JP6095171B2 - 糸状菌から有用代謝産物を生産する方法 - Google Patents
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Description
[1] 糸状菌の生長を抑制することで、菌糸中の有用代謝産物の含有量を増加させる生長抑制工程を含む、有用代謝産物の生産方法。
[2] 生長抑制工程が、糸状菌に570nmより短い中心波長の光刺激を付与することで、該糸状菌の生長を抑制する、[1]に記載の有用代謝産物の生産方法。
[3] 糸状菌から有用代謝産物を抽出する工程を含む、[1]または[2]に記載の方法。
[4] 糸状菌が担子菌である、[1] 〜[3]のいずれか一項に記載の方法。
[5] 担子菌がヒラタケ属である、[4]に記載の方法。
[6] 光刺激が青色光の光刺激である、[2]〜 [5]のいずれか一項に記載の方法。
[7] 光刺激が、10μmolm−2s−1以上で照射される、[2]〜 [6]のいずれか一項に記載の方法。
[8] 光刺激が、断続的な照射で与えられる、[2] 〜[7]のいずれか一項に記載の方法。
[9] 有用代謝産物がシキミ酸である、[1]〜 [8]のいずれか一項に記載の方法。
[10] 有用代謝産物が抗腫瘍性物質である、[1]〜[8]のいずれか一項に記載の方法。
[11] [1]〜 [10]のいずれか一項に記載の方法で生産された、有用代謝産物。
光刺激は、単色可視光であることが好ましく、紫、青紫、青、青緑、緑および黄緑の可視光を包含し、好ましくは青色光であるが、近紫外線(例えば、UVAなど)であってもよい。また、光照射前に糸状菌の培養を行う培養工程を含めることもできる。光刺激を付与する際の糸状菌の状態はとくに限定されないが、菌糸体、子実体のいずれにも適用が可能であり、菌糸体を用いる場合には培養時間を短縮できる。
光量子束密度は、10μmolm−2s−1以上であることが望ましく、とくに限定されないが、10〜1000μmolm−2s−1とすることができ、好ましくは30〜500μmolm−2s−1、より好ましくは50〜200μmolm−2s−1であり、さらに好ましくは90〜120μmolm−2s−1である。
光照射装置としては、とくに限定されないが、単色可視光および近紫外線などの光刺激を発生する装置を用いることができる。例えば、LED光照射装置を使用することができる。
本発明の一態様において、本発明に係るシキミ酸の製造方法は、糸状菌の生長を抑制することで、菌糸中のシキミ酸含有量を増加させる生長抑制工程を備えることを特徴とする。
また、前記糸状菌が、菌糸体であることを特徴とする。
また、前記生長抑制工程は、前記糸状菌に光刺激を付与することで、該糸状菌の生長を抑制するものであることを特徴とする。
また、前記光刺激に用いられる光は、波長が570nmより短い光であることを特徴とする。
また、前記光刺激に用いられる光は、青色光であることを特徴とする。
また、前記生長抑制工程の前工程として、糸状菌の培養を行う培養工程を備えることを特徴とする。
本発明に係る抗腫瘍性物質の製造方法は、糸状菌から有用代謝産物を抽出する工程を含んでもよい。抽出物は、有機溶媒を用いて有機層および水層に分離する方法を用いてもよく、代謝産物の抽出溶媒は、とくに限定されることはないが、メタノール、水、クロロホルムおよびジクロロメタンなどを用いることができる。その他にも、酢酸メチル、酢酸エチルなどのエステル、アセトンなどのケトン、ジエチルエーテルなどのエーテル、キシレン、トルエン、ベンゼンなどの芳香族炭化水素、ヘキサンなどの脂肪族炭化水素などの有機溶媒、ならびにメタノール、エタノール、イソプロパノール、ブタノールなどのアルコールなどを組み合わせて使用してもよい。本発明の抗腫瘍性物質は、典型的には、有機層から多く抽出することができる。
(使用機器)
本実施例において植物育成装置として使用した機器は、CCS社製ELUX−1096LED植物育成装置である。本実施例においては、これを設定温度20℃に設定し、ヒラタケ中のシキミ酸の製造実験を行った。ヒラタケ菌糸に照射する光の光源としては、CCS社製のLED光源パネルISLシリーズ305×302を用いた。また、発光強度の測定には、LI−COR社製LI−250Light−Meterに、同社製のLI−190QuantumSensor、またはPPSystemInternational社製660/730nmSKR110Sensorを取り付けて使用した。
Pyrex(登録商標)ガラスシャーレ(内径90mm)内に調製した2.5%寒天濃度改変MA培地(組成:2%麦芽エキス、2%グルコース、0.1%ペプトン)の中央に、供試菌として準備した市販菌種のヒラタケKH―3株(株式会社千曲化成社製)を接種し、これを温度20℃に設定された暗所に設置して、培養を行った。この作業により、シャーレ内では、菌糸体コロニーが同心円状に生長するため、その外周部分から、コルクボーラーを用いて、直径約6mmのディスク状に切り出し、これを本実施例の接種源として用いた。
