲ Ｌ３であり、配列番号１２４はＣＤＲ Ｈ１であり、配列番号１２５はＣＤＲ Ｈ２であり、配列番号１２６はＣＤＲ Ｈ３である。
１つの実施形態において、可変領域、例えば、以下の配列（抗体１１２５ 抗毒素Ｂ抗体；軽鎖可変領域配列）配列番号１２７を有する軽鎖可変領域が提供される：

ここで、ＣＤＲは下線を引かれている。
配列番号１２７をコードするポリヌクレオチド配列は、図８及びその中の配列番号１２８において示される。
１つの実施形態において、可変領域、例えば、以下の配列（抗体１１２５ 抗毒素Ｂ抗体重鎖可変領域配列）配列番号１２９を有する重鎖可変領域が提供される：

ここで、ＣＤＲは下線を引かれている。
１つの実施形態において、配列番号１２９の最後のアミノ酸（Ｓ）は、省かれる。
配列番号１２９をコードするポリヌクレオチド配列は、図９及びその中の配列番号１３０において示される。
１つの実施形態において、最後のアミノ酸ＳをコードするコドンＡＧＣは、省かれる。
１つの実施形態において、本発明に従う抗体は、配列番号１２７及び配列番号１２９に示される可変領域を含む。
１つの実施形態において、ＣＤＲ、例えば以下から選択される１、２、３、４、５又は６つのＣＤＲを含む抗体（例えば、抗毒素Ｂ抗体）が提供される：
１つの実施形態において、配列１３１〜１３３は、抗体の軽鎖にある。
１つの実施形態において、配列１３４〜１３６は、抗体の重鎖にある。
１つの実施形態において、配列番号１３１はＣＤＲ Ｌ１であり、配列番号１３２はＣＤＲ Ｌ２であり、配列番号１３３はＣＤＲ Ｌ３である。
１つの実施形態において、配列番号１３４はＣＤＲ Ｈ１であり、配列番号１３５はＣＤＲ Ｈ２であり、配列番号１３６はＣＤＲ Ｈ３である。
１つの実施形態において、配列番号１３１はＣＤＲ Ｌ１であり、配列番号１３２はＣＤＲ Ｌ２であり、配列番号１３３はＣＤＲ Ｌ３であり、配列番号１３４はＣＤＲ Ｈ１であり、配列番号１３５はＣＤＲ Ｈ２であり、配列番号１３６はＣＤＲ Ｈ３である。
１つの実施形態において、可変領域、例えば、以下の配列（抗体１１２９ 抗毒素Ｂ抗体；軽鎖可変領域配列）配列番号１３７を有する軽鎖可変領域が提供される：

ここで、ＣＤＲは下線を引かれている。
配列番号１３７をコードするポリヌクレオチド配列は、図８及びその中の配列番号１３８において示される。
１つの実施形態において、可変領域、例えば、以下の配列（抗体１１２９ 抗毒素Ｂ抗体重鎖可変領域配列）配列番号１３９を有する重鎖可変領域が提供される：

ここで、ＣＤＲは下線を引かれている。
１つの実施形態において、配列番号１３９の最後のアミノ酸（Ｓ）は、省かれる。
配列番号１３９をコードするポリヌクレオチド配列は、図８及びその中の配列番号１４０において示される。１つの実施形態において、最後のアミノ酸ＳをコードするコドンＡＧＣは、省かれる。
１つの実施形態において、本発明に従う抗体は、配列番号１３７及び配列番号１３９に示される可変領域を含む。
１つの実施形態において、ＣＤＲ、例えば以下から選択される１、２、３、４、５又は６つのＣＤＲを含む抗体（例えば、抗毒素Ｂ抗体）が提供される：
１つの実施形態において、配列１４１〜１４３が抗体の軽鎖にある。
１つの実施形態において、配列１４４〜１４６が抗体の重鎖にある。
１つの実施形態において、配列番号１４１はＣＤＲ Ｌ１であり、配列番号１４２はＣＤＲ Ｌ２であり、配列番号１４３はＣＤＲ Ｌ３である。
１つの実施形態において、配列番号１４４はＣＤＲ Ｈ１であり、配列番号１４５はＣＤＲ Ｈ２であり、配列番号１４６はＣＤＲ Ｈ３である。
１つの実施形態において、配列番号１４１はＣＤＲ Ｌ１であり、配列番号１４２はＣＤＲ Ｌ２であり、配列番号１４３はＣＤＲ Ｌ３であり、配列番号１４４はＣＤＲ Ｈ１であり、配列番号１４５はＣＤＲ Ｈ２であり、配列番号１４６はＣＤＲ Ｈ３である。
１つの実施形態において、可変領域、例えば、以下の配列（抗体１１３４ 抗毒素Ｂ抗体；軽鎖可変領域配列）配列番号１４７を有する軽鎖可変領域が提供される：

ここで、ＣＤＲは下線を引かれている。
配列番号１４７をコードするポリヌクレオチド配列は、図９及びその中の配列番号１４８において示される。
１つの実施形態において、可変領域、例えば、以下の配列（抗体１１３４ 抗毒素Ｂ抗体重鎖可変領域配列）配列番号１４９を有する重鎖可変領域が提供される：

ここで、ＣＤＲは下線を引かれている。
配列番号１４９をコードするポリヌクレオチド配列は、図９及びその中の配列番号１５０において示される。
１つの実施形態において、本発明に従う抗体は、配列番号１４７及び配列番号１４９に示される可変領域を含む。
１つの実施形態において、ＣＤＲ、例えば、以下から選択される１、２、３、４、５又は６つのＣＤＲを含む抗体（例えば、抗毒素Ｂ抗体）が提供される：
１つの実施形態において、配列１５１〜１５３が抗体の軽鎖にある。
１つの実施形態において、配列１５４〜１５６が抗体の重鎖にある。
１つの実施形態において、配列番号１５１はＣＤＲ Ｌ１であり、配列番号１５２はＣＤＲ Ｌ２であり、配列番号１５３はＣＤＲ Ｌ３である。
１つの実施形態において、配列番号１５４はＣＤＲ Ｈ１であり、配列番号１５５はＣＤＲ Ｈ２であり、配列番号１５６はＣＤＲ Ｈ３である。
１つの実施形態において、配列番号１５１はＣＤＲ Ｌ１であり、配列番号１５２はＣＤＲ Ｌ２であり、配列番号１５３はＣＤＲ Ｌ３であり、配列番号１５４はＣＤＲ Ｈ１であり、配列番号１５５はＣＤＲ Ｈ２であり、配列番号１５６はＣＤＲ Ｈ３である。
１つの実施形態において、可変領域、例えば、以下の配列（抗体１１５１ 抗毒素Ｂ抗体；軽鎖可変領域配列）配列番号１５７を有する軽鎖可変領域が提供される：

ここで、ＣＤＲは下線を引かれている。
配列番号１５７をコードするポリヌクレオチド配列は、図９及びその中の配列番号１５８において示される。
１つの実施形態において、可変領域、例えば、以下の配列（抗体１１５１ 抗毒素Ｂ抗体重鎖可変領域配列）配列番号１５９を有する重鎖可変領域が提供される：

ここで、ＣＤＲは下線を引かれている。
配列番号１５９をコードするポリヌクレオチド配列は、図９及びその中の配列番号１６０において示される。
１つの実施形態において、本発明に従う抗体は、配列番号１５７及び配列番号１５９に示される可変領域を含む。
１つの実施形態において、ＣＤＲ、例えば、以下から選択される１、２、３、４、５又は６つのＣＤＲを含む抗体（例えば、抗毒素Ｂ抗体）が提供される：
１つの実施形態において、配列１６１〜１６３が抗体の軽鎖にある。
１つの実施形態において、配列１６４〜１６６が抗体の重鎖にある。
１つの実施形態において、配列番号１６１はＣＤＲ Ｌ１であり、配列番号１６２はＣＤＲ Ｌ２であり、配列番号１６３はＣＤＲ Ｌ３である。
１つの実施形態において、配列番号１６４はＣＤＲ Ｈ１であり、配列番号１６５はＣＤＲ Ｈ２であり、配列番号１６６はＣＤＲ Ｈ３である。
１つの実施形態において、配列番号１６１はＣＤＲ Ｌ１であり、配列番号１６２はＣＤＲ Ｌ２であり、配列番号１６３はＣＤＲ Ｌ３であり、配列番号１６４はＣＤＲ Ｈ１であり、配列番号１６５はＣＤＲ Ｈ２であり、配列番号１６６はＣＤＲ Ｈ３である。
１つの実施形態において、可変領域、例えば、以下の配列（抗体１１５３ 抗毒素Ｂ抗体；軽鎖可変領域配列）配列番号１６７を有する軽鎖可変領域が提供される：

ここで、ＣＤＲは下線を引かれている。
配列番号１６７をコードするポリヌクレオチド配列は、図１０及びその中の配列番号１６８において示される。
１つの実施形態において、可変領域、例えば、以下の配列（抗体１１５３ 抗毒素Ｂ抗体重鎖可変領域配列）配列番号１６９を有する重鎖可変領域が提供される：

