ES2729278T3

ES2729278T3 - Anticuerpos neutralizantes de las exotoxinas principales tcda y tcdb de Clostridium difficile

Info

Publication number: ES2729278T3
Application number: ES12761789T
Authority: ES
Inventors: David Paul Humphreys; Daniel John Lightwood; Kerry Louise Tyson; David Edward Ormonde Knight; Karine Jeannine Madeleine Herve; Joanne Elizabeth Compson; Matthew Jon Timothy Page; Andrew Charles Payne; Nicola Louise Fisher; Brendon Mackenzie; Matthew Cox
Original assignee: UCB Biopharma SRL
Current assignee: UCB Biopharma SRL
Priority date: 2011-09-16
Filing date: 2012-09-10
Publication date: 2019-10-31
Anticipated expiration: 2032-09-10
Also published as: MX2014002769A; SG11201400193SA; EA032475B1; JP6603685B2; HK1199463A1; HRP20190917T1; PT2758432T; HUE043661T2; CY1121673T1; WO2013038156A1; SI2758432T1; US20140348844A1; JP2017149773A; EP3617227A3; LT2758432T; TN2014000101A1; DK2758432T3; IL231167A0; BR112014006175B1; CL2014000491A1

Abstract

Un anticuerpo monoclonal neutralizante o fragmento de unión específico de TcdA, que comprende: una cadena pesada que comprende una secuencia dada en la SEQ ID NO: 49, y una cadena ligera que comprende una secuencia dada en la SEQ ID NO: 47.

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos neutralizantes de las exotoxinas principales TcdA y TcdB de Clostridium difficile

La presente invención se refiere a anticuerpos de exotoxinas de Clostridium difficile, por ejemplo TcdA y TcdB, a composiciones farmacéuticas que comprenden los mismos, a procesos de producción de dichos anticuerpos y a composiciones y al uso de anticuerpos y composiciones en el tratamiento y/o la profilaxis, en particular el tratamiento o la profilaxis de infección por Clostridium difficile, colitis seudomembranosa, colitis fulminante y/o megacolon tóxico.

Las dos exotoxinas principales TcdA y TcdB se han establecido como los determinantes principales de la patogenicidad de Clostridium difficile en un gran número de estudios in vitro e in vivo. Las cepas no toxigénicas no son patogénicas para animales y el hombre (1, 2). Hasta la fecha, está todavía por establecer una comprensión completa del papel de la toxina binaria (3).

Ambas toxinas son enterotóxicas y citotóxicas, pero la suma de evidencias sugiere que TcdA es una enterotoxina más potente que TcdB, mientras que se observa típicamente que TcdB es ~1000x más citotóxica que TcdA (4). Aunque ambas toxinas son capaces de inducir una respuesta inflamatoria, TcdA parece ayudar a la migración de la TcdB más inflamatoria más profundamente en la mucosa intestinal (5).

En conjunto, una gran colección de datos generados durante más de 30 años apoya un modelo donde es probable que ambas toxinas sean importantes en el proceso de enfermedades humanas. Es probable que TcdA inicie un daño intestinal temprano (concretamente, antes que TcdB) y rápido (concretamente en 1-3 horas) mediante la pérdida de uniones estrechas y la destrucción de puntas de vellosidades y por ello diarrea, probablemente mediante pérdida de fluidos impulsada por albúmina. Este daño a la integridad del revestimiento intestinal posibilita a TcdB ejercer su potencial molar superior (TcdB se cita típicamente que es 1000x más citotóxica que TcdA) más rápida y eficazmente (concretamente, más profundamente en el tejido, dianas celulares alternativas y dañando órganos accedidos sistémicamente). Cualquier toxina puede ser eficaz sola in vitro sobre células y tejidos humanos o animales. Cualquier toxina puede ser eficaz sola in vivo en animales dependiendo de otros factores desencadenantes tales como daño mecánico, sobrecarga de barrera y sensibilidades específicas del hospedador. Resulta ahora evidente que, en hámsteres, al menos una de TcdA o TcdB sola suministrada por una infección intestinal por Clostridium difficile puede causar la muerte (1). Está bien establecido que las cepas A-B+ son capaces de causar síntomas y muerte en seres humanos (6,7). Sin embargo, la mayoría (~95 %) de cepas clínicas son A+B+, por ello los fármacos orientados a tratar infecciones por Clostridium difficile (ICD) deben ser capaces de neutralizar las actividades y eliminar ambas toxinas eficazmente.

La ICD es lo más típicamente una infección nosocomial de pacientes ancianos o aquellos con comorbilidades complicadas. Sin embargo, se ha señalado un aumento de las infecciones extrahospitalarias. La infección está casi siempre asociada a o inducida por el uso de antibióticos de amplio espectro. Los costes sanitarios asociados se estima que son de más de 1000 millones de dólares al año solo en EE. UU. Estos costes son debidos sobre todo a los pacientes que tienen estancias hospitalarias más largas. Las terapias actuales implican el uso de antibióticos tales como clindamicina, vancomicina o fidaxomicina que destruyen las células de Clostridium difficile en el intestino. Las terapias actuales abordan la infección bacteriana, pero no afrontan ni previenen directamente la patogénesis significativa causada por TcdA y TcdB, que son los contribuyentes principales a los síntomas y mortalidad de ICD.

Los síntomas de ICD en seres humanos incluyen diarrea de leve a grave, colitis seudomembranosa (CSM) y colitis fulminante o el denominado megacolon tóxico. La muerte es el resultado en un 5-15 % de los pacientes que reciben el mejor cuidado. Por tanto, actualmente no hay una terapia específica disponible para pacientes para prevenir el daño y lesiones causadas por toxinas de C. difficile después de la infección.

Suscitar una respuesta de anticuerpo mediante vacunación y administración parenteral de anticuerpos policlonales y monoclonales se ha mostrado capaz de proteger a animales de los síntomas de diarrea y muerte (8-15). Estudios tempranos en hámsteres sugerían que los anticuerpos contra TcdA sola eran todo lo necesario para protección. Sin embargo, el uso de cepas con deleción funcional de TcdA o TcdB demuestra que cualquiera de las toxinas es capaz de causar diarrea en hámsteres, pero que ambas toxinas juntas son más eficaces (1).

Para aplicaciones terapéuticas, los anticuerpos monoclonales (Mab) pueden ofrecer eficacia, seguridad, ventajas de fabricación y regulatorias frente a anticuerpos policlonales derivados de suero o sueros hiperinmunitarios derivados de suero. Por estas razones, los Mab son habitualmente la opción preferida para productos terapéuticos.

Ha habido una serie de intentos de generar Mab protectores contra TcdA y TcdB. El más avanzado de estos en clínica es una mezcla de 2 Mab IgG1, uno contra cada TcdA y TcdB originalmente llamados CDA1 y MDX1388 desarrollados por MBL y Medarex. Se demostraron incapaces de proteger completamente a hámsteres en modelos de infecciones agudas o recidivas (15). Esta combinación de Mab se está desarrollando ahora como MK3415A por Merck Inc. En un ensayo humano de fase II, MK3415A daba como resultado una reducción estadísticamente significativa de la recurrencia de la enfermedad (p= 0,006) (véase también Lowy et al., NEJM (2010) 362: 197-205) pero no afectaba a la duración/gravedad de la diarrea o a las tasas de mortalidad (16). Véanse también Babcock et al Infection and Immunity Nov 2006, páginas 6339 a 6347 y WO2006/121422. Esto puede significar que estos anticuerpos pueden ser útiles solo para prevenir la recurrencia de la infección. La recurrencia de la infección es el resultado en aproximadamente un 25 % de pacientes. Por tanto, habrá probablemente una población de pacientes significativa en que estos anticuerpos no sean eficaces.

Para poder tener una influencia positiva sobre la diarrea (por ejemplo, como resultado de daño agudo en las uniones estrechas del intestino debido a TcdA) y la muerte (por ejemplo, como resultado de un mal estado nutricional prolongado, estrés por deshidratación e iniciación de una cascada inflamatoria, lesión anatómica extendida en el revestimiento intestinal y posiblemente daño en órganos distantes debido a la toxina sistémica TcdB más que a TcdA), se requieren Mab con afinidad superior, neutralización de toxinas, prevención superior de la pérdida de RETE (resistencia eléctrica transepitelial), decoración de antígenos e inmunoeliminación de antígenos.

Compendio de la presente invención

La presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal neutralizante o fragmento de unión específico de TcdA, que comprende una cadena pesada que comprende una secuencia dada en la SEQ ID NO: 49, y una cadena ligera que comprende una secuencia dada en la SEQ ID NO: 47.

La divulgación proporciona también un Mab o varios con un nivel muy alto de potencia in vitro e in vivo que tienen el potencial de tener impacto sobre la duración y gravedad de la diarrea y la tasa de mortalidad en seres humanos que padecen infección por Clostridium difficile (ICD).

Se proporciona también una composición farmacéutica según la presente invención que comprende un anticuerpo monoclonal adicional o fragmento de unión del mismo específico de TcdA seleccionado independientemente de:

i) una cadena pesada en la que el dominio variable de la cadena pesada comprende una secuencia dada en la SEQ ID NO: 4 para CDR-H1, una secuencia dada en la SEQ ID NO: 5 para CDR-H2 y una secuencia dada en la SEQ ID NO: 6 para CDR-H3, y una cadena ligera en la que el dominio variable de la cadena ligera comprende una secuencia dada en la SEQ ID NO: 1 para CDR-L1, una secuencia dada en la SEQ ID NO: 2 para CDR-L2 y una secuencia dada en la SEQ ID NO: 3 para CDR-L3;

ii) una cadena pesada en la que el dominio variable de la cadena pesada comprende una secuencia dada en la SEQ iD NO: 34 para CDR-H1, una secuencia dada en la SEQ ID NO: 35 para CDR-H2 y una secuencia dada en la SEQ ID NO: 36 para CDR-H3, y una cadena ligera en la que el dominio variable de la cadena ligera comprende al menos una de una CDR que tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO: 31 para CDR-L1, una CDR que tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO: 32 para CDR-L2 y una CDR que tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO: 33 para CDR-L3; y

iiii) una cadena pesada en la que el dominio variable de la cadena pesada comprende una secuencia dada en la SEQ ID NO: 54 para CDR-H1, una secuencia dada en la SEQ ID NO: 55 para CDR-H2 y una secuencia dada en la SEQ ID NO: 56 para CDR-H3, y una cadena ligera en la que el dominio variable de la cadena ligera comprende una secuencia dada en la SEQ ID n O: 51 para CDR-L1, una secuencia dada en la SEQ ID NO: 52 para CDR-L2 y una secuencia dada en la SEQ ID NO: 53 para CDR-L3.

Los anticuerpos de la presente divulgación son útiles porque es probable que proporcionen un medio de tratamiento de la gravedad y duración de los síntomas de una infección primaria tal como diarrea en un paciente o prevengan la muerte y no solo prevengan la recurrencia de los síntomas de la enfermedad.

En al menos algunas realizaciones, los anticuerpos según la presente divulgación no muestran reducción de la potencia en presencia de altas concentraciones de toxina.

Descripción detallada de la presente invención

Específico, como se emplea en la presente memoria, pretende hacer referencia a un anticuerpo que solo reconoce el antígeno del que es específico o un anticuerpo que tiene una afinidad de unión significativamente mayor por el antígeno del que es específico en comparación con la unión a antígenos de los que no es específico, por ejemplo 5, 6, 7, 8, 9, 10 veces mayor afinidad de unión.

La afinidad de unión puede medirse por ensayos estándares tales como resonancia de plasmón de superficie, tales como BIAcore.

En una realización, la CE⁵⁰es menor de 75, 70, 60, 65, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1,5 ng/ml de infección por Clostridium difficile en ensayos de cultivo celular y el paciente. Esto es significativamente menor (más potente) que anticuerpos conocidos y se cree que es un factor importante de por qué los anticuerpos de la presente divulgación tienen un impacto significativo y positivo sobre la supervivencia de sujetos que reciben tratamiento.

Como se emplea en la presente memoria, potencia es la capacidad del anticuerpo de desencadenar una respuesta biológica apropiada, por ejemplo neutralización de los efectos nocivos de toxinas, a una dosis o concentración dada. Los ejemplos de potencia incluyen el porcentaje de neutralización máxima de la actividad de toxina (extensión de la protección), la concentración relativa mínima de Mab a antígeno (p. ej., CE⁵⁰), la velocidad y durabilidad de la actividad de neutralización.

En ensayos de cultivo celular, podría observarse neutralización como uno o más de los siguientes: prevención de la unión de toxina a células, inmunoprecipitación de toxina de la solución, prevención de la pérdida de forma y conformación celular, prevención de la pérdida de estructuras citoesqueléticas, prevención de la pérdida de uniones estrechas de monocapa celular y resistencia eléctrica transepitelial, prevención de la muerte celular, apoptosis y producción de citocinas proinflamatorias tales como TNFa, IL-1p, IL-6 y MIP1a.

En ensayos de seccionamiento y explante de tejidos, puede observarse neutralización, por ejemplo, como la prevención de necrosis y/o la acumulación de fluidos edematosos.

En ensayos in vivo, puede observarse neutralización como uno o más de los siguientes: prevención de la acumulación de fluidos en asas ileales ligadas y prevención de la necrosis de tejido intestinal, diarrea, formación seudomembranosa y muerte de animales.

La presente divulgación incluye un anticuerpo (por ejemplo un anticuerpo anti-toxina A) que comprende una CDR tal como 1,2, 3, 4, 5 o 6 CDR seleccionadas de:

En una realización, las secuencias 1 a 3 están en una cadena ligera del anticuerpo.

En una realización, las secuencias 4 a 6 están en una cadena pesada del anticuerpo.

En una realización, la SEQ ID NO: 1 es CDR L1, la SEQ ID NO: 2 es CDR L2 y la SEQ ID NO: 3 es CDR L3.

En una realización, la SEQ ID NO: 4 es CDR H1, la SEQ ID NO: 5 es CDR H2 y la SEQ ID NO: 6 es CDR H3.

En una realización, la SEQ ID NO: 1 es CDR L1, la SEQ ID NO: 2 es CDR L2, la SEQ ID NO: 3 es CDR L3, la SEQ ID NO: 4 es CDR H1, la SEQ ID NO: 5 es CDR H2 y la SEQ ID NO: 6 es CDR H3.

En una realización, se proporciona una región variable, tal como una región variable de cadena ligera, con la siguiente secuencia (anticuerpo 922 anticuerpo anti-toxina A; secuencia de región variable de cadena ligera) SEQ ID NO: 7: DPVMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQSISNALAWYQQKPGKAPKLLIYSASSLASGVPSRFK GSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQYTHYSHTSKNPFGGGTKVEIK

en la que las CDR se subrayan y el constructo se hace referencia en la presente memoria como 922.g1 VK (gL1). Se muestra la secuencia polinucleotídica que codifica la SEQ ID NO: 7 en la Figura 1 y en la SEQ ID NO: 8 en la misma.

En una realización, se proporciona una región variable, tal como una región variable de cadena pesada, con la siguiente secuencia (anticuerpo 922 anticuerpo anti-toxina A; secuencia de región variable de cadena pesada) SEQ ID NO: 9:

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTISSYYMSWVRQAPGKGLEWIGIISSGGHFTWYANW AKGRFTISSDSTTVYLQMNSLRDEDTATYFCARAYVSGSSFNGYALWGQGTLVTVS

en la que las CDR se subrayan y el constructo se hace referencia en la presente memoria como 922.g1 VH (gH1). Se muestra la secuencia polinucleotídica que codifica la SEQ ID NO: 9 en la Figura 1 y en la SEQ ID NO: 10 en la misma.

En una realización, el anticuerpo comprende las regiones variables mostradas en las SEQ ID NO: 7 y 9.

La presente divulgación proporciona también un anticuerpo (por ejemplo un anticuerpo anti-toxina A) que comprende una CDR tal como 1, 2, 3, 4, 5 o 6 CDR seleccionadas de:

En una realización, las secuencias 11 a 13 están en una cadena ligera del anticuerpo.

En una realización, las secuencias 14 a 16 están en una cadena pesada del anticuerpo.

En una realización, la SEQ ID NO: 11 es CDR L1, la SEQ ID NO: 12 es CDR L2 y la SEQ ID NO: 13 es CDR L3. En una realización, la SEQ ID NO: 14 es CDR H1, la SEQ ID NO: 15 es CDR H2 y la SEQ ID NO: 16 es CDR H3. En una realización, la SEQ ID NO: 11 es CDR L1, la SEQ ID NO: 12 es CDR L2, la SEQ ID NO: 13 es CDR L3, la SEQ ID NO: 14 es CDR H1, la SEQ ID NO: 15 es CDR H2 y la SEQ ID NO: 16 es CDR H3.

En una realización, se proporciona una región variable, tal como una región variable de cadena ligera, con la siguiente secuencia (anticuerpo 923 anticuerpo anti-toxina A; secuencia de región variable de cadena ligera) SEQ ID NO: 17: DVVMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSISNYLAWYQQKPGKVPKLLIYSASTLASGVPSRFK GSGSGTQFTLTISSLQPEDVATYYCQYSHYGTGVFGAFGGGTKVEIK

en la que las CDR se subrayan y el constructo se hace referencia en la presente memoria como CA923.g1 gL1 Se muestra la secuencia polinucleotídica que codifica la SEQ ID NO: 17 en la Figura 1 y en la SEQ ID NO: 18 en la misma.

En una realización, se proporciona una región variable, tal como una región variable de cadena pesada, con la siguiente secuencia (anticuerpo 923 anticuerpo anti-toxina A; secuencia de región variable de cadena pesada) SEQ ID NO: 19:

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASAFSLSNYYMSWVRQAPGKGLEWIGIISSGSNALKWYAS WPKGRFTISKDSTTVYLQMNSLRAEDTATYFCARNYVGSGSYYGMDLWGQGTLVTVS

en la que las CDR se subrayan y el constructo se hace referencia en la presente memoria como CA923.g1 gH1 Se muestra la secuencia polinucleotídica que codifica la SEQ ID NO: 19 en la Figura 2 y en la SEQ ID NO: 20 en la misma.

En una realización, un anticuerpo según la invención comprende regiones variables mostradas en la SEQ ID NO 17: y la SEQ ID NO: 19.

En una realización, las secuencias 21 a 23 están en una cadena ligera del anticuerpo.

En una realización, las secuencias 24 a 26 están en una cadena pesada del anticuerpo.

En una realización, la SEQ ID NO: 21 es CDR L1, la SEQ ID NO: 22 es CDR L2 y la SEQ ID NO: 23 es CDR L3. En una realización, la SEQ ID NO: 24 es CDR H1, la SEQ ID NO: 25 es CDR H2 y la SEQ ID NO: 26 es CDR H3. En una realización, la SEQ ID NO: 21 es CDR L1, la SEQ ID NO: 22 es CDR L2, la SEQ ID NO: 23 es CDR L3, la SEQ ID NO: 24 es CDR H1, la SEQ ID NO: 25 es CDR H2 y la SEQ ID NO: 26 es CDR H3.

En una realización, se proporciona una región variable, tal como una región variable de cadena ligera, con la siguiente secuencia (anticuerpo 993 anticuerpo anti-toxina A; secuencia de región variable de cadena ligera) SEQ ID NO: 27: DWMTQSPSTLSASVGDRVTITCQ A SQ SISSY FSWYQQKPGKAPQLLIYGASTLASGVPSRFK GSGSGTELTLTISSLQPDDFATYYCQCTDYSGIYFGGFGGGTKVEIK

en la que las CDR se subrayan y el constructo se hace referencia en la presente memoria como CA993.g1 gL1 Se muestra la secuencia polinucleotídica que codifica la SEQ ID NO: 27 en la Figura 2 y en la SEQ ID NO: 28 en la misma.

En una realización, se proporciona una región variable, tal como una región variable de cadena pesada, con la siguiente secuencia (anticuerpo 993 anticuerpo anti-toxina A; secuencia de región variable de cadena pesada) SEQ ID NO: 29:

EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCTASGFSLSSYYMSWVRQAPGKGLEWIGIISSGSSTTFTW YA SWAKGRFTISKTSTTVYLQMNSLKTEDTATYFCARAYVGSSSYYGFDPWGQGTLVTVS

en la que las CDR se subrayan y el constructo se hace referencia en la presente memoria como CA993.g1 gH1 Se muestra la secuencia polinucleotídica que codifica la SEQ ID NO: 29 en la Figura 2 y en la SEQ ID NO: 30 en la misma.

En una realización, un anticuerpo según la invención comprende regiones variables mostradas en la SEQ ID NO : 27 y la SEQ ID NO: 29.

La presente divulgación proporciona un anticuerpo (por ejemplo un anticuerpo anti-toxina A) que comprende una CDR tal como 1, 2, 3, 4, 5 o 6 CDR seleccionadas de:

En una realización, las secuencias 31 a 33 están en una cadena ligera del anticuerpo.

En una realización, las secuencias 34 a 36 están en una cadena pesada del anticuerpo.

En una realización, la SEQ ID NO: 31 es CDR L1, la SEQ ID NO: 32 es CDR L2 y la SEQ ID NO: 33 es CDR L3. En una realización, la SEQ ID NO: 34 es CDR H1, la SEQ ID NO: 35 es CDR H2 y la SEQ ID NO: 36 es CDR H3. En una realización, la SEQ ID NO: 31 es CDR L1, la SEQ ID NO: 32 es CDR L2, la SEQ ID NO: 33 es CDR L3, la SEQ ID NO: 34 es CDR H1, la SEQ ID NO: 35 es CDR H2 y la SEQ ID NO: 36 es CDR H3.

En una realización, se proporciona una región variable, tal como una región variable de cadena ligera, con la siguiente secuencia (anticuerpo 995 anticuerpo anti-toxina A; secuencia de región variable de cadena ligera) SEQ ID NO: 37: DWMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQSINNYFSWYQQKPGKAPKLLIYGAANLASGVPSRFK GSGSGTEYTLTISSLQPDDFATYSCQNNYGVHIYGAAFGGGTKVEIK

en la que las CDR están subrayadas.

Se muestra la secuencia polinucleotídica que codifica la SEQ ID NO: 37 en la Figura 3 y en la SEQ ID NO: 38 en la misma.

En una realización, se proporciona una región variable, tal como una región variable de cadena pesada, con la siguiente secuencia (anticuerpo 995 anticuerpo anti-toxina A; secuencia de región variable de cadena pesada) SEQ ID NO: 39

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFSLSNYDMIWVRQAPGKGLEYIGFINTGGITYYASWA KGRFTISRDSSTVYLQMNSLRAEDTATYFCARVDDYIGAWGAGLWGQGTLVTVS

en la que las CDR están subrayadas.

Se muestra la secuencia polinucleotídica que codifica la SEQ ID NO: 39 en la Figura 3 y en la SEQ ID NO: 40 en la misma.

En una realización, un anticuerpo según la invención comprende regiones variables mostradas en la SEQ ID NO: 37 y la SEQ ID NO: 39.

La presente divulgación proporciona también un anticuerpo (por ejemplo un anticuerpo anti-toxina A) que comprende una CDR tal como 1,2, 3, 4, 5 o 6 CDR seleccionadas de:

En una realización, las secuencias 41 a 43 están en una cadena ligera del anticuerpo.

En una realización, las secuencias 44 a 46 están en una cadena pesada del anticuerpo.

En una realización, la SEQ ID NO: 41 es CDR L1, la SEQ ID NO: 42 es CDR L2 y la SEQ ID NO: 43 es CDR L3. En una realización, la SEQ ID NO: 44 es CDR H1, la SEQ ID NO: 45 es CDR H2 y la SEQ ID NO: 46 es CDR H3. En una realización, la SEQ ID NO: 41 es CDR L1, la SEQ ID NO: 42 es CDR L2, la SEQ ID NO: 43 es CDR L3, la SEQ ID NO: 44 es CDR H1, la SEQ ID NO: 45 es CDR H2 y la SEQ ID NO: 46 es CDR H3.