Pyrex(登録商標)ガラスシャーレ(内径90mm)内に調製した2.5%寒天濃度GPY培地(組成:5%グルコース、2.5%ポリペプトン、2.5%酵母エキス)の中央に、前記のとおりに準備した接種源を接種し、これを温度20℃に設定された暗所に設置して、培養を行った。本実施例における実験においては、直径が6mmまで生長したコロニーと、直径が20mmまで生長したコロニーをサンプルとして使用した。
菌糸体に照射する光の波長を変えて、菌糸の生長に及ぼす光波長の影響を確認する実験を行った。前記のとおりに用意したサンプルに、発光強度を95μmolm−2s−1に設定した青色、緑色、赤色、遠赤色の各波長の単色光を照射して、それぞれの菌糸体コロニーの生長を観察、比較した。生長変化の追跡は、約24時間ごとに菌糸体コロニーの直径の最大値および最小値を測定してその平均を求め、その値を菌糸体コロニーの生長量変化とする評価方法である。なお、各単色可視光の中心波長は、青色光470nm、緑色光525nm、赤色光660nm、遠赤色光735nmである。
菌糸体に照射する青色光の発光強度を変えて、光強度が菌糸の生長に及ぼす影響を確認する実験を行った。前記のとおりに用意したサンプルに、発光強度を6μmolm−2s−1、11μmolm−2s−1、26μmolm−2s−1、51μmolm−2s−1、および105μmolm−2s−1に設定した青色光を照射しながら1週間培養し、それぞれの菌糸体コロニーの生長を観察、比較した。評価方法は上記実験と同様である。
青色光照射と暗所保存を交互に繰り返す断続照射が、菌糸体コロニーの生長に及ぼす影響を評価する実験を行った。前記のとおりに用意したサンプルに、105μmolm−2s−1に設定した青色光を3日間照射して、その後3日間は暗所培養を行い、これを交互に21日間繰り返した。評価方法は上記実験と同様である。
上記の実験によって生長したヒラタケ菌糸中の、シキミ酸の含有量を評価するため、菌糸体含有代謝産物の抽出を行った。抽出方法は以下のとおりである。
I.菌糸体への青色光照射による生長抑制実験によって所定の大きさに生長した菌糸体コロニーのシャーレから、培地表面の菌糸体を、スクレーバー(住友ベークライト社製 スミロンMS−93100)(登録商標)を用いて採取した。本実施例では、コロニーの直径は60mmまで生長させた。
II.上記Iの工程で採取した試料50mgに、氷冷下で50μM内部標準物質を含むメタノール溶液500μLを加え、これを、卓上型破砕機(BMS社製 BMS−M10N21)を用いて、1500rpm、120秒×3回の条件で破砕した。
III.上記IIの工程で破砕した破砕溶液に、クロロホルム500μLと、Milli−Q水200μLとを添加し攪拌、混合し、これを2300×g、4℃、120分の条件で遠心分離を行った。
IV.上記IIIの工程で遠心分離した溶液のうち、水層を限外ろ過チューブ(MILLPORE社製 ウルトラフリーMC UFC3 LCC遠心式フィルターユニット5kD)に400μL×1本だけ移し取った。
V.上記IVの工程で移し取った溶液を、さらに9100×g、4℃、120分の条件で遠心分離を行い、限外ろ過を行った。
VI.上記Vの工程のろ液を乾固させ、これを再びMilli−Q水25μLに溶解して、これを生長実験で得られた菌糸体の評価用試料とした。
上記の方法によって準備された各試料について、含有するシキミ酸を定量解析した。解析に使用した機器には、キャピラリー電気泳動―飛行時間型質量分析計(AgilentTechnologies社製 AgilentCE−TOFMS System)を使用しており、これをアニオンモードに設定し、各試料の陰イオン性代謝物質の分析を行った。解析に使用した試料は、ヒラタケを暗所で培養したOM−1、OM−1と同様の開始試料に青色光を12時間照射したOM−2、同様に青色光を36時間照射したOM−3の3試料について解析を行った。
また、本発明に係る方法が、菌糸体中のシキミ酸含有量を増加させるのに有効であることが確認できる。
(培養条件および有機層成分の抽出方法)
実施例1に記載のシキミ酸の抽出方法と同様の方法を用い、有機層から有機層成分を抽出した。
得られた有機層成分について、癌細胞増殖への効果を検討した。
FBS(MP Biomedicals社製)を10%添加したRPMI培地(SIGMA社製)で、ヒト前立腺癌細胞PC−3(財団法人ヒューマンサイエンス振興財団より入手)を培養した。前記のとおりに調製した有機層成分を用いて、PC−3細胞の細胞増殖への影響を細胞数の顕微鏡観察によって解析した (図4)。
暗所(0h)および青色光(48h)照射条件下で培養した菌糸体から抽出した有機層成分をエタノール(EtOH)で溶解したものを、最終濃度が、0.2%(v/v)および2% (v/v)になるように培地に添加し、48時間培養後に細胞数を顕微鏡で観察した。
(1)試料の調製