ここで、ＣＤＲは下線を引かれている。
配列番号１６９をコードするポリヌクレオチド配列は、図１０及びその中の配列番号１７０において示される。
１つの実施形態において、本発明に従う抗体は、配列番号１６７及び配列番号１６９に示される可変領域を含む。
１つの実施形態において、配列番号１、２、３、４、５、６、１１、１２、１３、１４、１５、１６、２１、２２、２３、２４、２５、２６、３１、３２、３３、３４、３５、３６、４１、４２、４３、４４、４５、４６、５１、５２、５３、５４、５５、５６、６１、６２、６３、６４、６５、６６、７１、７２、７３、７４、７５、７６、８１、８２、８３、８４、８５、８６、９１、９２、９３、９４、９５、９６、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１２１，１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５及び１６６から独立して選択される６つのＣＤＲを含む抗体が、提供される。
１つの実施形態において、配列番号１、２、３、４、５、６、１１、１２、１３、１４、１５、１６、２１、２２、２３、２４、２５、２６、３１、３２、３３、３４、３５、３６、４１、４２、４３、４４、４５、４６、５１、５２、５３、５４、５５及び５６から独立して選択される６つのＣＤＲを含む抗ＴｃｄＡ抗体が、提供される。
１つの実施形態において、配列番号６１、６２、６３、６４、６５、６６、７１、７２、７３、７４、７５、７６、８１、８２、８３、８４、８５、８６、９１、９２、９３、９４、９５、９６、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５及び１６６から独立して選択される６つのＣＤＲを含む抗ＴｃｄＢ抗体が、提供される。
１つの実施形態において、配列番号７、９、１７、１９、２７、２９、３７、３９、４７、４９、５７、５９、６７、６９、７７、７９、８７、８９、９７、９９、１０７、１０９、１１７、１１９、１２７、１２９、１３７、１３９、１４７、１４９、１５７及び１５９から独立して選択される２つの可変領域を含む抗体が、提供される。
１つの実施形態において、配列番号７、９、１７、１９、２７、２９、３７、３９、４７、４９、５７及び５９から独立して選択される２つの可変領域を含む抗体が、提供される。
１つの実施形態において、配列番号６７、６９、７７、７９、８７、８９、９７、９９、１０７、１０９、１１７、１１９、１２７、１２９、１３７、１３９、１４７、１４９、１５７及び１５９から独立して選択される２つの可変領域を含む抗体が、提供される。
１つの実施形態において、本発明に従う抗体は、ヒト化されている。
１つの実施形態において、この抗体（単数又は複数）は、ＴｃｄＡ及び／又はＴｃｄＢ毒素のＣ末端「細胞結合」部分に対する。
１つの実施形態において、本発明に従う抗体は、毒素Ａ又は毒素Ｂを中和するために好適である。
ここで使用される場合、中和するは、標的毒素の害のある／有害な効果の消滅又は低減、例えば関連の有害効果における少なくとも５０％の低減を意味するものとする。
本発明者らは、本願において発見された抗体間の内部比較を用いることによって、及び当該分野で十分に記載されている（Babcock et al. 2006; Lowy et al., 2010）抗体に対する比較を用いることによって、いくつかの抗体は、高い毒素濃度にあっても、有効な中和（例えば、低ＥＣ５０及び高い％防御）を維持する望ましい特徴を有することを確立した。当該分野で記載されているものを含む他の抗体は、高い毒素濃度において有効な毒素中和を維持しない。
有効な毒素濃度は、中和抗体の非存在下で、滴定研究において「致死用量」（ＬＤ）として規定され得る。中和アッセイは、代表的に、完全細胞殺傷の５０％のＬＤ（すなわち、ＬＤ５０）において行われるが、より厳密に、ＬＤ８０において行われてもよい。
アッセイは、かなり負荷の高い（challenging）条件、例えば、ＬＤ９０、ＬＤ９５及び／又はＬＤｍａｘ（ＬＤｍａｘは、アッセイ容量及び最大毒素濃度／溶解度によって制約される、アッセイに含まれ得る最大毒素量である）においても、実施され得る。このようなアッセイは、腸におけるＣ．ディフィシレ増殖が激しく、下痢及び他の症状から毒素濃度がその最大にあるとの仮定に導かれる場合、ヒトの感染の初期段階を模倣することを目的とする。高い毒素濃度条件下で毒素の損傷活性を有効に中和する抗体は、本発明者らによって、ヒト感染における症状を制御するために、特別な臨床的価値を有すると考えられる。１つの実施形態において、本開示の抗体（単数又は複数）は、１つ又は複数のＬＤ８０、ＬＤ９０、ＬＤ９５及び／又はＬＤｍａｘについて、有用な、例えば低ＥＣ５０値及び／又は細胞死からの高い％防御を有する。１つの実施形態において、後者の条件の１つ又は複数におけるＥＣ５０は、１５ｎｇ／ｍｌ以下、例えば１０ｎｇ／ｍｌ以下、例えば５ｎｇ／ｍｌ以下、詳細には１ｎｇ／ｍｌ以下である。１つの実施形態において、細胞死からの％防御は、９０％を超えるか、又は７５％を超えるか、又は５０％を超える。
従って、１つの実施形態において、本開示は、例えばここで提供されるアッセイで測定されるように、高レベルの毒素の存在下であっても、毒素中和を維持する抗体又は抗体の組み合わせを提供する。
毒素の有害効果は、例えば、好適なインビトロアッセイにおいて測定され得る。１つの実施形態において、中和は、以下の例１に示されるアッセイにおいて測定される。中和アッセイにおいて同定される抗体（単数又は複数）、例えば、抗体の力価が高レベルの毒素の存在下において維持される抗体もまた、提供される。
毒素Ａは、ＴｃｄＡと相互交換可能に使用される。
毒素Ｂは、ＴｃｄＢと相互交換可能に使用される。
１つの実施形態において、本発明に従う抗体は、モノクローナル抗体又はその結合断片である。
１つの実施形態において、本発明に従うモノクローナル抗体は、非常に高い力価及び親和性で、ＴｃｄＡを中和できる。
１つの実施形態において、本発明に従うモノクローナル抗体は、非常に高い力価及び親和性並びに高い結合活性で、ＴｃｄＡを中和できる。
ここで使用される場合、結合活性は、複数の結合親和性の複合強度を意味する。
１つの実施形態において、本発明に従うモノクローナル抗体は、非常に高い力価及び親和性並びに高い結合活性及び高い結合価で、ＴｃｄＡを中和できる。
ここで使用される場合、結合価は、モノクローナル抗体が抗原に複数回結合する能力を意味する。従って、高い結合価は、抗原の抗体による高レベルの修飾及び／又は毒素分子の高レベルの架橋をもたらし、これは、有利であると考えられる。
本開示に従う抗ＴｃｄＡ Ｍａｂは、ＴｃｄＡの早期効果、例えばタイトジャンクションの喪失などの細胞に対する早期効果を中和するために好適であり得る。
ここで使用されるタイトジャンクションは、単層又は解剖学的組織構造内の細胞間の結合の不透過性領域を意味するものとする。タイトジャンクションがその構造的及び機能的な完全性を保持している場合、体液喪失は起こらない。タイトジャンクションの喪失は、細胞が毒素によって損なわれていることの指標であり、ＴｃｄＡ及びＴｃｄＢの毒性効果における早期段階であることが十分に記載されていて（２５）、血清、免疫グロブリン及びイオンを含む体液の喪失をもたらす（２６、３）。タイトジャンクションの喪失は、ヒトにおける下痢の発症の第一段階と考えられている。
ＴＥＥＲアッセイ系は、インビトロでタイトジャンクションの喪失を測定するために使用され得る。ＴＥＥＲは、経上皮電気抵抗アッセイの頭字語であり、一般に、胃内皮壁に代表される分化した細胞層の透過性を測定するために使用される。しかし、抗体についてのスクリーニングの文脈において、ＴＥＥＲ喪失は、タイトジャンクションに対する損傷を減速するか又は予防する抗体を同定するために使用され得、従って、下痢をもたらす組織損傷に対する防御のための代理物である。
しばしば、Ｃａｃｏ−２が使用される。何故なら、これらは、ヒト結腸細胞に由来し、タイトジャンクションによって結合する細胞による分化した単層を形成することが公知であるからである。キットは、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎより、Ｃａｃｏ−２ ＢｉｏＣｏａｔ ＨＴＳプレートシステム（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ／３５４８０２）の名称で市販されている。キット中の指示は、この状況において試験するために好適である。膜の抵抗は、膜が損なわれている場合に変化する。
一般に、抗体は、ＴＥＥＲ系に添加される前に毒素と共にプレインキュベートされ、抗体が毒素によって引き起こされる膜に対する損傷を予防又は減速し得るかどうかを確立される。アッセイは、好適な期間、例えば２４時間にわたって実施され得、特定の時点で測定を行う。本発明者らは、４時間の時点で、治療的に有用な抗体が特に識別されることを確立している。ＴＥＥＲアッセイにおいて使用される毒素の濃度は、一般に、１００〜２００ｎｇ／ｍｌの範囲内であり、最も好ましくは、１２５ｎｇ／ｍｌである。
ＴＥＥＲアッセイにおいて使用される抗体（例えば、ＩｇＧ１）の濃度は、一般に、４〜２０００ｎｇ／ｍｌ、例えば５０〜１０００ｎｇ／ｍｌ、例えば１００〜５００ｎｇ／ｍｌの範囲内である。
１つの実施形態において、前記条件において使用されるＴＥＥＲアッセイにおける抗体のＥＣ５０は、少なくとも２００ｎｇ／ｍｌ、例えば１００ｎｇ／ｍｌ未満、例えば約６０〜８０ｎｇ／ｍｌである。
１つの実施形態において、Ｃ．ディフィシレ感染の処置又は予防における治療剤としての使用のために好適な抗ＴｃｄＡ抗体又は抗ＴｃｄＢ抗体が提供され、ここで、前記抗体は、ＴＥＥＲアッセイを使用してスクリーニングされ、そして選択される。
１つの局面において、ＴＥＥＲアッセイにおいて、タイトジャンクションの喪失を減速するか又は予防する能力について抗体をスクリーニングする方法が、提供される。１つの実施形態において、スクリーニングされる抗体（単数又は複数）は、抗ＴｃｄＡ抗体である。１つの実施形態において、スクリーニングされる抗体（単数又は複数）は、抗ＴｃｄＢ抗体である。１つの実施形態において、スクリーニングされる抗体（単数又は複数）は、抗ＴｃｄＡ抗体と抗ＴｃｄＢ抗体との組み合わせである。１つの実施形態において、この方法は、適切な抗体（単数又は複数）を同定し、その好適な量を発現する工程を含む。１つの実施形態において、この方法は、前記抗体（単数又は複数）を医薬製剤に製剤化するさらなる工程を含む。１つの実施形態において、この方法は、前記抗体（単数又は複数）又は前記製剤を、それを必要とする患者に投与するさらなる工程を含む。
１つの実施形態において、本開示の複数の抗体は、標的毒素（ＴｃｄＡ又はＴｃｄＢ）に対して結合可能であってもよく、これは、この毒素の免疫クリアランスを補助し得る。
ここで使用される複数の抗体は、同じ配列を有する抗体の複数のコピー、又は同じアミノ酸配列を有する抗体、又は異なるアミノ酸配列を有するが同じ標的抗原に対して特異的な抗体を意味するものとする。
１つの実施形態において、本発明に従う抗体は、標的抗原に対して特異的であり例えば、標的抗原におけるエピトープに対して特異的である。
１つの実施形態において、本発明の抗体は、２つ以上の位置、例えば２つ若しくは３つの位置、例えば、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０以上の位置で標的抗原に結合することができる。例えば、毒素は、反復ドメインを含み得、従って、抗体は、エピトープに対して特異的であり得、実際に、エピトープは、抗原において数回、すなわち、１つ以上の位置で、存在し得る。従って、所定の抗体は、同じエピトープに複数回、抗原における異なる位置で結合し得る。
１つの実施形態において、抗体は、所定の抗原に、複数回、例えば、２〜２０回、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又は１６回結合する。１つの実施形態において、抗体は、所定の抗原に、少なくとも３回結合する。この複数回結合は、毒素の中和及び／又はクリアランスに重要であると考えられる。理論に縛られることを望まないが、複数回、例えば３回以上の、すなわち、３以上のＦｃ断片による修飾による結合は、主に肝臓及び脾臓を介した（２７、２８）毒素の迅速なクリアランスの引き金を引くために重要である（２４）。
１つの実施形態において、抗ＴｃｄＡ抗体は、３回以上、例えば３〜１６回結合する。
１つの実施形態において、抗ＴｃｄＡ抗体は、１２回結合する。
１つの実施形態において、抗ＴｃｄＡ抗体は、２回結合する。
１つの実施形態において、抗ＴｃｄＡ抗体は、ＴｃｄＡの触媒末端細胞結合ドメインにおいて結合する。
１つの実施形態において、抗ＴｃｄＢ抗体は、２回以上、例えば２回結合する。
１つの実施形態において、抗ＴｃｄＢ抗体は、ＴｃｄＢの触媒末端細胞結合ドメインにおいて結合する。
１つの実施形態において、本開示に従う抗体（単数又は複数）は、毒素分子を架橋することができ、例えば、抗体分子の１つの腕が、１つの毒素分子に結合し、そして抗体の別の腕が、異なる毒素分子におけるエピトープに結合し、それによって、１種の免疫複合体を形成する。後者の形成はまた、免疫系の活性化を促進して関連の毒素を除去させ、それによってこの毒素の有害なインビボ効果を最小化することもできる。
１つの実施形態において、生来の免疫応答、例えば補体が、活性化される。
１つの実施形態において、本開示の抗体（単数又は複数）は、異なるリボタイプの株、例えば００３、０２７、０７８に由来する毒素に対する高い力価を有する。
１つの実施形態において、ＴｃｄＡに対する抗体は、例えば、リボタイプ００３、０２７及び０７８の株由来の毒素に対し、ＬＤ８０〜９５の毒素濃度において、０．１〜１００ｎｇ／ｍｌ、例えば１〜１０ｎｇ／ｍｌの範囲内のＥＣ５０、及び５０〜１００％の範囲内の最大阻害を有し得る。
１つの実施形態において、ＴｃｄＡに対する抗体は、例えば、リボタイプ００３、０２７及び０７８の株由来の毒素に対し、ＬＤ８０〜９５の毒素濃度において、０．１〜１００ｎｇ／ｍｌ、例えば１〜１０ｎｇ／ｍｌの範囲内のＥＣ５０、及び６０〜１００％、７０〜１００％、８０〜１００％又は９０〜１００％の範囲内の最大阻害を有し得る。
１つの実施形態において、ＴｃｄＢに対する抗体は、例えば、リボタイプ００３の株由来の毒素に対し、ＬＤ８０〜９５の毒素濃度において、０．１〜１００ｎｇ／ｍｌ、例えば１〜１０ｎｇ／ｍｌの範囲内のＥＣ５０、及び５０〜１００％の範囲内の最大阻害を有し得る。
１つの実施形態において、ＴｃｄＢに対する抗体は、例えば、リボタイプ００３の株由来の毒素に対し、ＬＤ８０〜９５の毒素濃度において、０．１〜１００ｎｇ／ｍｌ、例えば１〜１０ｎｇ／ｍｌの範囲内のＥＣ５０、及び６０〜１００％、７０〜１００％、８０〜１００％又は９０〜１００％の範囲内の最大阻害を有し得る。
１つの実施形態において、本発明に従う抗体の組み合わせ、例えばＴｃｄＡに特異的な抗体の組み合わせ、ＴｃｄＢに特異的な抗体の組み合わせ、又はＴｃｄＡに特異的な抗体とＴｃｄＢに特異的な抗体との組み合わせが提供される。
ＴｃｄＡに特異的な抗体の組み合わせは、一般に、標的抗原ＴｃｄＡ上の異なるエピトープに対する抗体の組み合わせ、又は少なくとも異なる結合特性を有する抗体の組み合わせを意味する。
ＴｃｄＢに特異的な抗体の組み合わせは、一般に、標的抗原ＴｃｄＢ上の異なるエピトープに対する抗体の組み合わせ、又は少なくとも異なる結合特性を有する抗体の組み合わせを意味する。
組み合わせは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５の別個の抗体、例えば２、３、４又は５の抗体を含み得る。
１つの実施形態において、１つの抗ＴｃｄＡ抗体と２つの抗ＴｃｄＢ抗体の組み合わせ、例えば、抗ＴｃｄＡ抗体が９９７であり、抗ＴｃｄＢ抗体が１１２５及び１１５１である組み合わせが提供される。
詳細には、配列番号４９に示される配列を有する重鎖可変領域及び配列番号４７に示される配列を有する軽鎖可変領域を含む１つの抗ＴｃｄＡ抗体と、配列番号１２９に示される重鎖可変領域及び配列番号１２７に示される軽鎖可変領域を有する第１の抗体並びに配列番号１５９に示される重鎖可変領域及び配列番号１５７に示される軽鎖可変領域を有する第２の抗体の２つの抗ＴｃｄＢ抗体との組み合わせが、提供される。
ここで使用される場合、別個の抗体は、標的抗原上の同じエピトープ又は異なるエピトープに結合し得る異なるアミノ酸配列を有する抗体を意味するものとする。
また、本発明によって提供される抗体、詳細には配列番号４９に示される重鎖配列及び配列番号４７に示される軽鎖配列を含む抗体によって結合される、ＴｃｄＡの特異的領域又はエピトープが、本発明によって提供される。
また、本発明によって提供される抗体、詳細には配列番号１２９に示される重鎖配列及び配列番号１２７に示される軽鎖配列を含む抗体、又は配列番号１５９に示される重鎖配列及び配列番号１５７に示される軽鎖配列を含む抗体によって結合される、ＴｃｄＢの特異的領域又はエピトープが、本発明によって提供される。
ＴｃｄＡ若しくはＴｃｄＢ毒素のこの特異的領域又はエピトープは、本発明によって提供される抗体の任意の１つと組み合わせた当該分野で公知の任意の好適なエピトープマッピング方法によって同定され得る。このような方法の例としては、毒素に由来する種々の長さのペプチドを、本発明の抗体への結合について、この抗体によって認識されるエピトープの配列を含む抗体に特異的に結合し得る最小の断片によってスクリーニングすることが挙げられる。ペプチドは、合成的に生成されても、毒素ポリペプチドのタンパク質分解消化によって生成されてもよい。抗体に結合するペプチドは、例えば、質量分析によって同定され得る。別の例において、ＮＭＲ分光学又はＸ線結晶学が、本発明の抗体によって結合されるエピトープを同定するために使用され得る。一旦同定されると、本発明の抗体に結合するこのエピトープ断片は、必要である場合、同じエピトープに結合するさらなる拮抗性の抗体を得るための免疫原として使用され得る。
本発明に従う抗体の結合を交差遮断する抗体は、同様に、毒素活性を中和する際に有用であり得る。従って、本発明はまた、ＴｃｄＡ又はＴｃｄＢに対する特異性を有する、ＴｃｄＡ若しくはＴｃｄＢに対する上記の抗体のいずれか１つの結合を交差遮断するか、及び／又はこれらの抗体のいずれか１つによってこれらの毒素の結合から交差遮断される中和抗体を提供する。１つの実施形態において、このような抗体は、ここで上記された抗体と同じエピトープに結合する。別の実施形態において、交差遮断する中和抗体は、ここで上記される抗体によって結合されるエピトープと境を接するか及び／又は重複するエピトープに結合する。別の実施形態において、本発明のこの局面の交差遮断する中和抗体は、本発明の抗体と同じエピトープ、又は前記エピトープと境を接するか及び／若しくは重複するエピトープに結合しない。
交差遮断する抗体は、当該分野で好適な任意の方法、例えば、競合ＥＬＩＳＡ又はＢＩＡｃｏｒｅアッセイ（ここでは、交差遮断する抗体のＴｃｄＡ又はＴｃｄＢに対する結合が、本発明の抗体の結合によって防止されるか、又はその逆である）を用いて同定され得る。
１つの実施形態において、抗ＴｃｄＡ又は抗ＴｃｄＢ抗体、詳細には、中和抗体及び／又はここで記載される抗体の結合を交差遮断する抗体を作製する方法が提供され、前記方法は、好適な抗原、例えば配列番号１７３〜１９４のいずれか１つに示される抗原又はこれらの組み合わせによって、宿主を免疫化する工程を含む。前記方法はまた、１つ又は複数の以下の工程を含む：例えば、目的の抗体を同定する工程（詳細には、機能的アッセイ、例えばＴＥＥＲアッセイを用いる）、目的の抗体を発現する工程、及び必要に応じて、この抗体を薬学的に許容可能な組成物として製剤化する工程。
従って、１つの局面において、本開示は、配列番号１７３〜１９４に示されるアミノ酸配列又はこれらの組み合わせによって宿主を免疫化する方法を提供する。
１つの実施形態において、本発明に従う抗体は、標的抗原に対し、１０ｎＭ以下、例えば１ｎＭ以下、例えば９００ｐＭ、詳細には８００ｐＭ、７００ｐＭ、６００ｐＭ又は５００ｐＭ、例えば６０ｐＭの親和性を有する。
１つの実施形態において、親和性は、ＴｃｄＡ若しくはＴｃｄＢ又はこれらの断片についてである。１つの例において、この断片は、ＴｃｄＡの残基Ｓ１８２７〜Ｄ２２４９に対応するＴｃｄＡ１２３である。１つの例において、この断片は、残基Ｇ２２０５〜Ｒ２６０８に対応するＴｃｄＡ４５６である。１つの実施形態において、この断片は、ＴｃｄＢの残基Ｓ１８３３〜Ｅ２３６６に対応するＴｃｄＢ１２３４である。
１つの実施形態において、本発明に従う抗体又はその組み合わせは、２００ｎｇ／ｍｌ以下、例えば１５０ｎｇ／ｍｌ以下、例えば１００ｎｇ／ｍｌ以下、例えば０．１〜１０ｎｇ／ｍｌの範囲内のＥＣ５０を有する。
混合物の個々の構成要素抗体は、これらが、１つ又は複数の抗体と組み合わせて使用される場合に、この組み合わせが前記範囲内のＥＣ５０を有する限り、前記範囲内のＥＣ５０を有することが必須ではない。
有利にも、本発明の抗体は、安定的であり、例えば、５０℃を超える温度、例えば６０℃又は７０℃において熱安定性である。
本発明に従う抗体及び組み合わせはまた、１つ又は複数の以下の有利な特性を有する：遅いオフレート、高い親和性、高い力価、標的抗原に複数回結合する能力、測定可能なＴＥＥＲ活性の喪失を低下するメカニズムにより毒素を中和すること、宿主天然免疫応答を刺激するか若しくは補助すること、病原（又は毒素）の免疫クリアランスを触媒するか若しくは補助すること、及び／又は病原（又は毒素）に対して適切に応答するよう免疫系を教育すること。
抗体可変ドメインにおける残基は、従来、Ｋａｂａｔらによって考案されたシステムに従って番号付けられる。このシステムは、Kabat et al., 1987, in Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA（以後「Ｋａｂａｔら（前出）」）に記載される。この番号付けシステムは、そうでないと示されない限り、本明細書中で使用される。
Ｋａｂａｔ残基名称は、アミノ酸残基の直鎖番号付けと必ずしも直接対応しない。実際の直鎖アミノ酸配列は、基本的可変ドメイン構造のフレームワーク又は相補性決定領域（ＣＤＲ）のいずれにせよ、構造的構成要素の短縮又はそれへの挿入に対応する厳密なＫａｂａｔ番号付けにおけるよりも、より少ないか又は追加のアミノ酸を含み得る。残基の正確なＫａｂａｔ番号付けは、「標準的」Ｋａｂａｔ番号付けをされた配列を有する抗体の配列における残基の相同性のアラインメントにより、所定の抗体について決定され得る。
重鎖可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って、残基３１〜３５（ＣＤＲ−Ｈ１）、残基５０〜６５（ＣＤＲ−Ｈ２）及び残基９５〜１０２（ＣＤＲ−Ｈ３）に位置する。しかし、Ｃｈｏｔｈｉａに従うと、（Chothia, C. and Lesk, A.M. J. Mol. Biol., 196, 901-917 (1987)）、ＣＤＲ−Ｈ１と同等のループは、残基２６から残基３２まで延びる。従って、そうでないと示されない限り、「ＣＤＲ−Ｈ１」は、ここで使用される場合、Ｋａｂａｔ番号付けシステム及びＣｈｏｔｈｉａトポロジカルループ定義の組み合わせによって記載されるように、残基２６〜３５を意味するものとする。
軽鎖可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って、残基２４〜３４（ＣＤＲ−Ｌ１）、残基５０〜５６（ＣＤＲ−Ｌ２）及び残基８９〜９７（ＣＤＲ−Ｌ３）に位置する。
本発明における使用のための抗体は、当該分野で公知の任意の好適な方法を用いて得ることができる。融合タンパク質、例えば毒素−Ｆｃ融合タンパク質を含む毒素Ａ及び／又は毒素Ｂポリペプチド／タンパク質又はポリペプチド（例えば、活性化Ｔ細胞）を（組換え的に又は天然で）発現する細胞は、標的毒素を特異的に認識する抗体を生成するために使用され得る。毒素ポリペプチドは、完全長ポリペプチド又はその生物学的に活性な断片若しくは誘導体であり得る。
ポリペプチドは、当該分野で周知のプロセスによって、発現系を含む遺伝子操作された宿主細胞から調製され得るか、又はこれらは、天然の生物学的供給源から回収され得る。本願において、用語「ポリペプチド」は、ペプチド、ポリペプチド及びタンパク質を含む。これらは、そうでないと特定されない限り、相互交換可能に使用される。リボタイプ０２７由来のＴｃｄＡについての配列は、配列番号１７１（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｃ９ＹＪ３７）において示され、そしてリボタイプ０２７由来のＴｃｄＢについての配列は、配列番号１７２（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｃ９ＹＪ３５）において示される。
抗原ポリペプチドは、いくつかの場合、例えばアフィニティタグに融合した融合タンパク質などのより大きなタンパク質の一部であってもよい。
抗原ポリペプチドに対して作製された抗体は、動物の免疫化が必要な場合に、ポリペプチドを動物、好ましくは非ヒト動物に、周知且つ慣用的なプロトコール（例えば、Handbook of Experimental Immunology, D. M. Weir (ed.), Vol 4, Blackwell Scientific Publishers, Oxford, England, 1986を参照されたい）を用いて投与することによって得ることができる。多くの温血動物、例えばウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、雌ウシ、ラクダ又はブタが、免疫化される。しかし、マウス、ウサギ、ブタ及びラットが、一般に最も好適である。
モノクローナル抗体は、当該分野で公知の任意の方法、例えばハイブリドーマ技術（Kohler & Milstein, 1975, Nature, 256:495-497）、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kozbor et al., 1983, Immunology Today, 4:72）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp77-96, Alan R Liss, Inc., 1985）によって調製され得る。
本発明における使用のための抗体はまた、特異的抗体の生成のために選択された一リンパ球から作製された免疫グロブリン可変領域ｃＤＮＡのクローニング及び発現によって、例えば、Babcook, J. et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(15):7843-7848l；ＷＯ９２／０２５５１；ＷＯ２００４／０５１２６８及び国際特許出願番号ＷＯ２００４／１０６３７７によって記載された方法により、一リンパ球抗体方法を用いて作製され得る。
ヒト化抗体（ＣＤＲグラフト抗体を含む）は、非ヒト種由来の１つ又は複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）及びヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する抗体分子である（例えば、ＵＳ５，５８５，０８９号；ＷＯ９１／０９９６７を参照されたい）。完全なＣＤＲよりもむしろＣＤＲの特異性決定残基を移す必要があるのみであり得ることが、理解される（例えば、Kashmiri et al., 2005, Methods, 36, 25-34を参照されたい）。ヒト化抗体は、必要に応じて、ＣＤＲが由来するところの非ヒト種由来の１つ又は複数のフレームワーク残基をさらに含み得る。