En una realización, se proporciona una región variable, tal como una región variable de cadena ligera, con la siguiente secuencia (anticuerpo 997 anticuerpo anti-toxina A; secuencia de región variable de cadena ligera) SEQ ID NO: 47: ALVMTQSPSSFSASTGDRVTITCQ ASQSISSYLSWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASGVPSRFS GSGSGTEYTLTISCLQSEDFATYYCLGVYGYSNDDGIAFGGGTKVEIK

en la que las CDR están subrayadas.

Se muestra la secuencia polinucleotídica que codifica la SEQ ID NO: 47 en la Figura 3 y en la SEQ ID NO: 48 en la misma.

En una realización, se proporciona una región variable, tal como una región variable de cadena pesada, con la siguiente secuencia (anticuerpo 997 anticuerpo anti-toxina A; secuencia de región variable de cadena pesada) SEQ ID NO: 49:

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTVSGIDLSSHHMCWVRQAPGKGLEYIGVIYHFGSTYYANWA TGRFTISKDSTTVYLQMNSLRAEDTATYFCARASIAGYSAFDPWGQGTLVTVS

en la que las CDR están subrayadas.

Se muestra la secuencia polinucleotídica que codifica la SEQ ID NO: 49 en la Figura 4 y en la SEQ ID NO: 50 en la misma.

En una realización, un anticuerpo según la invención comprende regiones variables mostradas en la SEQ ID NO: 47 y la SEQ ID NO: 49.

En una realización, las secuencias 51 a 53 están en una cadena ligera del anticuerpo.

En una realización, las secuencias 54 a 56 están en una cadena pesada del anticuerpo.

En una realización, la SEQ ID NO: 51 es CDR L1, la SEQ ID NO: 52 es CDR L2 y la SEQ ID NO: 53 es CDR L3. En una realización, la SEQ ID NO: 54 es CDR H1, la SEQ ID NO: 55 es CDR H2 y la SEQ ID NO: 56 es CDR H3. En una realización, la SEQ ID NO: 51 es CDR L1, la SEQ ID NO: 52 es CDR L2, la SEQ ID NO: 53 es CDR L3, la SEQ ID NO: 54 es CDR H1, la SEQ ID NO: 55 es CDR H2 y la SEQ ID NO: 56 es CDR H3.

En una realización, se proporciona una región variable, tal como una región variable de cadena ligera, con la siguiente secuencia (anticuerpo 1000 anticuerpo anti-toxina A; secuencia de región variable de cadena ligera) SEQ ID NO: 57: EIVMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQSIYSYLAWYQQKPGKAPKLLIYDASTLASGVPSRFK GSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQGNAYTSNSHDNAFGGGTKVEIK

en la que las CDR están subrayadas.

Se muestra la secuencia polinucleotídica que codifica la SEQ ID NO: 57 en la Figura 4 y en la SEQ ID NO: 58 en la misma.

En una realización, se proporciona una región variable, tal como una región variable de cadena pesada, con la siguiente secuencia (anticuerpo 1000 anticuerpo anti-toxina A; secuencia de región variable de cadena pesada) SEQ ID NO: 59:

EVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCTVSGIDLSSDAVGWVRQAPGKGLEYIGIIATFDSTYYASWA KGRFTISKASSTTVYLQMNSLRAEDTATYFCARTGSWYYISGWGSYYYGMDLWGQGTLVTVS

en la que las CDR están subrayadas.

Se muestra la secuencia polinucleotídica que codifica la SEQ ID NO: 59 en la Figura 4 y en la SEQ ID NO: 60 en la misma.

En una realización, un anticuerpo según la invención comprende regiones variables mostradas en la SEQ ID NO: 57 y la SEQ ID NO: 59.

La presente divulgación proporciona también un anticuerpo (por ejemplo un anticuerpo anti-toxina B) que comprende una CDR tal como 1, 2, 3, 4, 5 o 6 CDR seleccionadas de:

En una realización, las secuencias 61 a 63 están en una cadena ligera del anticuerpo.

En una realización, las secuencias 64 a 66 están en una cadena pesada del anticuerpo.

En una realización, la SEQ ID NO: 61 es CDR L1, la SEQ ID NO: 62 es CDR L2 y la SEQ ID NO: 63 es CDR L3. En una realización, la SEQ ID NO: 64 es CDR H1, la SEQ ID NO: 65 es CDR H2 y la SEQ ID NO: 66 es CDR H3. En una realización, la SEQ ID NO: 61 es CDR L1, la SEQ ID NO: 62 es CDR L2, la SEQ ID NO: 63 es CDR L3, la SEQ ID NO: 64 es CDR H1, la SEQ ID NO: 65 es CDR H2 y la SEQ ID NO: 66 es CDR H3.

En una realización, se proporciona una región variable, tal como una región variable de cadena ligera, con la siguiente secuencia (anticuerpo 926 anticuerpo anti-toxina B; secuencia de región variable de cadena ligera) SEQ ID NO: 67: DTVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKSVSTLMHWFQQKPGQAPKLLIYLASNLESGVPARFS GSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQTWNDPWTFGGGTKVEIK

en la que las CDR están subrayadas.

Se muestra la secuencia polinucleotídica que codifica la SEQ ID NO: 67 en la Figura 5 y en la SEQ ID NO: 68 en la misma.

En una realización, se proporciona una región variable, tal como una región variable de cadena pesada, con la siguiente secuencia (anticuerpo 926 anticuerpo anti-toxina B; secuencia de región variable de cadena pesada) SEQ ID NO: 69:

EVELLESGGGLVQPGGSLRLSCEASGFTFSNYGMAWVRQAPTKGLEWVTSISSSGGSTYYRDS VKGRFTISRDNAKSSLYLQMNSLRAEDTATYYCTTVIRGYVMDAWGQGTLVTVS

en la que las CDR están subrayadas.

Se muestra la secuencia polinucleotídica que codifica la SEQ ID NO: 69 en la Figura 5 y en la SEQ ID NO: 70 en la misma.

En una realización, las secuencias 71 a 73 están en una cadena ligera del anticuerpo.

En una realización, las secuencias 74 a 76 están en una cadena pesada del anticuerpo.

En una realización, la SEQ ID NO: 71 es CDR L1, la SEQ ID NO: 72 es CDR L2 y la SEQ ID NO: 73 es CDR L3. En una realización, la SEQ ID NO: 74 es CDR H1, la SEQ ID NO: 75 es CDR H2 y la SEQ ID NO: 76 es CDR H3. En una realización, la SEQ ID NO: 71 es CDR L1, la SEQ ID NO: 72 es CDR L2, la SEQ ID NO: 73 es CDR L3, la SEQ ID NO: 74 es CDR H1, la SEQ ID NO: 75 es CDR H2 y la SEQ ID NO: 76 es CDR H3.

En una realización, se proporciona una región variable, tal como una región variable de cadena ligera, con la siguiente secuencia (anticuerpo 927 anticuerpo anti-toxina B; secuencia de región variable de cadena ligera) SEQ ID NO: 77: DTQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASGSVSTLMHWYQQKPGKAPKLLIYKASNLASGVPSRFS GSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCHQSWNSDTFGQGTRLEIK

en la que las CDR están subrayadas.

Se muestra la secuencia polinucleotídica que codifica la SEQ ID NO: 77 en la Figura 5 y en la SEQ ID NO: 78 en la misma.

En una realización, se proporciona una región variable, tal como una región variable de cadena pesada, con la siguiente secuencia (anticuerpo 927 anticuerpo anti-toxina B; secuencia de región variable de cadena pesada) SEQ ID NO: 79:

EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSNYGMAWVRQAPGKGLEWVATINYDGRTTHYRDS VKGRFTISRDNSKSTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTSISRSHYFDCWGQGTLVTVS

en la que las CDR están subrayadas.

Se muestra la secuencia polinucleotídica que codifica la SEQ ID NO: 79 en la Figura 5 y en la SEQ ID NO: 80 en la misma.

En una realización, un anticuerpo según la invención comprende regiones variables mostradas en la SEQ ID NO : 77 y la SEQ ID NO: 79.

En una realización, las secuencias 81 a 83 están en una cadena ligera del anticuerpo.

En una realización, las secuencias 84 a 86 están en una cadena pesada del anticuerpo.

En una realización, la SEQ ID NO: 81 es CDR L1, la SEQ ID NO: 82 es CDR L2 y la SEQ ID NO: 83 es CDR L3. En una realización, la SEQ ID NO: 84 es CDR H1, la SEQ ID NO: 85 es CDR H2 y la SEQ ID NO: 86 es CDR H3. En una realización, la SEQ ID NO: 81 es CDR L1, la SEQ ID NO: 82 es CDR L2, la SEQ ID NO: 83 es CDR L3, la SEQ ID NO: 84 es CDR H1, la SEQ ID NO: 85 es CDR H2 y la SEQ ID NO: 86 es CDR H3.

En una realización, se proporciona una región variable, tal como una región variable de cadena ligera, con la siguiente secuencia (anticuerpo 1099 anticuerpo anti-toxina B; secuencia de región variable de cadena ligera) SEQ ID NO: 87: DVQLTQSPSFLSASVGDRVTITCKASKSISNHLAWYQEKPGKANKLLIHSGSTLQSGTPSRFS GSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQYDEYPYTFGQGTRLEIKRT

en la que las CDR están subrayadas.

En una realización, los últimos dos aminoácidos (RT) de la SEQ ID NO: 87 se omiten.

Se muestra la secuencia polinucleotídica que codifica la SEQ ID NO: 87 en la Figura 6 y en la SEQ ID NO: 88 en la misma. En una realización, los codones que codifican los dos últimos aminoácidos (RT) se omiten.

En una realización, se proporciona una región variable, tal como una región variable de cadena pesada, con la siguiente secuencia (anticuerpo 1099 anticuerpo anti-toxina B; secuencia de región variable de cadena pesada) SEQ ID NO: 89:

EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSG FSLQSYTISWVRQPPGKGLEWIAAISGGGSTYYNLPL KSRVTISRDTSKSQVSLKLSSVTAADTAVYYCTRPRWYPRSYFDYWGRGTLVTVS

en la que las CDR están subrayadas.

Se muestra la secuencia polinucleotídica que codifica la SEQ ID NO: 89 en la Figura 6 y en la SEQ ID NO: 90 en la misma.

En una realización, un anticuerpo según la invención comprende regiones variables mostradas en la SEQ ID NO 87: y la SEQ ID NO: 89.

La presente divulgación proporciona también un anticuerpo (por ejemplo un anticuerpo anti-toxina B) que comprende una CDR tal como 1,2, 3, 4, 5 o 6 CDR seleccionadas de:

En una realización, las secuencias 91 a 93 están en una cadena ligera del anticuerpo.

En una realización, las secuencias 94 a 96 están en una cadena pesada del anticuerpo.

En una realización, la SEQ ID NO: 91 es CDR L1, la SEQ ID NO: 92 es CDR L2 y la SEQ ID NO: 93 es CDR L3. En una realización, la SEQ ID NO: 94 es CDR H1, la SEQ ID NO: 95 es CDR H2 y la SEQ ID NO: 96 es CDR H3. En una realización, la SEQ ID NO: 91 es CDR L1, la SEQ ID NO: 92 es CDR L2, la SEQ ID NO: 93 es CDR L3, la SEQ ID NO: 94 es CDR H1, la SEQ ID NO: 95 es CDR H2 y la SEQ ID NO: 96 es CDR H3.

En una realización, se proporciona una región variable, tal como una región variable de cadena ligera, con la siguiente secuencia (anticuerpo 1102 anticuerpo anti-toxina B; secuencia de región variable de cadena ligera) SEQ ID NO: 97: NIVLTQSPATLSLSPGERATLSCR A SQ R ISTSIH WYQQKPGQAPRLLIKY A SQ SISGIPARFS GSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSYSSLYTFGQGTKLEIK

en la que las CDR están subrayadas.

Se muestra la secuencia polinucleotídica que codifica la SEQ ID NO: 97 en la Figura 6 y en la SEQ ID NO: 98 en la misma.

En una realización, se proporciona una región variable, tal como una región variable de cadena pesada, con la siguiente secuencia (anticuerpo 1102 anticuerpo anti-toxina B; secuencia de región variable de cadena pesada) SEQ ID NO: 99:

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFTFSDSYMAWVRQAPGKGLEWIASISYGGTIIQYGDS VKGRFTISRDNAKSSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRQGTYARYLDFWGQGTLVTVS

en la que las CDR están subrayadas.

Se muestra la secuencia polinucleotídica que codifica la SEQ ID NO: 99 en la Figura 7 y en la SEQ ID NO: 100 en la misma.

En una realización, un anticuerpo según la invención comprende regiones variables mostradas en la SEQ ID NO 97:

y la SEQ ID NO: 99.

En una realización, las secuencias 101 a 103 están en una cadena ligera del anticuerpo.

En una realización, las secuencias 104 a 106 están en una cadena pesada del anticuerpo.

En una realización, la SEQ ID NO: 101 es CDR L1, la SEQ ID NO: 102 es CDR L2 y la SEQ ID NO: 103 es CDR L3. En una realización, la SEQ ID NO: 104 es CDR H1, la SEQ ID NO: 105 es CDR H2 y la SEQ ID NO: 106 es CDR H3. En una realización, la SEQ ID NO: 101 es CDR L1, la SEQ ID NO: 102 es CDR L2, la SEQ ID NO: 103 es CDR L3, la SEQ ID NO: 104 es CDR H1, la SEQ ID NO: 105 es CDR H2 y la SEQ ID NO: 106 es CDR H3.

En una realización, se proporciona una región variable, tal como una región variable de cadena ligera, con la siguiente secuencia (anticuerpo 1114 anticuerpo anti-toxina B; secuencia de región variable de cadena ligera) SEQ ID NO: 107:

ATQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVSTLLHWYQQKPGKAPKLLIYKASNLASGVPSRFS GSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQSWNSPPTFGQGTKLEIK

en la que las CDR están subrayadas.

Se muestra la secuencia polinucleotídica que codifica la SEQ ID NO: 107 en la Figura 7 y en la SEQ ID NO: 108 en la misma.

En una realización, se proporciona una región variable, tal como una región variable de cadena pesada, con la siguiente secuencia (anticuerpo 1114 anticuerpo anti-toxina B; secuencia de región variable de cadena pesada) SEQ

ID NO: 109:

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMAWVRQAPGKGLEWVAIINYDASTTHYRDS VKGRFTISRDNAKSSLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRYGRSHYFDYWGQGTLVTVS

en la que las CDR están subrayadas.

Se muestra la secuencia polinucleotídica que codifica la SEQ ID NO: 109 en la Figura 7 y en la SEQ ID NO: 110 en la misma.

En una realización, un anticuerpo según la invención comprende regiones variables mostradas en la SEQ ID NO: 107 y la SEQ ID NO: 109.

En una realización, las secuencias 111 a 113 están en una cadena ligera del anticuerpo.

En una realización, las secuencias 114 a 116 están en una cadena pesada del anticuerpo.

En una realización,

: 111 es CDR L1, la SEQ ID NO: 112 es CDR L2 y la SEQ ID NO: 113 es En una realización,

: 114 es CDR H1, la SEQ ID NO: 115 es CDR H2 y la SEQ ID NO: 116 es En una realización,

la SEQ ID NO: 111 es CDR L1, la SEQ ID NO: 112 es CDR L2, la SEQ ID NO: 113 es C SEQ ID NO: 114 es CDR H1, la SEQ ID NO: 115 es CDR H2 y la SEQ ID NO: 116 es CDR H3.

En una realización, se proporciona una región variable, tal como una región variable de cadena ligera, con la siguiente

secuencia (injerto 8 de anticuerpo 1114 anticuerpo anti-toxina B; secuencia de región variable de cadena ligera) SEQ

ID NO: 117:

DTVLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVSTLLHWYQQKPGKAPKLLIYKASNLASGVPSRFS GSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQSWNSPPTFGQGTKLEIK

en la que las CDR están subrayadas.

Se muestra la secuencia polinucleotídica que codifica la SEQ ID NO: 117 en la Figura 8 y en la SEQ ID NO: 118 en la

misma.

En una realización, se proporciona una región variable, tal como una región variable de cadena pesada, con la

siguiente secuencia (injerto 8 de anticuerpo 1114 anticuerpo anti-toxina B; secuencia de región variable de cadena

pesada) SEQ ID NO: 119:

en la que las CDR están subrayadas.

Se muestra la secuencia polinucleotídica que codifica la SEQ ID NO: 119 en la Figura 8 y en la SEQ ID NO: 120 en la

misma.

En una realización, un anticuerpo según la invención comprende regiones variables mostradas en la SEQ ID NO: 117

y la SEQ ID NO: 119.

La presente divulgación proporciona también un anticuerpo (por ejemplo un anticuerpo anti-toxina B) que comprende

una CDR tal como 1, 2, 3, 4, 5 o 6 CDR seleccionadas de:

En una realización, las secuencias 121 a 123 están en una cadena ligera del anticuerpo.

En una realización, las secuencias 124 a 126 están en una cadena pesada del anticuerpo.

En una realización,

: 121 es CDR L1, la SEQ ID NO: 122 es CDR L2 y la SEQ ID NO: 123 es CD En una realización,

: 124 es CDR H1, la SEQ ID NO: 125 es CDR H2 y la SEQ ID NO: 126 es CD En una realización, la SEQ ID NO: 121 es CDR L1, la SEQ ID NO: 122 es CDR L2, la SEQ ID NO: 123 es CDR SEQ ID NO: 124 es CDR H1, la SEQ ID NO: 125 es CDR H2 y la SEQ ID NO: 126 es CDR H3.

secuencia (anticuerpo 1125 anticuerpo anti-toxina B; secuencia de región variable de cadena ligera) SEQ ID NO: 127:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNIYMYLNWYQQKPGKAPKRLIYNTNKLHTGVPSRFS GSGSGTEYTLTISSLQPEDFATYYCLQHKSFPYTFGQGTKLEIK

en la que las CDR están subrayadas.

Se muestra la secuencia polinucleotídica que codifica la SEQ ID NO: 127 en la Figura 8 y en la SEQ ID NO: 128 en la

misma.

siguiente secuencia (anticuerpo 1125 anticuerpo anti-toxina B; secuencia de región variable de cadena pesada) SEQ

ID NO: 129:

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRDSFMAWVRQAPGKGLEWVASISYEGDKTYYGDS VKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLTITTSGDSWGQGTMVTVSS

en la que las CDR están subrayadas.

En una realización, el último aminoácido (S) de la SEQ ID NO: 129 se omite.

Se muestra la secuencia polinucleotídica que codifica la SEQ ID NO: 129 en la Figura 9 y en la SEQ ID NO: 130 en la

misma. En una realización, el codón AGC que codifica el último aminoácido S se omite.

En una realización, un anticuerpo según la invención comprende regiones variables mostradas en la SEQ ID NO: 127

y la SEQ ID NO: 129.

una CDR tal como 1, 2, 3, 4, 5 o 6 CDR seleccionadas de:

En una realización, las secuencias 131 a 133 están en una cadena ligera del anticuerpo.

En una realización, las secuencias 134 a 136 están en una cadena pesada del anticuerpo.

En una realización, la SEQ ID NO: 131 es CDR L1, la SEQ ID NO: 132 es CDR L2 y la SEQ ID NO: 133 es CDR L3.

En una realización, la SEQ ID NO: 134 es CDR H1, la SEQ ID NO: 135 es CDR H2 y la SEQ ID NO: 136 es CDR H3.

En una realización, la SEQ ID NO: 131 es CDR L1, la SEQ ID NO: 132 es CDR L2, la SEQ ID NO: 133 es CDR L3, la

SEQ ID NO: 134 es CDR H1, la SEQ ID NO: 135 es CDR H2 y la SEQ ID NO: 136 es CDR H3.

secuencia (anticuerpo 1129 anticuerpo anti-toxina B; secuencia de región variable de cadena ligera) SEQ ID NO: 137: DTQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQHVGTNVDWYQQKPGKVPKLLIYGASIRYTGVPDRFT GSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLQYNYNPYTFGQGTKLEIK

en la que las CDR están subrayadas

Se muestra la secuencia polinucleotídica que codifica la SEQ ID NO: 137 en la Figura 8 y en la SEQ ID NO: 138 en la misma.

En una realización, se proporciona una región variable, tal como una región variable de cadena pesada, con la siguiente secuencia (anticuerpo 1129 anticuerpo anti-toxina B; secuencia de región variable de cadena pesada) SEQ ID NO: 139:

EVQLVESGGGWQPGRSLRLSCATSGFIFSNFGMSWVRQAPGKGLEWVASISPSGGNAYYRDS VKGRFTISRDNSKTTLYLQMNSLRAE DTAVYYCTRRAYSSPFAFWGQGTLVTVSS

en la que las CDR están subrayadas

En una realización, el último aminoácido (S) de la SEQ ID NO: 139 se omite.

Se muestra la secuencia polinucleotídica que codifica la SEQ ID NO: 139 en la Figura 8 y en la SEQ ID NO: 140 en la misma. En una realización, el codón AGC que codifica el último aminoácido S se omite.

En una realización, un anticuerpo según la invención comprende regiones variables mostradas en la SEQ ID NO: 137 y la SEQ ID NO: 139.

En una realización, las secuencias 141 a 143 están en una cadena ligera del anticuerpo.

En una realización, las secuencias 144 a 146 están en una cadena pesada del anticuerpo.

En una realización, la SEQ ID NO: 141 es CDR L1, la SEQ ID NO: 142 es CDR L2 y la SEQ ID NO: 143 es CDR L3. En una realización, la SEQ ID NO: 144 es CDR H1, la SEQ ID NO: 145 es CDR H2 y la SEQ ID NO: 146 es CDR H3. En una realización, la SEQ ID NO: 141 es CDR L1, la SEQ ID NO: 142 es CDR L2, la SEQ ID NO: 143 es CDR L3, la SEQ ID NO: 144 es CDR H1, la SEQ ID NO: 145 es CDR H2 y la SEQ ID NO: 146 es CDR H3.

En una realización, se proporciona una región variable, tal como una región variable de cadena ligera, con la siguiente secuencia (anticuerpo 1134 anticuerpo anti-toxina B; secuencia de región variable de cadena ligera):

DVQLTQSPSFLSASVGDRVTITCKASKSISNHLAWYQEKPGKANKLLIHSGSTLQPGT PSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQYDEYPYTFGQGTRLEIK

SEQ ID NO: 147 en la que las CDR están subrayadas.

Se muestra la secuencia polinucleotídica que codifica la SEQ ID NO: 147 en la Figura 9 y en la SEQ ID NO: 148 en la misma.

En una realización, se proporciona una región variable, tal como una región variable de cadena pesada, con la siguiente secuencia (anticuerpo 1134 anticuerpo anti-toxina B; secuencia de región variable de cadena pesada) SEQ ID NO: 149:

EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLNSYTITWVRQPPGKGLEWIAAISGGGSTYFNSAL KSRVTISRDTSKSQVSLKLSSVTAADTAVYYCTRPRWYPRSYFDYWGRGTLVTVS

en la que las CDR están subrayadas.

Se muestra la secuencia polinucleotídica que codifica la SEQ ID NO: 149 en la Figura 9 y en la SEQ ID NO: 150 en la misma.

En una realización, un anticuerpo según la invención comprende regiones variables mostradas en la SEQ ID NO: 147 y la SEQ ID NO: 149.

En una realización, las secuencias 151 a 153 están en una cadena ligera del anticuerpo.