培養したPC−3細胞を6wellプレート(NUNC(商標登録 MULTIDISH)で、各wellが50%になるまで培養した。これに、前記調製した有機層成分を用いて、半定量RT−PCRによる遺伝子発現解析を行った。エタノール(EtOH)で溶解した有機層成分を最終濃度が、0.2% (v/v)および2% (v/v)になるように培地に添加し、48時間培養後に半定量PCR解析を行った。
回収したRNAに100μLクロロホルムを添加して混合し、室温で2〜3分置いた後、遠心分離(13,000rpm 15分 4℃)を行い、上清を回収した。この上清に同量のイソプロパノールを添加し転倒混和して室温で10分置いた後、遠心分離(13,000rpm 10分 4℃)し、上清をデカンテーションした。
これに70%エタノールを添加してペレットを洗浄した後、遠心分離(13,000rpm 5分 4℃)し、上清をデカンテーションし、室温でペレットを乾燥した後、DEPC水を20μL添加して溶解したものを試料とした。
ReverTra Ace(登録商標)キット(TOYOBO社製)および2×GoTaq(登録商標)Green Master Mix(Promega社製)を用いて、RT−PCRを行った。
まず、上記(1)で調製した試料をDEPC水で250ng/μLに希釈した。これを用いて表2の組成としたものを、サーマルサイクラーで次の工程1〜3で処理し(工程1:30℃、10分間、工程2:42℃、60分間、工程3:95℃、5分間)、cDNA(complementary DNA)を合成した。
増幅したDNAをアガロースゲルで電気泳動し、臭化エチジウムで染色してE−Graph(ATTO)でゲルを撮影した。ImageJを用いて各バンドの蛍光強度を数値化することによって半定量分析を行なった。その結果、図5〜図7に示すように、c−myc(図6)およびSmad4(図7)遺伝子の発現は、暗所および青色光照射由来由来サンプルの添加によってはほとんど低下しなかったが、β−actin遺伝子の発現は、青色光照射サンプル(2% v/v)の添加で約25%抑制された(図5)。
定量RT−PCR法(リアルタイムPCR)
上記の逆転写反応によって得られたcDNAを1/100に希釈して鋳型として用いた。定量RT−PCRに用いた試薬の組成およびプライマーを、それぞれ表5および表6に示す。
図8に示すように、FABP5遺伝子の発現は、暗所および青色光照射由来由来サンプルの添加によって有意に低下したが、青色光照射サンプルの方がその効果は強く、青色光照射サンプル(2% v/v)の添加によってFABP5遺伝子の発現が約65%抑制され、青色光照射によって抗腫瘍性物質の生産量が増加することが示された。
Claims (13)
- 糸状菌を用いた有用代謝産物の生産方法であって、糸状菌に光刺激を付与することで生長を抑制する工程、および該糸状菌から有用代謝産物を抽出する工程を含み、有用代謝産物が、芳香族アミノ酸生合成経路の一次代謝産物および二次代謝産物である、前記方法。
- 光刺激が、570nmより短い中心波長の光刺激である、請求項1に記載の有用代謝産物の生産方法。
- 光刺激が、青色光の光刺激および/または11μmolm−2s−1以上の光量子束密度の光刺激である、請求項1または2に記載の方法。
- 光刺激が、断続的な照射で与えられる、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 抽出が、菌糸体の状態の糸状菌から行われる、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 糸状菌が、ヒラタケ(Pleurotus ostreatus)である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 光刺激が、芳香族アミノ酸生合成経路を遮断するものである、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 抽出が、有機溶媒および水を用いて水層および有機層に分離し、水層を収集することを含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 有用代謝産物が、シキミ酸である、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- シキミ酸を含む、糸状菌の水抽出物。
- 糸状菌を用いた有用代謝産物の生産方法であって、糸状菌に光刺激を付与することで生長を抑制する工程、および該糸状菌から有用代謝産物を抽出する工程を含み、有用代謝産物が、抗腫瘍性物質であり、抽出が、有機溶媒および水を用いて水層および有機層に分離し、有機層を収集することを含む、前記方法。
- 有用代謝産物が、FABP5発現抑制物質である、請求項11に記載の方法。
- 請求項11または12に記載の方法で生産された、有機溶媒抽出物。
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