ここで使用される場合、用語「ヒト化抗体分子」は、重鎖及び／又は軽鎖が、アクセプター抗体（例えば、ヒト抗体）の重鎖及び／又は軽鎖可変領域フレームワーク内にグラフトされたドナー抗体（例えば、マウスモノクローナル抗体）由来の１つ又は複数のＣＤＲ（所望される場合、１つ又は複数の改変ＣＤＲを含む）を含む、抗体分子を意味する。概説のために、Vaughan et al, Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998を参照されたい。１つの実施形態において、完全なＣＤＲが移されるよりもむしろ、ここで上述されたＣＤＲの任意の１つ由来の１つ又は複数の特異性決定残基のみが、ヒト抗体フレームワークに移される（例えば、Kashmiri et al., 2005, Methods, 36, 25-34を参照されたい）。１つの実施形態において、ここで上述されたＣＤＲの１つ又は複数に由来する特異性決定残基のみが、ヒト抗体フレームワークに移される。別の実施形態において、ここで上述されたＣＤＲのそれぞれに由来する特異性決定残基のみが、ヒト抗体フレームワークに移される。
ＣＤＲ又は特異性決定残基がグラフトされた場合、任意の適切なアクセプター可変領域フレームワーク配列が、ＣＤＲが由来するところのドナー抗体のクラス／タイプに関連して使用され得る（マウス、霊長類及びヒトフレームワーク領域を含む）。好適には、本発明に従うヒト化抗体は、ヒトアクセプターフレームワーク領域及びここで提供された１つ又は複数のＣＤＲを含む可変ドメインを有する。
従って、１つの実施形態において、毒素Ａ又は毒素Ｂに結合するヒト化抗体が提供され、ここで、可変ドメインは、ヒトアクセプターフレームワーク領域及び非ヒトドナーＣＤＲを含む。
本発明において使用され得るヒトフレームワークの例は、ＫＯＬ、ＮＥＷＭ、ＲＥＩ、ＥＵ、ＴＵＲ、ＴＥＩ、ＬＡＹ及びＰＯＭである（Ｋａｂａｔら、前出）。例えば、ＫＯＬ及びＮＥＷＭは、重鎖のために使用され得、ＲＥＩは、軽鎖のために使用され得、そしてＥＵ、ＬＡＹ及びＰＯＭは、重鎖及び軽鎖の両方のために使用され得る。或いは、ヒト生殖細胞配列が、使用されてもよい；これらは、http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/において利用可能である。
本発明のヒト化抗体において、アクセプター重鎖及びアクセプター軽鎖は、同じ抗体由来である必要は必ずしもなく、そして、所望される場合、異なる鎖由来のフレームワーク領域を有する混成鎖を含んでもよい。
また、本発明のヒト化抗体において、フレームワーク領域は、アクセプター抗体の配列と正確に同じ配列を有さなくてもよい。例えば、稀な残基は、アクセプター鎖クラス又はタイプにより頻繁に出現する残基に変更されてもよい。或いは、アクセプターフレームワーク領域において選択された残基は、ドナー抗体の同じ位置で見出される残基に対応するように変更されてもよい（Reichmann et al., 1998, Nature, 332, 323-324を参照されたい）。このような変更は、ドナー抗体の親和性を回復するために必要な最小限に留められるべきである。アクセプターフレームワーク領域において変更する必要のある残基を選択するためのプロトコールは、ＷＯ９１／０９９６７に記載される。
一般に、本明細書中に開示される抗体配列は、ヒト化される。
本発明はまた、ここで開示される配列又は抗体に８０％、９０％、９１％、９２％、９３％ ９４％、９５％ ９６％、９７％、９８％又は９９％類似する配列も提供する。
ここで使用される場合、「同一性」は、並べられた配列における、任意の特定の位置で、アミノ酸残基が配列間で同一であることを示す。「類似性」は、ここで使用される場合、並べられた配列における、任意の特定の位置で、アミノ酸残基が配列間で類似の型であることを示す。例えば、ロイシンは、イソロイシン又はバリンと置換され得る。しばしば互いに置換され得る他のアミノ酸としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
● フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン（芳香族側鎖を有するアミノ酸）；
●リシン、アルギニン及びヒスチジン（塩基性側鎖を有するアミノ酸）；
●アスパラギン酸及びグルタミン酸（酸性側鎖を有するアミノ酸）；
●アスパラギン及びグルタミン（アミド側鎖を有するアミノ酸）；及び
● システイン及びメチオニン（硫黄含有側鎖を有するアミノ酸）。
同一性及び類似性の程度は、容易に計算され得る（Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988；Biocomputing. Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993；Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994；Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987, Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991、ＮＣＢＩから入手可能なＢＬＡＳＴ（商標）ソフトウェア（Altschul, S.F. et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410；Gish, W. & States, D.J. 1993, Nature Genet. 3:266-272. Madden, T.L. et al., 1996, Meth. Enzymol. 266:131-141；Altschul, S.F. et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402；Zhang, J. & Madden, T.L. 1997, Genome Res. 7:649-656）。
本発明の抗体分子としては、完全長の重鎖及び軽鎖を有する完全抗体分子又はその断片が挙げられ、限定されないが、Ｆａｂ、改変Ｆａｂ、Ｆａｂ’、改変Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆａｂ−Ｆｖ、Ｆａｂ−ｄｓＦｖ、一ドメイン抗体（例えば、ＶＨ又はＶＬ又はＶＨＨ）、ｓｃＦｖ、二価抗体、三価抗体若しくは四価抗体、ビス−ｓｃＦｖ、ディアボディ、トリアボディ、テトラボディ及び上記の任意のエピトープ結合断片であってもよい（例えば、Holliger and Hudson, 2005、Nature Biotech. 23(9):1126-1136；Adair and Lawson, 2005, Drug Design Reviews - Online 2(3), 209〜217を参照されたい）。これらの抗体断片を作り、製造するための方法は、当該分野で周知である（例えば、Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181を参照されたい）。本発明における使用のための他の抗体断片としては、国際特許出願ＷＯ２００５／００３１６９、ＷＯ２００５／００３１７０及びＷＯ２００５／００３１７１に記載されるＦａｂ断片及びＦａｂ’断片が挙げられる。多価抗体は、複数の特異性を、例えば二重特異性を含んでいてもよく、又は一重特異性であってもよい（例えば、ＷＯ９２／２２８５３及びＷＯ０５／１１３６０５を参照されたい）。二重特異性及び多特異性抗体改変体は、この例において、２つの独立した標的タンパク質：ＴｃｄＡ及びＴｃｄＢを中和することが目的であるので、特に考慮される。ここで開示される抗体由来の可変領域は、ＴｃｄＡ及びＴｃｄＢに結合し中和可能である１つの抗体改変体を生成する様式で構成され得る。
１つの実施形態において、本開示に従う抗体は、例えば、ＷＯ２００９／０４０５６２に記載されるように、免疫グロブリング部分、例えばＦａｂ又はＦａｂ’断片及びこれらに直接的に又は間接的に連結する１つ又は２つの一ドメイン抗体（ｄＡｂ）を含む、ＴｃｄＡ又はＴｃｄＢ結合抗体融合タンパク質として提供される。
１つの実施形態において、融合タンパク質は、例えば、ＷＯ２０１０／０３５０１２に記載されるように、例えば、ジスルフィド結合で必要に応じて連結した可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）対などの二ドメイン抗体を含む。
１つの実施形態において、融合タンパク質のＦａｂ又はＦａｂ’エレメントは、一ドメイン抗体（単数又は複数）に対して同一又は類似の特異性を有する。１つの実施形態において、Ｆａｂ又はＦａｂ’は、一ドメイン抗体（単数又は複数）に対して異なる特異性を有し、すなわち、この融合タンパク質は、多価である。１つの実施形態において、本発明に従う多価融合タンパク質は、アルブミン結合部位を有し、例えば、その中のＶＨ／ＶＬ対が、アルブミン結合部位を提供する。
１つの実施形態において、本発明に従う多価融合タンパク質はＴｃｄＡ及びＴｃｄＢに結合する。
１つの実施形態において、本発明に従う多価融合タンパク質は、複数の位置でＴｃｄＢに結合し、例えば、２つの異なるエピトープに特異的な別個の結合領域を有する。
本発明の抗体分子の定常領域ドメインは、存在する場合、抗体分子の提唱された機能、詳細には、必要とされ得るエフェクター機能に関して選択され得る。例えば、定常領域ドメインは、ヒトＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭドメインであり得る。詳細には、特にＩｇＧ１及びＩｇＧ３イソ型のヒトＩｇＧ定常領域ドメインは、抗体分子が治療的使用のために企図され、そして抗体エフェクター機能が必要とされる場合に、使用され得る。或いは、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４イソ型は、抗体分子が治療目的を企図され、そして抗体エフェクター機能が必要とされない場合、例えば、単に抗原を中和するか又はアゴナイズすることを企図される場合に、使用され得る。これらの定常領域ドメインの配列改変体も使用され得ることが、理解される。例えば、Angal et al., Molecular Immunology, 1993, 30 (1), 105-108に記載されるように２４１位のセリンがプロリンに変更されているＩｇＧ４分子が、使用され得る。抗体は、種々の翻訳後修飾を受け得ることもまた、当業者によって理解される。これらの修飾の型及び程度は、多くの場合、抗体を発現するために使用される宿主細胞系並びに培養条件に依存する。このような修飾は、グリコシル化、メチオニン酸化、ジケトピペラジン形成、アスパラギン酸異性化及びアスパラギン脱アミド化における変種を含み得る。頻繁な修飾は、カルボキシペプチダーゼの作用によるカルボキシ末端塩基性残基（例えば、リシン又はアルギニン）の欠失である（Harris, RJ. Journal of Chromatography 705:129-134, 1995に記載される通りである）。
１つの実施形態において、抗体重鎖は、ＣＨ１ドメインを含み、抗体軽鎖は、κ又はλのいずれかのＣＬドメインを含む。
生物学的分子、例えば抗体又は断片は、酸性及び／又は塩基性の官能基を含み、それによって、総合的に正又は負に荷電する分子を生じる。全体の「観察された」電荷の量は、実体の絶対アミノ酸配列、３Ｄ構造における荷電した基の局所的環境及びこの分子の環境条件に依存する。等電点（ｐＩ）は、特定の分子又はその溶媒接近可能表面が総合的な電荷を保有しないｐＨである。１つの例において、本発明の抗体及び断片は、適切な等電点を有するように操作され得る。このことは、より強固な特性、詳細には、好適な溶解度及び／又は安定性プロフィール及び／又は改善された精製特徴を有する抗体及び／又は断片をもたらし得る。
従って、１つの局面において、本発明は、由来する元々同定された抗体とは異なる等電点を有するように操作されたヒト化抗体を提供する。抗体は、例えば、アミノ酸残基を置き換える、例えば酸性アミノ酸残基を１つ又は複数の塩基性アミノ酸残基と置き換えることによって操作され得る。或いは、塩基性アミノ酸残基が導入され得るか、又は酸性アミノ酸残基が除去され得る。或いは、分子が受容できない高いｐＩ値を有する場合、必要とされる場合に酸性残基が導入されて、ｐＩを下げる。ｐＩを操作する場合に、抗体又は断片の望ましい活性を保持することに留意するべきであることが、重要である。従って、１つの実施形態において、操作された抗体又は断片は、「未修飾の」抗体又は断片と同じ又は実質的に同じ活性を有する。
例えば、＊＊ ＥｘＰＡＳＹ http://www.expasy.ch/tools/pi_tool.html、及びhttp://www.iut-arles.up.univ-mrs.fr/w3bb/d_abim/compo-p.htmlなどのプログラムが、抗体又は断片の等電点を予測するために使用され得る。
本発明によって提供される抗体の親和性は、当該分野で公知の任意の好適な方法を用いて変えることができることが理解される。抗体又はその改変体の親和性は、適切な単離された天然のタンパク質又は組換えタンパク質又は好適な融合タンパク質／ポリペプチドを用いるＢＩＡｃｏｒｅを含む、当該分野で公知の任意の好適な方法を用いて測定され得る。
従って、本発明はまた、適切な場合にＴｃｄＡ又はＴｃｄＢについての改善された親和性を有する本発明の抗体分子の改変体に関する。このような改変体は、ＣＤＲの（Yang et al., J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995）、鎖シャッフリング（Marks et al., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の突然変異誘発株の使用（Low et al., J. Mol. Biol., 250, 359-368, 1996）、ＤＮＡシャッフリング（Patten et al., Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, 1997）、ファージディスプレイ（Thompson et al., J. Mol. Biol., 256, 77-88, 1996）及び性ＰＣＲ（Crameri et al., Nature, 391, 288-291, 1998）を含む多くの親和性成熟プロトコールによって得ることができる。Ｖａｕｇｈａｎら（前出）は、これらの親和性成熟の方法を議論する。
この文脈においてここで使用される場合、改善された親和性は、開始分子をしのぐ改善を意味する改善を意味する。
所望される場合、本発明における使用のための抗体は、１つ又は複数のエフェクター分子とコンジュゲートされ得る。エフェクター分子は、１つのエフェクター分子、又は、連結して本発明の抗体に結合し得る１つの部分を形成する２以上のこのような分子を含み得ることが、理解される。エフェクター分子に連結した抗体断片を得ることが所望される場合、これは、抗体断片がエフェクター分子に直接的に連結するか又はカップリング剤を介して連結する、標準的化学的手順又は組換えＤＮＡ手順によって調製され得る。このようなエフェクター分子を抗体にコンジュゲートするための技術は、当該分野で周知である（Hellstrom et al., Controlled Drug Delivery, 2nd Ed., Robinson et al., eds., 1987, pp. 623-53；Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev., 62:119-58及びDubowchik et al., 1999, Pharmacology and Therapeutics, 83, 67-123を参照されたい）。詳細な化学的手順としては、例えば、ＷＯ９３／０６２３１、ＷＯ９２／２２５８３、ＷＯ８９／００１９５、ＷＯ８９／０１４７６及びＷＯ０３０３１５８１に記載されるものが挙げられる。或いは、エフェクター分子がタンパク質又はポリペプチドである場合、連結は、例えばＷＯ８６／０１５３３及びＥＰ０３９２７４５に記載されるように、組換えＤＮＡ手順を用いて達成され得る。
用語エフェクター分子は、ここで使用される場合、例えば、生物学的に活性なタンパク質、例えば酵素、他の抗体又は抗体断片、合成又は天然に存在するポリマー、核酸及びその断片、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ及びその断片、放射性核種、特に放射性ヨウ化物、放射性同位体、キレート化金属、ナノ粒子及びＮＭＲ若しくはＥＳＲ分光学によって検出され得る蛍光化合物のようなレポーター基が挙げられる。
他のエフェクター分子は、１１１Ｉｎ及び９０Ｙ、Ｌｕ１７７、ビスマス２１３、カリフォルニウム２５２、イリジウム１９２及びタングステン１８８／レニウム１８８などのキレート化放射性核種；又はアルキルホスホコリン、トポイソメラーゼＩインヒビター、タキソイド及びスラミンなどであるがこれらに限定されない薬物を含み得る。
他のエフェクター分子としては、タンパク質、ペプチド及び酵素が挙げられる。目的の酵素としては、タンパク質分解酵素、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。目的のタンパク質、ポリペプチド及びペプチドとしては、免疫グロブリン、アブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素、又はジフテリア毒素などの毒素、インスリン、腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経増殖因子、血小板由来増殖因子又は組織プラスミノゲンアクチベーター、血栓剤又は抗血管形成剤、例えばアンギオスタチン若しくはエンドスタチン、又はリンホカイン、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）又は他の増殖因子などの生物学的応答改変因子並びに免疫グロブリンなどのタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
他のエフェクター分子は、例えば診断のために有用な、検出可能な物質を含み得る。検出可能な物質の例としては、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性核種、陽電子放出金属（陽電子放出トモグラフィーにおける使用のため）、及び非放射活性常磁性金属イオンが挙げられる。一般的に、診断としての使用のための抗体にコンジュゲート可能な金属イオンについては、米国特許第４，７４１，９００号を参照されたい。好適な酵素としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ又はアセチルコリンエステラーゼが挙げられる；好適な補欠分子族としては、ストレプトアビジン、アビジン及びビオチンが挙げられる；好適な蛍光物質としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド及びフィコエリトリンが挙げられる；好適な蛍光物質としては、ルミノールが挙げられる；好適な生物発光物質としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン及びエクオリンが挙げられる；並びに好適な放射性核種としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ及び９９Ｔｃが挙げられる。
別の例において、エフェクター分子は、抗体の半減期をインビボで延長させ得るか、及び／又は抗体の免疫原性を低減し得るか、及び／又は上皮性関門を通った免疫系への抗体の送達を増強し得る。この型の好適なエフェクター分子の例としては、ＷＯ０５／１１７９８４に記載される、ポリマー、アルブミン、アルブミン結合タンパク質又はアルブミン結合化合物が挙げられる。
エフェクター分子がポリマーである場合、これは、一般に、合成又は天然に存在するポリマー、例えば、必要に応じて置換される直鎖若しくは分枝鎖のポリアルキレンポリマー、ポリアルケニレンポリマー又はポリオキシアルキレンポリマー又は分枝鎖若しくは非分枝鎖の多糖類、例えばホモ多糖類又はヘテロ多糖類であり得る。
上述の合成ポリマー上に存在し得る特異的な必要に応じた置換基としては、１つ又は複数のヒドロキシ基、メチル基又はメトキシ基が挙げられる。
合成ポリマーの具体的な例としては、必要に応じて置換された直鎖若しくは分枝鎖のポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）、ポリ（ビニルアルコール）又はその誘導体が挙げられ、特に、必要に応じて置換されたポリ（エチレングリコール）、例えばメトキシポリ（エチレングリコール）又はその誘導体が挙げられる。
具体的な天然に存在するポリマーとしては、ラクトース、アミロース、デキストラン、グリコーゲン又はその誘導体が挙げられる。
「誘導体」は、ここで使用される場合、反応性の誘導体、例えばチオール−選択的反応基、例えばマレイミドなどを含むことが企図される。反応性の基は、直接的に、又はリンカーセグメントを通して、ポリマーに連結され得る。このような基の残基は、いくつかの場合、抗体断片とポリマーとの間の連結基としての産物の一部を形成することが、理解される。
ポリマーの大きさは、所望されるように変動し得るが、一般に、５００Ｄａ〜５００００Ｄａ、例えば５０００〜４００００Ｄａ、例えば２００００〜４００００Ｄａの範囲の平均分子量である。ポリマーの大きさは、詳細には、産物の企図される使用に基づいて、例えば、腫瘍などの特定の組織に局在する能力又は循環中の半減期を延長する能力に基づいて、選択され得る（概説については、Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews, 54, 531-545を参照されたい）。従って、例えば、例えば、腫瘍の処置における使用のために、この産物が循環から離れて組織に浸透することが企図される場合、低分子量のポリマー、例えば約５０００Ｄａの分子量のポリマーを用いることが有利であり得る。産物が循環中に留まる適用のために、より高分子量のポリマー、例えば２００００Ｄａ〜４００００Ｄａの範囲内の分子量を有するポリマーを用いることが有利であり得る。
好適なポリマーとしては、ポリアルキレンポリマー、例えばポリ（エチレングリコール）又は、特に、メトキシポリ（エチレングリコール）又はその誘導体、及び特に、約１５０００Ｄａ〜約４００００Ｄａの範囲内の分子量を有するポリマーが、挙げられる。
１つの例において、本発明における使用のための抗体は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分に結合する。１つの詳細な例において、抗体は、抗体断片であり、ＰＥＧ分子は、この抗体断片内に位置する任意の利用可能なアミノ酸側鎖若しくは末端アミノ酸官能基、例えば、任意の遊離のアミノ基、イミノ基、チオール基、ヒドロキシル基又はカルボキシル基を介して結合し得る。このようなアミノ酸は、抗体断片内に天然に存在し得るか、又は断片内に、組換えＤＮＡ法を用いて操作され得る（例えば、ＵＳ５，２１９，９９６；ＵＳ５，６６７，４２５；ＷＯ９８／２５９７１、ＷＯ２００８／０３８０２４を参照されたい）。１つの例において、本発明の抗体分子は、修飾されたＦａｂ断片であり、ここで、この修飾は、その重鎖のＣ末端に、１つ又は複数のアミノ酸を付加し、エフェクター分子の結合を可能にする。好適には、さらなるアミノ酸は、エフェクター分子が結合し得る１つ又は複数のシステイン残基を含む修飾されたヒンジ領域を形成する。複数の部位が、２つ以上のＰＥＧ分子を結合するために、使用され得る。
好適には、ＰＥＧ分子は、抗体断片内に位置する少なくとも１つのシステイン残基のチオール基を介して共有結合している。修飾抗体断片に結合した各ポリマー分子は、この断片内に位置するシステイン残基の硫黄原子に共有結合し得る。共有結合は、一般に、ジスルフィド結合又は、詳細には、硫黄−炭素結合である。結合の地点としてチオール基が使用される場合、適切に活性化したエフェクター分子、例えば、マレイミド及びシステイン誘導体などのチオール選択的誘導体が、使用され得る。活性化ポリマーは、上述のようなポリマー修飾抗体断片の調製における開始物質として使用され得る。活性化ポリマーは、チオール反応基を含む任意のポリマー、例えばα−ハロカルボン酸又はエステル、例えば、ヨードアセトアミド、イミド、例えばマレイミド、ビニルスルホン又はジスルフィドであり得る。このような開始物質は（例えば、Ｎｅｋｔａｒ、以前のＳｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ Ｉｎｃ．、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ、ＵＳＡから）市販されているか、又は市販の開始物質から従来的化学手順を用いて調製され得る。詳細なＰＥＧ分子としては、２０Ｋメトキシ−ＰＥＧ−アミン（Ｎｅｋｔａｒ、以前のＳｈｅａｒｗａｔｅｒ；Ｒａｐｐ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ；及びＳｕｎＢｉｏから得られる）及びＭ−ＰＥＧ−ＳＰＡ（Ｎｅｋｔａｒ、以前のＳｈｅａｒｗａｔｅｒから得られる）が挙げられる。
１つの実施形態において、抗体は、例えば、ＥＰ０９４８５４４又はＥＰ１０９００３７に開示される方法［"Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications", 1992, J. Milton Harris (ed), Plenum Press, New York、"Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications", 1997, J. Milton Harris and S. Zalipsky (eds), American Chemical Society, Washington DC及び"Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences", 1998, M. Aslam and A. Dent, Grove Publishers, New York；Chapman, A. 2002, Advanced Drug Delivery Reviews 2002, 54:531-545もまた、参照されたい］に従ってＰＥＧ化された、すなわちそれに共有結合したＰＥＧ（ポリ（エチレングリコール））を有する、修飾Ｆａｂ断片又はｄｉＦａｂである。１つの例において、ＰＥＧは、ヒンジ領域においてシステインに結合している。１つの例において、ＰＥＧ修飾Ｆａｂ断片は、修飾ヒンジ領域において１つのチオール基に共有結合したマレイミド基を有する。リシン残基は、マレイミド基に共有結合され得、リシン残基上のアミン基のそれぞれに対し、約２０，０００Ｄａの分子量を有するメトキシポリ（エチレングリコール）ポリマーが結合し得る。Ｆａｂ断片に結合するＰＥＧの全分子量は、従って、約４０，０００Ｄａである。
特定のＰＥＧ分子としては、ＰＥＧ２ＭＡＬ４０Ｋとしても知られるＮ，Ｎ’−ビス（メトキシポリ（エチレングリコール）ＭＷ ２０，０００）修飾リシンの２−［３−（Ｎ−マレイミド）プロピオンアミド］エチルアミドが挙げられる（Ｎｅｋｔａｒ、以前のＳｈｅａｒｗａｔｅｒから得られる）。
ＰＥＧリンカーの代替の供給源としては、ＧＬ２−４００ＭＡ２（ここで、以下の構造中のｍは、５である）及びＧＬ２−４００ＭＡ（ここで、ｍは、２である）（ｎは、約４５０である）を供給するＮＯＦが挙げられる：