En una realización, las secuencias 154 a 156 están en una cadena pesada del anticuerpo.

En una realización,

la SEQ ID NO: 151 es CDR L1, la SEQ ID NO: 152 es CDR L2 y la SEQ ID NO: 153 es CDR L3. En una realización,

la SEQ ID NO: 154 es CDR H1, la SEQ ID NO: 155 es CDR H2 y la SEQ ID NO: 156 es CDR H3. En una realización, la SEQ ID NO: 151 es CDR L1, la SEQ ID NO: 152 es CDR L2, la SEQ ID NO: 153 es CDR L3, la SEQ ID NO: 154 es CDR H1, la SEQ ID NO: 155 es CDR H2 y la SEQ ID NO: 156 es CDR H3.

En una realización, se proporciona una región variable, tal como una región variable de cadena ligera, con la siguiente secuencia (anticuerpo 1151 anticuerpo anti-toxina B; secuencia de región variable de cadena ligera) SEQ ID NO: 157:

AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGNNVAWYQHKPGKAPKLLIYYASNRFTGVPSRFT GGGYGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQRVYQSTWTFGQGTKVEIK

en la que las CDR están subrayadas.

Se muestra la secuencia polinucleotídica que codifica la SEQ ID NO: 157 en la Figura 9 y en la SEQ ID NO: 158 en la misma.

En una realización, se proporciona una región variable, tal como una región variable de cadena pesada, con la siguiente secuencia (anticuerpo 1151 anticuerpo anti-toxina B; secuencia de región variable de cadena pesada) SEQ

ID NO: 159:

EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTSYYVHWVRQPPGKGLEWMGCIRTGGNTEYQSEF KSRVTISRDTSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCARGNYGFAYWGQGTLVTVS

en la que las CDR están subrayadas.

Se muestra la secuencia polinucleotídica que codifica la SEQ ID NO: 159 en la Figura 9 y en la SEQ ID NO: 160 en la misma.

En una realización, un anticuerpo según la invención comprende regiones variables mostradas en la SEQ ID NO: 157 y la SEQ ID NO: 159.

En una realización, las secuencias 161 a 163 están en una cadena ligera del anticuerpo.

En una realización, las secuencias 164 a 166 están en una cadena pesada del anticuerpo.

En una realización, la SEQ ID NO: 161 es CDR L1, la SEQ ID NO: 162 es CDR L2 y la SEQ ID NO: 163 es CDR L3. En una realización, la SEQ ID NO: 164 es CDR H1, la SEQ ID NO: 165 es CDR H2 y la SEQ ID NO: 166 es CDR H3. En una realización, la SEQ ID NO: 161 es CDR L1, la SEQ ID NO: 162 es CDR L2, la SEQ ID NO: 163 es CDR L3, la SEQ ID NO: 164 es CDR H1, la SEQ ID NO: 165 es CDR H2 y la SEQ ID NO: 166 es CDR H3.

En una realización, se proporciona una región variable, tal como una región variable de cadena ligera, con la siguiente secuencia (anticuerpo 1153 anticuerpo anti-toxina B; secuencia de región variable de cadena ligera) SEQ ID NO: 167: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNINKYLDWYQQKPGKVPKLLIYNIQSLHTGIPSRFS GSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCFQHNSGWTFGQGTRLEIK

en la que las CDR están subrayadas.

Se muestra la secuencia polinucleotídica que codifica la SEQ ID NO: 167 en la Figura 10 y en la SEQ ID NO: 168 en la misma.

En una realización, se proporciona una región variable, tal como una región variable de cadena pesada, con la siguiente secuencia (anticuerpo 1153 anticuerpo anti-toxina B; secuencia de región variable de cadena pesada) SEQ ID NO: 169:

EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFTQAAMFWVRQASGKGLEGIARISTKSNNFATYYP DSVKGRFTISRDDSKNTVYLQMNSLKTEDTAVYYCTAPAYYYDGTVPFAYWGQGTLVTVS

en la que las CDR están subrayadas.

Se muestra la secuencia polinucleotídica que codifica la SEQ ID NO: 169 en la Figura 10 y en la SEQ ID NO: 170 en la misma.

En una realización, un anticuerpo según la invención comprende regiones variables mostradas en la SEQ ID NO: 167 y la SEQ ID NO: 169.

La presente divulgación proporciona también un anticuerpo que comprende 6 CDR independientemente seleccionadas de las SEQ ID NO 1,2, 3, 4, 5, 6, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 21,22, 23, 24, 25, 26, 31,32, 33, 34, 35, 36, 41,42, 43, 44, 45, 46, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 61,62, 63, 64, 65, 66, 71,72, 73, 74, 75, 76, 81,82, 83, 84, 85, 86, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 121,122, 123, 124, 125, 126, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 161, 162, 163, 164, 165 y 166.

La presente divulgación proporciona también un anticuerpo anti-TcdA que comprende 6 CDR independientemente seleccionadas de las SEQ ID NO 1,2, 3, 4, 5, 6, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 21,22, 23, 24, 25, 26, 31,32, 33, 34, 35, 36, 41,42, 43, 44, 45, 46, 51,52, 53, 54, 55 y 56.

La presente divulgación proporciona también un anticuerpo que comprende un anticuerpo anti-TcdB que comprende 6 CDR independientemente seleccionadas de las SEQ ID NO 61,62, 63, 64, 65, 66, 71,72, 73, 74, 75, 76, 81,82, 83, 84, 85, 86, 91,92, 93, 94, 95, 96, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 121,122, 123, 124, 125, 126, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 161, 162, 163, 164, 165 y 166.

En una realización, se proporciona un anticuerpo que comprende dos regiones variables independientemente seleccionadas de las SEQ ID NO: 7, 9, 17, 19, 27, 29, 37, 39, 47, 49, 57, 59, 67, 69, 77, 79, 87, 89, 97, 99, 107, 109, 117, 119, 127, 129, 137, 139, 147, 149, 157 y 159.

La presente divulgación proporciona también un anticuerpo que comprende dos regiones variables independientemente seleccionadas de las SEQ ID NO: 7, 9, 17, 19, 27, 29, 37, 39, 47, 49, 57 y 59.

En una realización, se proporciona un anticuerpo que comprende dos regiones variables independientemente seleccionadas de las SEQ ID NO: 67, 69, 77, 79, 87, 89, 97, 99, 107, 109, 117, 119, 127, 129, 137, 139, 147, 149, 157 y 159.

En una realización, los anticuerpos según la invención están humanizados.

La presente divulgación proporciona también un anticuerpo o anticuerpos que están dirigidos a la porción de "unión celular" C-terminal de la toxina TcdA y/o TcdB.

En una realización, un anticuerpo según la invención es adecuado para neutralizar toxina A o toxina B.

Neutralizar como se emplea en la presente memoria pretende hacer referencia a la eliminación o reducción de efectos dañinos/nocivos de la toxina diana, por ejemplo al menos un 50 % de reducción del efecto dañino relevante.

Los inventores han establecido, usando comparaciones internas entre anticuerpos descubiertos en esta solicitud y por comparación frente a anticuerpos bien descritos en la materia (Babcock et al. 2006; Lowy et al., 2010) que algunos anticuerpos tienen la característica deseable de mantener una neutralización eficaz (por ejemplo, baja CE⁵⁰y alto % de protección) incluso a altas concentraciones de toxina. Otros anticuerpos, incluyendo aquellos descritos en la materia, no mantienen una neutralización de toxina eficaz a altas concentraciones de toxina.

Las concentraciones eficaces de toxina pueden definirse como una "dosis letal" (DL) en estudios de titulación en ausencia de anticuerpos neutralizantes. Los ensayos de neutralización se realizan típicamente a una DL del 50 % de la destrucción celular completa (concretamente. una DL⁵⁰) pero pueden realizarse más rigurosamente a una DL^s0.

Pueden realizarse también ensayos en condiciones considerablemente más exigentes tales como DL⁹⁰, DL^{g s}y/o DL^máx(DL^máxes la cantidad de toxina máxima que puede incluirse en un ensayo limitada por el volumen de ensayo y la concentración/solubilidad máxima de la toxina). Tales ensayos aspiran a imitar los estadios tempranos de infección de seres humanos cuando el crecimiento de C. diffiále en el intestino es generalizado y la diarrea y otros síntomas conducen a teorizar que las concentraciones de toxina están al máximo. Los anticuerpos que neutralizan eficazmente las actividades de toxina dañinas en condiciones de alta concentración de toxina se cree por los presentes inventores que tienen especial valor clínico para el control de síntomas en infecciones humanas. En una realización, el anticuerpo 0 anticuerpos de la presente divulgación tienen, por ejemplo, bajos valores de CE⁵⁰y/o alto % de protección de la muerte celular útiles para una o más de DL^s0, DL⁹⁰, d L⁹⁵y/o DL^máx. En una realización, la CE⁵⁰en una o más de las últimas situaciones es de 15 ng/ml o menos, por ejemplo 10 ng/ml o menos, tal como 5 ng/ml o menos, en particular 1 ng/ml o menos. En una realización, el % de protección de muerte celular es >90 % o >75 % o >50 %.

Por tanto, en una realización la presente divulgación proporciona un anticuerpo o una combinación de anticuerpos que mantienen la neutralización de toxinas incluso en presencia de altos niveles de toxina, por ejemplo como se mide en un ensayo proporcionado en la presente memoria.

El efecto dañino de la toxina puede medirse, por ejemplo, en un ensayo in vitro adecuado. En una realización, se mide la neutralización en un ensayo dado en el Ejemplo 1 siguiente. Se proporciona también un anticuerpo o anticuerpos identificados en un ensayo de neutralización, por ejemplo en el que se mantiene la potencia del anticuerpo en presencia de altos niveles de toxina.

Toxina A se usa intercambiablemente con TcdA.

Toxina B se usa intercambiablemente con TcdB.

En una realización, un anticuerpo según la invención es un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión del mismo.

En una realización, un anticuerpo monoclonal según la invención es capaz de neutralizar TcdA con muy alta potencia y afinidad.

En una realización, un anticuerpo monoclonal según la invención es capaz de neutralizar TcdA con muy alta potencia y afinidad y alta avidez.

La avidez como se emplea en la presente memoria hace referencia a la fuerza combinada de múltiples afinidades de unión.

En una realización, un anticuerpo monoclonal según la invención es capaz de neutralizar TcdA con muy alta potencia y afinidad y alta avidez y alta valencia de unión.

La valencia de unión como se emplea en la presente memoria hace referencia a la capacidad de un anticuerpo monoclonal de unirse a un antígeno múltiples veces. La alta valencia de la unión da como resultado por ello altos niveles de decoración de antígeno con anticuerpos y/o altos niveles de reticulación de moléculas de toxina, que se cree que es ventajoso.

Los Mab anti-TcdA según la presente divulgación pueden ser adecuados para neutralizar los efectos tempranos de TcdA, por ejemplo sobre células, tales como pérdida de uniones estrechas.

Unión estrecha como se emplea en la presente memoria pretende hacer referencia a la zona impermeable de conexión entre células en una monocapa o estructura de tejido anatómico. No aparece pérdida de fluido cuando las uniones estrechas retienen su integridad estructural y funcional. La pérdida de uniones estrechas es una indicación de que la célula se ha comprometido por la toxina y está bien documentado que es una etapa temprana en los efectos tóxicos de TcdA y TcdB (25) y da como resultado la pérdida de fluido que contiene suero, inmunoglobulina e iones (26, 3). La pérdida de uniones estrechas se cree que es la primera etapa del inicio de la diarrea en seres humanos.

El sistema de ensayo de RETE puede usarse para medir la pérdida de unión estrecha in vitro. RETE es un acrónimo para ensayo de resistencia eléctrica transepitelial y se emplea generalmente para medir la permeabilidad de una capa celular diferenciada representativa de un revestimiento endotelial intestinal Sin embargo, en el contexto del cribado de anticuerpos, la pérdida de RETE puede emplearse para identificar anticuerpos que retardan o previenen el daño a las uniones estrechas y por ello es un sustituto de protección contra daño de tejido que conduce a diarrea.

A menudo se emplean células Caco-2, puesto que derivan de células de colon humanas y son conocidas por formar monocapas diferenciadas con las células conectadas por uniones estrechas. Está comercialmente disponible un kit en Becton-Dickinson llamado sistema de placa Caco-2 BioCoat HTS (BD Biosciences/ 354802). Las instrucciones en el kit son adecuadas para pruebas en el presente contexto. La resistencia de la membrana cambia cuando se ha comprometido la membrana.

Generalmente, el anticuerpo se preincubará con toxina antes de la adición al sistema de RETE para establecer si el anticuerpo puede prevenir o retardar el daño a la membrana causado por la toxina. El ensayo puede realizarse durante un periodo adecuado, por ejemplo 24 horas, tomando medidas en ciertos puntos temporales. Los presentes inventores han establecido que el punto temporal de 4 horas es particularmente discriminante de anticuerpos terapéuticamente útiles. La concentración de toxina empleada en el ensayo de RETE está generalmente en el intervalo de 100-200 ng/ml, lo más preferiblemente 125 ng/ml

La concentración de anticuerpo (por ejemplo IgG1) empleada en el ensayo de RETE está generalmente en el intervalo de 4 a 2000 ng/ml, por ejemplo de 50 a 1000 ng/ml, tal como de 100 a 500 ng/ml.

En una realización, la CE⁵⁰del anticuerpo en el ensayo de RETE empleado en dichas condiciones es de al menos 200 ng/ml, por ejemplo menos de 100 ng/ml, tal como aproximadamente 60-80 ng/ml.

En una realización, se proporciona un anticuerpo anti-TcdA o un anticuerpo anti-TcdB adecuado para uso como agente terapéutico en el tratamiento o la prevención de infección por C. difficile, en el que dicho anticuerpo se cribó y seleccionó empleando un ensayo de RETE.

En un aspecto, se proporciona un método de cribado en un anticuerpo en un ensayo de RETE de la capacidad de retardar o prevenir la pérdida de uniones estrechas. En una realización, el anticuerpo o anticuerpos cribados son anticuerpos anti-TcdA. En una realización, el anticuerpo o anticuerpos cribados son anticuerpos anti-TcdAB. En una realización, el anticuerpo o anticuerpos cribados son una combinación de anticuerpos anti-TcdA y anti-TcdB. En una realización, el método comprende la etapa de identificar un anticuerpo o anticuerpos apropiados y expresar cantidades adecuadas del mismo. En una realización, el método comprende la etapa adicional de formular dicho anticuerpo o anticuerpos en una formulación farmacéutica. En una realización, el método comprende la etapa adicional de administrar dicho anticuerpo o anticuerpos o dicha formulación a un paciente necesitado de ello.

En una realización, múltiples anticuerpos de la divulgación pueden ser capaces de unirse a la toxina diana (TcdA o TcdB), lo que puede ayudar a la inmunoeliminación de la toxina.

Múltiples anticuerpos como se emplea en la presente memoria pretende hacer referencia a múltiples copias de un anticuerpo con la misma secuencia o a un anticuerpo con la misma secuencia de aminoácidos o a un anticuerpo específico del mismo antígeno diana, pero con una secuencia de aminoácidos diferente.

En una realización, los anticuerpos según la invención son específicos del antígeno diana, por ejemplo específicos de un epítopo en el antígeno diana.

En una realización, los anticuerpos de la invención son capaces de unirse al antígeno diana en dos o más localizaciones, por ejemplo dos o tres localizaciones, tal como cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más localizaciones, por ejemplo la toxina puede comprender dominios repetidos y por tanto un anticuerpo puede ser específico de un epítopo, y de hecho ese epítopo puede estar presente en el antígeno varias veces, concretamente en más de una localización. Por tanto, los anticuerpos dados pueden unirse al mismo epítopo múltiples veces en localizaciones diferentes en el antígeno.

En una realización, el anticuerpo se une al antígeno dado múltiples veces, por ejemplo de 2 a 20 veces, tal como 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16 veces. En una realización, el anticuerpo se une al antígeno dado al menos 3 veces. Esta unión múltiple se cree que es importante en la neutralización y/o eliminación de la toxina. Sin desear ligarse a teoría alguna, se cree que la unión múltiple, por ejemplo 3 veces, concretamente por decoración con 3 o más fragmentos de Fc, es importante para desencadenar la eliminación rápida de la toxina (24) sobre todo por el hígado y el bazo (27, 28).

En una realización, el anticuerpo anti-TcdA se une 3 o más veces, por ejemplo de 3 a 16 veces.

En una realización, el anticuerpo anti-TcdA se une 12 veces.

En una realización, el anticuerpo anti-TcdA se une 2 veces.

En una realización, un anticuerpo anti-TcdA se une al dominio de unión celular terminal catalítico de TcdA.

En una realización, el anticuerpo anti-TcdB se une 2 o más veces, por ejemplo 2 veces.

En una realización, un anticuerpo anti-TcdB se une al dominio de unión celular terminal catalítico de TcdB.

En una realización, el anticuerpo o anticuerpos según la divulgación son capaces de reticular moléculas de toxina, por ejemplo un brazo de la molécula de anticuerpo se une a una molécula de toxina y otro de los anticuerpos se une a un epítopo en una molécula de toxina diferente, formando así una especie de complejo inmunitario. La formación de este último puede facilitar también la activación del sistema inmunitario para eliminar la toxina relacionada y minimizar así los efectos nocivos in vivo de la misma.

En una realización, se activa una respuesta inmunitaria innata, tal como complemento.

En una realización, el anticuerpo o anticuerpos de la divulgación tienen una alta potencia contra toxinas derivadas de cepas de diferentes ribotipos, por ejemplo 003, 027, 078.

En una realización, los anticuerpos contra TcdA pueden tener una CE⁵⁰en el intervalo de 0,1-100 ng/ml, tal como 1 a 10 ng/ml, y una inhibición máxima en el intervalo de 50-100 % a concentraciones de toxina de DL^80-95, por ejemplo contra toxinas de cepas de ribotipos 003, 027 y 078.

En una realización, los anticuerpos contra TcdA pueden tener una CE⁵⁰en el intervalo de 0,1-100 ng/ml, tal como 1 a 10 ng/ml y una inhibición máxima en el intervalo de 60-100, 70-100, 80-100 o 90-100 % a concentraciones de toxina de DL^80-95, por ejemplo contra toxinas de cepas de ribotipos 003, 027 y 078.

En una realización, los anticuerpos contra TcdB pueden tener una CE⁵⁰en el intervalo de 0,1-100 ng/ml, tal como 1 a 10 ng/ml y una inhibición máxima en el intervalo de 50-100 % a concentraciones de toxina de DL^80-95, por ejemplo contra toxinas de cepas de ribotipo 003.

En una realización, los anticuerpos contra TcdB pueden tener una CE⁵⁰en el intervalo de 0,1-100 ng/ml, tal como 1 a 10 ng/ml y una inhibición máxima en el intervalo de 60-100, 70-100, 80-100 o 90-100 % a concentraciones de toxina de DL^80-95, por ejemplo contra toxinas de cepas de ribotipo 003.

En una realización, se proporcionan combinaciones de anticuerpos según la invención, por ejemplo combinaciones de anticuerpos específicos de TcdA, combinaciones de anticuerpos específicos de TcdB o combinaciones de anticuerpos específicos de TcdA y anticuerpos específicos de TcdB.

Las combinaciones de anticuerpos específicos de TcdA harán referencia generalmente a combinaciones de anticuerpos dirigidos a diferentes epítopos en el antígeno diana TcdA, o al menos con diferentes propiedades de unión. Las combinaciones de anticuerpos específicos de TcdB harán referencia generalmente a combinaciones de anticuerpos dirigidos a diferentes epítopos en el antígeno diana TcdB, o al menos con diferentes propiedades de unión. Las combinaciones pueden comprender 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 anticuerpos distintos, por ejemplo 2, 3, 4 o 5 anticuerpos.

En una realización, se proporciona una combinación de un anticuerpo anti-TcdA según la presente divulgación y dos anti-TcdB, por ejemplo en la que el anticuerpo anti-TcdA es 997 y donde los anticuerpos anti-TcdB son 1125 y 1151 Se proporciona también una combinación de un anticuerpo anti-TcdA que comprende una región variable de cadena pesada con una secuencia como se muestra en la SEQ ID NO: 49 y una región variable ligera con una secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 47 y dos anticuerpos anti-TcdB, el primero con una región variable pesada mostrada en la SEQ ID NO: 129 y una región variable ligera mostrada en la SEQ ID NO: 127, y el segundo con una región variable pesada mostrada en la SEQ ID NO: 159 y una región variable ligera mostrada en la SEQ ID NO: 157.

Distintos anticuerpos como se emplea en la presente memoria pretende hacer referencia a anticuerpos con diferentes secuencias de aminoácidos, que pueden unirse al mismo epítopo o a diferentes epítopos en el antígeno diana.

Se proporciona también por la presente divulgación una región específica o epítopo de TcdA que se une por un anticuerpo proporcionado por la presente invención, en particular un anticuerpo que comprende la secuencia de cadena pesada dada en la SEQ ID NO: 49 y la secuencia de cadena ligera dada en la SEQ ID NO: 47.

Se proporciona también por la presente divulgación una región específica o epítopo de TcdB que se une por un anticuerpo proporcionado por la presente invención, en particular un anticuerpo que comprende la secuencia de cadena pesada dada en la SEQ ID NO: 129 y la secuencia de cadena ligera dada en la SEQ ID NO: 127 o un anticuerpo que comprende la secuencia de cadena pesada dada en la SEQ ID NO: 159 y la secuencia de cadena ligera dada en la SEQ ID NO: 157.

Esta región específica o epítopo de las toxinas TcdA o TcdB puede identificarse por cualquier método de cartografía de epítopos adecuado conocido en la materia en combinación con uno cualquiera de los anticuerpos proporcionados por la presente invención. Los ejemplos de tales métodos incluyen cribado de péptidos de longitudes variables derivados de toxinas para unión al anticuerpo de la presente invención con el fragmento más pequeño que pueda unirse específicamente al anticuerpo que contiene la secuencia del epítopo reconocido por el anticuerpo. Los péptidos pueden producirse sintéticamente o por digestión proteolítica del polipéptido de toxina. Los péptidos que se unen al anticuerpo pueden identificarse, por ejemplo, por análisis espectrométrico de masas. En otro ejemplo, puede usarse espectroscopía de RMN o cristalografía de rayos X para identificar el epítopo unido por un anticuerpo de la presente invención. Una vez identificado, el fragmento epitópico que se une a un anticuerpo de la presente invención puede usarse, si es necesario, como inmunógeno para obtener anticuerpos antagonísticos adicionales que se unen al mismo epítopo.

Los anticuerpos que bloquean de forma cruzada la unión de un anticuerpo según la presente invención pueden ser útiles de forma similar en la neutralización de la actividad de toxina. Por consiguiente, la presente invención proporciona también un anticuerpo neutralizante que tiene especificidad por TcdA o TcdB, que bloquea de forma cruzada la unión de uno cualquiera de los anticuerpos descritos anteriormente a TcdA o TcdB y/o se bloquea de forma cruzada en la unión de estas toxinas por uno cualquiera de esos anticuerpos. En una realización, tal anticuerpo se une al mismo epítopo que un anticuerpo descrito anteriormente en la presente memoria. En otra realización, el anticuerpo neutralizante bloqueante cruzado se une a un epítopo que bordea a y/o se superpone con el epítopo unido por el anticuerpo descrito anteriormente en la presente memoria. En otra realización, el anticuerpo neutralizante bloqueante cruzado de este aspecto de la invención no se une al mismo epítopo que un anticuerpo de la presente invención o un epítopo que bordea a y/o se superpone con dicho epítopo.

Los anticuerpos bloqueantes cruzados pueden identificarse usando cualquier método adecuado en la materia, por ejemplo, usando ELISA competitiva o ensayos BIAcore donde la unión del anticuerpo bloqueante cruzado a TcdA o TcdB previene la unión de un anticuerpo de la presente invención o viceversa.

En una realización, se proporciona un método de generación de un anticuerpo anti-TcdA o anti-TcdB, en particular un anticuerpo neutralizante y/o un anticuerpo que bloquea de forma cruzada la unión de un anticuerpo descrito en la presente memoria, comprendiendo dicho método las etapas de inmunizar un hospedador con un antígeno adecuado, por ejemplo un antígeno mostrado en una cualquiera de las SEQ ID NO: 173 a 194 o una combinación de las mismas. Dicho método puede comprender también una o más de las siguientes etapas, por ejemplo, identificar un anticuerpo de interés (en particular, usando un ensayo funcional tal como un ensayo de RETE), expresar el anticuerpo de interés y, opcionalmente, formular el anticuerpo en forma de una composición farmacéuticamente aceptable.

Por tanto, en un aspecto la presente divulgación proporciona un método de inmunización de un hospedador con una secuencia de aminoácidos mostrada en las SEQ ID NO: 173 a 194 o una combinación de las mismas.

En una realización, los anticuerpos según la invención tienen una afinidad por el antígeno diana de 10 nM o menos, por ejemplo 1 nM o menos, tal como 900 pM, en particular 800 pM, 700 pM, 600 pM o 500 pM, tal como 60 pM.

En una realización, la afinidad es por TcdA o TcdB o un fragmento de las mismas. En un ejemplo, el fragmento es TcdA123 correspondiente a los residuos S1827-D2249 de TcdA. En un ejemplo, el fragmento es TcdA456 correspondiente a los residuos G2205-R2608. En una realización, el fragmento es TcdB1234 correspondiente a los residuos S1833-E2366 de TcdB.

En una realización, los anticuerpos según la invención o una combinación de los mismos tienen una CE⁵⁰de 200 ng/ml o menos, por ejemplo 150 ng/ml o menos, tal como 100 ng/ml o menos, tal como en el intervalo de 0,1 a 10 ng/ml.

Los anticuerpos componentes individuales de mezclas no requieren tener una CE⁵⁰en dicho intervalo a condición de que, cuando se usan en combinación con uno o más anticuerpos, la combinación tenga una CE⁵⁰en dicho intervalo.

Ventajosamente, los anticuerpos de la invención son estables, por ejemplo son térmicamente estables a temperaturas superiores a 50 °C tales como 60 o 70 °C.

Los anticuerpos y combinaciones según la presente invención tienen también una o más de las siguientes propiedades ventajosas: baja tasa de disociación, alta afinidad, alta potencia, la capacidad de unirse múltiples veces al antígeno diana para neutralizar la toxina mediante un mecanismo que reduce la pérdida de actividad de RETE medible, para estimular o ayudar a la repuesta inmunitaria natural del hospedador, para catalizar o ayudar a la inmunoeliminación del patógeno (o toxina) y/o para educar el sistema inmunitario a responder apropiadamente al patógeno (o toxina).

Los residuos en los dominios variables de anticuerpo se numeran convencionalmente según un sistema ideado por Kabat et al. Este sistema se expone en Kabat et al., 1987, en Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, EE. UU. (de aqui en adelante "Kabat et al. (supra)"). Este sistema de numeración se usa en la presente memoria descriptiva excepto cuando se indica otra cosa.

Las denominaciones de residuo de Kabat no siempre se corresponden directamente con la numeración lineal de los residuos de aminoácidos. La secuencia de aminoácidos real puede contener menos aminoácidos o adicionales que en la numeración de Kabat estricta correspondientes a un acortamiento, o inserción, de un componente estructural, tanto de región marco como determinante de la complementariedad (CDR), de la estructura de dominio variable básica. La numeración de Kabat correcta de residuos puede determinarse para un anticuerpo dado por alineamiento de los residuos de homología en la secuencia del anticuerpo con una secuencia numerada de Kabat "estándar".

Las CDR del dominio variable de cadena pesada están localizadas en los residuos 31-35 (CDR-H1), residuos 50-65 (CDR-H2) y residuos 95-102 (CDR-H3) según el sistema de numeración de Kabat. Sin embargo, según Chothia (Chothia, C. y Lesk, A.M. J. Mol. Biol., 196, 901 - 917 (1987)), el bucle equivalente a CDR-H1 se extiende desde el residuo 26 al residuo 32. Por tanto, a menos que se indique otra cosa, "CDR-H1" como se emplea en la presente memoria pretende hacer referencia a los residuos 26 a 35, como se describe por una combinación del sistema de numeración de Kabat y la definición topológica de bucle de Chothia.

Las CDR del dominio variable de cadena ligera están localizadas en los residuos 24-34 (CDR-L1), residuos 50-56 (CDR-L2) y residuos 89-97 (CDR-L3) según el sistema de numeración de Kabat.

Los anticuerpos para uso en la presente invención pueden obtenerse usando cualquier método adecuado conocido en la materia. El polipéptido/proteína de toxina A y/o toxina B, incluyendo proteínas de fusión, por ejemplo proteínas de fusión toxina-Fc o células que expresan (de forma recombinante o natural) el polipéptido (tal como linfocitos T activados) puede usarse para producir anticuerpos que reconocen específicamente las toxinas diana. El polipéptido de toxina puede ser el polipéptido de longitud completa o un fragmento biológicamente activo o derivado del mismo.

Los polipéptidos pueden prepararse mediante procesos bien conocidos en la materia a partir de células hospedadoras genomanipuladas que comprenden sistemas de expresión o pueden recuperarse de fuentes biológicas naturales. En la presente solicitud, el término "polipéptidos" incluye péptidos, polipéptidos y proteínas. Estos se usan intercambiablemente a menos que se especifique otra cosa. La secuencia para TcdA del ribotipo 027 se da en la SEQ ID NO: 171 (número de acceso a Uniprot C9YJ37) y la secuencia para TcdB del ribotipo 027 se da en la SEQ ID NO: 172 (número de acceso a Uniprot C9YJ35).

El polipéptido de antígeno puede ser en algunos casos parte de una proteína mayor tal como una proteína de fusión, por ejemplo, fusionada con un marcaje de afinidad.

Los anticuerpos generados contra el polipéptido de antígeno pueden obtenerse, cuando es necesaria la inmunización de un animal, administrando los polipéptidos a un animal, preferiblemente un animal no humano, usando protocolos bien conocidos y rutinarios, véase por ejemplo Handbook of Experimental Immunology, D. M. Weir (ed.), Vol 4, Blackwell Scientific Publishers, Oxford, Inglaterra, 1986). Muchos animales de sangre caliente, tales como conejos, ratones, ratas, ovejas, vacas, camellos o cerdos, pueden inmunizarse. Sin embargo, ratones, conejos, cerdos y ratas son generalmente los más adecuados.

Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse mediante cualquier método conocido en la materia tal como la técnica de hibridoma (Kohler y Milstein, 1975, Nature, 256: 495-497), la técnica de trioma, la técnica de hibridoma de linfocitos B humanos (Kozbor et al., 1983, Immunology Today, 4:72) y la técnica de hibridoma de EBV (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pág. 77-96, Alan R Liss, Inc., 1985).

Los anticuerpos para uso en la invención pueden generarse también usando métodos de anticuerpo linfocítico único por clonación y expresión de ADNc de región variable de inmunoglobulina generados a partir de linfocitos únicos seleccionados para la producción de anticuerpos específicos, por ejemplo, los métodos descritos por Babcook, J. et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(15): 7843-78481; los documentos WO92/02551; WO2004/051268 y la solicitud de patente internacional número WO2004/106377.

Los anticuerpos humanizados (que incluyen anticuerpos injertados con CDR) son moléculas de anticuerpo que tienen una o más regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de una especie no humana y una región marco de una molécula de inmunoglobulina humana (véanse, p. ej. los documentos US 5.585.089; WO91/09967). Se apreciará que puede ser necesario solo transferir los residuos determinantes de la especificidad de las CDR en lugar de la CDR entera (véase, por ejemplo Kashmiri et al., 2005, Methods, 36, 25-34). Los anticuerpos humanizados pueden comprender opcionalmente además uno o más residuos marco derivados de la especie no humana de la que derivaban las Cd R.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "molécula de anticuerpo humanizado" hace referencia a una molécula de anticuerpo en la que la cadena pesada y/o ligera contiene una o más CDR (incluyendo, si se desea, una o más CDR modificadas) de un anticuerpo donante (p. ej., un anticuerpo monoclonal de múrido) injertadas en un marco de región variable de cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo aceptor (p. ej., un anticuerpo humano). Para revisión, véase Vaughan et al, Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998. En una realización, en lugar de transferir la CDR completa, se transfieren solo uno o más de los residuos determinantes de la especificidad de una cualquiera de las CDR descritas anteriormente en la presente memoria al marco de anticuerpo humano (véase, por ejemplo, Kashmiri et al., 2005, Methods, 36, 25-34). En una realización, se transfieren solo los residuos determinantes de la especificidad de una o más de las CDR descritas anteriormente en la presente memoria al marco de anticuerpo humano. En otra realización, se transfieren solo los residuos determinantes de la especificidad de cada una de las CDR descritas anteriormente en la presente memoria al marco de anticuerpo humano.

Cuando las CDR o residuos determinantes de la especificidad se injertan, puede usarse cualquier secuencia marco de región variable aceptora apropiada con respecto a la clase/tipo de anticuerpo donante del que derivan las CDR, incluyendo regiones marco de ratón, primate y humana. Adecuadamente, el anticuerpo humanizado según la presente invención tiene un dominio variable que comprende regiones marco aceptoras humanas así como una o más de las CDR proporcionadas en la presente memoria.

Por tanto, se proporciona en una realización un anticuerpo humanizado que se une a toxina A o toxina B, en la que el dominio variable comprende regiones marco aceptoras humanas y CDR donantes ho humanas.

Son ejemplos de marcos humanos que pueden usarse en la presente invención KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY y POM (Kabat et al., supra). Por ejemplo, pueden usarse, KOL y NEWM para la cadena pesada, puede usarse REI para la cadena ligera y pueden usarse EU, LAY y POM tanto para la cadena pesada como la cadena ligera. Como alternativa, pueden usarse secuencias de línea germinal humana; estas están disponibles en: http://vbase.mrccpe.cam.ac.uk/

En un anticuerpo humanizado de la presente invención, las cadena pesada y ligera aceptoras no necesitan derivar necesariamente del mismo anticuerpo y pueden, si se desea, comprender cadenas compuestas que tienen regiones marco derivadas de diferentes cadenas.

También, en un anticuerpo humanizado de la presente invención, las regiones marco no necesitan tener exactamente la misma secuencia que las del anticuerpo aceptor. Por ejemplo, pueden cambiarse residuos inhabituales por residuos de aparición más frecuente para esta clase o tipo de cadena aceptora. Como alternativa, pueden cambiarse residuos seleccionados en las regiones marco aceptoras de modo que correspondan con el residuo encontrado en la misma posición en el anticuerpo donante (véase Reichmann et al., 1998, Nature, 332, 323-324). Tales cambios deberían mantenerse al mínimo necesario para recuperar la afinidad del anticuerpo donante. Se expone un protocolo para seleccionar residuos en las regiones marco aceptoras que pueden necesitar cambiarse en el documento WO 91/09967.

Generalmente, las secuencias de anticuerpo divulgadas en la presente memoria descriptiva están humanizadas.

La invención proporciona también secuencias que son un 80 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % similares a una secuencia o anticuerpo divulgado en la presente memoria.

"Identidad", como se usa en la presente memoria, indica que, en cualquier posición particular en las secuencias alineadas, el residuo de aminoácido es idéntico entre las secuencias. "Similitud", como se usa en la presente memoria, indica que, en cualquier posición particular en las secuencias alineadas, el residuo de aminoácido es de un tipo similar entre las secuencias. Por ejemplo, la leucina puede sustituirse por isoleucina o valina. Otros aminoácidos que pueden sustituirse a menudo por otro incluyen, pero sin limitación:

• fenilalanina, tirosina y triptófano (aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas);

• lisina, arginina e histidina (aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas);

• aspartato y glutamato (aminoácidos que tienen cadenas laterales ácidas);

• asparagina y glutamina (aminoácidos que tienen cadenas laterales amida); y

• cisteína y metionina (aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre).

Pueden calcularse fácilmente los grados de identidad y similitud (Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing. Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte 1, Griffin, A.M., y Griffin, H.G., eds., Humana Press, Nueva Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987, Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991, el software BLAST™ disponible en NCBI (Altschul, S.F. et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410; Gish, W. y States, D.J. 1993, Nature Genet. 3:266-272. Madden, T.L. et al., 1996, Meth. Enzymol. 266:131-141; Altschul, S.F. et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Zhang, J. y Madden, T.L. 1997, Genome Res. 7:649-656,).

Las moléculas de anticuerpo de la presente invención incluyen una molécula de anticuerpo completa que tiene cadenas pesada y ligera de longitud completa o un fragmento de las mismas y pueden ser, pero sin limitación, Fab, Fab modificado, Fab', Fab' modificado, F(ab')2, Fv, Fab-Fv, Fab-dsFv, anticuerpos de dominio único (p. ej., VH o VL o VHH), scFv, anticuerpos bivalentes, trivalentes o tetravalentes, Bis-scFv, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos y fragmentos de unión a antígeno de cualquiera de los anteriores (véanse, por ejemplo, Holliger y Hudson, 2005, Nature Biotech. 23(9): 1126-1136; Adair y Lawson, 2005, Drug Design Reviews - Online 2(3), 209-217). Los métodos para crear y fabricar estos fragmentos de anticuerpo son bien conocidos en la materia (véase, por ejemplo, Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181). Otros fragmentos de anticuerpo para uso en la presente invención incluyen los fragmentos Fab y Fab' descritos en las solicitudes de patente internacional WO2005/003169, W02005/003170 y WO2005/003171. Los anticuerpos multivalentes pueden comprender múltiples especificidades, p. ej. biespecíficos, o pueden ser monoespecíficos (véanse, por ejemplo, los documentos WO 92/22853 y WO05/113605). Las variantes de anticuerpo biespecíficas y multiespecíficas se consideran especialmente en este ejemplo, puesto que la finalidad es neutralizar dos proteínas diana independientes: TcdA y TcdB. Las regiones variables de anticuerpos divulgadas en la presente memoria pueden configurarse de tal modo que produzcan una variante de anticuerpo único que sea capaz de unirse a y neutralizar TcdA y TcdB.

En una realización, el anticuerpo según la presente divulgación se proporciona como proteína de fusión de unión a TcdA o TcdB que comprende un resto de inmunoglobulina, por ejemplo un fragmento Fab o Fab', y uno o dos anticuerpos de dominio único (dAb) ligados directa o indirectamente con el mismo, por ejemplo como se describe en el documento WO2009/040562.

En una realización, la proteína de fusión comprende anticuerpos de dos dominios, por ejemplo como apareamiento pesado variable (VH) y ligero variable (VL), opcionalmente ligados por un enlace disulfuro, por ejemplo como se describe en el documento WO2010/035012.

En una realización, el elemento Fab o Fab' de la proteína de fusión tiene la misma o similar especificidad por el anticuerpo o anticuerpos de dominio único. En una realización, el Fab o Fab' tiene una especificidad diferente por el anticuerpo o anticuerpos de dominio único, es decir, la proteína de fusión es multivalente. En una realización, una proteína de fusión multivalente según la presente invención tiene un sitio de unión a albúmina, por ejemplo un par VH/VL, que proporciona a la misma un sitio de unión a albúmina.

En una realización, la proteína de fusión multivalente según la invención se une a TcdA y TcdB.

En una realización, la proteína de fusión multivalente según la invención se une a TcdB en múltiples posiciones, por ejemplo tiene distintas regiones de unión específicas de dos epítopos diferentes.

Los dominios de región constante de la molécula de anticuerpo de la presente invención, si están presentes, pueden seleccionarse con respecto a la función propuesta de la molécula de anticuerpo, y en particular las funciones efectoras, que puedan requerirse. Por ejemplo, los dominios de región constante pueden ser dominios IgA, IgD, IgE, IgG o IgM humanos. En particular, pueden usarse dominios de región constante de IgG humana, especialmente de isotipos IgG1 e IgG3, cuando la molécula de anticuerpo se pretende para usos terapéuticos y se requieren funciones efectoras de anticuerpo. Como alternativa, pueden usarse los isotipos IgG2 e IgG4 cuando la molécula de anticuerpo se pretende para fines terapéuticos y no se requieren funciones efectoras de anticuerpo, p. ej. para simplemente neutralizar o agonizar un antígeno. Se apreciará que pueden usarse también las variantes de secuencia de estos dominios de región constante. Por ejemplo, pueden usarse moléculas de IgG4 en que la serina en posición 214 se ha cambiado a prolina como se describe en Angal et al., Molecular Immunology, 1993, 30 (1), 105-108. Se entenderá también por un especialista en la materia que los anticuerpos pueden experimentar una variedad de modificaciones postraduccionales. El tipo y extensión de estas modificaciones dependen a menudo de la línea celular hospedadora usada para expresar el anticuerpo, así como de las condiciones de cultivo. Tales modificaciones pueden incluir variaciones en la glicosilación, oxidación de metionina, formación de dicetopiperazina, isomerización de aspartato y desamidación de asparagina. Una modificación frecuente es la pérdida de un residuo básico carboxiterminal (tal como lisina o arginina) debido a la acción de carboxipeptidasas (como se describe en Harris, RJ. Journal of Chromatography 705:129-134, 1995).

En una realización, la cadena pesada de anticuerpo comprende un dominio CH1 y la cadena ligera de anticuerpo comprende un dominio CL, kappa o bien lambda.

Las moléculas biológicas, tales como anticuerpos o fragmentos, contienen grupos funcionales ácidos y/o básicos, dando así a la molécula una carga neta positiva o negativa. La cantidad de carga global "observada" dependerá de la secuencia de aminoácidos absoluta de la entidad, del entorno local de los grupos cargados en la estructura 3D y de las condiciones ambientales de la molécula. El punto isoeléctrico (pl) es el pH al que una molécula particular o superficie accesible al disolvente de la misma no porta carga eléctrica neta. En un ejemplo, el anticuerpo y fragmentos de la invención pueden genomanipularse para tener un punto isoeléctrico apropiado. Esto puede conducir a anticuerpos y/o fragmentos con propiedades más robustas, en particular perfiles de solubilidad y/o estabilidad adecuados y/o características de purificación mejoradas.

Por tanto, en un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo humanizado genomanipulado para tener un punto isoeléctrico diferente del anticuerpo identificado originalmente del que deriva. El anticuerpo puede genomanipularse, por ejemplo, reemplazando un residuo de aminoácido tal como reemplazando un residuo de aminoácido por uno o más residuos de aminoácido básicos. Como alternativa, pueden introducirse residuos de aminoácido básicos o pueden retirarse residuos de aminoácido ácidos. Como alternativa, si la molécula tiene un valor de pI inaceptablemente alto, pueden introducirse residuos ácidos para rebajar el pI, según se requiera. Es importante, después de manipular el pI, tener cuidado de retener la actividad deseable del anticuerpo o fragmento. Por tanto, en una realización, el anticuerpo o fragmento genomanipulado tiene la misma o sustancialmente la misma actividad que el anticuerpo o fragmento "no modificado".

Programas tales como ** ExPASY http://www.expasy.ch/tools/pi_tool.html, y http://www.iut-arles.up.univmrs.fr/w3bb/d_abim/compo-p.html, pueden usarse para predecir el punto isoeléctrico del anticuerpo o fragmento.

Se apreciará que la afinidad de los anticuerpos proporcionados por la presente invención puede alterarse usando cualquier método adecuado conocido en la materia. La afinidad de los anticuerpos o variantes de los mismos puede medirse usando cualquier método adecuado conocido en la materia, incluyendo BIAcore, usando una proteína natural o recombinante aislada apropiada o una proteína/polipéptido de fusión adecuado.

La presente invención se refiere por lo tanto también a variantes de las moléculas de anticuerpo de la presente invención que tienen una afinidad mejorada por TcdA o TcdB, según sea apropiado. Tales variantes pueden obtenerse mediante una serie de protocolos de maduración de afinidad, incluyendo mutación de CDR (Yang et al., J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995), transposición de cadena (Marks et al., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992), uso de cepas mutantes de E. coli (Low et al., J. Mol. Biol., 250, 359-368, 1996), transposición de ADN (Patten et al., Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, 1997), presentación en fago (Thompson et al., J. Mol. Biol., 256, 77-88, 1996) y PCR sexual (Crameri et al., Nature, 391, 288-291, 1998). Vaughan et al. (supra) discute estos métodos de maduración de afinidad.

Afinidad mejorada como se emplea en la presente memoria en este contexto hace referencia a una mejora frente a la molécula de partida.

Si se desea, un anticuerpo para uso en la presente invención puede conjugarse con una o más moléculas efectoras. Se apreciará que la molécula efectora puede comprender una molécula efectora única o dos o más de tales moléculas ligadas para formar un resto único que puede enlazarse con los anticuerpos de la presente invención. Cuando se desea obtener un fragmento de anticuerpo ligado a una molécula efectora, este puede prepararse por procedimientos de ADN químicos o recombinantes estándares en que el fragmento de anticuerpo se liga directamente o a través de un agente de acoplamiento a la molécula efectora. Las técnicas para conjugar tales moléculas efectoras con anticuerpos son bien conocidas en la materia (véanse Hellstrom et al., Controlled Drug Delivery, 2a Ed., Robinson et al., eds., 1987, pág. 623-53; Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev., 62:119-58 y Dubowchik et al., 1999, Pharmacology and Therapeutics, 83, 67-123). Los procedimientos químicos particulares incluyen, por ejemplo, aquellos descritos en los documentos WO93/06231, WO92/22583, WO89/00195, WO89/01476 y WO03/031581. Como alternativa, cuando la molécula efectora es una proteína o polipéptido, la ligación puede conseguirse usando procedimientos de ARN recombinante, por ejemplo como se describe en los documentos WO 86/01533 y EP0392745.

La expresión molécula efectora como se usa en la presente memoria incluye, por ejemplo, proteínas biológicamente activas, por ejemplo enzimas, otros anticuerpos o fragmentos de anticuerpo, polímeros de origen sintético o natural, ácidos nucleicos y fragmentos de los mismos, p. ej. ADN, ARN y fragmentos de los mismos, radionucleidos, particularmente radioyodo, radioisótopos, metales quelados, nanopartículas y grupos indicadores tales como compuestos fluorescentes o compuestos que pueden detectarse por RMN o espectroscopía de ESR.

Otras moléculas efectoras pueden incluir radionucleidos quelados tales como 111In y 90Y, Lu177, bismuto213, californio252, iridio192 y wolframio88/renio188; o fármacos tales como, pero sin limitación, alquilfosfocolinas, inhibidores de topoisomerasa I, taxoides y suramina.

Otras moléculas efectoras incluyen proteínas, péptidos y enzimas. Las enzimas de interés incluyen, pero sin limitación, enzimas proteolíticas, hidrolasas, liasas, isomerasas y transferasas. Las proteínas, polipéptidos y péptidos de interés incluyen, pero sin limitación, inmunoglobulinas, toxinas tales como abrina, ricina A, exotoxina de Pseudomonas o toxina de difteria, una proteína tal como insulina, factor de necrosis tumoral, interferón a, interferón p, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento derivado de plaquetas o activador de plasminógeno en tejido, un agente trombótico o un agente antiangiogénico, p. ej., angiostatina o endostatina, o un modificador de la respuesta biológica tal como una linfocina, interleucina 1 (IL-1), interleucina 2 (IL-2), factor estimulante de colonias de granulocitosmacrófagos (GM-CSF), factor estimulante de colonias de granuloacitos (G-CSF), factor de crecimiento nervioso (NGF) u otros factores de crecimiento e inmunoglobulinas.