すなわち、各ＰＥＧは、約２０，０００Ｄａである。
以下の型のさらなる代替のＰＥＧエフェクター分子：

は、Ｄｒ Ｒｅｄｄｙ、ＮＯＦ及びＪｅｎｋｅｍから入手可能である。
１つの実施形態において、鎖内のアミノ酸２２６又はその近傍、例えば重鎖のアミノ酸２２６（配列番号付けによる）においてシステインアミノ酸残基を通して結合した、（例えば、ここで記載されたＰＥＧによって）ＰＥＧ化された抗体が、提供される。
１つの実施形態において、本開示に従う１つの特定の抗体は、以下の特性を有する：
本発明はまた、ここで規定される抗体又は抗体の組み合わせの医薬組成物などの組成物を提供する。
本発明はまた、本発明に従う少なくとも２つの抗体を含む組成物を提供し、例えば、そのうちの少なくとも１つの抗体はＴｃｄＡに対して特異的であり、そのうちの少なくとも１つの抗体はＴｃｄＢに対して特異的であるか、又は代替的には、少なくとも２つの抗体が、ＴｃｄＡに対して特異的であるか、又は少なくとも２つの抗体が、ＴｃｄＢに対して特異的である。
１つの実施形態において、ＴｃｄＡに対して特異的な複数の抗体及び必要に応じて１つ又は複数のＴｃｄＢに対して特異的な抗体を含む組成物が、提供される。
１つの実施形態において、ＴｃｄＢに対して特異的な複数の抗体及び必要に応じて１つ又は複数のＴｃｄＡに対して特異的な抗体を含む組成物が、提供される。
従って、１つの実施形態において、本発明に従う２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５の抗体、すなわち別個の抗体を含む組成物が、提供される。
本発明は、３つのＭａｂを含む１つの特定の混合物を記載し、その１つのＭａｂは、ＴｃｄＡに対して特異的であり、そしてその２つのＭａｂは、ＴｃｄＢに対して特異的である。この混合物は、ハムスターにおいて、感染経口用量のクロストリジウム・ディフィシレによる、死及び胃炎症からの非常に高いレベルの防御を実証した。
詳細には、配列番号４９に示される配列を有する重鎖可変領域及び配列番号４７に示される配列を有する軽鎖可変領域を含む１つの抗ＴｃｄＡ抗体と、第１に配列番号１２９に示される重鎖可変領域及び配列番号１２７に示される軽鎖可変領域、並びに第２に配列番号１５９に示される重鎖可変領域及び配列番号１５７に示される軽鎖可変領域の２つの抗ＴｃｄＢとの組み合わせを含む組成物を提供する。
１つの実施形態において、この組成物は、１つの抗ＴｃｄＡ及び２つの抗ＴｃｄＢ抗体などの３つの抗体を含み、これらの抗体は、その全抗体含量のそれぞれ５０％、２５％及び２５％である。
１つの実施形態において、ＴｃｄＡに対して特異的な２、３、４又は５の抗体、及び必要に応じて、ＴｃｄＢに対して特異的な１、２、３、４又は５の抗体を含む組成物が、提供される。
１つの実施形態において、本発明に従って提供される組成物は、十分に規定されており、例えば、免疫化されたか免疫応答性の宿主に由来する単純なポリクローナル組成物よりもむしろ、モノクローナル抗体の混合物である。
１つの実施形態において、抗体の組成物は、２００ｎｇ／ｍｌ以下、例えば１５０ｎｇ／ｍｌ以下、例えば１００ｎｇ／ｍｌ以下、例えば０．１〜１０ｎｇ／ｍｌのＥＣ５０を有する。
有利には、ここで記載される抗体は、非常に高いレベルの生物物理学的安定性を有し、従って、抗体の混合物に含めるために好適である。
１つの局面において、本発明に従う薬学的製剤又は組成物は、さらに、薬学的に許容可能な賦形剤を含む。
治療組成物中の薬学的に許容可能なキャリアは、さらに、水、生理食塩水、グリセロール及びエタノールなどの液体を含み得る。さらに、補助物質、例えば湿潤剤若しくは乳化剤又はｐＨ緩衝化物質が、このような組成物中に存在し得る。このようなキャリアは、医薬組成物を、患者による摂取のための、錠剤、丸剤、ドラジェ、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー及び懸濁剤として製剤化可能である。
投与のために好適な形態としては、例えば、注射若しくは注入による、例えば、ボーラス注射又は連続的注入による非経口投与のために好適な形態が、挙げられる。製品が注射又は注入のためである場合、これは、油性若しくは水性のビヒクル中の懸濁液、溶液又はエマルジョンの形態を取り得、懸濁化剤、保存剤、安定化剤及び／又は分散剤などの、製剤化剤を含み得る。或いは、抗体分子は、適切な滅菌液による使用前の再構築のための、乾燥形態であってもよい。
一旦製剤化されると、本発明の組成物は、対象に直接投与される。処置される対象は、動物であり得る。しかし、１つ又は複数の実施形態において、組成物は、ヒト対象に対する投与に適合している。
本開示に従う製剤において、好適には、最終製剤のｐＨは、抗体又は断片の等電点の値に類似せず、例えば、製剤のｐＨが７である場合、８〜９以上のｐＩが、適切であり得る。理論に縛られることを望まないが、最終的には、改善された安定性を有する最終製剤、例えば溶液中に抗体又は断片が留まっている製剤が、提供され得ると考えられる。
１つの実施形態において、本開示の組成物又は製剤は、１〜２００ｍｇ／ｍＬの抗体、すなわち、合わせた抗体含量を、例えば、１５０ｍｇ／ｍＬ以下、例えば１００ｍｇ／ｍＬ以下、詳細には９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０ｍｇ／ｍＬ以下含む。
１つの実施形態において、本開示に従う組成物又は製剤は、各２０ｍｇ／ｍＬの抗体をその中に含む。
１つの実施形態において、以下を含む製剤が、提供される：
配列番号４９に示される配列を有する重鎖可変領域及び配列番号４７に示される配列を有する軽鎖可変領域を含む、３３ｍｇ／ｍＬ以下の１つの抗ＴｃｄＡ抗体、及び
配列番号１２９に示される重鎖可変領域及び配列番号１２７に示される軽鎖可変領域を含む、２８ｍｇ／ｍＬ以下の第１の抗ＴｃｄＢ、並びに
配列番号１５９に示される重鎖可変領域及び配列番号１５７に示される軽鎖可変領域を含む、２５ｍｇ／ｍＬの第２の抗ＴｃｄＢ。
１つの実施形態において、４．０〜７．０の範囲内のｐＨの薬学的製剤は、以下：１〜２００ｍｇ／ｍＬの本開示に従う抗体、１〜１００ｍＭの緩衝液、０．００１〜１％の界面活性剤、
（ａ）１０〜５００ｍＭの安定化剤、
（ｂ）５〜５００ｍＭの等張剤、又は
（ｃ）１０〜５００ｍＭの安定化剤及び５〜５００ｍＭの等張剤
を含む。
１つの実施形態において、本開示に従う組成物又は製剤は、リン酸緩衝化生理食塩水の緩衝液を含む。
例えば、約ｐＨ６であるこの製剤は、１〜５０ｍｇ／ｍＬの抗体、２０ｍＭのＬ−ヒスチジンＨＣｌ、２４０ｍＭトレハロース及び０．０２％ポリソルベート２０を含み得る。或いは、約ｐＨ５．５の製剤は、１〜５０ｍｇ／ｍＬの抗体、２０ｍＭクエン酸緩衝液、２４０ｍＭショ糖、２０ｍＭアルギニン、及び０．０２％ポリソルベート２０を含み得る。
本発明の医薬組成物は、任意の数の経路によって投与され得、これらとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：経口経路、静脈内経路、筋肉内経路、動脈内経路、脊髄内経路、髄腔内経路、心室内経路、経皮経路（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）、経皮経路（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）（例えば、ＷＯ９８／２０７３４を参照されたい）、皮下経路、腹腔内経路、鼻腔内経路、経腸経路、局所経路、舌下経路、膣内経路又は直腸経路。皮下噴射器もまた、本発明の医薬組成物を投与するために使用され得る。代表的には、治療組成物は、液体溶液又は懸濁液のいずれかとして、注射剤として調製され得る。液体ビヒクル中の溶液又は懸濁液のために好適な固体形態が、注射の前に調製されてもよい。
組成物の直接送達は、一般に、皮下的、腹腔内、静脈内又は筋肉内の注射によって達成されるか、又は組織の間質腔に送達される。
この組成物はまた、例えば、飲み込むためのカプセル化経口投薬物によって、胃若しくは回腸への経鼻胃管を通して、直腸管を通して、又は浣腸液若しくは直腸カプセルによって、病変内に又は直接胃腸管内に投与され得る。投薬処置は、単回投薬スケジュールであっても、多回投薬スケジュールであってもよい。
組成物中の活性成分は、抗体分子であることが、理解される。それ自体が、胃腸管において分解を受けやすい。従って、胃腸管を用いる経路によって組成物が投与される場合、組成物は、抗体を分解から防御するが、一旦胃腸管から吸収されたら抗体を放出する薬剤を含むことを必要とする。
薬学的に許容可能なキャリアについての完全な議論は、Remington's Pharmaceutical Sciences（Mack Publishing Company, N.J. 1991）において利用可能である。
本発明はまた、ここで記載されるように、処置のため、例えばＣ．ディフィシレ感染又はこれに関連する合併症、例えば下痢、大腸炎、詳細には偽膜性大腸炎、腹部膨満、腹痛及び中毒性巨大結腸の処置又は予防のための、抗体若しくは抗体組み合わせ又はこれを含む組成物を提供する。
予防はまた、ワクチンを作るための不活化毒素抗原（トキソイド）及び抗体の事前に形成された複合体を投与することによって達成され得る。
１つの実施形態において、本発明に従う抗体、その組み合わせ及びそれを含む組成物は、いわゆるＣ．ディフィシレのスーパー株、すなわち、リボタイプ０２７などの高毒性株による感染を処置するために好適である。
本発明に従う抗体及び組成物は、一次感染の間の、対応するＣ．ディフィシレ毒素の急性及び／又は慢性の効果の処置又は予防における使用のために好適である。
本発明に従う抗体及び組成物は、二次感染の間又は再感染の間の、対応するＣ．ディフィシレ毒素の効果の処置又は予防における使用のために、好適である。国際ガイドラインは、一次感染後の時間間隔を重要視し、その後、存在する症状の持続とは異なる、時々ぶり返しと記載される二次（すなわち再発性の）感染を規定する（２９）。研究は、二次感染は、一次感染と同じ株又はリボタイプの結果であり得ることを示した。このような場合、ぶり返しよりもむしろ再発は、承認された時間的制約に依拠する。しかし、研究はまた、二次感染はまた、一次感染とは別個の株又はリボタイプの感染の結果であり得ることをも明らかに示す。１つの研究において、疾患再発の４８％は、第１の感染を起こしたものとは別個の第２の株の結果であった（３０）。別の研究において、５６％を超える疾患再発が、第１の感染を起こしたものとは別個の第２の株の結果であった（３１）。
１つの実施形態において、本発明に従う抗体、その組み合わせ及びそれを含む組成物は、損傷、例えば結腸の上皮の長期の構造的損傷の予防における使用のために好適である。
１つの実施形態において、抗体、組み合わせ及び組成物は、感染の再発を含めたＣ．ディフィシレ感染、詳細には院内感染の予防のために好適である。
１つの実施形態において、本発明に従う抗体、その組み合わせ及びそれを含む組成物は、Ｃ．ディフィシレ感染の再発のリスクを低減するために好適である。
有利にも、本開示の抗体は、感染又は再感染を予防するために、予防的に投与され得る。何故なら、この抗体が特異的である毒素の非存在下で、この抗体は、対象の身体組織に対し有害な相互作用を引き起こすことなく、身体から単純に除去されるからである。
有利にも、本開示の抗体は、投与後に、迅速な応答を誘発するとみられ、例えば、投与の１日若しくは２日間以内に、標的毒素の迅速なクリアランスが発動され、これは、致命的な器官、例えば肺、心臓及び腎臓が損傷されることを予防し得る。共に利用可能であるように作られた薬剤が、急性のＣ．ディフィシレ感染段階において、患者に対する毒素Ａ及び／又はＢによる損傷又は傷害を予防するために使用され得ることは、初めてである。
従って、１つの実施形態において、本発明に従う抗体、その組み合わせ及びそれを含む組成物は、致命的な器官に対する損傷を予防するために好適である。
１つの実施形態において、ここで記載される抗体、組み合わせ又は製剤は、毒素によって回復不能な損傷を負わされる前に適切な時間枠内で投与された場合、感染患者の死を予防するために好適である。
本開示の抗体は、速いオンレートを有し、このことは、インビボでの迅速な効果を促進する。
１つの実施形態において、患者集団は、６０歳を超える、例えば６５歳を超える年齢である。
１つの実施形態において、患者集団は、５歳以下である。
本発明に従う抗体は、抗生物質、例えばメトロニダゾール、バンコマイシン又はフィダキソマイシンの処置と組み合わせて使用され得る。様々なインビトロデータは、Ｍａｂ及びＭａｂ混合物の特性を例示する。我々は、３つのＭａｂの１つの混合物（５０％モル量の抗ＴｃｄＡ構成要素及び５０％モル量の抗ＴｃｄＢ構成要素）が、ハムスターを致死性のＣＤＩから防御可能であったことを示す。
１つの実施形態において、治療有効量のここで記載される抗体若しくは抗体組み合わせ又はそれを含む組成物を、例えばＣ．ディフィシレ感染又はそれに関連する合併症、例えば下痢、大腸炎、詳細には偽膜性大腸炎、腹部膨満、腹痛及び中毒性巨大結腸の処置又は予防において投与することにより、それを必要とする患者を処置する方法が提供される。
１つの実施形態において、抗体、組み合わせ又は製剤は、非経口経路、例えば皮下経路、腹腔内経路、静脈内経路又は筋肉内経路によって投与される。ハムスターにおいて出された実施例におけるデータは、この経路によって投与された用量は、胃に達し、従って、治療効果をもたらすことができることを示す。
１つの実施形態において、抗体、組み合わせ又は製剤は、経口的に投与され、例えば腸溶コーティングした製剤である。
１つの実施形態において、Ｃ．ディフィシレ感染の処置又は予防のための医薬の製造のための、ここで記載される抗体、組み合わせ又は製剤の使用が提供される。
１つの実施形態において、投与される用量は、１〜１０００ｍｇ／Ｋｇ、例えば１０〜７５ｍｇ／Ｋｇ、例えば２０〜５０ｍｇ／Ｋｇの範囲内である。
１つの実施形態において、マウス及びハムスターにおけるインビボの抗体（単数又は複数）の半減期は、健康な（未感染の）動物において６〜８日間の範囲内であり、従って、ヒトにおいては１４〜２８日間の範囲内の半減期を有すると予測される。
１つの実施形態において、抗体（単数又は複数）は、１用量のみ与えられる。
１つの実施形態において、抗体（単数又は複数）は、週に１回又は二週に１回の用量で与えられる。
１つの実施形態において、抗体（単数又は複数）は、１日に１回用量で与えられる。
１つの実施形態において、ここで規定される１種又は複数の抗ＴｃｄＡ抗体と複合体化したＴｃｄＡ又はその免疫原性断片を含む複合体を、提供する。この複合体は、例えば、ヒトへの投与の後にインビボで毒素Ａに対する防御抗体を作製するために好適なワクチン製剤における抗原として使用され得る。
１つの実施形態において、ここで規定される１種又は複数の抗ＴｃｄＢ抗体と複合体化したＴｃｄＢ又はその免疫原性断片を含む複合体を、提供する。この複合体は、例えば、ヒトへの投与の後にインビボで毒素Ｂに対する防御抗体を作製するために好適なワクチン製剤における抗原として使用され得る。
製剤化されて本発明における使用のために好適なアジュバントを生成し得るＴｈ１型免疫刺激剤としては、以下が挙げられるが、これらに制限されない。
１つの実施形態において、ＴｃｄＡ又はその免疫原性断片及びＴｃｄＢ又はその免疫原性断片を含む複合体が提供され、ここで、それぞれの毒素又は断片は、それに特異的な１つ又は複数の抗体と複合体化し、ここで、その複合体は、ワクチン製剤としての投与のために好適である。
抗体：抗原複合体は、Ｆｃレセプター媒介型プロセスにおいて免疫系によって取り込まれることが公知であり（２７、２８）、そして抗体の事前形成された複合体：抗原複合体は、ヒト臨床試験におけるワクチンとしての成功した使用である（２２）。
１つ又は複数の実施形態において、ワクチン製剤は、さらに、免疫刺激剤としてのアジュバントを含む。
モノホスホリルリピドＡ、詳細には、３−脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）は、本発明における使用のために好ましいＴｈ１型免疫刺激剤である。３Ｄ−ＭＰＬは、Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ、Ｍｏｎｔａｎａによって製造される、周知のアジュバントである。化学的には、多くの場合、３−脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡと４、５又は６のいずれかのアシル化鎖との混合物として、供給される。これは、ＧＢ２１２２２０４Ｂ（その参考文献は、ジホスホリルリピドＡ及びその３−Ｏ−脱アシル化改変体の調製も開示する）において教示される方法によって精製され、そして調製され得る。他の精製されそして合成されたリポ多糖は、記載されている（ＵＳ６，００５，０９９及びＥＰ０ ７２９ ４７３ Ｂ１；Hilgers et al., 1986, Int.Arch.Allergy.Immunol., 79(4):392-6；Hilgers et al., 1987, Immunology, 60(1):141-6；及びＥＰ ０ ５４９ ０７４ Ｂ１）。３Ｄ−ＭＰＬの好ましい形態は、直径０．２ｍｍ未満の小さな粒子サイズを有する微粒子製剤の形態であり、その製造方法は、ＥＰ ０ ６８９ ４５４に開示される。
サポニンもまた、本発明に従う好ましいＴｈ１免疫刺激剤である。サポニンは、周知のアジュバントであり、Lacaille-Dubois, M and Wagner H.（1996. A review of the biological and pharmacological activities of saponins. Phytomedicine vol 2 pp 363-386）において教示される。例えば、Ｑｕｉｌ Ａ（bark of the South American tree Quillaja Saponaria Molinaに由来する）及びその画分は、ＵＳ５，０５７，５４０及び“Saponins as vaccine adjuvants”, Kensil, C. R., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12 (1-2):1-55；及びＥＰ ０ ３６２ ２７９ Ｂ１に記載される。溶血性サポニンＱＳ２１及びＱＳ１７（Ｑｕｉｌ ＡのＨＰＬＣ精製画分）は、強力な全身性アジュバントであると記載されており、その生成方法は、米国特許第５，０５７，５４０号及びＥＰ ０ ３６２ ２７９ Ｂ１に開示される。また、これらの参考文献において、全身性ワクチンのための強力なアジュバントとして作用するＱＳ７（Ｑｕｉｌ−Ａの非溶血性画分）の使用も記載される。ＱＳ２１の使用は、さらにKensil et al.（1991. J. Immunology vol 146, 431-437）において記載される。ＱＳ２１及びポリソルベート又はシクロデキストリンとの組み合わせもまた、公知である（ＷＯ９９／１０００８）。ＱｕｉｌＡの画分を含む微粒子アジュバント系、例えばＱＳ２１及びＱＳ７は、ＷＯ９６／３３７３９及びＷＯ９６／１１７１１に記載される。１つのこのような系は、Ｉｓｃｏｒｎとして公知であり、１種又は複数のサポニンを含み得る。
別の好ましい免疫刺激剤は、非メチル化ＣｐＧジヌクレオチド（「ＣｐＧ」）を含む免疫刺激性オリゴヌクレオチドである。ＣｐＧは、ＤＮＡ中に存在するシトシン−グアノシンジヌクレオチドモチーフの略称である。ＣｐＧは、全身性経路及び粘膜経路の両方によって投与されるアジュバントとして、当該分野で公知である（ＷＯ９６／０２５５５、ＥＰ４６８５２０、Davis et al., J.Immunol, 1998, 160(2):870-876；McCluskie and Davis, J.Immunol., 1998, 161(9):4463-6）。歴史的に、ＢＣＧのＤＮＡ画分は、抗腫瘍効果を発揮し得ることが観察されている。さらなる研究において、ＢＣＧ遺伝子配列に由来する全身性オリゴヌクレオチドは、（インビトロ及びインビボの両方で）免疫刺激効果を誘導可能であると示された。これらの研究の著者らは、中央のＣＧモチーフを含む特定の回帰性配列は、この活性を有すると結論づけた。免疫刺激におけるＣＧモチーフの中心的役割は、Krieg, Nature 374, p546 1995による刊行物において後に説明された。詳細な分析は、ＣＧモチーフは、特定の配列文脈において存在しなければならず、このような配列は、細菌性ＤＮＡにおいて一般的であるが、脊椎動物ＤＮＡにおいては稀であることを示している。免疫刺激性配列は、多くの場合：プリン、プリン、Ｃ、Ｇ、ピリミジン、ピリミジンであって；ここで、ＣＧモチーフは、メチル化されていないが、他の非メチル化ＣｐＧ配列は、免疫刺激性であることが公知であり、本発明において使用され得る。
６つのヌクレオチドの特定の組み合わせにおいて、回帰性の配列が、存在する。１つのモチーフ又は異なるモチーフの組み合わせの繰り返しのいずれかとしてのこれらのモチーフのいくつかは、同じオリゴヌクレオチド中に存在し得る。オリゴヌクレオチドを含む１つ又は複数のこれらの免疫刺激配列の存在は、ナチュラルキラー細胞（インターフェロンｇを生成し、細胞溶解活性を有する）及びマクロファージを含む種々の免疫下位集団を活性化し得る（Wooldrige et al Vol 89 (no. 8), 1977）。現在このコンセンサス配列を有さない配列を含む他の非メチル化ＣｐＧもまた、免疫調節性であることが示されている。
ワクチンに製剤化される場合、ＣｐＧは、一般に、遊離の抗原と一緒に（ＷＯ９６／０２５５５；McCluskie and Davis, supra）、又は抗原に共有結合して（ＷＯ９８／１６２４７）、又は水酸化アルミニウムなどのキャリアと共に製剤化されて（（肝炎表面抗原）Davis et al. supra；Brazolot-Millan et al., Proc.Natl.Acad.Sci., USA, 1998, 95(26), 15553-8）、自由溶液中で投与される。
上述のような免疫刺激剤は、キャリア、例えばリポソーム、水中油エマルジョン及び／又はアルミニウム塩を含む金属塩（例えば、水酸化アルミニウム）と共に、製剤化され得る。例えば、３Ｄ−ＭＰＬは、水酸化アルミニウム（ＥＰ ０ ６８９ ４５４）又は水中油エマルジョン（ＷＯ９５／１７２１０）と共に製剤化され得る；ＱＳ２１は、リポソーム（ＷＯ９６／３３７３９）、水中油エマルジョン（ＷＯ９５／１７２１０）又はミョウバン（ＷＯ９８／１５２８７）を含むコレステロールと共に、有利に製剤化され得る；ＣｐＧは、ミョウバン（Davis et al. supra；Brazolot-Millan supra）と共に、又は他のカチオン性キャリアと共に製剤化され得る。
免疫刺激剤の組み合わせ、詳細にはモノホスホリルリピドＡとサポニン誘導体との組み合わせ（ＷＯ９４／００１５３；ＷＯ９５／１７２１０；ＷＯ９６／３３７３９；ＷＯ９８／５６４１４；ＷＯ９９／１２５６５；ＷＯ９９／１１２４１）、より詳細には、ＷＯ９４／００１５３に開示されるＱＳ２１と３Ｄ−ＭＰＬとの組み合わせもまた、好ましい。或いは、ＣｐＧとサポニン、例えばＱＳ２１との組み合わせもまた、本発明における使用のための強力なアジュバントを形成する。或いは、サポニンは、リポソーム若しくはＩｓｃｏｒｎに製剤化され得、免疫刺激性オリゴヌクレオチドと組み合わされ得る。
従って、好適なアジュバント系としては、例えば、モノホスホリルリピドＡ、好ましくは３Ｄ−ＭＰＬとアルミニウム塩との組み合わせが挙げられる。
従って、１つの実施形態において、アジュバントは、水中油又はリポソーム製剤中のＱＳ２１と３Ｄ−ＭＰＬとの組み合わせである。
増強された系は、モノホスホリルリピドＡとサポニン誘導体との組み合わせ、特にＷＯ９４／００１５３に開示されるＱＳ２１と３Ｄ−ＭＰＬとの組み合わせ、又は、ＷＯ９６／３３７３９に開示されるように、ＱＳ２１がリポソームを含むコレステロール中でクエンチされる（ＤＱ）場合には、反応原性がより低い組成物を含む。この組み合わせは、さらに、免疫刺激性オリゴヌクレオチドを含み得る。
ＱＳ２１、３Ｄ−ＭＰＬ及びトコフェロールを水中油エマルジョン中に含む特に強力なアジュバント製剤は、ＷＯ９５／１７２１０に記載され、本発明における使用のための別の好ましい製剤である。
別の好ましい製剤は、単独で又はアルミニウム塩と組み合わせて、ＣｐＧオリゴヌクレオチドを含む。
本発明のさらなる局面において、ここで記載されるワクチン製剤の製造の方法が提供され、ここで、この方法は、本発明に従うポリペプチドを、好適なアジュバントと混合することを含む。
本発明に従う製剤における使用のために特に好適なアジュバント組み合わせは、以下の通りである：
ｉ） リポソーム中３Ｄ−ＭＰＬ＋ＱＳ２１
ｉｉ） ミョウバン＋３Ｄ−ＭＰＬ
ｉｉｉ） リポソーム＋３Ｄ−ＭＰＬ中ミョウバン＋ＱＳ２１
ｉｖ） ミョウバン＋ＣｐＧ
ｖ） ３Ｄ−ＭＰＬ＋ＱＳ２１＋水中油エマルジョン
ｖｉ） ＣｐＧ
ここで使用される場合、本明細書の文脈において用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」と解釈されるべきである。
実施形態及び優先度は、技術的に適切に組み合わされ得る。
ここでの開示は、特定の整数を含む実施形態を記載する。本開示はまた、前記整数からなるか、本質的に前記整数からなる同じ実施形態まで拡張される。
図１は、種々の抗体配列及び断片配列を示す。 図２は、種々の抗体配列及び断片配列を示す。 図３は、種々の抗体配列及び断片配列を示す。 図４は、種々の抗体配列及び断片配列を示す。 図５は、種々の抗体配列及び断片配列を示す。 図６は、種々の抗体配列及び断片配列を示す。 図７は、種々の抗体配列及び断片配列を示す。 図８は、種々の抗体配列及び断片配列を示す。 図９は、種々の抗体配列及び断片配列を示す。 図１０は、種々の抗体配列及び断片配列を示す。 図１１は、ＴｃｄＡ及びＴｃｄＢについての血清滴定量を示す。 図１２は、１つのＭａｂに対する抗ＴｃｄＡ（リボタイプ００３）インビトロ中和データを示す。 図１３は、１つ又は対のＭａｂに対する抗ＴｃｄＡ（リボタイプ００３）インビトロ中和データを示す。 図１４は、対のＭａｂに対する抗ＴｃｄＡ（リボタイプ００３）インビトロ中和データを示す。 図１５は、対のＭａｂに対する抗ＴｃｄＡ（リボタイプ００３）インビトロ中和データを示す。 図１６は、３つのＭａｂ混合物に対する抗ＴｃｄＡ（リボタイプ００３）インビトロ中和データを示す。 図１７は、３つのＭａｂ混合物に対する抗ＴｃｄＡ（リボタイプ００３）インビトロ中和データを示す。 図１８は、３つのＭａｂ混合物に対する抗ＴｃｄＡ（リボタイプ００３）インビトロ中和データを示す。 図１９は、４つ及び５つのＭａｂ混合物に対する抗ＴｃｄＡ（リボタイプ００３）インビトロ中和データを示す。 図２０は、４つ及び５つのＭａｂ混合物に対する抗ＴｃｄＡ（リボタイプ００３）インビトロ中和データを示す。 図２１は、異なるＴｃｄＡ濃度における１つ又は対のＭａｂに対する抗ＴｃｄＡ（リボタイプ００３）インビトロ中和データを示す。 図２２は、異なるＴｃｄＡ濃度における１つ又は対のＭａｂに対する抗ＴｃｄＡ（リボタイプ００３）インビトロ中和データを示す。 図２３は、異なるＴｃｄＡ濃度における１及び５つまでのＭａｂ混合物に対する抗ＴｃｄＡ（リボタイプ００３）インビトロ中和データを示す。 図２４は、異なるＴｃｄＡ濃度における１及び５つまでのＭａｂ混合物に対する抗ＴｃｄＡ（リボタイプ００３）インビトロ中和データを示す。 図２５は、１つのＭａｂに対する抗ＴｃｄＢ（リボタイプ００３）インビトロ中和データを示す。 図２６は、１つのＭａｂに対する抗ＴｃｄＢ（リボタイプ００３）インビトロ中和データを示す。 図２７は、対のＭａｂに対する抗ＴｃｄＢ（リボタイプ００３）インビトロ中和データを示す。 図２８は、対のＭａｂに対する抗ＴｃｄＢ（リボタイプ００３）インビトロ中和データを示す。 図２９は、対のＭａｂに対する抗ＴｃｄＢ（リボタイプ００３）インビトロ中和データを示す。 図３０は、対のＭａｂに対する抗ＴｃｄＢ（リボタイプ００３）インビトロ中和データを示す。 図３１は、３つのＭａｂ混合物に対する抗ＴｃｄＢ（リボタイプ００３）インビトロ中和データを示す。 図３２は、３つのＭａｂ混合物に対する抗ＴｃｄＢ（リボタイプ００３）インビトロ中和データを示す。 図３３は、３つのＭａｂ混合物に対する抗ＴｃｄＢ（リボタイプ００３）インビトロ中和データを示す。 図３４は、異なる毒素濃度における２つのＭａｂ混合物に対する抗ＴｃｄＢ（リボタイプ００３）インビトロ中和データを示す。 図３５は、異なる毒素濃度における２つのＭａｂ混合物に対する抗ＴｃｄＢ（リボタイプ００３）インビトロ中和データを示す。 図３６は、異なる毒素濃度における２つのＭａｂ混合物に対する抗ＴｃｄＢ（リボタイプ００３）インビトロ中和データを示す。 図３７は、異なる毒素濃度における２つのＭａｂ混合物に対する抗ＴｃｄＢ（リボタイプ００３）インビトロ中和データを示す。 図３８は、異なる毒素濃度における２つのＭａｂ混合物に対する抗ＴｃｄＢ（リボタイプ００３）インビトロ中和データを示す。 図３９は、異なる毒素濃度における２つのＭａｂ混合物に対する抗ＴｃｄＢ（リボタイプ００３）インビトロ中和データを示す。 図４０は、異なる毒素濃度における２つのＭａｂ混合物に対する抗ＴｃｄＢ（リボタイプ００３）インビトロ中和データを示す。 図４１は、異なる相対的Ｍａｂ比及び異なる毒素濃度における２つのＭａｂ混合物に対する抗ＴｃｄＢ（リボタイプ００３）インビトロ中和データを示す。 図４２は、異なる相対的Ｍａｂ比及び異なる毒素濃度における２つのＭａｂ混合物に対する抗ＴｃｄＢ（リボタイプ００３）インビトロ中和データを示す。 図４３は、異なる相対的Ｍａｂ比及び異なる毒素濃度における２つのＭａｂ混合物に対する抗ＴｃｄＢ（リボタイプ００３）インビトロ中和データを示す。 図４４は、異なる相対的Ｍａｂ比及び異なる毒素濃度における２つのＭａｂ混合物に対する抗ＴｃｄＢ（リボタイプ００３）インビトロ中和データを示す。 図４５は、異なる相対的Ｍａｂ比及び異なる毒素濃度における２つのＭａｂ混合物に対する抗ＴｃｄＢ（リボタイプ００３）インビトロ中和データを示す。 図４６は、１つの抗体及び対の抗体に対するＴｃｄＢ中和データを示す。 図４７は、１つの抗体及び対の抗体に対するＴｃｄＢ中和データを示す。 図４８は、１つの抗体及び対の抗体に対するＴｃｄＢ中和データを示す。 図４９は、１つの抗体及び対の抗体に対するＴｃｄＢ中和データを示す。 図５０は、１つの抗体及び対の抗体に対するＴｃｄＢ中和データを示す。 図５１は、１つの抗体及び対の抗体に対するＴｃｄＢ中和データを示す。 図５２は、１つの抗体及び対の抗体に対するＴｃｄＢ中和データを示す。 図５３は、１つの抗体及び対の抗体に対するＴｃｄＢ中和データを示す。 図５４は、１つの抗体及び対の抗体に対するＴｃｄＢ中和データを示す。 図５５は、１つの抗体及び対の抗体に対するＴｃｄＢ中和データを示す。 図５６は、１つの抗体及び対の抗体に対するＴｃｄＢ中和データを示す。 図５７は、１つの抗体及び対の抗体に対するＴｃｄＢ中和データを示す。 図５８は、１つの抗体及び対の抗体に対するＴｃｄＢ中和データを示す。 図５９は、１つの抗体及び対の抗体に対するＴｃｄＢ中和データを示す。 図６０は、ＴｃｄＡについてのアミノ酸配列を示す。 図６１は、ＴｃｄＢについてのアミノ酸配列を示す。 図６２は、ＴｃｄＡについてのＴＥＥＲアッセイデータをヒストグラム様式で示す。 図６２Ａは、ＴｃｄＡについてのＴＥＥＲアッセイデータを折れ線グラフ様式で示す。 図６３は、抗体９９７、１１２５及び１１５１の組み合わせについてのマイヤー−カプラン曲線を示し、高濃度は５０ｍｇ／Ｋｇであり、低濃度は５ｍｇ／Ｋｇである。５０ｍｇ／ｋｇ用量は、１１日目に１００％防御を、２８日目に約８２％防御を与えた。５ｍｇ／ｋｇ用量は、非耐久性の不完全な防御をもたらした。 図６４は、バンコマイシン及びビヒクルで処理したハムスターについての体重変化を示す。 図６５は、低用量抗体５ｍｇ／Ｋｇ及び高用量抗体５０ｍｇ／Ｋｇについての体重を示す。 図６６は、動物が本開示に従う抗体による処理を受けた場合の結腸の写真を、対照に対して示す。 図６７は、抗体安定性におけるボルテックスの効果を示す。 図６８は、抗体安定性におけるボルテックスの効果を示す。 図６９は、種々の抗体についての凝集安定性の比較を示す。 図７０は、種々のリボタイプについてのＴｃｄＡの中和を示す。 図７１は、種々のリボタイプについてのＴｃｄＡの中和を示す。 図７２は、種々のリボタイプについてのＴｃｄＡの中和を示す。 図７３は、種々のリボタイプについてのＴｃｄＡの中和を示す。
抗体作製
種々の異なる免疫原及びスクリーニング試薬を、購入するか、又は従来の大腸菌発現技術によって生成し、多様且つ広範な免疫応答を提供し、モノクローナル抗体（表１に列挙する）の同定及び性質決定を容易にした。組換えタンパク質又はペプチドを作製した場合、配列は、リボタイプ０２７に基づいた。リボタイプ０２７由来のＴｃｄＡについての配列は、配列番号１７１（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｃ９ＹＪ３７）で示され、そしてリボタイプ０２７由来のＴｃｄＢについての配列は、配列番号１７２（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｃ９ＹＪ３５）に示される。
Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット及びｈａｌｆ−ｌｏｐウサギを、ＴｃｄＡ及びＴｃｄＢ完全長毒素の両方に共通する領域に対してマッピングする合成ペプチド、ホルムアルデヒド不活化毒素Ａ、毒素Ａの結合ドメイン断片（ＣＲＯＰ１、２、３又はＣＲＯＰ４、５、６）若しくは毒素Ｂの結合ドメイン断片（ＣＲＯＰ１、２、３、４）、又はいくつかの場合、上記の組み合わせの、いずれかによって免疫化した。２〜６の免疫化の後、動物を屠殺し、そしてＰＢＭＣ、脾臓及び骨髄を回収した。血清を、毒素Ａドメイン、毒素Ｂドメイン、毒素又はトキソイドに対する結合についてＥＬＩＳＡによってモニタリングした。２のこのような免疫化の血清滴定量を、図１１に示す。
ＵＣＢ ＳＬＡＭを、モノクローナル抗体を作製する手段として使用した。Ｂ細胞を、免疫化した動物から直接的に培養した（Zubler et al., 1985）。この工程は、大部分のＢ細胞レパートリーのサンプリングを可能にした。選択したリンパ球抗体方法（ＳＬＡＭ）（Babcook et al., 1996）を組み込むことによって、陽性培養ウェルをデコンボリューションし、抗原特異的抗体分泌細胞を同定することが可能であった。ここで、我々は、ＳＬＡＭ（ＵＣＢ ＳＬＡＭ（Tickle et al. 2009））の修飾バージョンを使用し、これは、培養ウェルから抗原特異的Ｂ細胞を同定する、蛍光ベースの方法を使用する。Ｂ細胞培養物を準備し、そして初めに上清を、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ ８２００細胞検出システムを用いて、対応する精製した毒素ドメインに結合するその能力（結合、トランスロケーション又は触媒）についてビーズベースのアッセイにおいてスクリーニングした。これは、ＩｇＧ、ストレプトアビジンビーズ上にコートされたビオチン化毒素ドメイン及びヤギ抗ラット／ウサギＦｃ−Ｃｙ５コンジュゲートを含むＢ細胞培養上清を用いる、同種アッセイであった。このアッセイ由来のＴｃｄＡ又はＴｃｄＢ構成要素に結合することについて陽性である細胞培養物を、毒素誘導型細胞毒性の中和物を同定するための細胞ベースの機能的アッセイにおける使用について選択した。
およそ１２，０００の毒素特異性陽性体を、計４０×５０プレート実験から一次結合スクリーニングにおいて同定した。これは、約５億のＢ細胞のスクリーニングと同等であった。重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子対を、逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲ後に約１００毒素中和ウェルから微小操作によって回収した１細胞から単離した。次いで、これらのＶ領域遺伝子を、ラット可変領域についてのマウスＩｇＧ１／κ完全長抗体及びウサギ可変領域についてのウサギＩｇＧ／κ完全長抗体としてクローニングした。抗体を、ＨＥＫ−２９３一過性発現系において再発現した。次いで、これらの組換え抗体を、細胞ベースのアッセイにおいて毒素を中和する能力について再試験した。また、組換え抗体を、ＢＩＡｃｏｒｅによってスクリーニングし、所定の毒素ドメインについての親和性を決定し、また、特異性を決定し、毒素に対する抗体の結合事象の数を推定した。細胞ベースアッセイ及び親和性測定におけるインビトロ活性に基づき、ヒト化について選択されるリード候補を導いた。そうでないと言及されない限り、ここでの全てのデータを、ヒト化抗体を用いて作成した。
組換え体のパネル、大腸菌生成毒素断片（ＴｃｄＡ）、Ｃ．ディフィシレ由来毒素又はトキソイド（Ａ）及び合成ペプチド（Ｂ）を、作製するか、又は市販の供給源から購入した。
Ｃ．ディフィシレ抗毒素Ｍａｂの発現及び精製
別個の軽鎖及び重鎖の哺乳動物発現プラスミドを、等モル濃度比で合わせ、ＨＥＫ−２９３又はＣＨＯ−Ｓ細胞をトランスフェクトするために使用した。小規模発現研究のために、リポフェクタミン及びＨＥＫ−２９３細胞を使用し、一方で、ＩｇＧのより大きなバッチの生成のためには、ＣＨＯ−Ｓへのエレクトロポレーションが好ましかった。
培養上清を、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅカラム（ＰＢＳ ｐＨ７．４中）上にロードした。抗体を、１００％ ０．１Ｍクエン酸ナトリウムｐＨ３．４緩衝液で溶出した。サンプルを、ｐＨ７．４までＴｒｉｓ．Ｃｌ ｐＨ８．０で中性化した。凝集物を、ＰＢＳ ｐＨ７．４中のＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｇｅｌ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎカラムによって除去した。
（例１）
精製ＭａｂによるＴｃｄＡ活性のインビトロ中和
全ての中和スクリーニングアッセイを、９６ウェルポリスチレンプレート内で実施した。アッセイは、成長したＣＡＣＯ−２細胞を使用し、ＭＥＭ＋２０％ ＦＣＳ、２ｍＭ Ｑ及びＮＥＡＡにおいてスクリーニングした。任意の抗体組み合わせは、そうでないと言及されない限り、等モル濃度比である。１日目：細胞を、１ウェルあたり５０μｌ培地中３０００個でプレート培養し、そして２４時間にわたってインキュベートした；２日目：ヒト化Ｍａｂの精製サンプルを、９６ウェル丸底ポリプロピレン滅菌プレートに添加した；ＰＰプレートに、毒素Ａを適切な致死用量、すなわちＬＤ８０以上を生じるために充分な濃度をスパイクし、そして１時間にわたって３７℃でインキュベートした；５０μｌのこの混合物を、細胞プレートに添加し、そして９６時間にわたってインキュベートした；５日目：メチレンブルー（０．５％メチレンブルー、５０％エタノール）を添加した；室温で１時間インキュベートした；１％ Ｎ−ラウリルサルコシンで細胞を溶解し、ＢＩＯＴＥＫ Ｓｙｎｅｒｇｙ２プレートリーダーにおいて４０５ｎｍにて読み取った。この結果を、図１２〜２４に示す。示したＴｃｄＡ活性のＥＣ５０及び％最大中和は、選択された抗体は、単体の薬剤として非常に高い力価を有することを確認する。これらの２〜５の組み合わせは、最も良いＥＣ５０又は％最大中和において改善しなかった。ＣＡ９２２、９２３、９９５、９９７及び１０００のＭａｂを合わせた場合のいかなる相乗作用もの欠如は、重要な観察であり、各抗体単独が、特に高いレベルの親和性及び力価を有するという事実に起因し得る。例５における支持データは、Ｍａｂのいくつか（例えば、ＣＡ９９７）は、ＴｃｄＡサブドメインに多数回結合可能であることを示す。従って、恐らく、これらの５つのＭａｂは、ＴｃｄＡのＣ末端細胞結合ドメインを標的した場合に達成可能である最大の親和性、力価及び結合価を示す。この抗体はまた、ＬＤ８０からＬＤ９５を超えるまでの範囲に及ぶ非常に高い毒素濃度（ＬＤｍａｘ）を中和する場合に有効であるが、ＥＣ５０におけるいくつかの中程度の増大（すなわち、力価の下降）を、非常に高レベルの［ＴｃｄＡ］によって観察した。他のデータは、高いＴｃｄＡ濃度を試験した場合、力価の実質的な低下を示した（２０）ので、これらのデータはまた、非常に驚くべきものである。
ここに記載されるＭａｂ、例えばＣＡ９９７の高い力価及び親和性は、その高い結合価のみに起因するのではない。他（２０及びＷＯ０６／０７１８７７）では、抗ＴｃｄＡ Ｍａｂは、１４回までの結合が可能であると記載する。これらのＭａｂのみが、０．３〜１００ｎＭの範囲内の親和性を有し、単独で（２６〜６３％防御）又は対で（３１〜７３％防御）、ＴｃｄＡ媒介型細胞殺傷に対する不完全な防御を示した。従って、ＴｃｄＡに対する結合の高い結合価は、ＴｃｄＡへの結合の高い親和性又はＴｃｄＡの中和のいずれをも、必ずしも呼び起こすものではないことが実証された。Ｍａｂ ＣＤＡ−１（１８及びＵＳ７６２５５５９）については、親和性もＴｃｄＡへの結合価も、記載されなかった。従って、ここで記載されるＭａｂは、驚くべき親和性、力価及び結合価を有する。
（例２）
精製Ｍａｂによる抗ＴｃｄＢインビトロ中和。
アッセイ方法説明：
全ての中和スクリーニングアッセイを、９６ウェルポリスチレンプレート内で行った。
このアッセイは、成長したＣＡＣＯ−２細胞を使用し、ＭＥＭ＋２０％ ＦＣＳ、２ｍＭ Ｑ及びＮＥＡＡにおいてスクリーニングした。述べない限り、全てのＡｂ組み合わせは、等比である。
●１日目：細胞を、１ウェルあたり５０μｌ培地中３０００個でプレート培養し、そして２４時間にわたってインキュベートする
●２日目：ヒト化Ｍａｂの精製サンプルを、９６ウェル丸底ポリプロピレン滅菌プレートに添加した
●ＰＰプレートに、毒素Ｂロット番号０３１をスパイクし、そして１時間にわたって３７℃でインキュベートする
●５０μｌのこの混合物を、細胞プレートに添加する
●そして９６時間にわたってインキュベートする
●５日目：メチレンブルー（０．５％メチレンブルー、５０％エタノール）を添加する
●室温で１時間インキュベートする
●１％ Ｎ−ラウリルサルコシンで細胞を溶解する
●ＢＩＯＴＥＫ Ｓｙｎｅｒｇｙ２プレートリーダーにおいて４０５ｎｍにて読み取る
図２５〜３３におけるデータは、単体のＭａｂのみは、％最大中和及び活性（ＥＣ５０）の両方において、ＴｃｄＢの中和において比較的有効ではなかったことを示す。しかし、抗体が２つ及び３つに合わされた場合、％最大中和及び活性（ＥＣ５０）の両方における相当な改善が観察された。１１２５及び１１５１は、最も良い対として選択されたが、他の良い対が観察された：１１２５＋１１５３、１１２５＋１１３４。
Ｍａｂの最も有効な対を、経験的に選択し、各Ｍａｂの個々の力価を考慮した際に、予期せぬ驚くべき組み合わせを作製することを遡及的に見出した。例えば、表６において、ＣＡ９２７のみがＴｃｄＢ中和能力を有し、規定のＥＣ５０を生じたが、一方で、ＣＡ１１２５及びＣＡ１１５１の両方のＴｃｄＢ中和能力は、これらのアッセイ条件の下では、規定のＥＣ５０を生じるのに不十分であった。しかし、ＣＡ９２７は、組み合わせ内で使用されるためには、最も有効なＭａｂであるとは見出されなかった。最も良いＣＡ９２７を含む組み合わせは、１３．５ｎｇ／ｍｌのＥＣ５０を有したが、一方で、他の２つのＭａｂ組み合わせは、２．５９及び４．７１ｎｇ／ｍｌの低さのＥＣ５０を有した。別の例において、表８において、ＣＡ１０９９は、使用したアッセイ条件下で、最低のＴｃｄＢ中和ＥＣ５０を有した。しかし、ＣＡ１０９９は、組み合わせ内で使用されるためには、最も有効なＭａｂであるとは見出されなかった。最も良いＣＡ１０９９を含む組み合わせは、６ｎｇ／ｍｌのＥＣ５０を有したが、一方で、他の２つのＭａｂ組み合わせは、２及び１ｎｇ／ｍｌの低さのＥＣ５０を有した。我々は、Ｍａｂの最も有効な対は、その共働結合様式によって決定され、特に重複しないエピトープを有することによって決定されると推測し得る。
（例３）
精製Ｍａｂの組み合わせによるＴｃｄＢの中和。
全ての中和スクリーニングアッセイを、９６ウェルポリスチレンプレート内で行った。
このアッセイは、成長したＣＡＣＯ−２細胞を使用し、ＭＥＭ＋２０％ ＦＣＳ、２ｍＭ Ｑ及びＮＥＡＡにおいてスクリーニングした。
●１日目：細胞を、１ウェルあたり５０μｌ培地中３０００個でプレート培養し、そして２４時間にわたってインキュベートする
●２日目：ヒト化Ｍａｂの精製サンプルを、９６ウェル丸底ポリプロピレン滅菌プレートに添加した
●ＰＰプレートに、毒素Ｂ（ＶＰＩ １０４６３）をスパイクし、そして１時間にわたって３７℃でインキュベートする
●５０μｌのこの混合物を、細胞プレートに添加する
●そして７２時間にわたってインキュベートする
●５日目：メチレンブルー（０．５％メチレンブルー、５０％ＥＴＯＨ）を添加する
●室温で１時間インキュベートする
●１％ Ｎ−ラウリルサルコシンで細胞を溶解する
●ＢＩＯＴＥＫ Ｓｙｎｅｒｇｙ２プレートリーダーにおいて４０５ｎｍにて読み取る
結果を、図３４〜４５に示す。
これらのデータは、一定範囲の毒素濃度において、ＴｃｄＢ中和のためのＭａｂの最も良い対は、ＣＡ１１２５及びＣＡ１１５１であったことを示す。さらに、１１２５＋１１５１組み合わせは、１１２５＋１１５３と対照的に、相対的モル濃度比における変化によって大きく影響を受けなかった。
データは、最も活性特異的な対組み合わせは、互いに対し、驚くべき且つ予測せぬ異なった特性を有することすら示す。好ましい組み合わせであるＣＡ１１２５及びＣＡ１１５１等モル濃度比でのＥＣ５０は、［ＴｃｄＢ］の増大によって大きく影響を受けない。試験したＭａｂの３つの相対的モル濃度比（すなわち、２５：７５対５０：５０対７５：２５）は、互いに非常に類似したＥＣ５０を有し、このことは、ＣＡ１１２５及びＣＡ１１５１は、特に相補的な作用様式を有することを示唆する。このことは、ＣＡ１１２５のＣＡ１１３４との組み合わせに対して対照的であり、ここで、より高い［ＴｃｄＢ］によるＥＣ５０における増加（すなわち、効力の低下）は、より実質的であり、ここで、３つのＭａｂのモル濃度比は、等しく有効ではない：２５：７５のＣＡ１１２５：ＣＡ１１３４比は、５０：５０及び７５：２５よりもとりわけ効力が低い。このことは、合わせたＣＡ１１２５＋ＣＡ１１３４の力価は、ＣＡ１１２５構成要素に対しより依存的であることを示唆する。ＣＡ１１２５及びＣＡ１１５３の３つ全てのモル濃度比の組み合わせのＥＣ５０は、実質的に、［ＴｃｄＢ］の増大によって影響を受け、このことは、ＣＡ１１５３は、ＣＡ１１２５との組み合わせのために余り好適なパートナーではないことを示唆する。これらのデータは、全てで、ＣＡ１１２５及びＣＡ１１５１は、最も高い力価がＭａｂ及びＴｃｄＢのモル濃度比の範囲に亘って維持されるので、特に好ましい組み合わせであることを示す。
これらのデータは、Ｍａｂの組み合わせ、特にＣＡ１１２５及びＣＡ１１５１の組み合わせは、ＥＣ５０によって測定される力価及び％最大防御によっても測定される力価の両方を改善する。％最大防御は、Ｍａｂ：ＴｃｄＢ混合物は長い時間（７２時間）にわたって細胞と共にインキュベートされるので、このアッセイ方法において特に適切である。ＴｃｄＢは、Ｃａｃｏ−２細胞に対し、ｐｇ／ｍｌの範囲で２〜４時間毒性であるので、この測定値は、Ｍａｂ中和能力の非常に困難な試験であると考えられ、その結合動態学又は結合様式に関するＭａｂ混合物の能力が反映され得る。同様に、これは、ＴｃｄＢの実質的な量が多くの時間にわたって組織内にあり得る場合、確立された感染中のＴｃｄＢの効果に対して防御するＭａｂ混合物の能力を反映し得る。
表６〜９から選択されたデータは、さらに、図４６〜５９において説明される。
（例４）
ＭａｂのＴｃｄＢサブドメインに対する結合価
抗Ｃ．ディフィシレＴｃｄＢ抗体のＴｃｄＢ１２３４に対する結合事象のモル数を、Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）において、表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定した。ストレプトアビジンを、ＣＭ５センサーチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に約４０００ＲＵのレベルまでアミンカップリングを介して固定化し、ビオチン化ＴｃｄＢ１２３４を５００〜６００ＲＵで結合させた。同じ抗ＴｃｄＢ抗体混合物（各抗体の最終濃度は５００ｎＭであった）の２回の２０μｌ注入を、この表面にわたって１０μｌ／分で注入し、飽和結合応答を記録した。表面を、ＨＣｌを用いて毎周期後に再生した。全てのデータを、ストレプトアビジンのみの参照フローセルに対する応答を用いてバックグラウンド結合について修正した。