Otras moléculas efectoras pueden incluir sustancias detectables útiles por ejemplo en el diagnóstico. Los ejemplos de sustancias detectables incluyen diversas enzimas, grupos protésicos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes, nucleidos radiactivos, metales emisores de positrones (para uso en tomografía de emisión de positrones) e iones metálicos paramagnéticos no radiactivos. Véase en general la patente de EE. UU. n° 4.741.900 para iones metálicos que pueden conjugarse con anticuerpos para uso como diagnóstico. Las enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o acetilcolinesterasa; los grupos protésicos adecuados incluyen estreptavidina, avidina y biotina; los materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilaminofluoresceína, cloruro de dansilo y ficoeritrina; los materiales luminiscentes adecuados incluyen luminol; los materiales bioluminiscentes adecuados incluyen luciferasa, luficerina y aecuorina y los nucleidos radiactivos adecuados incluyen 125I, 131I, 111In y 99Tc.

En otro ejemplo, la molécula efectora puede aumentar la vida media del anticuerpo in vivo, y/o reducir la inmunogenicidad del anticuerpo y/o potenciar el suministro del anticuerpo a través de una barrera epitelial al sistema inmunitario. Los ejemplos de moléculas efectoras adecuadas de este tipo incluyen polímeros, albúmina, proteínas de unión a albúmina o compuestos de unión a albúmina tales como los descritos en el documento WO05/117984.

Cuando la molécula efectora es un polímero, puede ser en general un polímero de origen sintético o natural, por ejemplo un polímero de polialquileno, polialquenileno o polioxialquileno de cadena lineal o ramificada opcionalmente sustituido o un polisacárido ramificado o no ramificado, p. ej. un homopolisacárido o heteropolisacárido.

Los sustituyentes opcionales específicos que pueden estar presentes en los polímeros sintéticos anteriormente mencionados incluyen uno o más grupos hidroxi, metilo o metoxi.

Los ejemplos específicos de polímeros sintéticos incluyen polietilenglicol, polipropilenglicol, polivinilalcohol de cadena lineal o ramificada opcionalmente sustituidos o derivados de los mismos, especialmente polietilenglicol opcionalmente sustituido tal como metoxipolietilenglicol o derivados del mismo.

Los polímeros de origen natural específicos incluyen lactosa, amilosa, dextrano, glicógeno o derivados de los mismos.

"Derivados" como se usa en la presente memoria pretende incluir derivados reactivos, por ejemplo grupos reactivos selectivos de tiol tales como maleimidas y similares. El grupo reactivo puede ligarse directamente o a través de un segmento ligador al polímero. Se apreciará que el residuo de tal grupo formará parte en algunos casos del producto como grupo ligante entre el fragmento de anticuerpo y el polímero.

El tamaño del polímero puede variar como se desee, pero estará generalmente en un intervalo medio de peso molecular de 500 Da a 50000 Da, por ejemplo de 5000 a 40000 Da, tal como de 20000 a 40000 Da. El tamaño de polímero puede seleccionarse en particular basándose en el uso pretendido del producto, por ejemplo la capacidad de localizarse en ciertos tejidos tales como tumores o extender la vida media en circulación (para revisión, véase Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews, 54, 531-545). Por tanto, por ejemplo, cuando se pretende que el producto deje la circulación y penetre en tejido, por ejemplo para uso en el tratamiento de un tumor, puede ser ventajoso usar un polímero de pequeño peso molecular, por ejemplo con un peso molecular de alrededor de 5000 Da. Para aplicaciones en que el producto permanece en circulación, puede ser ventajoso usar un polímero de mayor peso molecular, por ejemplo que tenga un peso molecular en el intervalo de 20000 Da a 40000 Da.

Los polímeros adecuados incluyen un polímero de polialquileno, tal como un polietilenglicol, o, especialmente, un metoxipolietilenglicol o un derivado del mismo, y especialmente con un peso molecular en el intervalo de aproximadamente 15000 Da a aproximadamente 40000 Da.

En un ejemplo, los anticuerpos para uso en la presente invención están enlazados con restos de polietilenglicol (PEG). En un ejemplo particular, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo y las moléculas de PEG pueden estar enlazadas a través de cualquier cadena lateral de aminoácido disponible o grupo funcional de aminoácido terminal localizado en el fragmento de anticuerpo, por ejemplo cualquier grupo amino, imino, tiol, hidroxilo o carboxilo libre. Tales aminoácidos pueden aparecer naturalmente en el fragmento de anticuerpo o pueden genomanipularse en el fragmento usando métodos de ADN recombinante (véanse por ejemplo los documentos US 5.219.996; US 5.667.425; WO98/25971, WO2008/038024). En un ejemplo, la molécula de anticuerpo de la presente invención es un fragmento Fab modificado en el que la modificación es la adición al extremo C-terminal de su cadena pesada de uno o más aminoácidos para permitir el enlazamiento de una molécula efectora. Adecuadamente, los aminoácidos adicionales forman una región bisagra modificada que contiene uno o más residuos de cisteína a los que puede enlazarse la molécula efectora. Pueden usarse múltiples sitios para enlazar dos o más moléculas de PEG.

Adecuadamente, las moléculas de PEG se ligan covalentemente a través de un grupo tiol de al menos un residuo de cisteína localizado en el fragmento de anticuerpo. Cada molécula de polímero enlazada al fragmento de anticuerpo modificado puede ligarse covalentemente al átomo de azufre de un residuo de cisteína localizado en el fragmento. El ligamiento covalente será generalmente un enlace disulfuro o, en particular, un enlace de azufre-carbono. Cuando se usa un grupo tiol como punto de enlazamiento, pueden usarse moléculas efectoras apropiadamente activadas, por ejemplo derivados selectivos de tiol tales como maleimidas y derivados de cisteína. Puede usarse un polímero activado como material de partida en la preparación de fragmentos de anticuerpo modificados con polímero como se describe anteriormente. El polímero activado puede ser cualquier polímero que contenga un grupo reactivo con tiol tal como un ácido o éster a-halogenocarboxilico, p.ej. yodoacetamida, una imida, p.ej. maleimida, una vinilsufona o un disulfuro.

Tales materiales de partida pueden obtenerse comercialmente (por ejemplo de Nektar, antiguamente Shearwater Polymers Inc., Huntsville, AL, EE.UU.) o pueden prepararse a partir de materiales de partida comercialmente disponibles usando procedimientos químicos convencionales. Las moléculas de PEG particulares incluyen metoxi-PEG-amina 20K (obtenible en Nektar, antiguamente Shearwater; Rapp Polymere; y SunBio) y M-PEG-SPA (obtenible en Nektar, antiguamente Shearwater).

En una realización, el anticuerpo es un fragmento Fab modificado o diFab que está PEGilado, concretamente tiene PEG (polietilenglicol) enlazado covalentemente con el mismo, p. ej. según el método divulgado en los documentos EP 0948544 o EP1090037 [véanse también "Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications", 1992, J. Milton Harris (ed), Plenum Press, Nueva York, "Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications", 1997, J. Milton Harris y S. Zalipsky (eds), American Chemical Society, Washington DC y "Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences", 1998, M. Aslam y A. Dent, Grove Publishers, Nueva York; Chapman, A. 2002, Advanced Drug Delivery Reviews 2002, 54: 531-545]. En un ejemplo, el PEG está enlazado con una cisteína en la región de bisagra. En un ejemplo, un fragmento de Fab modificado con PEG tiene un grupo maleimida ligado covalentemente a un único grupo tiol en una región de bisagra modificada. Puede ligarse covalentemente un residuo de lisina al grupo maleimida y a cada uno de los grupos amina en el residuo de lisina puede enlazarse un polímero de metoxipolietilenglicol que tiene un peso molecular de aproximadamente 20.000 Da. El peso molecular total del PEG enlazado con el fragmento Fab puede ser por lo tanto de aproximadamente 40.000 Da. Las moléculas de PEG particulares incluyen 2-[3-(N-maleimido)propionamido]etilamida de lisina modificada con N,N'-bis(metoxipolietilenglicol) de PM 20.000, también conocida como PEG2MAL40K (obtenible en Nektar, antiguamente Shearwater).

Las fuentes alternativas de ligadores de PEG incluyen NOF, que suministra GL2-400MA2 (en la que m en la estructura siguiente es 5) y GL2-400MA (donde m es 2) y n es aproximadamente 450:

m es 2 o 5

Es decir, cada PEG es de aproximadamente 20.000 Da.

Otras moléculas efectoras de PEG alternativas del tipo siguiente:

están disponibles en Dr Reddy, NOF y Jenkem.

En una realización, se proporciona un anticuerpo que está PEGilado (por ejemplo, con un PEG descrito en la presente memoria) enlazado a través de un residuo de aminoácido de cisteína en o aproximadamente en el aminoácido 226 en la cadena, por ejemplo el aminoácido 226 de la cadena pesada (por numeración secuencial).

En una realización, uno de ciertos anticuerpos según la presente divulgación tiene las siguientes propiedades:

La presente invención proporciona también composiciones tales como una composición farmacéutica de anticuerpo o combinación de anticuerpos definida en la presente memoria.

La presente invención proporciona también una composición que comprende al menos dos anticuerpos según la invención, por ejemplo en la que al menos un anticuerpo en la misma es específico de TcdA y al menos un anticuerpo en la misma es específico de TcdB o, como alternativa, al menos dos anticuerpos específicos de TcdA o al menos dos anticuerpos específicos de TcdB.

En una realización, se proporciona una composición que comprende múltiples anticuerpos específicos de TcdA y opcionalmente uno o más anticuerpos específicos de TcdB.

La divulgación proporciona también una composición que comprende múltiples anticuerpos específicos de TcdB y opcionalmente uno o más anticuerpos específicos de TcdA.

Por tanto, en una realización se proporciona una composición que comprende 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 anticuerpos según la invención, concretamente anticuerpos distintos.

La invención describe una mezcla particular que comprende 3 Mab, un Mab que es específico de TcdA y dos anticuerpos que son específicos de TcdB. Esta mezcla demostraba muy altos niveles de protección de muerte e inflamación intestinal por una dosis oral infecciosa letal de Clostridium diffiále en hámsteres.

En particular, se proporciona una composición que comprende una combinación de un anticuerpo anti-TcdA que comprende una región variable de cadena pesada con una secuencia como se muestra en la SEQ ID NO: 49 y una región variable ligera con una secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 47 y dos anti-TcdB, el primero con una región variable pesada mostrada en la SEQ ID NO: 129 y una región variable ligera mostrada en la SEQ ID NO: 127, y el segundo con una región variable pesada mostrada en la SEQ ID NO: 159 y una región variable ligera mostrada en la SEQ ID NO: 157.

En una realización en la que la composición comprende 3 anticuerpos, tal como un anticuerpo anti-TcdA y dos anti-TcdB, los anticuerpos están a una relación de 50 %, 25 % y 25 %, respectivamente, del contenido de anticuerpo total de la misma.

En una realización, se proporciona una composición que comprende 2, 3, 4 o 5 anticuerpos específicos de TcdA y opcionalmente 1, 2, 3, 4 o 5 anticuerpos específicos de TcdB.

En una realización, las composiciones proporcionadas según la invención están bien definidas, por ejemplo son mezclas de anticuerpos monoclonales en lugar de simplemente composiciones policlonales derivadas de un hospedador inmunizado o inmunocompetente.

En una realización, la composición de anticuerpos tiene una CE⁵⁰de 200 ng/ml o menos, por ejemplo de 150 ng/ml o menos, tal como de 100 ng/ml o menos, tal como de 0,1 a 10 ng/ml.

Ventajosamente, los anticuerpos descritos en la presente memoria tienen niveles muy altos de estabilidad biofísica y son así adecuados para inclusión en mezclas de anticuerpos.

En un aspecto, una formulación farmacéutica o composición según la invención comprende además un excipiente farmacéuticamente aceptable.

Los portadores farmacéuticamente aceptables en composiciones terapéuticas pueden contener adicionalmente líquidos tales como agua, solución salina, glicerol y etanol. Adicionalmente, pueden estar presentes en tales composiciones sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes o sustancias tamponadoras del pH. Tales portadores posibilitan formular las composiciones farmacéuticas en forma de comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, suspensiones densas y suspensiones, para ingestión por el paciente.

Las formas adecuadas para administración incluyen formas adecuadas para administración parenteral, p. ej. por inyección o infusión, por ejemplo por inyección en embolada o infusión continua. Cuando el producto es para inyección o infusión, puede tomar la forma de una suspensión, solución o emulsión en un vehículo oleoso o acuoso y puede contener agentes formuladores tales como agentes de suspensión, conservantes, estabilizantes y/o dispersantes. Como alternativa, la molécula de anticuerpo puede estar en forma seca, para reconstitución antes del uso con un líquido estéril apropiado.

Una vez formulada, la composición de la invención puede administrarse directamente al sujeto. Los sujetos para tratar pueden ser animales. Sin embargo, en una o más realizaciones, las composiciones están adaptadas para administración a sujetos humanos.

Adecuadamente en formulaciones según la presente divulgación, el pH de la formulación final no es similar al valor del punto isoeléctrico del anticuerpo o fragmento, por ejemplo si el pH de la formulación es 7, entonces puede ser apropiado un pI de 8-9 o superior. Sin desear ligarse a teoría alguna, se cree que esto puede proporcionar en última instancia una formulación final con estabilidad mejorada, por ejemplo el anticuerpo o fragmento permanece en solución.

En una realización, la composición o formulación de la presente divulgación comprende 1-200 mg/ml de anticuerpos, es decir, un contenido combinado de anticuerpo de 150 mg/mol o menos, tal como de 100 mg/ml o menos, en particular de 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10 mg/ml o menos.

En una realización, una composición o formulación según la presente divulgación comprende 20 mg/ml de cada anticuerpo en la misma.

En una realización, se proporciona una formulación que comprende:

33 mg/ml o menos de un anticuerpo anti-TcdA que comprende una región variable de cadena pesada con una secuencia como se muestra en la s Eq ID NO: 49 y una región variable ligera con una secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 47, y

28 mg/ml o menos de un primer anti-TcdB con una región variable pesada mostrada en la SEQ ID NO: 129 y una región variable ligera mostrada en la SEQ ID NO: 127, y

25 mg/ml de un segundo anti-TcdB con una región variable pesada mostrada en la SEQ ID NO: 159 y una región variable ligera mostrada en la SEQ ID NO: 157.

En una realización, la formulación farmacéutica a un pH en el intervalo de 4,0 a 7,0 comprende: de 1 a 200 mg/ml de un anticuerpo según la presente divulgación, de 1 a 100 mM de un tampón, de 0,001 a 1 % de un tensioactivo,

a) de 10 a 500 mM de un estabilizante,

b) de 5 a 500 mM de un agente de tonicidad, o

c) de 10 a 500 mM de un estabilizante y de 5 a 500 mM de un agente de tonicidad.

En una realización, la composición o formulación según la presente divulgación comprende el tampón solución salina tamponada con fosfato.

Por ejemplo, la formulación a aproximadamente pH 6 puede comprender de 1 a 50 mg/ml de anticuerpo, HCl de L-histidina 20 mM, trehalosa 240 mM y 0,02 % de polisorbato 20. Como alternativa, una formulación a aproximadamente pH 5,5 puede comprender de 1 a 50 mg/ml de anticuerpo, tampón citrato 20 mM, sacarosa 240 mM, arginina 20 mM y 0,02 % de polisorbato 20.

Las composiciones farmacéuticas de esta invención pueden administrarse mediante cualquier serie de vías incluyendo, pero sin limitación, las vías oral, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intramedular, intratecal, intraventricular, transdérmica, transcutánea (por ejemplo, véase el documento WO98/20734), subcutánea, intraperitoneal, intranasal, entérica, tópica, sublingual, intravaginal o rectal. Pueden usarse también hidropulverizadores para administrar las composiciones farmacéuticas de la invención. Típicamente, las composiciones terapéuticas pueden prepararse como inyectables, en forma de soluciones o suspensiones líquidas. Pueden prepararse también formas sólidas adecuadas para solución, o suspensión, en vehículos líquidos antes de inyección.

El suministro directo de las composiciones se logrará generalmente mediante inyección subcutánea, intraperitoneal, intravenosa o intramuscular, o suministrado al espacio intersticial de un tejido.

Las composiciones pueden administrarse también en una lesión o directamente en el tracto gastrointestinal mediante, por ejemplo, dosificación oral encapsulada para tragar, mediante un tubo nasogástrico al estómago o íleo, mediante un tubo rectal o soluciones de enema o mediante cápsula rectal. El tratamiento de dosificación puede ser un programa de dosis única o un programa de dosis múltiples.

Se apreciará que el ingrediente activo en la composición será una molécula de anticuerpo. Como tal, será susceptible de degradación en el tracto gastrointestinal. Por tanto, si la composición se va a administrar mediante una vía que usa el tracto gastrointestinal, la composición necesitará contener agentes que protejan al anticuerpo de la degradación, pero que liberen el anticuerpo una vez se ha absorbido del tracto gastrointestinal.

Está disponible una discusión concienzuda de portadores farmacéuticamente aceptables en Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, N.J. 1991).

La presente invención proporciona también un anticuerpo o combinación de anticuerpos o una composición que comprende los mismos para tratamiento, por ejemplo para el tratamiento o la profilaxis de infección por C. difficile o complicaciones asociadas a la misma tales como diarrea, colitis, en particular colitis seudomembranosa, distensión, dolor abdominal y mecagolon tóxico.

La profilaxis puede conseguirse también mediante la administración de complejos preformados de antígeno de toxina inactivada (toxoide) y anticuerpo para crear una vacuna.

En una realización, los anticuerpos, combinaciones de los mismos y composiciones que comprenden los mismos según la invención son adecuados para tratar la infección con las denominadas supercepas de C. difficile, concretamente cepas hipervirulentas tales como el ribotipo 027.

Los anticuerpos y composiciones según la presente invención son adecuados para uso en el tratamiento o la profilaxis de efectos agudos y/o crónicos de toxinas de C. difficile relevantes durante la infección primaria.

Los anticuerpos y composiciones según la presente invención son adecuados para uso en el tratamiento o la profilaxis de efectos agudos y/o crónicos de toxinas de C. difficile relevantes durante la infección secundaria o reinfección. Las directrices internacionales consagran intervalos temporales después de una infección primaria, lo que define por ello una infección secundaria (o recurrente) como distinta de una continuación de síntomas existentes a veces descrita como una recaída (29). La investigación ha mostrado que las infecciones secundarias pueden ser el resultado de la misma cepa o ribotipo que la infección primaria. En tales casos, la recurrencia en lugar de la recaída se basa en limitaciones temporales acordadas. Sin embargo, la investigación muestra claramente también que la infección secundaria puede ser también el resultado de infección por una cepa o ribotipo distinto de la infección primaria. En un estudio, un 48 % de las recurrencias de enfermedad eran el resultado de una segunda cepa distinta de la que ha causado la primera infección (30). En otro estudio, más de un 56 % de las recurrencias de enfermedad eran el resultado de una segunda cepa distinta de la que ha causado la primera infección (31).

En una realización, los anticuerpos, combinaciones de los mismos y composiciones que comprenden los mismos según la invención son adecuados para uso en la prevención de daño, por ejemplo daño estructural a largo plazo, al epitelio del colon.

En una realización, los anticuerpos, combinaciones y composición son adecuados para prevenir infección por C. difficile incluyendo recurrencia de infección, en particular infección nosocomial.

En una realización, los anticuerpos, combinaciones de los mismos y composiciones que comprenden los mismos según la invención son adecuados para reducir el riesgo de recurrencia de infección por C. difficile.

Ventajosamente, los anticuerpos de la presente divulgación pueden administrarse profilácticamente para prevenir la infección o reinfección porque, en ausencia de la toxina de la que el anticuerpo es específico, el anticuerpo se va a eliminar simplemente del cuerpo sin causar interacciones adversas con los tejidos corporales del sujeto.

Ventajosamente, los anticuerpos de la presente divulgación parecen desencadenar una respuesta rápida tras la administración, por ejemplo al cabo de uno o dos días de la administración se provoca una eliminación rápida de la toxina diana, esto puede prevenir el daño en órganos vitales tales como pulmones, corazón y riñones. Esta es la primera vez que se ponen a disposición agentes que pueden emplearse para prevenir el daño o lesión en un paciente por las toxinas A y/o B en el estadio de infección agudo por C. difficile.

Por tanto, en una realización, los anticuerpos, combinaciones de los mismos y composiciones que comprenden los mismos según la invención son adecuados para prevenir el daño en órganos vitales..

En una realización, el anticuerpo, combinaciones o formulaciones descritos en la presente memoria son adecuados para prevenir la muerte de un paciente infectado, si se administran en un marco temporal apropiado antes de realizar un daño irreparable las toxinas.

Los anticuerpos de la presente divulgación tienen tasas de asociación rápidas, que facilitan el efecto rápido in vivo.

En una realización, la población de pacientes es de más de 60, tal como más de 65 años de edad.

En una realización, la población de pacientes es de 5 años de edad o menos.

Los anticuerpos según la invención pueden emplearse en combinación con tratamiento antibiótico, por ejemplo metronidazol, vancomicina o fidaxomicina. Una serie de datos in vitro ejemplifican las propiedades de los Mab y mezclas de Mab. Se muestra que una mezcla de 3 MAb (cantidades molares del 50 % de componentes anti-TcdA y cantidades molares del 50 % de anti-TcdB) era capaz de proteger a hámsteres de una ICD letal.

En una realización, se proporciona un método de tratamiento de un paciente necesitado de ello por administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo como se describe en la presente memoria o combinación de anticuerpos o composición que comprende los mismos, por ejemplo en el tratamiento o la profilaxis de infección por C. difficile o complicaciones asociadas con la misma tales como diarrea, colitis, en particular colitis seudomembranosa, distensión, dolor abdominal y megacolon tóxico.

En una realización, el anticuerpo, combinación o formulación se administra por una vía parenteral, por ejemplo subcutánea, intraperitoneal, intravenosa o intramuscular. Los datos en los Ejemplos generados en hámsteres indicaban que las dosis administradas por esta vía alcanzan el intestino y son por tanto capaces de generar un efecto terapéutico.

En una realización, el anticuerpo, combinación o formulación se administran por vía oral, por ejemplo como formulaciones recubiertas entéricas.

En una realización, se proporciona el uso de un anticuerpo, combinación o formulación como se describe en la presente memoria para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la profilaxis de infección por C. difficile.

En una realización, la dosis administrada está en el intervalo de 1 a 1000 mg/kg, por ejemplo de 10 a 75 mg/kg, tal como de 20 a 50 mg/kg.

En una realización, la vida media del anticuerpo o anticuerpos en ratones y hámsteres in vivo está en el intervalo de 6 a 8 días en animales sanos (no infectados), y por ello se espera que tengan vidas medias en seres humanos en el intervalo de 14-28 días.

En una realización, el anticuerpo o anticuerpos se procuran en forma de solo una dosis.

En una realización, el anticuerpo o anticuerpos se procuran en forma

e una dosis semanal o bisemanal.

En una realización, el anticuerpo o anticuerpos se procuran en forma de dosis una vez al día.

En una realización, se proporciona un complejo que comprende TcdA o un fragmento inmunogénico de la misma según la presente invención, complejado con uno o más anticuerpos anti-TcdA definidos en la presente memoria. El complejo puede emplearse como antígeno en una formulación de vacuna, por ejemplo adecuada para generar anticuerpos protectores de toxina A in vivo después de administración a un ser humano.