ＣＡ９２７は、ＴｃｄＢ１２３４に１回しか結合しないＭａｂの代表と考えられるので、全ての応答は、ＣＡ９２７平均応答（表１０の最終欄）の倍数に関して表現されている。
固定化ＣＡ１１２５は、ＴｃｄＢ１２３４と結合する場合、ＣＡ１１２５にさらなる結合をさせないことは、ＣＡ１１２５が、ＴｃｄＢ１２３４上の１つの結合部位を有し、これが飽和した後には、ＣＡ１１２５は他の結合部位を見出し得ないという着想を支持する。しかし、ＴｃｄＢ１２３４がＣＡ１１２５によって飽和される場合、ＣＡ１１５１はなお結合可能である。このことは、ＣＡ１１５１が、ＣＡ１１２５によって占められた部位の代替の部位において結合することを実証する。これらのデータを合わせると、ＣＡ１１２５は、ＴｃｄＢ１２３４の単独の結合剤であり、一方で、１１５１ ＩｇＧは、ＴｃｄＢ１２３４に１回以上、最も適当には２回結合することを示す。従って、ＣＡ１１２５及びＣＡ１１５１の混合物は、約３回、ＴｃｄＢ１２３４と結合し得る。
全ての抗体組み合わせは、付加物結合応答を有し、このことは、ＴｃｄＢ１２３４上には、これらの組み合わせによって結合される２以上の非競合的部位が存在することを示す。
（例５）
ＭａｂのＴｃｄＡサブドメインに対する結合価
抗Ｃ．ディフィシレＴｃｄＡ抗体のＴｃｄＡ１２３及びＡ４５６に対する結合事象のモル数を、Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）において、表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定した。ストレプトアビジンを、ＣＭ５センサーチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に約４０００ＲＵのレベルまでアミンカップリングを介して固定化し、ビオチン化ＴｃｄＡ１２３を１つのフローセルに結合させ、そしてＴｃｄＡ４５６を異なるフローセルに対し約５００ＲＵの応答で結合させた。同じ抗ＴｃｄＡ抗体１μＭの２回の３０μｌ注入を、両フローセルにわたって１０μｌ／分で注入し、飽和結合応答を記録した。表面を、ＨＣｌを用いて毎周期後に再生した。全てのデータを、ストレプトアビジンのみの参照フローセルに対する応答を用いてバックグラウンド結合について修正した。