La presente divulgación proporciona también un complejo que comprende TcdB o un fragmento inmunogénico de la misma, complejado con uno o más anticuerpos anti-TcdB definidos en la presente memoria. El complejo puede emplearse como antígeno en una formulación de vacuna, por ejemplo adecuada para generar anticuerpos protectores de toxina B in vivo después de administración a un ser humano.

Los inmunoestimulantes de tipo Th1, que pueden formularse para producir coadyuvantes adecuados para uso en la presente invención, incluyen y no están limitados a los siguientes.

En una realización, se proporciona un complejo que comprende TcdA o un fragmento inmunogénico de la misma según la presente invención y TcdB o un fragmento inmunogénico de la misma, en el que cada toxina o fragmento se compleja con uno o más anticuerpos específicos del mismo, en el que el complejo es adecuado para administración como formulación de vacuna.

Anticuerpo: Los complejos de antígeno son conocidos por captarse por el sistema inmunitario en un proceso mediado por el receptor de Fc (27, 28) y los complejos preformados de anticuerpo:antígeno se han usado exitosamente como vacunas en ensayos clínicos humanos (22).

En una o más realizaciones, la formulación de vacuna comprende además un coadyuvante tal como un inmunoestimulante.

El monofosforil-lípido A, en particular monofosforil-lípido A 3-des-O-acilado (3D-MPL) es un inmunoestimulante de tipo Th1 preferido para uso en la invención. El 3D-MPL es un coadyuvante bien conocido fabricado por Ribi Immunochem, Montana. Químicamente, se suministra a menudo como una mezcla de monofosforil-lípido A 3-des-O-acilado con 4, 5 o 6 cadenas aciladas. Puede purificarse y prepararse mediante métodos enseñados en GB 2122204B, cuya referencia divulga también la preparación de difosforil-lípido A y variantes 3-des-O-aciladas del mismo. Se han descrito otros lipopolisacáridos purificados y sintéticos (documentos US 6.005.099 y EP 0729473 B1; Hilgers et al., 1986, Int.Arch.Allergy.Immunol., 79(4): 392-6; Hilgers et al., 1987, Immunology, 60(1): 141-6; y EP 0549074 B1). Una forma preferida de 3D-MPL es la forma de una formulación de partículas que tiene un tamaño de partícula pequeño de menos de 0,2 mm de diámetro, y este método de fabricación se divulga en el documento EP 0689454.

Las saponinas son también inmunoestimulantes de Th1 preferidos de acuerdo con la invención. Las saponinas son coadyuvantes bien conocidos y se enseñan en: Lacaille-Dubois, M y Wagner H. (1996. A review of the biological and pharmacological activities of saponins. Phytomedicine vol 2 pág 363-386). Por ejemplo, se describen Quil A (derivado de la corteza del árbol sudamericano Quillaja Saponaria Molina), y fracciones del mismo, en el documento US 5.057.540 y "Saponins as vaccine adjuvants", Kensil, C. R., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12 (1-2): 1-55; y EP 0362279 B1. Las saponinas hemolíticas QS21 y QS17 (fracciones purificadas por HPLC de Quil A) se han descrito como coadyuvantes sistémicos potentes, y se divulgan métodos para su producción en la patente de EE. UU. n° 5.057.540 y el documento EP 0362279 B1. Se describe también en estas referencias el uso de QS7 (una fracción no hemolítica de Quil-A) que actúa como potente coadyuvante para vacunas sistémicas. El uso de QS21 se describe además en Kensil et al. (1991. J. Immunology vol 146, 431-437). Son también conocidas combinaciones de QS21 y poliisorbato o ciclodextrina (documento WO 99/10008). Se describen sistemas coadyuvantes de partículas que comprenden fracciones de Quil A, tales como QS21 y QS7, en los documentos WO 96/33739 y WO 96/11711. Uno de tales sistemas es conocido como Iscom y puede contener una o más saponinas.

Otro inmunoestimulante preferido es un oligonucleótido inmunoestimulante que contiene dinucleótidos de CpG no metilados ("CpG"). CpG es una abreviatura de motivos dinucleotídicos de citosina-guanosina presentes en a Dn . El CpG es conocido en la materia por ser un coadyuvante cuando se administra por vías tanto sistémica como mucosa (documentos WO 96/02555, EP 468520, Davis et al., J.Immunol, 1998, 160(2): 870-876; McCluskie y Davis, J.Immunol., 1998, 161(9): 4463-6). Históricamente, se observó que la fracción de ADN de BCG podía ejercer un efecto antitumoral. En estudios adicionales, se mostró que los oligonucleótidos sintéticos derivados de secuencias génicas de BCG son capaces de inducir efectos inmunoestimulantes (tanto in vitro como in vivo). Los autores de estos estudios concluían que ciertas secuencias palindrómicas, incluyendo un motivo CG central, portaban esta actividad. El papel central del motivo CG en la inmunoestimulación se dilucidó posteriormente en una publicación de Krieg, Nature 374, p546 1995. Un análisis detallado ha mostrado que el motivo CG tiene que estar en un cierto contexto de secuencia, y que tales secuencias son comunes en ADN bacteriano pero raras en ADN de vertebrado. La secuencia inmunoestimulante es a menudo: purina, purina, C, G, pirimidina, pirimidina; en la que el motivo CG no está metilado, pero son conocidas otras secuencias de CpG no metiladas que son inmunoestimulantes y pueden usarse en la presente invención.

En ciertas combinaciones de los seis nucleótidos, está presente una secuencia palindrómica. Varios de estos motivos, como repeticiones de un motivo o combinación de diferentes motivos, pueden estar presentes en el mismo oligonucleótido. La presencia de uno o más de estos oligonucleótidos que contienen secuencias inmunoestimulantes puede activar diversos subconjuntos inmunitarios, incluyendo linfocitos citotóxicos naturales (que producen interferón g y tienen actividad citolítica) y macrófagos (Wooldrige et al Vol 89 (N.° 8), 1977). Se ha mostrado ahora también que son inmunomoduladoras otras secuencias que contienen CpG no metilados que no tienen esta secuencia de consenso.

El CpG, cuando se formula en vacunas, se administra generalmente en solución libre junto con antígeno libre (documentos WO 96/02555; McCluskie y Davis, supra) o conjugado covalentemente con un antígeno (documento WO 98/16247), o formulado con un portador tal como un hidróxido de aluminio (antígeno de superficie de hepatitis) Davis et al. supra ; Brazolot-Millan et al., Proc.Natl.Acad.Sci., USA, 1998, 95(26), 15553-8).

Tales inmunoestimulantes como se describen anteriormente pueden formularse junto con portadores, tales como por ejemplo liposomas, emulsiones de aceite en agua y/o sales metálicas, incluyendo sales de aluminio (tales como hidróxido de aluminio). Por ejemplo, puede formularse 3D-MPL con hidróxido de aluminio (documento EP 0689454) o emulsiones de aceite en agua (documento WO 95/17210); puede formularse ventajosamente QS21 con liposomas que contienen colesterol (documento WO 96/33739), emulsiones de aceite en agua (documento WO 95/17210) o alúmina (documento WO 98/15287); puede formularse CpG con alúmina (Davis et al. supra; Brazolot-Millan supra) o con otros portadores catiónicos.

Se prefieren también combinaciones de inmunoestimulantes, en particular una combinación de un monofosforil-lípido A y un derivado de saponina (documentos WO 94/00153; WO 95/17210; WO 96/33739; WO 98/56414; WO 99/12565; WO 99/11241), más particularmente la combinación de QS21 y 3D-MPL como se divulga en el documento WO 94/00153. Como alternativa, una combinación de CpG más una saponina tal como QS21 forma también un potente coadyuvante para uso en la presente invención. Como alternativa, la saponina puede formularse en un liposoma o en un Iscom y combinarse con un oligonucleótido inmunoestimulante.

Por tanto, los sistemas coadyuvantes adecuados incluyen, por ejemplo, una combinación de monofosforil-lípido A, preferiblemente 3D-MPL, junto con una sal de aluminio.

Por tanto, en una realización el coadyuvante es una combinación de QS21 y 3D-MPL en una formulación de aceite en agua o liposómica.

Un sistema potenciado implica la combinación de un monofosforil-lípido A y un derivado de saponina, particularmente la combinación de QS21 y 3D-MPL como se divulga en el documento WO 94/00153, o una composición menos reactogénica donde QS21 se inactiva en liposomas que contienen colesterol (DQ) como se divulga en el documento WO 96/33739. Esta combinación puede comprender adicionalmente un oligonucleótido inmunoestimulante.

Se describe una formulación coadyuvante particularmente potente que implica QS21, 3D-MPL y tocoferol en una emulsión de aceite en agua en el documento WO 95/17210 y es otra formulación preferida para uso en la invención. Otra formulación preferida comprende un oligonucleótido CpG solo o junto con una sal de aluminio.

En un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un método de fabricación de una formulación de vacuna como se describe en la presente memoria, en el que el método comprende mezclar un polipéptido según la invención con un coadyuvante adecuado.

Son combinaciones coadyuvantes particularmente adecuadas para uso en las formulaciones según la invención como sigue:

i) 3D-MPL QS21 en un liposoma

ii) Alúmina 3D-MPL

iii) Alúmina QS21 en un liposoma 3D-MPL

iv) Alúmina CpG

v) 3D-MPL QS21 emulsión de aceite en agua

vi) CpG

Como se usa en la presente memoria, el término "comprende" en el contexto de la presente memoria descriptiva debería interpretarse como "incluye".

Las realizaciones y preferencias pueden combinarse como sea técnicamente apropiado.

La divulgación de la presente memoria describe realizaciones que comprenden ciertos enteros. La divulgación se extiende también a las mismas realizaciones consistentes o consistentes esencialmente en dichos enteros.

Figuras

Las Fig 1-10 muestran diversas secuencias de anticuerpo y fragmento

La Fig 11 muestra titulaciones séricas para TcdA y TcdB

La Fig 12 muestra datos de neutralización in vitro anti TcdA (ribotipo 003) para Mab únicos

La Fig 13 muestra datos de neutralización in vitro anti TcdA (ribotipo 003) para Mab únicos y pareados Las Fig 14-15 muestran datos de neutralización in vitro anti TcdA (ribotipo 003) para Mab pareados Las Fig 16-18 muestran datos de neutralización in vitro anti TcdA (ribotipo 003) para mezclas de tres Mab Las Fig 19-20 muestran datos de neutralización in vitro anti TcdA (ribotipo 003) para mezclas de cuatro y cinco Mab

Las Fig 21-22 muestran datos de neutralización in vitro anti-TcdA (ribotipo 003) para Mab únicos y apareados a diferentes concentraciones de TcdA

Las Fig -23-24 muestran datos de neutralización in vitro anti-TcdA (ribotipo 003) para Mab únicos y mezclas de cinco a diferentes concentraciones de TcdA

Las Fig 25-26 muestran datos de neutralización in vitro anti TcdB (ribotipo 003) para Mab únicos Las Fig 27-30 muestran datos de neutralización in vitro anti TcdB (ribotipo 003) para Mab pareados Las Fig -31-33 muestran datos de neutralización in vitro anti TcdB (ribotipo 003) para mezclas de tres Mab Las Fig -34-40 muestran datos de neutralización in vitro anti-TcdB (ribotipo 003) para mezclas de dos Mab a diferentes concentraciones de toxina

Las Fig 41-45 muestran datos de neutralización in vitro anti-TcdB (ribotipo 003) para mezclas de dos Mab a diferentes concentraciones de toxina

Las Fig 46-59 muestran datos de neutralización de TcdB para anticuerpos únicos y pares de anticuerpos La Fig 60 muestra la secuencia de aminoácidos de TcdA

La Fig 61 muestra

La Fig 62 muestra

La Fig 62A muestra

La Fig 63 muestra

la alta concentración es 50 mg/kg

protección el día 11, ~82 % de protección el día 28. La dosis de 5 mg/kg daba como resultado una protección no duradera e incompleta.

La Fig 64 muestra los cambios de peso corporal para hámsteres tratados con vancomicina y vehículo

La Fig 65 muestra el peso corporal para anticuerpos de baja dosis 5 mg/kg y anticuerpos de alta dosis 50 mg/kg

La Fig 66 muestra fotografías de un colon donde el animal recibió tratamiento con anticuerpos según la presente divulgación frente a un control

Las Fig -67-68 muestran los efectos de agitar con vórtex sobre la estabilidad de anticuerpos

La Fig 69 muestra una comparación de la estabilidad de agregación para diversos anticuerpos

Las Fig 70-73 muestran la neutralización de TcdA para diversos ribotipos

Ejemplos

Generación de anticuerpos

Se adquirieron una serie de diferentes inmunógenos y reactivos de cribado o se produjeron mediante técnicas de expresión convencionales de E. coli para proporcionar una respuesta inmunitaria diversa y amplia y para facilitar la identificación y caracterización de anticuerpos monoclonales (listados en la Tabla 1). En casos en que se generaron proteínas o péptidos recombinantes, las secuencias estaban basadas en el ribotipo 027. La secuencia para TcdA del ribotipo 027 se da en la SEQ ID NO: 171 (número de acceso a Uniprot C9YJ37) y la secuencia para TcdB del ribotipo 027 se da en la SEQ ID NO: 172 (número de acceso a Uniprot C9YJ35).

Se inmunizaron ratas Sprague Dawley y conejos de una oreja caída con péptidos sintéticos cartografiados en regiones comunes tanto a toxina de longitud completa TcdA como TdcdB, toxoide A inactivado con formaldehído, fragmentos de dominio de unión de toxina A (CROP1,2,3 o CROP 4,5,6) o fragmento de dominio de unión de toxina B (CROP I , 2,3,4) o, en algunos casos, una combinación de los anteriores. Después de 2 a 6 inmunizaciones, se sacrificaron los animales y se recolectaron PBMC, bazo y médula ósea. Se monitorizó en los sueros la unión a dominios de toxina A, dominios de toxina B, toxina o toxoide por ELISA. Se muestran títulos séricos de 2 de tales inmunizaciones en la Figura I I .

Se usó UCB SLAM como medio para generar anticuerpos monoclonales. Se cultivaron linfocitos B directamente de animales inmunizados (Zubler et al., 1985). Esta etapa posibilitaba muestrear un gran porcentaje del repertorio de linfocitos B. Al incorporar el método de anticuerpo linfocítico seleccionado (SLAM) (Babcook et al., 1996), era posible deconvolucionar pocillos de cultivo positivos e identificar células secretoras de anticuerpo específico de antígeno. Aquí se usó una versión modificada de SLAM (UCB SLAM (Tickle et al. 2009)) que utiliza un método basado en fluorescencia para identificar linfocitos B específicos de antígeno de pocillos de cultivo. Se configuraron los cultivos de linfocitos B y se cribó en primer lugar en los sobrenadantes su capacidad de unirse a un dominio de toxina purificado relevante (de unión, translocación o catalítico) en un ensayo basado en perlas que usa un sistema de detección celular Applied Biosystem 8200.

Este era un ensayo homogéneo que usa sobrenadante de cultivo de linfocitos B que contiene IgG, dominios de toxina biotinilada recubiertos sobre perlas de estreptavidina y un conjugado Fc-Cy5 de cabra anti-ratón/conejo. Se seleccionaron cultivos celulares positivos de unión a componentes de TcdA o TcdB de este ensayo para uso en ensayos funcionales basados en células para identificar neutralizadores de citotoxicidad inducida por toxina. Aproximadamente, se identificaron 12.000 positivos específicos de toxina en el cribado de unión primario de un total de 40 x experimentos placa de 50. Esto equivalía al cribado de aproximadamente 500 millones de linfocitos B. Se aislaron pares de genes de región variable pesada y ligera de células únicas recolectadas por micromanipulación de aproximadamente 100 pocillos neutralizantes de toxina después de PCR con transcripción inversa (TI). Se clonaron entonces estos genes de la región V como anticuerpos de longitud completa IgG1/kappa de ratón para regiones variables de rata y anticuerpos de longitud completa IgG/kappa de conejo para regiones variables de conejo. Se reexpresaron los anticuerpos en un sistema de expresión transitoria de HEK-293. Se volvió a probar entonces en estos anticuerpos recombinante su capacidad de neutralizar toxina en ensayos basados en células. Se cribaron también anticuerpos recombinantes por BIAcore para determinar la afinidad por un dominio de toxina dado y también para determinar la especificidad y aproximar el número de eventos de unión de anticuerpo a toxina. Basándose en la actividad in vitro en ensayos basados en células y medidas de afinidad, se seleccionaron los candidatos principales para humanización. A menos que se afirme otra cosa, todos los datos de la presente memoria se generaron usando los anticuerpos humanizados.

Se generó un panel de fragmentos de toxina producida por E. coli recombinante (TcdA), toxina derivada de C. diffiále o toxoide (A) y péptidos sintéticos (B) o se adquirieron en fuentes comerciales.

Tabla 1. Reactivos relacionados con la secuencia de toxina A (TcdA) para cribado e inmunizaciones.

Tabla 2. Reactivos relacionados con la secuencia de toxina B (TcdB) para cribado e inmunizaciones.

Expresión y purificación de Mab anti-toxina de C. d iffic ile

Se combinaron plásmidos de expresión de mamífero de cadena ligera y cadena pesada separados en relaciones equimolares y se usaron para transfectar células HEK-293 o CHO-S. Para estudios de expresión a pequeña escala, se usaron lipofectamina y células HEK-293, mientras que para la producción de lotes mayores se prefirió electroporación en CHO-S.

Se cargaron los sobrenadantes de cultivo en una columna MabSelect SuRe (en PBS a pH 7,4). Se eluyó el anticuerpo con 100 % de citrato de sodio 0,1 M, tampón a pH 3,4. Se neutralizaron las muestras a pH 7,4 con TrisC l a pH 8,0. Se retiró el agregado por columna de filtración de gel Superdex 200 en PBS a pH 7,4.

Tabla 3.

Ejemplo 1 Neutralización in v itro de la actividad de TcdA por Mab purificados

Todos los ensayos de cribado de neutralización se ejecutaron en placas de poliestireno de 96 pocillos. El ensayo usa células CACO-2 crecidas y cribadas en MEM 20 % de FCS, Q 2 mM y NEAa . Cualquier combinación de anticuerpos está a relaciones molares iguales a menos que se afirme otra cosa. Día 1: Se sembraron las células a 3000 por pocillo en 50 |jl de medio y se incubaron durante 24 horas; Día 2: Se añadieron muestras purificadas de Mab humanizados a placas estériles de polipropileno de fondo redondo de 96 pocillos; Se adiciona a las placas de PP toxina A a una concentración suficiente para generar la dosis letal apropiada, concretamente DL⁸⁰o superior y se incuba durante 1 h a 37 °C; Se añaden 50 j l de esta mezcla a placas celulares y se incuba durante 96 horas; Día 5: Se añade azul de metileno (0,5 % de azul de metileno, 50 % de etanol); Se incuba durante 1 h a temperatura ambiente; Se lisan las células con N-laurilsarcosina al 1 % y se leen en el lector de placas BIOTEK Synergy2 a 405 nm. Se muestran los resultados en las Fig. 12 a 24. La CE⁵⁰y el % máximo de neutralización de la actividad de TcdA mostrados confirman que los anticuerpos seleccionados tienen muy altas potencias como agentes únicos. Las combinaciones de 2 a 5 de estos no mejoraban los mejores CE⁵⁰o % máximo de neutralización. La falta de sinergia cuando se combinan los Mab CA922, 923, 995, 997 y 1000 es una observación importante y puede ser debido al hecho de que cada anticuerpo solo tiene niveles excepcionalmente altos de afinidad y potencia. Los datos de apoyo del Ejemplo 5 muestran también que algunos de los Mab (p. ej. CA997) son capaces de unirse a subdominios de TcdA muchas veces. Por ello, parece probable que estos 5 Mab representen la máxima afinidad, potencia y valencia conseguibles cuando se orienta al dominio de unión celular C-terminal de TcdA. Los anticuerpos eran también eficaces en la neutralización de concentraciones muy altas de toxina que oscilan de DL80 a más de DL⁹⁵(DLmáx) pero se observaron aumentos más modestos de CE⁵⁰(concretamente disminuciones de potencia) con niveles muy altos de [TcdA]. Estos datos son también sorprendentes puesto que otros han mostrado reducciones sustanciales de potencia cuando se ensayan concentraciones elevadas de TcdA (20).

La alta potencia y afinidad de los Mab descritos aquí, p. ej. para CA997; no es debida solamente a su alta valencia de unión. Otros (20 y documento WO06/071877) describen Mab anti-TcdA capaces de unirse hasta 14 veces. Estos Mab tenían solo afinidades en el intervalo de 0,3 a 100 nM y mostraban una protección incompleta contra la destrucción celular mediada por TcdA, solos (26-63 % de protección) o en pares (31-73 % de protección). Por ello, se ha demostrado que la alta valencia de unión a TcdA no provoca necesariamente una alta afinidad de unión o neutralización de TcdA. No se describieron las afinidades ni valencias de unión a TcdA para el Mab CDA-1 (18 y documento US7625559). Por tanto, los Mab descritos en la presente memoria tienen unas sorprendentes afinidades, potencias y valencias.

Tabla 4 Combinaciones de Mab anti-TcdA 1, 2 y 3 a una única conc. de TcdA (DL⁸⁰)

Anticuerpo Conc. de Mab final (máxima) ng/ml CE⁵⁰(ng/ml)

922 500 1,21

923 500 160,42

995 500 37,64

997 500 6,25

1000 500 19,73

922+923 500 3,58

922+925 500 3,326

922+997 500 2,88

922+1000 500 2,64

923+995 500 60,23

923+997 500 7,54

923+1000 500 9,24

995+997 500 7,29

995+1000 500 19,63

997+1000 500 4,46

922+923+995 500 4,72

922+923+997 500 3,23

922+923+1000 500 3,21 Anticuerpo Conc. de Mab final (máxima) ng/ml CE⁵⁰(ng/ml) 922+995+997 500 2,22 922+995+1000 500 2,85 922+997+1000 500 2,22 923+995+997 500 5,04 923+995+1000 500 9,49 995+997+1000 500 5,84 922+923+995+997 500 2,75 922+923+995+1000 500 3,75 922+995+997+1000 500 3,46 923+995+997+1000 500 4,81 922+923+997+1000 500 3,06 922+923+995+997+1000 500 4,72

Tabla 5 Combinaciones de Mab anti-TcdA únicos, pareados y tripletes a diversas concentraciones de TcdA, donde TcdA está a su DL⁸⁰, DL⁹⁰, DL⁹⁵y DLmáx.

Ejemplo 2 Neutralización in-vitro anti-TcdB por Mab purificados.

Descripción de los métodos de ensayo:

Todos los ensayos de cribado de neutralización se ejecutaron en placas de poliestireno de 96 pocilios.

El ensayo usa células CACO-2 crecidas y cribadas en MEM 20 % de FCS, Q 2 mM y NEAA. A menos que se afirme otra cosa, todas las combinaciones de Ab están a relaciones iguales.

• Día 1: Se siembran las células a 3000 por pocillo en 50 j l de medio y se incuban durante 24 horas;

• Día 2: Se añadieron muestras purificadas de Mab humanizados a placas estériles de polipropileno de fondo redondo de 96 pocillos;

Se adiciona a placas de PP el lote n° 031 de toxina B y se incuba durante 1 h a 37 °C

• Se añaden 50 j l de esta mezcla a placas celulares

• Se incuba durante 96 h

• Día 5: Se añade azul de metileno (0,5 % de azul de metileno, 50 % de etanol)

• Se incuba durante 1 h a temperatura ambiente

Se lisan las células con N-laurilsarcosina al 1 %

• Se lee en el lector de placas BIOTEK Synergy2 a 405 nm

Los datos en las Figuras 25 a 33 muestran que los Mab solos eran relativamente ineficaces para neutralizar TcdB, tanto en términos de % máximo de neutralización como de actividad (CE⁵⁰). Sin embargo, cuando los anticuerpos se combinaron en dúos y tríos se observaron mejoras considerables del % máximo de neutralización y la actividad (CE⁵⁰).