抗体ＣＡ９９７及びＣＡ１０００は、ＴｃｄＡ１２３に、６つのＣＡ９９７対１つのＣＡ１０００の比で結合し、一方で、これらは、ＴｃｄＡ４５６に、３つのＣＡ９９７対１つのＣＡ１０００の比で結合する（表２）。
分子量及び固定化毒素レベルについて修正されたＣＡ９９７に対する最大抗体応答は、ＴｃｄＡ１２３及びＴｃｄＡ４５６について類似である。このことは、ＣＡ９９７がＴｃｄＡ４５６に６回結合し、ＣＡ１０００がＴｃｄＡ４５６に２回結合することを示唆する。従って、抗体ＣＡ９９７は、ＴｃｄＡ全毒素（ＴｃｄＡ）に対し、約１２回結合する可能性が高い。
ＣＡ９９７全体は、Ａ１２３に６回以上、そしてＡ４５６に６回以上結合し、一方で、ＣＡ１０００は、Ａ１２３に少なくとも１回、そしてＡ４５６に２回結合する。
ＴｃｄＡ及びＴｃｄＢに対する結合価の増大は、インビボで、２つの重要な効果を有し得る。第１に、ＴｃｄＢに１回以上結合可能である任意のＭａｂ又はＭａｂ混合物が、毒素間結合事象を形成し、従って、免疫沈降する、増大した可能性を有することである。免疫沈降は、毒素の可溶性を低減し、非常に大きな巨大分子複合体を形成して、効果的に作用する毒素濃度を低下させることによって、力価に寄与し得る。このような大きなタンパク質複合体は、組織中に存在するマクロファージ及び単球によって摂取され得、そして増強された宿主免疫応答に寄与し得る。Ｆｃ断片を担う抗原：抗体複合体は、胃の病原体に対して宿主免疫応答を開始できることが具体的に示されている（２１）。また、可溶性抗原：抗体複合体が、ヒト臨床試験において、抗原に対し指向するワクチンとして成功裏に使用されている（２２）。加えて、Ｆｃ保有ＩｇＧによる毒素の免疫修飾は、肝臓及び脾臓を通した通常のメカニズムを用いて免疫クリアランスに寄与し得る。一般に、より高いレベルの抗原のＦｃ修飾は、より速くより完全なレベルのクリアランスをもたらす（２３）。重要なことには、毒素あたり２つ以上のＭａｂ Ｆｃドメインの存在、特に毒素あたり３つのＦｃドメインの存在は、非常に迅速且つ実質的な毒素のクリアランスに必要であるＦｃの臨界数を表し得る（２４）。抗ＴｃｄＡ Ｍａｂ ＣＡ９９７は、ＴｃｄＡに、１２回まで結合可能である可能性が高く、ＣＡ１１２５及びＣＡ１１５１の組み合わせは、ＴｃｄＢに対し３回結合可能である可能性が高い。従って、３つのＭａｂ混合物は、インビボのこれらの種のさらなる力価メカニズムを提供することができる可能性が非常に高い。
（例６）
ＴｃｄＡによって起こったＴＥＥＲの喪失のＭａｂ中和
Ｃ．ディフィシレ単層完全性アッセイを、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（ＢＤ）Ｃａｃｏ−２ ＢｉｏＣｏａｔ ＨＴＳプレートシステムを用いて実施する。
１日目− Ｃａｃｏ−２細胞を、５００μｌの基礎播種培地（ＢＤによって供給される）中で、プレート挿入物の１ウェルあたり２×１０５／ｍｌにて播種した。３５ｍｌの基礎播種培地を、フィーダートレイに添加した。細胞を、２４時間にわたって３７℃でインキュベートした。２日目−基礎播種培地を挿入物及びフィーダートレイから除去し、そしてＥｎｔｅｒｏ−ＳＴＩＭ分化培地（ＢＤによって供給される）と置き換えた。挿入物のウェルあたり５００μｌ添加し、フィーダートレイに３５ｍｌ添加した。細胞を、さらに７２時間、３７℃でインキュベートした。５日目−抗体を、ポリプロピレンプレート内及び毒素Ａのアッセイウェルにおいて使用される濃度に対し２×濃度で調製した。毒素Ａを、抗体に１２５ｎｇ／ｍｌの濃度で加え、プレートを、１時間にわたって３７℃でインキュベートした。１ｍｌのＣａｃｏ−２増殖培地（ＭＥＭ＋２０％ ＦＣＳ、２ｍＭ Ｑ、ＮＥＡＡ）を、標準２４ウェルＴＣプレートの各ウェルに加えた。ＢｉｏＣｏａｔ挿入プレートを、２４ウェルＴＣプレートに移した。Ｅｎｔｅｒｏ−ＳＴＩＭ培地を、挿入物から除去し、４００μｌの毒素：Ａｂ混合物と置き換えた。
胃の細胞間のタイトジャンクションの喪失は、細胞単層及び胃組織切片上のＴｃｄＡの重要な初期効果であり、主に下痢を起こす。アルブミン及び他の血清タンパク質が、血清液と共に腸管内腔内に失われる。単層を形成している分化した培養細胞における経上皮電気抵抗の喪失は、ＴｃｄＡの急性効果に対する防御のための有用な代理物である。示している３つの抗体は、ＴＥＥＲ喪失に対するよいレベルの防御を有する。図６２。これらのＭａｂのＴＥＥＲアッセイにおける能力は、細胞増殖アッセイにおいて測定される毒素中和においてみられるものを反映しないことは注目すべき且つ驚くべきことである。ＣＡ９２２は、細胞増殖アッセイにおける最善の性能を有し（ＥＣ５０＝１．２１ｎｇ／ｍｌ）、これはなお、抗体（ＣＡ１０００）によるＴＥＥＲアッセイにおいてかなり性能が優れており、細胞増殖アッセイにおいて１０倍以上低い力価を有した（ＥＣ５０＝１９．７３ｎｇ／ｍｌ）。ＣＡ９９７は、より低いＭａｂ濃度にて高レベルの防御を有し、これを維持したので、ＴＥＥＲアッセイにおいて最善の性能を有した。ＣＡ９９７は、８０％せまる最大阻害及び４時間で約８０ｎｇ／ｍｌのＥＣ５０を有し、ＴＥＥＲ喪失を中和する実質的な能力を有した。これらの観察は、問題のＭａｂが、全て、ＴｃｄＡドメインに対する高い親和性（ＣＡ９２２ 約４ｐＭ、ＣＡ９９７ 約１３２ｐＭ、ＣＡ１０００ 約７３ｐＭ）を有したので、予期せぬものである。これらのデータは、ＣＡ９９７及びＣＡ１０００が、ＴＥＥＲ喪失において重要なエピトープを認識するか、又は、他のＭａｂとは異なるメカニズムにより、ＴｃｄＡを中和することを示唆する。さらに、ＣＡ１０００は、ホロ毒素に２回結合すると推定される（ＴｃｄＡ１２３において１回、及びＴｃｄＡ４５６において１回）ので、ＣＡ１０００は、ＴｃｄＡ細胞結合領域内の「ＴＥＥＲの重要な」エピトープを規定し得、これは、ワクチン免疫原を規定するための特定の値を有し得る。結果を、図６２に示す。
（例７）
抗Ｃ．ディフィシレ毒素抗体の、ＴｃｄＡ及びＴｃｄＢのサブドメイン：ＴｃｄＡ１２３、ＴｃｄＡ４５６及びＴｃｄＢ１２３４に対する親和性。
抗Ｃ．ディフィシレＴｃｄＡ及びＴｃｄＢ抗体の相互作用についての動態定数を、ＣＭ５センサーチップを用いるＢＩＡｃｏｒｅ ３０００において行われる表面プラスモン共鳴によって決定した。全ての実験を、２５℃で実施した。Ａｆｆｉｎｉｐｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ，Ｆｃ断片特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を、ＣＭ５センサーチップ（ＧＥ）上に、アミンカップリング化学を介して固定化し、≒７０００応答単位（ＲＵ）の補足レベルとした。ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％界面活性剤 Ｐ２０、Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ）を、１０μＬ／分の流速でランニングバッファーとして使用した。各抗体の１μｇ／ｍｌ以下での１０μＬ注入を、固定化した抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃを補足するために使用した。ＴｃｄＡ１２３、ＴｃｄＡ４５６又はＴｃｄＢ１２３４を、１２．５ｎＭから二倍希釈にて３０μＬ／分の流速にて補足した精製抗体にわたって滴定した。培養上清中に存在する抗体について、１濃度の１２．５ｎＭのＴｃｄＡ１２３又はＴｃｄＡ４５６及び５０ｎＭのＴｃｄＢ１２３４を、３０μｌ／分にて抗体の上を通過させた。動態を、ｎ＝２にて計算した。表面を、４０ｍＭ ＨＣｌの２回の１０μＬ注入、及び５ｍＭ ＮａＯＨ５μＬ注入により、１０μＬ／分の流速にて再生した。
二重参照バックグラウンドを減算した結合曲線を、標準的手順に従い、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（バージョン３．２）を用いて分析した。動態パラメータを、適合アルゴリズムから決定した。
抗ＴｃｄＡ親和性は、他のＭａｂの公表された親和性と比較して、特に高い。我々は、４ｐＭの低さの親和性が達成可能であることを実証した。好ましいＣＡ９９７は、１３２ｐＭ、ＣＡ１１２５は１２２ｐＭ、及びＣＡ１１５は５５１ｐＭの親和性を有する。ＣＡ９９５は、ＣＲＯＰ Ａ１２３に結合しないことを明らかに示し、従って、ここで示されるＭａｂは互いに異なる特性を有することを、驚くべき且つ予測しない方法で、実証する。ＣＡ９２２、９２３、９９７及び１０００は、ＣＲＯＰ Ａ１２３及びＡ４５６に対し、少なくとも１回結合する。従って、これらの４つのＭａｂは、各々、ホロ毒素に少なくとも２回結合しなければならないことを確認する。我々は、技術的制約に起因し、ホロ毒素に対するこれらのＭａｂの結合のための親和性を導くことはできなかった。しかし、高い親和性及び結合価が、抗ＴｃｄＡ Ｍａｂについて実証された場合、ホロ毒素に対する機能的親和性が、毒素サブドメインに対する結合について説明されたものよりもなお強い場合があることを推測することができる。抗ＴｃｄＢ Ｍａｂはまた、３１ｐＭの低さに達した強い親和性が実証された。詳細には、ＣＡ１１２５、１１５１、９２７、１０９９、１１３４及び１１５３は、他に実証されたものをしのぐ親和性を示す。
（例８）
Ｃ．ディフィシレ抗毒素ヒト化ＩｇＧ１分子の生物物理学性質決定
分析した分子
抗ＴｃｄＡ ＩｇＧ１：
ＣＡ１６４＿００９２２．ｇ１
ＣＡ１６４＿０９２３．ｇ１
ＣＡ１６４＿０９９５．ｇ１
ＣＡ１６４＿０９９７．ｇ１
ＣＡ１６４＿０１０００．ｇ１
抗ＴｃｄＢ ＩｇＧ１：
ＣＡ１６４＿０１１２５．ｇ１
ＣＡ１６４＿０１１２５．ｇ２
ＣＡ１６４＿０１１３４．ｇ４
ＣＡ１６４＿０１１３４．ｇ５
ＣＡ１６４＿０１１３４．ｇ６
ＣＡ１６４＿０１１０２．ｇ１
ＣＡ１６４＿０１１０２．ｇ４
ＣＡ１６４＿０１１５１．ｇ４
長期間保存の間の凝集の潜在的な危険性を減らすため、抗体組み合わせは、高レベルの安定性を有するＭａｂで構成される必要がある。熱安定性（Ｔｍ）が、１つの基準として使用される。Ｍａｂ混合物に対する特別な値は、物理的ストレス、例えば撹拌又は振とうに起因するその凝集傾向の測定である。凝集物は、貯蔵期間を短縮し得、特定のレベルで患者に対する安全性リスクを引き起こし得るので、薬物組成物の望ましくない成分である。Ｔｍデータは、全５の抗ＴｃｄＡ Ｍａｂが高いＴｍ安定性を有し、３つ（ＣＡ９２２、９２３及び９９７）は、７９〜８１℃の範囲内の非常に高いＴｍを有することを示す。試験した抗ＴｃｄＢ Ｍａｂのうち２つを除く全てが、非常に高いＴｍを有する。ハムスター感染研究（例９）において試験されたＣＡ９９７、ＣＡ１１２５及びＣＡ１１５１は、非常に高いＴｍを有し（それぞれ、７９．２℃、７９．３℃及び８０．８℃）、このことは、これらをＭａｂ混合物における使用のために好ましくすることが注目される。
振とう凝集アッセイにおいて、ＣＡ９９７及び９２２は、５つの抗ＴｃｄＡＭａｂの最も低い凝集傾向を有した。同様に、ＣＡ１１５及び１１５１は、抗ＴｃｄＢ Ｍａｂの最も低い凝集特性を示した。従って、ＣＡ９９７、１１２５及び１１５１のＭａｂ混合物としての使用は、これらは、共製剤化及び高タンパク質濃度での保存を生き残る可能性がより高いので、特別な値を有し得る。
キャピラリーＩＥＦによる等電点（ｐＩ）の推定
サンプルを、以下を混合することによって調製した：２ｍｇ／ｍｌの３０μｌのタンパク質サンプル、０．３５％ メチルセルロース、４％ ｐＨ３〜１０両性電解質（Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ）、合成ｐＩマーカー（４．６５及び９．７７）、１μｌの各ストック溶液及び最終容量を２００μｌにするためのＨＰＬＣ等級の水。次いで、この混合物を、ｉＣＥ２８０ ＩＥＦアナライザー（１５００Ｖにて１分間事前焦点合わせをし、その後、３０００Ｖで６分間焦点合わせをする）を用いて分析した。次いで、キャリブレーションした電気泳動図を、Ｅｍｐｏｗｅｒソフトウェア（Ｗａｔｅｒｓ製）を用いて組み込んだ。
熱蛍光アッセイを介して測定した熱安定性（Ｔｍ）。
この方法は、Ｓｙｐｒｏ ｏｒａｎｇｅ蛍光色素を用い、タンパク質ドメインの変性プロセスをモニタリングする。この色素は、変性の結果として露出された露出疎水性領域に結合し、その結果、放出スペクトルの変化をもたらす。
サンプル（１ｍｇ／ｍｌで５μｌ）を、Ｓｙｐｒｏ ｏｒａｎｇｅの５μｌのストック溶液（３０倍）と混合し、容量を、ＰＢＳ、ｐＨ７．４０で５０μｌにする。
この溶液の１０μｌのアリコートを、３８４ウェルプレート内のウェルに適用した（ｎ＝４）。
このプレートを、正確な温度制御のための加熱デバイスを含む７９００ＨＴ ｆａｓｔ実時間ＰＣＲシステム内においた。温度は、２０℃から９９℃にまで上がった（１．１℃／分の傾斜率）。ＣＣＤデバイスは、ウェル内で変化する蛍光を同時にモニタリングする。アルゴリズムは、強度データを処理して、複数の変遷を考慮に入れるために使用される。
撹拌によるサンプルのストレス負荷
抗体を製造する間、サンプルを、ポンピング及び濾過などのプロセスによって生じた機械的ストレスに供する。これは、タンパク質の気体−液体境界の曝露及び生物活性の最終的喪失をもたらす剪断力に起因して、変性及び結果としての凝集を引き起こし得る。ボルテックスによるストレスは、凝集安定性の予測についての抗体サンプルの頑強さをスクリーニングする方法である。
抗ＴｃｄＡ及び抗ＴｃｄＢ ＩｇＧ１分子の両方を、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ Ｃｏｍｆｏｒｔを用いて２５℃、１４００ｒｐｍでボルテックスすることにより、撹拌によるストレスに供した。サンプルサイズは、１．５ｍＬ円錐形エッペンドルフスタイルキャップチューブ（プラスチック）中で、２５０μｌ（１サンプルにつき×３）、ＰＢＳ ｐＨ７．４中であった。各サンプルを、１ｍｇ／ｍｌの濃度にし（配列から計算された減衰係数を用いる）、凝集を、Ｖａｒｉａｎ Ｃａｒｙ ５０−Ｂｉｏ分光光度計を用いることにより、３４０ｎｍ及び／又は５９５ｎｍにて吸光度によってモニタリングし、２４時間まで間隔をあけて測定した。
結果
表１４は、抗ＴｃｄＡ及び抗ＴｃｄＢ ＩｇＧ１分子の両方について、測定したｐＩ及びＴｍデータのまとめを提供する。
測定したｐＩ
分子の測定したｐＩは、高く（ＣＡ１６４＿０１０００．ｇ１＿Ｐ３を除く）、ＰＢＳ、ｐＨ７．４及び５０ｍ酢酸ナトリウム／１２５ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ５などの製剤化緩衝液のｐＨから離れていた。これは、２以上のＭａｂの共製剤化のために好適なｐＨを有する緩衝液が、選択され得ることを意味し得る。
熱蛍光アッセイを介して測定された熱安定性（Ｔｍ）
全ての分子がＩｇＧ１であるので、ＦｃドメインのＴｍ（Ｔｍ（ＣＨ２））は、同じである。分子間の熱安定性の相違は、Ｆａｂ’ドメインのＴｍ（Ｔｍ（Ｆａｂ））によって決定され得る。
抗ＴｃｄＡ分子について、ランクの順番（最も安定なものが１番目）は、ＣＡ９２２は９９７以上であり、９９７＞９２３＞９９５＞１０００である。抗ＴｃｄＢ分子について（最も安定なものが１番目）は、ＣＡ１１５１．ｇ４＞１１２５．ｇ１、ｇ４＞１１３４．ｇ４＞１１３４．ｇ５、１１３４．ｇ５は１１３４．ｇ６以上であり、１１３４．ｇ６＞１１０２．ｇ１＝１１０２．ｇ４である。
撹拌によるサンプルのストレス負荷
異なる抗体間の異なる凝集安定性を決定することができ、図６７は、ＰＢＳ、ｐＨ７．４中の種々の抗ＴｃｄＡ ＩｇＧ１分子に対するボルテックスを介した撹拌の効果を示す。
ランクの順番を決定することが可能であった（最も凝集安定性であるものが１番目）：ＣＡ９２２は９９７以上であり、９９７＞９２３であり、９２３は９９５以上であり、９９５＞１０００である。
図６８は、種々の抗ＴｃｄＢ分子に対するボルテックスを介した撹拌の効果を示す。
凝集安定性の順番をランク付けすることが可能であったが、ＣＡ１１２５グラフトは、ＣＡ１１３４分子よりも安定であると考えられ、このＣＡ１１３４分子は、ＣＡ１１０２分子よりも安定であった。
さらなる研究を実施し、抗ＴｃｄＢ分子（ＣＡ１１５１．ｇ４）の凝集安定性を、より安定な分子ＣＡ１１２５．ｇ２（図２を参照されたい）及びより凝集安定性である抗ＴｃｄＡ分子（ＣＡ９２２．ｇ１及びＣＡ９９７．ｇ１）と直接的に比較した。結果は、図６９において示され得る。
これらの４つのＭａｂについてのさらなる結果を、図６７及び６８に示す。
抗ＴｃｄＡ分子について、ＣＡ９２２．ｇ１及びＣＡ９７７．ｇ１、ＣＡ９２２が、上の分析に基づいて好ましく、ＣＡ１０００は除外して、全ての分子が、治療的ＩｇＧ１としての使用のための好適な候補と考えられ得る。
抗ＴｃｄＢ分子について、生物物理学的特徴が、凝集安定性及びＴｍに基づくグラフトのファミリー内にグループ化され得る、ＣＡ１１２５グラフとは、潜在的により安定であると証明される。ＣＡ１１０２グラフトは、最も貧しいＴｍデータを示し、また、撹拌によるストレスを介して、最も大きな凝集の傾向を示した。
ＣＡ１１５１．ｇ４を用いる研究は、この分子が、ＣＡ１１１２５．ｇ２と比較して僅かに増加した凝集安定性を示し、ＴｃｄＡ分子と同等であるとみられることを示した（ＣＡ９２２．ｇ１及びＣＡ９９７．ｇ１）。全ての４つの分子は、同等のＴｍ値を示した。ＣＡ９９７、ＣＡ１１２５及びＣＡ１１５１は、非常に高いレベルの熱安定性及び撹拌後の非常に低いレベルの凝集形成を示す。
（例９）
抗Ｃ．ディフィシレ毒素Ｍａｂハムスター感染研究。
ハムスター感染研究が、Ｒｉｃｅｒｃａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＬＬＣ、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、Ｏｈｉｏ、ＵＳＡによって実施された。研究プロトコールは、Ｒｉｃｅｒｃａ ＩＡＣＵＣ委員会によって承認された。活性構成要素及び対照構成要素（組成物及び用量）を、計画された２８日間の研究期間の完了後まで、Ｒｉｃｅｒｃａスタッフに対して盲検とした。
ゴールデンシリアン雄ハムスター（８２〜１０３ｇ、５４日齢）を、ＨＥＰＡフィルターをした使い捨てケージ内に個別に入れ、Ｔｅｋｌａｄ Ｇｌｏｂａｌ Ｄｉｅｔ ２０１６を食餌し、水を適宜与えた。順化後、ハムスターを、Ｍａｂ混合物又はＰＢＳ（ビヒクル対照）で４日間（−３日目、−２日目、−１日目及び０日目）のそれぞれ１日１回事前投薬した（ｉ．ｐ．）。２用量のＭａｂを、調査した：高用量＝抗ＴｃｄＡ及び抗ＴｃｄＢ構成要素それぞれ５０ｍｇ／ｋｇ及び低用量は、抗ＴｃｄＡ及び抗ＴｃｄＢ構成要素それぞれ５ｍｇ／ｋｇ。
試験した薬物組み合わせは、注射されたタンパク質の５０％を構成する１つの抗ＴｃｄＡ抗体（ＣＡ９９７．ｇ１）及び共に注射されたタンパク質の５０％を構成するが単独では注射されたタンパク質の２５％を構成する２つの抗ＴｃｄＢ抗体（ＣＡ１１２５．ｇ２及びＣＡ１１５１．ｇ４）から構成されていた。ハムスターを、（−１日目に）５０ｍｇ／ｋｇのＰＢＳ中リン酸クリンダマイシン（ｓ．ｃ．）で感作し、その１日後（０日目）に、３．４×１０６ｃ．ｆ．ｕ．の株ＡＴＣＣ４３５９６由来の栄養細胞でチャレンジした。バンコマイシンを、１日目、２日目、３日目、４日目、５日目に、５日間５ｍｇ／ｋｇ日に２回投薬した（ｐ．ｏ．）。
生存能力チェックを、動物に対し１日に２回行い、死にかけていると見出された動物を安楽死させ、死として数えた。体重を、各投薬日、次いで、２週に１度及び生存個体の安楽死の前に決定した。全体的剖検を、全ての動物に対して行った。生存曲線を、カプラン及びメイヤーの方法によって作成した。生存曲線を、対数順位検定からのＰ値を、ボンフェローニ補正した閾値のＰ＝０．００５と比較して用いて分析した。バンコマイシン処置群を、分析に含めなかった。全ての統計学的試験を、Ｐｒｉｓｍ ｖ５．０４によって行った。全ての群は、５匹の動物を含むバンコマイシン処置群を除き、１１匹の動物を含んだ。
生存曲線は、図６３において見ることができる。ＰＢＳ（対照）を受けたハムスターは全て、＋２日目及び＋３日目に死亡したが、一方，バンコマイシン処置を５日間受けた個体は、＋１０日目及び＋１１日目に全て死んだ。高用量のＵＣＢ Ｍａｂ混合物を受けたハムスターは、＋１１日目まで生存したが、その後、２８日間の研究の最終日までに、２匹のみが死んだ。低用量のＵＣＢ Ｍａｂ混合物を受けたハムスターは、全て、＋３日目までは生存し、その後、動物は、全てが死んだ＋１６日目までに、公平に安定的に失われた。このデータは、ハムスターにおける抗毒素Ｍａｂの使用についての刊行されたデータ（１８）と比較した場合の、防御の例外的なレベル及び持続期間を示す。これらのインビボデータは、中和及び安定性についての非常に高レベルの性能のインビトロ観察を支持する。
感染の急性期（１〜５日目）の間、死と体重との間は明らかにリンクしていなかった。図６４〜６５。従って、ハムスターは、圧倒的なＴｃｄＡ及びＴｃｄＢの直接的及び間接的な影響により死んだと考えることができる。中和Ｍａｂの部分的防御（ＵＣＢ低用量）に起因して急性期を生き延びたハムスターは、恐らく、胃の損傷及び栄養状態の変化に起因して、体重を落した。研究の２８日間を生き残ったハムスターの多くは、ＵＣＢ高用量Ｍａｂの防御効果に起因し、体重喪失から回復し、実際には体重を増やしたことは、注目すべき点である。このことは、ＵＣＢ Ｍａｂの優れた防御効果が、胃を正常に機能させることが可能であるという証拠として採用され得る。
ＵＣＢ Ｍａｂは、ＴｃｄＡ及びＴｃｄＢによって起こる血液滲出から大腸及び小腸を防御できたことは、明らかである。
結果を、図６３〜６６に示す。
図６６中の写真は、ＴｃｄＡ及びＴｃｄＢによって起こる盲嚢の膨潤及び血液滲出についての代表的な全体的病理学（左画像、ＰＢＳ対照、２日目の動物死）及びＵＣＢ高用量Ｍａｂによる防御後の、正常な大便に満たされた盲嚢（右画像、ＵＣＢ高用量、２８日目まで生存した動物）を示す。これらのデータは、高用量のＵＣＢ Ｍａｂによる防御後、大腸は、正常な形態及び機能に戻り得ることを示す。
（例１０）
精製Ｍａｂによる、種々のリボタイプの株由来のＴｃｄＡの中和。
臨床的感染を、種々の異なる株によって引き起こす。株相違を、リボタイプが鍵となる多くの種々の方法を用いて性質決定する。異なるリボタイプ株を種々の病原性、感染及び胞子形成特性を有することを観察する。上で示されるＴｃｄＡ中和の全ては、ＶＰＩ１０４６３として公知の株から精製されたＴｃｄＡを用いた。しかし、発生に関連する優勢且つ積極的に病原性の株は、リボタイプ０２７と呼ばれる。他の鍵となるリボタイプとしては、０７８、００１、１０６が挙げられる。アミノ酸配列相違は、異なるリボタイプによって生成された毒素間で観察されていて、従って、Ｍａｂが広範なセットの臨床的単離物からの毒素を中和可能であることが重要である。ＣＡ９２２、９９７及び１０００を、株０２７及び０７８由来のＴｃｄＡを中和する能力について試験し、その能力を、ＶＰＩ１０４６３由来のＴｃｄＡに対して比較した。Ｍａｂを、４の［ＴｃｄＡ］において試験し、有意差なしでＬＤ８０、ＬＤ９０及びＬＤ９５において、全ての毒素の中和が可能であることを見出した。
（例１１）
ＰＫデータ
健康なハムスターにおけるヒトＩｇＧ１（２０ｍｇ／ｋｇ）のＰＫ研究。ハムスターＰＫは、マウス又はラットにおけるＭａｂと類似の半減期を有することが見出された（ｔ１／２ ６〜８日間）。ｉ．ｐ．及びｓ．ｃ．投薬は、本質的に同じであった。薬物動態学及びｈＩｇＧ１ Ｍａｂの胃への分布を、「正常」（非感染）ゴールデンシリアンハムスターにおいて研究した。精製Ｍａｂを、ＣＡＲＥ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＬＬＣ，Ｆｏｒｔ Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ、ＵＳＡにより雄のハムスター（１２０〜１３５ｇ）に投与し、サンプルを、ＵＣＢ Ｐｈａｒｍａ．によりアッセイした。この研究は、ＣＡＲＥ ＩＡＣＵＣ委員会によって承認された。８匹の動物に２０ｍｇ／ｋｇのＩｇＧ１の単回用量を与え、４匹に、ｉ．ｐ．で投薬し、４匹にｓ．ｃ．で投薬した。血液を、投薬の１、３、８、２４、４８、７２、１０３及び１６８時間後に収集し、血清を、−８０℃での保存の前に分離した。また、血液を、アッセイ対照を提供するために、２匹の未処理ハムスターからも採取した。安楽死後、２ｃｍの長さの結腸を、各ハムスター由来の盲嚢接合部以降から切り出した。結腸切片を、洗浄緩衝液（５０％（ｖ／ｖ）Ｓｉｇｍａプロテアーゼインヒビターカクテル（Ｐ２７１４）含有５０％（ｖ／ｖ）ＰＢＳ）で洗い流した後、切開し、下にある筋肉からの粘膜の分離及び除去を行った。粘膜サンプルを、０．５ｍｌの洗浄緩衝液中に入れ、視覚的に均一になるまでホモジナイズし、輸送の直前までウェットアイス上で４℃にて保存した。抗ヒトＩｇＧ１ ＥＬＩＳＡ Ｎｕｎｃ ｍａｘｉｓｏｒｐ ９６ウェルプレートを、Ｇｏａｔ Ｆ（ａｂ’）２抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃγ断片（Ｊａｃｋｓｏｎ １０９−００６−０９８）を含む０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３ ｐＨ８．３中で一晩コートし、プレートを、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（ＰＢＳ／０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０）で洗浄し、次いで、１．０％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ及びＰＢＳ中０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎでブロックした。血清サンプルを、サンプルコンジュゲート緩衝液（１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、ＰＢＳ中０．２％ Ｔｗｅｅｎ）中に希釈し、洗浄後、サンプルコンジュゲート緩衝液及び２．５Ｍ Ｈ２ＳＯ４停止溶液を含むＴＭＢ中のヤギ抗ヒトκ−ＨＲＰ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ２０６０−０５）によって明らかにした。
胃、粘膜及び血清レベル：
１６８時間の時点で採取した血液から収集した血清サンプル及び結腸サンプルを、この後、除去した。
１６８時間における２０ｍｇ／ｋｇ ＩＰ