1125 y 1151 se seleccionaron como el mejor apareamiento, aunque se observaron otros buenos apareamientos: 1125+1153, 1125+1134

Los pares más eficaces de Mab se seleccionaron empíricamente y se encontró retrospectivamente que elaboraban combinaciones inesperadas y sorprendentes con respecto a las potencias individuales de cada Mab. Por ejemplo, en la Tabla 6 solo CA927 tenía un potencial de neutralización de TcdB que podía dar como resultado una CE50 definida, mientras que el potencial de neutralización de TcdB de ambos CA1125 y CA1151 era insuficiente en estas condiciones de ensayo para dar como resultado una CE⁵⁰definida. Sin embargo, se encontró que CA927 no era el Mab más eficaz para usar en una combinación. La mejor combinación que contiene CA927 tenía una CE⁵⁰de 13,5 ng/ml, mientras que otras dos combinaciones de Mab tenían CE⁵⁰tan bajas como 2,59 y 4,71 ng/ml. En otro ejemplo, en la Tabla 8 CA1099 tenía la CE⁵⁰de neutralización de TcdB menor en las condiciones de ensayo usadas. Sin embargo, se encontró que CA1099 no era el Mab más eficaz para usar en una combinación. La mejor combinación que contiene CA1099 tenía una CE⁵⁰de 6 ng/ml, mientras que otras dos combinaciones de Mab tenían CE⁵⁰tan bajas como 2 y 1 ng/ml. Podría especularse que los apareamientos más eficaces de Mab se definen por sus modalidades de unión cooperativa, especialmente como se definen por tener epítopos no superpuestos.

Tabla 6 Combinaciones de Mab anti-TcdB y relaciones de Mab relativas a concentración de toxina constante.

Ejemplo 3 Neutralización de TcdB por combinaciones de Mab purificados.

El ensayo usa células CACO-2 crecidas y cribadas en MEM 20 % de FCS, Q 2 mM y NEAA.

• Se adiciona a placas de PP toxina B (VPI 10463) y se incuba durante 1 h a 37 °C

• Se añaden 50 j l de esta mezcla a placas celulares

• Se incuba durante 72 h

• Día 5: Se añade azul de metileno (0,5 % de azul de metileno, 50 % de EtOH)

• Se incuba durante 1 h a temperatura ambiente

• Se lisan las células con N-laurilsarcosina al 1 %

• Se lee en el lector de placas BIOTEK Synergy2 a 405 nm

Se muestran los resultados en las Figuras 34 a 45.

Estos datos muestran que el mejor par de Mab para neutralización de TcdB en un intervalo de concentraciones de toxina era CA1125 y CA1151. Además, la combinación 1125+1151 no estaba afectada en gran medida por los cambios en las relaciones molares relativas en contraposición con 1125+1153.

Tabla 7 Combinaciones de Mab anti-TcdB y relaciones de Mab relativas a 3 conc. de toxina diferentes.

Los datos muestran que incluso las combinaciones pareadas específicas más activas tienen propiedades sorprendentemente diferentes y no previsibles respecto a cada uno. La CE⁵⁰de la combinación preferida de CA1125 y CA1151 a relaciones equimolares no está afectada en gran medida por una [TcdB] creciente. Las tres relaciones molares relativas de los Mab probados (concretamente 25:75 frente a 50:50 frente a 75:25) tienen CE⁵⁰muy similares entre sí, sugiriendo que CA1125 y CA1151 tienen modos de acción especialmente complementarios. Esto está en contraposición con la combinación de CA1125 con CA1134, donde el aumento de CE⁵⁰(concretamente la reducción de potencia) a mayor [TcdB] es más sustancial y donde las tres relaciones molares de Mab no son igualmente eficaces: La relación de CA1125:CA1134 de 25:75 es notablemente menos potente que 50:50 y 75:25.

Esto sugiere que la potencia combinada de CA1125+CA1134 es más dependiente del componente CA1125. La CE50 de las tres combinaciones molares de CA1125 y CA1153 está afectada sustancialmente por la [TcdB] creciente, sugiriendo que CA1153 es un asociado menos adecuado para combinación con CA1125. En conjunto, estos datos muestran que CA1125 y CA1151 son una combinación particularmente favorable, puesto que se mantiene la máxima potencia en un intervalo de relaciones molares de Mab y TdcB.

Tabla 8 Neutralización de TcdB -1 o 2 Mab anti-TcdB a una dosis de toxina constante (DLso).

Tabla 9 Neutralización de TcdB -1 o 2 Mab anti-TcdB a diversas dosis de TcdB.

Estos datos muestran que la combinación de Mab, especialmente CA1125 y CA1151, mejora tanto la potencia medida por CE⁵⁰, como también medida por % de protección máxima. El % de protección máxima es de particular relevancia en este método de ensayo puesto que la mezcla de Mab:TcdB se incuba con células durante largo tiempo (72 h). Puesto que TcdB es tóxica para células Caco-2 en el intervalo de pg/ml en 2-4 h, esta medida puede considerarse que es una prueba muy difícil de la capacidad de neutralización de Mab, y puede reflejar la capacidad de la mezcla de Mab con respecto a su cinética o modalidades de unión. A su vez, esto puede reflejar la capacidad de mezclas de Mab de proteger frente a los efectos de TcdB durante una infección establecida cuando puede haber cantidades sustanciales de TcdB en tejidos durante muchas horas.

Se ilustran adicionalmente datos seleccionados de las Tablas 6-9 en las Figuras 46-59.

Ejemplo 4 Valencia de unión de Mab a subdom inios de TcdB.

Se determinó el número de moles de eventos de unión de anticuerpos anti-Tcdb de C. diffiále a TcdB¹²³⁴por resonancia de plasmón de superficie (SPR) en un Biacore 3000 (GE Healthcare). Se inmovilizó estreptavidina sobre un chip sensor CM5 (GE Healthcare) a un nivel de -4000 UR mediante acoplamiento amina y se unió TcdBi²³⁴biotinilado a 500-600 UR. Se inyectaron dos inyecciones de 20 pl de las mismas mezclas de anticuerpos anti-TcdB (la concentración final de cada anticuerpo era 500 nM) sobre esta superficie a 10 pl/min y se registró la respuesta de unión saturante. Se regeneró la superficie después de cada ciclo usando HCl. Se corrigieron todos los datos con la unión de fondo usando la respuesta a la celda de flujo de referencia de solo estreptavidina.

Tabla 10. Análisis de resonancia de plasmón de superficie del número de sitios de unión a IgG en TcdB1234

Todas las respuestas se han expresado respecto a una respuesta media de CA927 múltiple (columna final de la tabla 10), puesto que CA927 parece ser representativo de un Mab que se une a TcdB^{-^34}solo una vez.

El CA1125 inmovilizado, cuando se une a TcdB¹²³⁴, no permite a CA1125 unirse adicionalmente, apoyando la idea de que CA1125 tiene un sitio de unión en TcdB¹²³⁴y que, después de que este se satura, no puede encontrarse ningún otro sitio de unión para CA1125. Sin embargo, cuando TcdB¹²³⁴se ha saturado con CA1125, puede seguir uniéndose CA1151. Esto demuestra que CA1151 se une a sitios alternativos al ocupado por CA1125. En conjunto, estos datos muestran que CA1125 es un agente de unión único a TcdB-^³⁴, mientras que 1151 IgG se une a TcdB-^m ás de una vez, lo más probablemente dos veces. Por ello, una mezcla de CA1125 y CA1151 puede unirse a TcdB^-1234aproximadamente 3 veces.

Todas las combinaciones de anticuerpos tienen una respuesta de unión aditiva que muestra que hay 2 o más sitios no competitivos en TcdB^-1234unidos por estas combinaciones.

Ejemplo 5 Valencia de unión de Mab a subdom inios de TcdA.

Se determinó el número de moles de eventos de unión de anticuerpos anti-TcdA de C. difficile a TcdA¹²³⁴y A⁴⁵⁶por resonancia de plasmón de superficie (SPR) en un Biacore 3000 (GE Healthcare). Se inmovilizó estreptavidina en un chip sensor CM5 (GE Healthcare) mediante acoplamiento de amina a un nivel de -4000 UR, se unió TcdA-i²³biotinilado a una celda de flujo y se unió TcdA⁴⁵⁶a una celda de flujo diferente a una respuesta de -500 UR. Se inyectaron dos inyecciones de 30 pl del mismo anticuerpo anti-TcdA a 1 pM en ambas celdas de flujo a 10 pl/min y se registró la respuesta de unión saturante.

Se regeneró la superficie después de cada ciclo usando HCl. Se corrigieron todos los datos con la unión de fondo usando la respuesta a la celda de flujo de referencia de solo estreptavidina.

Tabla 11. Análisis SPR de las respuestas de unión de IgG a TcdAm y TcdA456 inmovilizados

Los anticuerpos CA997 y CA1000 se unen a TcdA-i²³a una relación de seis CA997 a un CA1000, mientras que se unen a TcdA⁴⁵⁶a una relación de tres CA997 a un CA1000 (Tabla 2).

La respuesta máxima de anticuerpo para CA997, corregida para el peso molecular y el nivel de toxina inmovilizada, es similar para TcdA^-123y TcdA⁴⁵⁶. Esto sugiere que CA997 se une a TcdA⁴⁵⁶seis veces y CA1000 se une a TcdA⁴⁵⁶dos veces. Por ello, el anticuerpo CA997 se une probablemente a la toxina entera TcdA (TcdA) aproximadamente 12 veces.

Globalmente, CA997 se une seis veces o más a A¹²³y seis veces o más a A⁴⁵⁶, mientras que CA1000 se une al menos una vez a A¹²³y dos veces a A⁴⁵⁶.

La valencia de unión a TcdA y TcdB aumentada puede tener dos efectos importantes in vivo. El primero es que cualquier Mab o mezcla de Mab que sea capaz de unirse a TcdB más de una vez tendrá un potencial aumentado de formar eventos de unión intertoxina y por ello inmunoprecipitación. La inmunoprecipitación puede contribuir a la potencia al reducir la solubilidad de la toxina y formar complejos macromoleculares muy grandes que pueden reducir por ello la concentración de trabajo eficaz de toxina. Tales complejos grandes de proteína pueden captarse por macrófagos y monocitos residentes en el tejido y pueden contribuir a una respuesta inmunitaria del hospedador aumentada. Se ha mostrado específicamente que los complejos de antígeno-anticuerpo que portan fragmentos Fc son capaces de cebar una respuesta inmunitaria del hospedador frente a un patógeno intestinal (21). También se han usado complejos de antígeno-anticuerpo solubles exitosamente como vacuna dirigida contra el antígeno en ensayos clínicos humanos (22). Además, la decoración inmunitaria de la toxina con IgG portador de Fc puede contribuir a la inmunoeliminación usando mecanismos normales a través de hígado y bazo. En general, los niveles mayores de decoración de Fc del antígeno conducen a niveles más rápidos y más completos de eliminación (23). De forma crítica, puede ser que la presencia de 2 o más dominios Fc de Mab por toxina, especialmente 3 dominios Fc por toxina, puedan representar un número crítico de Fc requeridos para una eliminación muy rápida y sustancial de toxina (24). El Mab anti-TcdA CA997 es probablemente capaz de unirse a TcdA hasta 12 veces y la combinación de CA1125 y CA1151 es probablemente capaz de unirse a TcdB 3 veces. Por ello, la mezcla de 3 Mab es muy probable que sea capaz de proporcionar estas clases de mecanismos de potencia adicionales in vivo.

Ejemplo ⁶Neutralización por Mab de la pérdida de RETE causada por TcdA.

Se realiza el ensayo de integridad de monocapa de C.diffiále usando el sistema de placa Becton-Dickinson (BD) Caco-2 BioCoat HTS.

Día 1 - Se siembran células Caco-2 a 2x105/ml por pocillo del inserto de placa en 500 j l de medio de siembra basal (proporcionado por BD). Se añaden 35 ml de medio de siembra basal a la bandeja de alimentación. Se incuban las células durante 24 horas a 37 °C. Día 2 - Se retira el medio de siembra basal de los insertos y la bandeja de alimentación y se reemplaza por medio de diferenciación Entero-STIM (suministrado por BD). Se añaden 500 j l por inserto de pocillo y 35 ml a la bandeja de alimentación. Se incuban las células durante 72 h adicionales a 37 °C. Día 5 - Se preparan anticuerpos a una concentración 2x respecto a la usada en el pocillo de ensayo en una placa de polipropileno y toxina A. Se añade toxina A a los anticuerpos a una concentración de 125 ng/ml y se incuba la placa durante 1 h a 37 °C. Se añade 1 ml de medio de crecimiento de Caco-2 (MEM 20 % de FCS, Q 2 mM, NEAA) a cada pocillo de una placa de TC de 24 pocillos estándar. Se transfiere la placa de inserto BioCoat a la placa de TC de 24 pocillos. Se retira medio Entero-STlM de los insertos y se reemplaza por 400 j l de mezcla de toxina:Ab.

La pérdida de uniones estrechas entre células intestinales es el efecto temprano clave de TcdA sobre monocapas celulares y secciones de tejido intestinal y es la causa primaria de diarrea. La albúmina y otras seroproteínas se pierden en el lumen intestinal junto con el fluido sérico acompañante. La pérdida de resistencia eléctrica transepitelial en células cultivadas diferencialmente que han formado una monocapa es un sustituto útil para la protección frente a los efectos agudos de TcdA. Tres anticuerpos mostrados tienen buenos niveles de protección frente a la pérdida de RETE, Figura 62. Es destacable y sorprendente que las capacidades de estos Mab en ensayos de RETE no reflejan las observadas en neutralización de toxina medida en un ensayo de proliferación celular. CA922 tiene el mejor desempeño en un ensayo de proliferación celular (CE⁵⁰= 1,21 ng/ml) y sin embargo está considerablemente superado en el ensayo de RETE por un anticuerpo (CA1000) que tiene > 10x menos potencia en un ensayo de proliferación celular (CE⁵⁰= 19,73 ng/ml). CA997 tenía el mejor desempeño en el ensayo de RETE, puesto que tenía tanto altos niveles de protección como mantenía estos a las menores conc. de Mab. CA997 tenía un potencial sustancial de neutralizar la pérdida de RETE con una inhibición máxima cercana al 80 % y una CE⁵⁰de aproximadamente 80 ng/ml a las 4 h. Estas observaciones son inesperadas, puesto que los Mab en cuestión tenían todos altas afinidades por dominios de TcdA (CA922 ~4 pM, CA997 ~132 pM, CA1000 ~73 pM). Estos datos sugieren que CA997 y CA1000 reconocen epítopos importantes en la pérdida de RETE o neutralizan TcdA por mecanismos diferentes a otros Mab. Además, puesto que se estima que CA1000 se une a holotoxina dos veces (una vez en TcdA-i²³y una vez en TcdA⁴⁵⁶), CA1000 puede definir epítopos "críticos de RETE" en las regiones de unión celular a TcdA que podrían tener un valor particular para definir inmunógenos de vacuna. Los resultados se muestran en las Figuras 62.

Ejemplo 7 Afinidad de anticuerpos anti-toxina de C d ilfic ile para subdom inios de TcdA y TcdB: TcdA123, TcdA456 y TcdB1234.

Se determinaron las constantes cinéticas para las interacciones de anticuerpos anti-TcdA y TcdB de C. difficile por resonancia de plasmón de superficie realizados en un BIAcore 3000 usando chips sensores CM5.

Se realizaron todos los experimentos a 25 °C. Se inmovilizó un fragmento Affinipure F(ab')²de IgG de cabra anti humano, específico de fragmento Fc (Jackson ImmunoResearch) en un chip sensor CM5 (GE) mediante química de acoplamiento amina a un nivel de captura de “ 7000 unidades de respuestas (UR). Se usó tampón HBS-EP (HEPES 10 mM a pH 7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, 0,005 % de tensioactivo P20, Biacore A b ) como tampón de migración con un caudal de 10 jl/m in. Se usó una inyección de 10 j l de cada anticuerpo a 1 ug/ml o menor para captura por el Fc de IgG inmovilizado anti-humano. Se titularon TcdA123, TcdA456 o TcdB1234 frente a anticuerpos purificados capturados a diluciones de duplicación desde 12,5 nM a un caudal de 30 jl/min. Para anticuerpos presentes en sobrenadantes de cultivo, se pasó una única concentración de 12,5 nM de TcdA123 o TcdA456 y 50 nM de TcdB1234 por los anticuerpos a 30 ul/min. Se calcularon las cinéticas en n= 2. Se regeneró la superficie a un caudal de 10 jl/min por dos inyecciones de 10 j l de HCl 40 mM y una inyección de 5 j l de NaOH 5 mM..

Se analizaron las curvas de unión con fondo restado referenciadas dobles usando el software BIAevaluation (versión 3.2) siguiendo procedimientos estándares. Se determinaron los parámetros cinéticos a partir del algoritmo de ajuste.

Tabla 12 Afinidades y cinéticas de unión de Mab anti-TcdA

Tabla 13 Afinidades de Mab anti-TcdB y cinética de unión

Las afinidades anti-TcdA son particularmente altas en comparación con las afinidades publicadas de otros Mab. Se demuestra que son conseguibles afinidades tan bajas como 4 pM. El CA997 preferido tiene una afinidad de 132 pM, CA1125 de 122 pM y CA115 de 551 pM. CA995 muestra claramente que no se une a CROP A¹²³y por ello demuestra que los Mab mostrados aquí tienen propiedades que son diferentes entre sí de formas sorprendentes e inesperadas. CA922, 923, 997 y 1000 se unen al menos una vez a CROP A123 y A456. Por ello, estos 4 Mab confirman que cada uno debe unirse a holotoxina al menos dos veces. No se han podido derivar afinidades para la unión de estos Mab a holotoxina debido a limitaciones técnicas. Sin embargo, dado las altas afinidades y valencias demostradas para los Mab anti-TcdA, es posible especular que las afinidades funcionales contra holotoxina pueden ser incluso más fuertes que las ilustradas para unión a subdominios de toxina.

Los Mab anti-TcdB demostraban también fuertes afinidades que alcanzaban tan bajo como 31 pM. En particular, CA1125, 1151, 927, 1099, 1134 y 1153 muestran afinidades que sobrepasan las demostradas por otros.

Ejemplo ⁸Caracterización biofísica de moléculas de IgG1 humanizadas anti-toxina de C. dilficile. Moléculas analizadas

IgG1 anti-TcdA:

CA164_00922.g1

CA164_0923.g1

CA164_0995.g1

CA164_0997.g1

CA164_01000.g1

IgG1 anti-TcdB

CA164_01125.g1

CA164_01134.g4

CA164_01134.g5

CA164_01134.g6

CA164_01102.g1

CA164_01102.g4

CA164_01151.g4

Las combinaciones de anticuerpos tienen que estar compuestas por Mab que tienen altos niveles de estabilidad para mitigar los riesgos potenciales de agregación durante el almacenamiento a largo plazo. Se usa la estabilidad térmica (Tm) como una medida. Es de especial valor para las mezclas de Mab medir su tendencia a agregar debido a estrés físico tal como agitación o sacudidas. Los agregados son componentes indeseables de composiciones farmacológicas, puesto que pueden reducir el tiempo de vida de almacenamiento y pueden plantear un riesgo de seguridad a pacientes a ciertos niveles. Los datos de Tm mostraban que los 5 Mab anti-TcdA tienen alta estabilidad de Tm, mientras que tres (CA922, 923 y 997) tienen Tm muy altas en el intervalo de 79-81 °C. De los Mab anti-TcdB probados, todos menos dos tienen Tm muy altas. Ha de señalarse que CA997, CA1125 y CA1151, que se ensayaron en el estudio de infección de hámster (Ejemplo 9), tenían Tm muy altas (79,2 °C, 79,3 °C y 80,8 °C respectivamente), lo que los hace adecuados para uso en una mezcla de Mab.

En el ensayo de agregación por sacudidas, CA997 y 922 tenían la tendencia menor a agregar de los 5 Mab anti-TcdA. De forma similar, CA115 y 1151 tenían las tendencias a agregación menores de los Mab anti-TcdB. Por ello, el uso de CA997, 1125 y 1151 como mezcla de Mab puede tener un valor especial, puesto que es más probable que sobrevivan a coformulación y almacenamiento a altas concentraciones de proteínas.

Estimación del punto isoeléctrico (pI) por IEF capilar

Se prepararon las muestras mezclando lo siguiente: 30 ul de muestra de proteína a 2 mg/ml, 0,35 % de metilcelulosa, 4 % de anfolitos pH 3-10 (Pharmalyte), marcadores de pI sintéticos (4,65 y 9,77), 1 ul de cada solución madre y agua de pureza HPLC para completar el volumen final de 200 ul. Se analizó entonces la mezcla usando un analizador iCE280 IEF (preenfoque a 1500V durante 1 min seguido de enfoque a 3000 V durante ⁶min). Se integraron entonces los electroferogramas calibrados usando el software Empower (de Waters)

Estabilidad térmica (Tm) medida mediante el ensayo Thermofluor.

Este método usa tinte fluorescente naranja Sypro para monitorizar el proceso de desplegamiento de dominios proteicos. El tinte se une a regiones hidrófobas expuestas que se vuelven expuestas como consecuencia del desplegamiento, lo que da como resultado un cambio en el espectro de emisión.

Se mezcla la muestra (5 ul a 1 mg/ml) con 5 ul de una solución madre de naranja Sypro (30x) y se completa el volumen a 50 ul con PBS, pH 7,40.

Se aplican alícuotas de 10 ul de esta solución a pocillos en una placa de 384 pocillos (n= 4).

Se coloca la placa en un sistema de PCR instantáneo rápido 7900HT que contiene un dispositivo de calentamiento para control preciso de la temperatura. Se aumenta la temperatura de 20 a 99 °C (tasa de pendiente de 1,1 °C/min). Un dispositivo CCD monotoriza simultáneamente los cambios de fluorescencia en los pocillos. Se usa un algoritmo para procesar los datos de intensidad y tener en cuenta múltiples transiciones.

Estresamiento de muestras por agitación.

Durante la fabricación, se someten las muestras de anticuerpo a estrés mecánico generado por procesos tales como bombeo y filtración. Esto puede causar desnaturalización y en consecuencia agregación debido a la exposición de la proteína a interfases de aire-líquido y fuerzas de cizalladura resultantes en la pérdida última de bioactividad. El estrés por vórtex es un método para cribar la robustez de las muestras de anticuerpo para la predicción de la estabilidad de agregación.

Se sometieron ambas moléculas de IgG1 anti-TcdA y anti-TcdB a estrés por agitación, mediante agitación con vórtex usando un Eppendorf Thermomixer Comfort a 25 °C, 1400 rpm. El tamaño de muestra era de 250 ul, (x3 por muestra) en un tubo tapado de estilo Eppendorf cónico de 1,5 ml (plástico) en PBS a pH 7,4. Se llevó cada muestra a una concentración de 1 mg/ml (usando un coeficiente de extinción calculado a partir de la secuencia) y se monitorizó la agregación por absorbancia a 340 nm y/o 595 nm, mediante el uso de un espectrofotómetro Varian Cary 50-Bio, medido a intervalos de hasta 24 horas.

Resultados La Tabla 14 proporciona un compendio de los datos de pl y Tm medidos tanto para moléculas de IgG1 anti-TcdA como anti-TcdB.

Tabla 14: Compilación de datos de pI y Tm

pI medido

El pI medido de las moléculas era alto (excepto para CA164_01000.g1_P3) y alejado del pH de tampones de formulación tales como PBS, pH 7,4, y acetato de sodio 50 m/cloruro de sodio 125 mM, pH 5. Esto puede significar que pueden seleccionarse los tampones con pH adecuados para coformulación de dos o más Mab.

Estabilidad térmica (Tm) medida mediante ensayo Thermofluor.

Puesto que todas las moléculas son de IgG1, las Tm del dominio Fc ((Tm(CH2)) son iguales. La diferencia en estabilidad térmica entre las moléculas puede determinarse por la Tm del dominio Fab' (Tm(Fab)).

Para las moléculas anti-TcdA, el orden de rangos (el más estable primero) era de CA922>997>923>995>1000 y para las moléculas anti-TcdB (el más estable primero) era de CA1151.g4>1125.g1,g4>1134.g4>1134.g5>1134.g6>1102.g1=1102.g4.

Estresamiento de muestras por agitación.

Era posible determinar una diferente estabilidad de agregación entre los diferentes anticuerpos. La Figura 67 muestra el efecto de la agitación a través de agitación con vórtex sobre diferentes moléculas de IgG1 anti-TcdA en PBS, pH 7,4.

Era posible determinar un orden de rangos (primero el más estable a agregación):

CA922>997>923>995>1000

La Figura 68 muestra el efecto de la agitación mediante vórtex sobre diferentes moléculas anti-TcdB.

Era posible clasificar el orden de estabilidad de agregación, de tal modo que los injertos de CA1125 parecían más estables que las moléculas de CA1134, que eran más estables que las moléculas de CA1102.

Se realizó un estudio adicional para comparar directamente la estabilidad de agregación de la molécula anti-TcdB (CA1151.g4) con la molécula más estable CA1125.g2 (véase la Figura 2) y las moléculas anti-TcdA más estables a la agregación (CA922.g1 y CA997.g1). Los resultados pueden verse en la Figura 69.

Se muestran también resultados adicionales para estos 4 Mab en las Figuras 67 y 68.

Para las moléculas anti-TcdA, CA922.g1 y CA977.g1, CA922 eran preferibles basándose en los análisis anteriores, aunque aparte de CA1000 todas las moléculas podían considerarse candidatos adecuados para uso como IgG1 terapéutico.

Para las moléculas anti-TcdB, podían agruparse las características biofísicas en la familia de injertos basándose en la estabilidad de agregación y la Tm, de tal modo que los injertos de CA1125 probaron ser potencialmente más estables. Los injertos de CA1102 mostraban los datos de Tm peores y mostraban también la mayor tendencia a agregar mediante estrés por agitación.

Un estudio que usa CA1151.g4 mostraba que esta molécula exhibía una estabilidad de agregación ligeramente aumentada respecto a CA11125.g2 y parecía equivalente a las moléculas de TcdA (CA922.g1 y CA997.g1). Todas las cuatro moléculas mostraban valores de Tm equivalentes. CA997, CA1125 y CA1151 muestran niveles muy altos de termoestabilidad y niveles muy bajos de formación de agregado después de agitación.

Ejemplo 9 Estudio de infección en hámster por Mab anti-toxina de C. dUficile.

Se realizó el estudio de infección en hámster por Ricerca Biosciences LLC, Cleveland, Ohio, EE. UU.

El protocolo de estudio se aprobó por el comité IACUC de Ricerca. Los componentes activos y de control se anonimizaron (composición y dosis) para el personal de Ricerca hasta después de la terminación del periodo de estudio de 28 días planeado.

Se albergaron individualmente hámsteres macho sirios dorados (de 82-103 g de peso, 54 días de edad) en jaulas desechables filtradas con HEPA y se alimentaron con Teklad Global Diet 2016 y agua a voluntad. Después de la aclimatación, se predosificaron a los hámsteres (i.p.) mezclas de Mab o PBS (control de vehículo) una vez al día durante cada uno de 4 días: días -3, -2, -1 y 0. Se investigaron dos dosis de Mab: dosis alta= 50 mg/kg de cada uno de los componentes anti-TcdA y anti-TcdB y dosis baja de 5 mg/kg de cada uno de los componentes anti-TcdA y anti-TcdB.

La combinación farmacológica probada estaba compuesta por un anticuerpo anti-TcdA (CA997.g1) que constituía el 50 % de la proteína inyectada y dos anticuerpos anti-TcdB (CA1125.g2 y CA1151.g4) que constituían en conjunto un 50 % de la proteína inyectada, pero que solos constituían el 25 % de la proteína inyectada. Se sensibilizaron los hámsteres (día -1) con fosfato de clindamicina 50 mg/kg en PBS (s.c.) antes de exponerse 1 día después (día 0) a 3,4 x 106 u.f.c. de células vegetativas de la cepa ATCC43596. Se dosificó vancomicina 5 mg/kg dos veces al día durante 5 días (p.o.) los días 1, 2, 3, 4, 5.

Se realizaron comprobaciones de viabilidad en animales dos veces al día, los animales que se encontró que estaban en situación extrema se sacrificaron y se contaron como muertos. Se determinaron los pesos corporales en cada día de dosificación y entonces dos veces por semana y antes de sacrificar los supervivientes. Se realizó una autopsia macroscópica en todos los animales. Se crearon curvas de supervivencia mediante el método de Kaplan y Meier. Se analizaron las curvas de supervivencia usando el valor de P de la prueba del logaritmo de los rangos en comparación con el umbral corregido de Bonferroni de P= 0,005. El grupo tratado con vancomicina no se incluyó en los análisis. Se realizaron todas las pruebas estadísticas con Prism v5.04. Todos los grupos contenían 11 animales, excepto el grupo de control de vancomicina que contenía 5 animales.

Las curvas de supervivencia pueden verse en la Figura 63. Los hámsteres que recibieron PBS (control) murieron todos los días 2 y 3, mientras que aquellos que recibieron el tratamiento de vancomicina durante 5 días murieron todos los días 10 y 11. Los hámsteres que recibieron la dosis alta de mezcla de Mab de UCB sobrevivieron todos hasta el día 11, después de ello solo dos animales murieron hasta el final del estudio de 28 días. Los hámsteres que recibieron la dosis baja de mezcla de Mab de UCB sobrevivieron todos hasta el día 3, después de ello se perdieron animales bastante continuamente hasta el día 16 cuando todos habían muerto. Los datos muestran unos niveles y duración excepcionales de la protección cuando se comparan con los datos publicados para uso de Mab anti-toxina en hámsteres (18). Estos datos in vivo apoyan las observaciones in vitro de un desempeño de muy alto nivel para neutralización y estabilidad.

No hay un nexo evidente entre la muerte y el peso corporal durante la fase aguda (días 1-5) de la infección, Figuras 64-65. Por ello, puede suponerse que los hámsteres mueren por los abrumadores efectos directos e indirectos de TcdA y TcdB. Los hámsteres que sobreviven al periodo agudo debido a protección parcial (dosis baja de UCB) de Mab neutralizantes pierden peso, presuntamente debido al daño intestinal y al estado nutricional alterado. Era notable que muchos de los hámsteres que seguían sobreviviendo al periodo de 28 días debido a los efectos protectores de los Mab de alta dosis de UCB se recuperaban de la pérdida de peso y de hecho incluso ganaban peso. Esto puede tomarse como prueba de los efectos protectores superiores de los Mab de UCB, que posibilitan que el intestino funcione normalmente.

Tabla 15. Puntuaciones de patología macroscópica

Resulta evidente que los Mab de UCB eran capaces de proteger el intestino grueso y delgado de los derrames hemorrágicos causados por TcdA y TcdB.

Se muestran los resultados en las Figuras 63 a 66.

Las fotografías de la Figura 66 muestran patologías macroscópicas típicas para el hinchamiento y derrames hemorrágicos de ciegos causados por TcdA y TcdB (imagen izquierda, control de PBS, muerte animal el día 2) y ciegos llenos de heces normales después de protección por Mab de UCB de dosis alta (imagen derecha, UCB de dosis alta, supervivencia animal hasta el día 28). Estos datos muestran que, después de la protección con una dosis alta de Mab de UCB, el intestino grueso puede volver a la morfología y función normales.

Ejemplo 10 Neutralización de TcdA de cepas diferentemente ribotipadas por Mab purificado.

Las infecciones clínicas están causadas por una variedad de cepas diferentes. Se caracterizan las diferencias de cepas usando una serie de diferentes métodos de los que el ribotipado es uno clave. Se observa que las diferentes cepas de ribotipo tienen diferentes propiedades de patogenicidad, infección y esporulación. Toda la neutralización de TcdA mostrada anteriormente usaba TcdA purificada de la cepa conocida como VPI10463. Sin embargo, la cepa agresivamente patogénica predominante asociada con brotes se llama ribotipo 027. Otros ribotipos clave incluyen 078, 001, 106. Se ha observado diferencia en la secuencia de aminoácidos entre toxinas producidas por diferentes ribotipos, y por ello es importante que los Mab sean capaces de neutralizar toxinas de un diverso conjunto de aislamientos clínicos. Se probó en CA922, 997 y 1000 su capacidad de neutralizar TcdA de las cepas 027 y 078 y se comparó con sus capacidades contra TcdA de VPI10463. Se probaron los Mab a 4 [TcdA] y se encontró que eran capaces de neutralizar todas las toxinas sin diferencia significativa a DL⁸⁰, DLgo y DL⁹⁵

Tabla 16.

Tabla 17.

Tabla 18

Ejemplo 11 Datos PK

Un estudio PK de una IgG1 humana (20 mg/kg) en hámsteres sanos. Se encontró en la PK de hámster una vida media similar a los Mab en ratones o ratas. (t1^ 6-8 días). Las dosificaciones i.p. y s.c. fueron esencialmente las mismas.

Se estudio la farmacocinética y distribución en el intestino de un Mab hIgGI en hámsteres dorado sirios "normales" (no infectados). Se administró Mab purificado a hámsteres macho (120-135 g) por CARE Research LLC, Fort Collins, Colorado, EE. UU. y se ensayaron muestras por UCB Pharma.

El estudio se aprobó por el comité IACUC de CARE. Cada uno de ocho animales recibió una dosis única de 20 mg/kg de IgG1, cuatro se dosificaron por vía i.p., y cuatro se dosificaron por vía s.c. Se recogió sangre a las 1, 3, 8, 24, 48, 72, 103 y 168 horas después de la dosis y se separó el suero antes del almacenamiento a -80 °C. Se tomó también sangre de dos hámsteres no tratados para proporcionar controles de ensayo. Después del sacrificio, se cortó una longitud de 2 cm de colon desde la unión de los ciegos en adelante de cada hámster. Se aclaró la sección de colon con tampón de lavado (PBS al 50 % (v/v)) que contenía cóctel inhibidor de proteasa Sigma (P2714) antes de abrir y separar y retirar la mucosa del músculo subyacente. Se colocaron muestras de mucosa en 0,5 ml de tampón de lavado homogeneizado hasta uniformidad visual y se almacenaron a 4 °C antes de envío inmediato en hielo húmedo. Para ELISA de IgG anti-humana, se recubrieron placas de 96 pocillos Nunc maxisorp durante una noche en NaHCO³0,1 M a pH 8,3 con fragmento F(ab')²de IgG-FcY de cabra anti-humano (Jackson 109-006-098), se lavaron las placas con pBS-Tween (PBS/0,1 % (v/v) de Tween 20) y se bloquearon entonces con 1,0 % (p/v) de BsA y 0,1 % (v/v) de Tween en PBS.

Se diluyeron muestras de suero en tampón de muestra-conjugado (1 % (p/v) de BSA, 0,2 % de Tween en PBS) y, después de lavar, se revelaron con kappa-HRP de cabra anti-humano (Cambridge Bioscience 2060-05) en tampón de muestra-conjugado y TMB con una solución de terminación de H²SO⁴2,5 M.

Niveles en intestino, mucosa y suero:

Se recogieron muestras de suero de sangre tomada en el punto temporal de 168 h y se retiraron muestras de colon después de esto.

20 m/kg IP a las 168 horas

20 mg/kg SC a las 168 horas

Datos de suero

Los datos se muestran también en las Figuras 70 y 71

Se mostró también que la hIgGI podía encontrarse en "raspaduras" del intestino, concretamente que la hIgGI entra en la vasculatura del intestino sano, y así podría ser protectora a "dosificación profiláctica". Este efecto sería incluso más profundo en seres humanos, puesto que tienen un hFcRn afín.

Ejemplo 12 Niveles séricos en hámsteres con infección por C. d ilfic ile

Este estudio era determinar la concentración sérica de CA725.0, CA726.0, CA997.g1 CA1125.g2 y CA01151.g4 después de administración i.p. (diversas dosis detalladas a continuación) en hámster dorado sirio.

Se cuantificaron los Mab humanizados usando análisis de cromatografía líquida en tándem con espectrometría de masas (LC-MS/MS) después de digestión tríptica. Se consiguió la cuantificación por comparación con material estándar auténtico adicionado a concentraciones conocidas en matriz de blanco, con mioglobina equina adicionada usada como patrón interno.

Se seleccionó un único péptido ("proteotípico") común a todos los Mab humanizados investigados (DTLMISR, un péptido de la región CH2) y se digirieron trípticamente tanto muestras como muestras de calibración como se esquematiza. Se realizó la digestión tríptica de muestras séricas de 5 pl durante una noche usando tripsina modificada de pureza de secuenciación (Promega, Southampton, RU) después de desnaturalización/reducción con acetonitrilo/Tris (2-carboxietil)fosfina y carbamidometilación con yodoacetamida (Sigma-Aldrich, Poole, RU).

El sistema de LC-MS/MS consistía en un automuestreador CTC HTS-x (CTC Analytics, Zwingen, Suiza), un sistema Agilent 1290 LC (Agilent Technologies, Stockport, RU) y un sistema Sciex 5500 QTrap MS (AB Sciex, Warrington, RU), equipado con una fuente de iones Turbo V que funciona en modo de electropulverización. Se separaron los analitos usando una columna Onyx Monolithic C18 (100x4,6 mm, Phenomenex, Macclesfield, RU) con un gradiente de 2 a 95 % (v/v) de agua/acetonitrilo (0,1 % de ácido fórmico) suministrado a 1,5 ml/min durante ⁶minutos. El volumen de inyección era de 10 pl; se introdujo todo el eluyente en la fuente de espectrómetro de masas. Se mantuvo la temperatura de fuente del espectrómetro de masas a 600 °C y se optimizaron otros parámetros de fuente (p. ej., energía de colisión, potencial de desagrupamiento, presión de cortina de gas, etc.) para conseguir la máxima sensibilidad para el péptido de interés. Se monitorizaron las transiciones selectivas para cada péptido de interés proteotípico.

Se seleccionaron péptidos únicos ("proteotípicos") para todos los analitos de interés; se analizaron las muestras después de digestión tríptica.

Se calcularon las concentraciones plasmáticas basándose en los péptidos monitorizados como se esquematiza a continuación.

Para CA164_00997 y CA16401151, se observaron picos interferentes en las trazas de MRM. Por esta razón, estos dos analitos no pudieron cuantificarse en las muestras.

Se cuantificó la h-IgG total en todas las muestras usando un péptido común a todos los analitos de interés. Esto se realizó usando una curva patrón combinada de los cinco analitos. Se demuestra la validez de este enfoque por el hecho de que la suma de las concentraciones observadas para CA164_00725 y CA164_00726 está bien de acuerdo (dentro del error experimental) con la concentración observada para h-IgG total.

Usando este enfoque, se determinó la concentración total de h-IgG en las muestras de animales dosificados con CA164_00997, CA164_01125 y CA164_01151.

Globalmente, los datos obtenidos indican que la exposición de los cinco analitos de interés era similar para una dosis dada.

Grupos de estudio

Mareajes

ea ^Díasles _deComponentes de tratamiento ^anonimizadosTratamientos r _dosis

Grp Tratamiento Anti-toxina A Anti-toxina B

4 Tratamiento Vehículo PBS 5 ml/kg i.p. 3, -2, -1, 0

3

2 Vancomicina Vancomicina 5 mg/kg b.i.d.p.o. 1, 2, 3, 4■, 5

1 Tratamiento LD* de UCB 3, -2, -1, 0 CA997.g1_P3 CA1125.g2_P3 CA1151.g4_P3 1

5 mg/kgA5mg/kg i.p. 5 mg/kg 2,5 mg/kg 2,5 mg/kg 5 Tratamiento HD* de UCB 3, -2, -1, 0 CA997.g1_P3 CA1125.g2_P3 CA1151.g4_P3 4

50 mg/kgA50 mg/kg i.p. 50 mg/kg 25 mg/kg 25 mg/kg 6 Tratamiento LD* de competidor 3, -2, -1, 0 CA726_P3 CA725_P3

5

5 mg/kgA5 mg/kg i.p. 5 mg/kg 5 mg/kg

3 Tratamiento HD* de competidor 3, -2, -1, 0 CA726_P3 CA725_P3

2

50 mg/kgA50 mg/kg i.p. 50 mg/kg 50 mg/kg

Tabla 19

Tabla 20 El anticuerpo CA725 es el anticuerpo de la técnica anterior MDX1388. El anticuerpo CA726 es el anticuerpo de la técnica anterior CDA1 como se describe (15). Se presenta un compendio de estos datos en la Figura 72.

Referencias

1. Kuehne, S et al., "The role of toxin A and toxin B in Clostridium difficile Infection" Nature (2010) 467: 711-713 2. Davies AH et al., "Super toxins from a super bug: structure and function of Clostridium difficile toxins" Biochem. J (2011) 436: 517-526

3. Rothman, S et al., "Differential Cytotoxic Effects of Toxins A and B Isolated from Clostridium difficile" Infect. Imm. (1984) 46: 324-331.

4. Du, T y Alfa, MJ "Translocation of Clostridium difficile toxin B across polarized Caco-2 cell monolayers is enhanced by toxin A" Can J Infect Dis. (2004) 15: 83-88.

5. Kim, Iaconis y Rolfe. "Immunization of Adult Hamsters against Clostridium diffcile-Associated Ileocecitis and Transfer of Protection to Infant Hamsters" Infect. Imm. (1987) 55:2984-2992

6. Rupnik JCM (2003) 41: 1118-1125

7. Chaves-Olarte JBC (1999) 274: 11046-11052.

8. Lylerly, DM et al., "Passive Immunization of Hamsters against Disease Caused by Clostridium difficile by Use of Bovine Immunoglobulin G Concentrate" Infection and Immunity (1991) 59: 2215-2218.

9. Lylerly, DM et al., "Vaccination against Lethal Clostridium difficile Enterocolitis with a Nontoxic Recombinant Peptide of Toxin A" Current Microbiology (1990) 21: 29-32.

10. Lylerly, DM et al., "Characterization of Toxins A and B of Clostridium difficile with Monoclonal Antibodies" Infect. Imm. (1986) 54: 70-76.

11. Corthier et al., "Protection against Experimental Pseudomembranous Colitis in Gnotobiotic Mice by Use of Monoclonal Antibodies against Clostridium difficile Toxin A" Infect. Imm. (1991) 59: 1192-1195

12. Kink JA y Williams JA, "Antibodies to Recombinant Clostridium difficile Toxins A and B Are an Effective Treatment and Prevent Relapse of C. difficile-Associated Disease in a Hamster Model of Infection" Infect. Imm. (1998) 66: 2018 2025.

13. Ma D, et al., Progenics inc. Póster de ASM, 27 de mayo de 2010

14. Hansen, G y Demarest, SJ. WO 2006/0718877 A2

15. Babcock GJ, et al., "Human monoclonal antibodies directed against toxins A and B prevent Clostridium difficileinduced mortality in hamster" Infect. Imm.(2006) 74: 6339-6347.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo monoclonal neutralizante o fragmento de unión específico de TcdA, que comprende:

una cadena pesada que comprende una secuencia dada en la SEQ ID NO: 49, y

una cadena ligera que comprende una secuencia dada en la SEQ ID NO: 47.

2. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión según la reivindicación 1.

3. Una composición farmacéutica según la reivindicación 2 que comprende un anticuerpo monoclonal adicional o fragmento de unión del mismo específico de TcdA seleccionado independientemente de:

i) una cadena pesada en la que el dominio variable de la cadena pesada comprende una secuencia dada en la SEQ ID NO: 4 para CDR-H1, una secuencia dada en la SEQ ID NO: 5 para CDR-H2 y una secuencia dada en la SEQ ID NO: 6 para CDR-H3, y una cadena ligera, en la que el dominio variable de cadena ligera comprende una secuencia dada en la SEQ ID NO: 1 para CDR-L1, una secuencia dada en la SEQ ID NO: 2 para CDR-L2 y una secuencia dada en la SEQ ID NO: 3 para CDR-L3;

iii) una cadena pesada en la que el dominio variable de la cadena pesada comprende una secuencia dada en la SEQ iD NO: 54 para CDR-H1, una secuencia dada en la SEQ ID NO: 55 para CDR-H2 y una secuencia dada en la SEQ ID NO: 56 para CDR-H3, y una cadena ligera en la que el dominio variable de la cadena ligera comprende una secuencia dada en la SEQ ID n O: 51 para CDR-L1, una secuencia dada en la SEQ ID NO: 52 para CDR-L2 y una secuencia dada en la SEQ ID NO: 53 para CDR-L3.

4. Una composición farmacéutica según la reivindicación 2 o 3, que comprende un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión del mismo que se une específicamente a TcdB, que comprende una cadena pesada en la que el dominio variable de la cadena pesada comprende al menos una CDR que tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO: 124 para CDR-H1, una CDR que tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO: 125 para CDR-H2 y una CDR que tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO: 126 para CDR-H3, y una cadena ligera en la que el dominio variable de la cadena ligera comprende al menos una CDR que tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO: 121 para CDR-L1, una CDR que tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO: 122 para CDR-L2 y una CDR que tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO: 123 para CDR-L3.

5. Una composición farmacéutica según la reivindicación 4, que comprende un anticuerpo monoclonal que tiene una cadena pesada que comprende la secuencia dada en la SEQ ID NO: 129 y una cadena ligera que comprende la secuencia dada en la SEQ ID NO: 127.

6. Una composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 2 o 5, que comprende un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión del mismo que se une específicamente a TcdB, que comprende una cadena pesada en la que el dominio variable de la cadena pesada comprende al menos una CDR que tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO: 154 para CDR-H1, una CDR que tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO: 155 para CDR-H2 y una CDR que tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO: 156 para CDR-H3, y una cadena ligera en la que el dominio variable de la cadena ligera comprende al menos una CDR que tiene la secuencia dada en la SEQ ID No : 151 para CDR-L1, una CDR que tiene la secuencia dada en la SEQ iD NO: 152 para CDR-L2 y una CDR que tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO: 153 para CDR-L3.

7. Una composición farmacéutica según la reivindicación 6, que comprende un anticuerpo monoclonal que tiene una cadena pesada que comprende la secuencia dada en la SEQ ID NO: 159 y una cadena ligera que comprende la secuencia dada en la SEQ ID NO: 157.

8. Un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión según la reivindicación 1 o una composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7 para uso en tratamiento.

9. Un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión o composición farmacéutica para uso según la reivindicación 8, para el tratamiento o profilaxis de infección por Clostridium diffiále.

10. Un anticuerpo o fragmento de unión o composición farmacéutica para uso según la reivindicación 9 para uso en una terapia de combinación, que comprende además un compuesto seleccionado del grupo que comprende metronidazol, vancomicina, clindamicina, fidaxomicina y combinaciones de los mismos.