１６８時間における２０ｍｇ／ｋｇ ＳＣ

ｈＩｇＧ１は、胃の「掻き取り」において見出され得る、すなわち、ｈＩｇＧ１は、健康な胃の血管構造に入り、「予防的投薬」において防御的であり得ることもまた、示される。この効果は、ヒトは、同族のｈＦｃＲｎを有するので、ヒトにおいてなおより深遠である。
（例１２）
Ｃ．ディフィシレ感染を有するハムスターにおける血清レベル
この研究は、ゴールデンシリアンハムスターにおけるｉ．ｐ．投与（種々の用量は、以下に詳説する）後に、ＣＡ７２５．０、ＣＡ７２６．０、ＣＡ９９７．ｇ１、ＣＡ１１２５．ｇ２及びＣＡ０１１５１．ｇ４の血清濃度を決定することであった。
ヒト化Ｍａｂを、トリプシン消化後の液体クロマトグラフィータンデム質量（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）分析を用いて定量した。定量化を、スパイクしたウマミオグロビンを内部標準として使用し、公知の濃度でブランクのマトリクスにスパイクした信頼のおける標準的材料に対する比較によって達成した。
調査した全てのヒト化Ｍａｂに対して共通する独特の（「プロテオティピックな」）ペプチドを選択し（ＤＴＬＭＩＳＲ、ＣＨ２領域ペプチド）、両サンプル及びキャリブレーションサンプルを、概説するようにトリプシン消化した。５μｌ血清サンプルのトリプシン消化を、変性／アセトニトリルによる還元／Ｔｒｉｓ（２−カルボキシエチル）ホスフィン及びヨードアセトアミドによるカルバミド−メチル化（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐｏｏｌｅ、ＵＫ）の後に、配列決定グレード修飾トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ、ＵＫ）を用いて一晩実施した。
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステムは、ＣＴＣ ＨＴＳ−ｘ Ａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒ（ＣＴＣ Ａｎａｌｙｔｉｃｓ、Ｚｗｉｎｇｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、Ａｇｉｌｅｎｔ １２９０ ＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓｔｏｃｋｐｏｒｔ、ＵＫ）及びＳｃｉｅｘ ５５００ ＱＴｒａｐ ＭＳシステム（ＡＢ Ｓｃｉｅｘ、Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ、ＵＫ）からなり、エレクトロスプレーモードで操作されるＴｕｒｂｏ Ｖイオン供給源を備える。分析物を、２〜９５％（ｖ／ｖ）水／アセトニトリル（０．１％ギ酸）の勾配を用いたＯｎｙｘ Ｍｏｎｏｌｉｔｈｉｃ Ｃ１８カラム（１００×４．６ｍｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ， Ｍａｃｃｌｅｓｆｉｅｌｄ， ＵＫ）を用いて分離し、１．５ｍＬ／分で６分間にわたって送った。注入容量は、１０μＬであった：溶出物の全ては、質量分析供給源に導入した。質量分析の供給源温度を、６００℃に維持し、他の供給源パラメータ（例えば、衝突エネルギー、デクラスタリング電位、カーテンガス圧など）を最適化し、目的のペプチドについて最大感度を達成した。目的のプロテオティピックペプチド各々の選択的遷移を、モニタリングした。
独特の（「プロテオティピック」）ペプチドを、目的の分析物の全てについて選択した；サンプルを、トリプシン消化後に分析した。
モニタリングしたペプチドに基づいて計算した血漿濃度を、以下で概説する。
ＣＡ１６４＿００９９７及びＣＡ１６４＿０１１５１について、干渉ピークを、ＭＲＭトレースにおいて観察した。この理由のため、これら２つの分析物は、サンプル中で定量できなかった。
総ｈ−ＩｇＧを、目的の全ての分析物に共通するペプチドを用い、全てのサンプルにおいて定量化した。これは、５つ全ての分析物を合わせた標準曲線を用いて行われた。このアプローチの妥当性は、ＣＡ１６４＿００７２５及びＣＡ１６４＿００７２６について観察された濃度の合計が、総ｈ−ＩｇＧについて観察された濃度と、（実験誤差範囲内で）一致しているという事実によって実証される。
このアプローチを用い、ＣＡ１６４＿００９９７、ＣＡ１６４＿０１１２５及びＣＡ１６４＿０１１５１を投薬された動物のサンプル中のｈ−ＩｇＧの総濃度を決定した。
得られたデータ全体は、目的の全ての５つの分析物の曝露が、所定の用量と類似したことを示す。

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Claims (17)

  1. １つ又は複数の、抗原ＴｃｄＡ１２３に対して特異的なモノクローナル抗体を含有する医薬組成物であって、前記抗体が、標的抗原ＴｃｄＡ１２３に対して５００ｐＭまたはそれ以下の親和性を有し、
    該１つ又は複数のモノクローナル抗体は、独立して以下から選択される：
    １）重鎖可変ドメインが、
    ＣＤＲ-Ｈ１用の配列番号４に示される配列を有するＣＤＲ、
    ＣＤＲ-Ｈ２用の配列番号５に示される配列を有するＣＤＲ、及び
    ＣＤＲ-Ｈ３用の配列番号６に示される配列を有するＣＤＲを含む重鎖、および
    軽鎖可変ドメインが、
    ＣＤＲ-Ｌ１用の配列番号１に示される配列を有するＣＤＲ、
    ＣＤＲ-Ｌ２用の配列番号２に示される配列を有するＣＤＲ、及び
    ＣＤＲ-Ｌ３用の配列番号３に示される配列を有するＣＤＲを含む軽鎖を含む；
    ２）重鎖可変ドメインが、
    ＣＤＲ-Ｈ１用の配列番号３４に示される配列を有するＣＤＲ、
    ＣＤＲ-Ｈ２用の配列番号３５に示される配列を有するＣＤＲ、及び
    ＣＤＲ-Ｈ３用の配列番号３６に示される配列を有するＣＤＲを含む重鎖、および
    軽鎖可変ドメインが、
    ＣＤＲ-Ｌ１用の配列番号３１に示される配列を有するＣＤＲ、
    ＣＤＲ-Ｌ２用の配列番号３２に示される配列を有するＣＤＲ、及び
    ＣＤＲ-Ｌ３用の配列番号３３に示される配列を有するＣＤＲを含む軽鎖を含む；
    ３）重鎖可変ドメインが、
    ＣＤＲ-Ｈ１用の配列番号４４に示される配列を有するＣＤＲ、
    ＣＤＲ-Ｈ２用の配列番号４５に示される配列を有するＣＤＲ、及び
    ＣＤＲ-Ｈ３用の配列番号４６に示される配列を有するＣＤＲを含む重鎖、および
    軽鎖可変ドメインが、
    ＣＤＲ-Ｌ１用の配列番号４１に示される配列を有するＣＤＲ、
    ＣＤＲ-Ｌ２用の配列番号４２に示される配列を有するＣＤＲ、及び
    ＣＤＲ-Ｌ３用の配列番号４３に示される配列を有するＣＤＲを含む軽鎖を含む；
    並びに
    ４）重鎖可変ドメインが、
    ＣＤＲ-Ｈ１用の配列番号５４に示される配列を有するＣＤＲ、
    ＣＤＲ-Ｈ２用の配列番号５５に示される配列を有するＣＤＲ、及び
    ＣＤＲ-Ｈ３用の配列番号５６に示される配列を有するＣＤＲを含む重鎖、および
    軽鎖可変ドメインが、
    ＣＤＲ-Ｌ１用の配列番号５１に示される配列を有するＣＤＲ、
    ＣＤＲ-Ｌ２用の配列番号５２に示される配列を有するＣＤＲ、及び
    ＣＤＲ-Ｌ３用の配列番号５３に示される配列を有するＣＤＲを含む軽鎖を含む；
    上記医薬組成物。
  2. ＴｃｄＡ１２３に対して特異的に結合するモノクローナル抗体が、
    重鎖可変ドメインが、
    ＣＤＲ-Ｈ１用の配列番号４４に示される配列を有するＣＤＲ、
    ＣＤＲ-Ｈ２用の配列番号４５に示される配列を有するＣＤＲ、及び
    ＣＤＲ-Ｈ３用の配列番号４６に示される配列を有するＣＤＲを含む重鎖、および
    軽鎖可変ドメインが、
    ＣＤＲ-Ｌ１用の配列番号４１に示される配列を有するＣＤＲ、
    ＣＤＲ-Ｌ２用の配列番号４２に示される配列を有するＣＤＲ、及び
    ＣＤＲ-Ｌ３用の配列番号４３に示される配列を有するＣＤＲを含む軽鎖を含む、
    請求項１に記載の医薬組成物。
  3. 前記モノクローナル抗体が、配列番号４９に示される配列を含む重鎖及び配列番号４７に示される配列を含む軽鎖を含む、請求項２に記載の医薬組成物。
  4. ＴｃｄＡ１２３に対して特異的に結合するモノクローナル抗体が、
    重鎖可変ドメインが、
    ＣＤＲ-Ｈ１用の配列番号５４に示される配列を有するＣＤＲ、
    ＣＤＲ-Ｈ２用の配列番号５５に示される配列を有するＣＤＲ、及び
    ＣＤＲ-Ｈ３用の配列番号５６に示される配列を有するＣＤＲを含む重鎖、および
    軽鎖可変ドメインが、
    ＣＤＲ-Ｌ１用の配列番号５１に示される配列を有するＣＤＲ、
    ＣＤＲ-Ｌ２用の配列番号５２に示される配列を有するＣＤＲ、及び
    ＣＤＲ-Ｌ３用の配列番号５３に示される配列を有するＣＤＲを含む軽鎖を含む、
    請求項１に記載の医薬組成物。
  5. 前記モノクローナル抗体が、配列番号５９に示される配列を含む重鎖及び配列番号５７に示される配列を含む軽鎖を含む、請求項４に記載の医薬組成物。
  6. 前記抗体の少なくとも１つが、リボタイプ００３、０１２、０２７及び０７８に対して有効な中和抗体である、請求項１から５までのいずれか一項に記載の医薬組成物。
  7. 前記抗体が、ＴＥＥＲアッセイにおいて、前記アッセイの開始の４時間後に測定した場合、６０〜８０ｎｇ／ｍｌの範囲内のＥＣ５０を有する、請求項１から６までのいずれか一項に記載の医薬組成物。
  8. ＴｃｄＢに特異的に結合し、
    重鎖可変ドメインが、
    ＣＤＲ-Ｈ１用の配列番号１２４に示される配列を有するＣＤＲ、
    ＣＤＲ-Ｈ２用の配列番号１２５に示される配列を有するＣＤＲ、及び
    ＣＤＲ-Ｈ３用の配列番号１２６に示される配列を有するＣＤＲを含む重鎖、および
    軽鎖可変ドメインが、
    ＣＤＲ-Ｌ１用の配列番号１２１に示される配列を有するＣＤＲ、
    ＣＤＲ-Ｌ２用の配列番号１２２に示される配列を有するＣＤＲ、及び
    ＣＤＲ-Ｌ３用の配列番号１２３に示される配列を有するＣＤＲを含む軽鎖を含む、
    モノクローナル抗体をさらに含む、請求項１から７までのいずれか一項に記載の医薬組成物。
  9. ＴｃｄＢに特異的に結合するモノクローナル抗体が、配列番号１２９に示される配列を含む重鎖及び配列番号１２７に示される配列を含む軽鎖を含む、請求項８に記載の医薬組成物。
  10. ＴｃｄＢに特異的に結合し、
    重鎖可変ドメインが、
    ＣＤＲ-Ｈ１用の配列番号１５４に示される配列を有するＣＤＲ、
    ＣＤＲ-Ｈ２用の配列番号１５５に示される配列を有するＣＤＲ、及び
    ＣＤＲ-Ｈ３用の配列番号１５６に示される配列を有するＣＤＲを含む重鎖、および
    軽鎖可変ドメインが、
    ＣＤＲ-Ｌ１用の配列番号１５１に示される配列を有するＣＤＲ、
    ＣＤＲ-Ｌ２用の配列番号１５２に示される配列を有するＣＤＲ、及び
    ＣＤＲ-Ｌ３用の配列番号１５３に示される配列を有するＣＤＲを含む軽鎖を含む、
    モノクローナル抗体をさらに含む、請求項１から９までのいずれか一項に記載の医薬組成物。
  11. ＴｃｄＢに特異的に結合するモノクローナル抗体が、配列番号１５９に示される配列を含む重鎖及び配列番号１５７に示される配列を含む軽鎖を含む、請求項１０に記載の医薬組成物。
  12. ＴｃｄＢに特異的な２つ以上の抗体をさらに含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  13. ＴｃｄＡに特異的な２つ以上の抗体をさらに含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  14. 薬学的に許容可能な賦形剤をさらに含む、請求項１から１３までのいずれか一項に記載の医薬組成物。
  15. クロストリジウム・ディフィシレ（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染又はその合併症の処置又は予防のための医薬の製造のための、請求項１から１４までのいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。
  16. 前記医薬が、メトロニダゾール、バンコマイシン、クリンダマイシン、フィダキソマイシン及びこれらの組み合わせからなる群より選択される化合物をさらに含む、請求項１５に記載の医薬組成物の使用。
  17. 前記医薬が、メトロニダゾール、バンコマイシン、クリンダマイシン、フィダキソマイシン及びこれらの組み合わせからなる群より選択される化合物と共に投与される、請求項１５に記載の医薬組成物の使用。
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