JP5996026B2 - 薬理学的硝子体融解 - Google Patents
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Description
分解限定的消化によって一般に「Lys−プラスミノゲン」と呼ばれるタンパク質に変換される。ウロキナーゼまたはストレプトキナーゼなどのプラスミノゲンアクチベーターによるプラスミノゲンの活性化により、Arg561とVal562との間のペプチド結合が切断されてプラスミノゲン分子がプラスミンと呼ばれる二本鎖の酵素活性形態に変換される。プラスミンは、2つのポリペプチド、2つのジスルフィド結合によって軽B鎖に結合した重A鎖を含み、B鎖はセリンプロテアーゼ触媒ドメインを含む。プラスミンのセリンプロテアーゼ触媒活性は、in vivoでのその血餅溶解能力に関与する。
ミン酵素の精製および安定性試験を含む骨の折れる時間のかかるプロセスを必要とする。さらに、この手順はコストがかかり、且つ血液感染病原体の存在がこの手順をさらに複雑にし得る。また、プラスミンは非常に分解しやすいので、使用前に長期間保存することができない。さらなる欠点は、65,000ダルトンと83,000ダルトンとの間の範囲であるプラスミンの分子量の大きさである。従って、より小さな分子と比較して硝子体中の注射位置から硝子体網膜境界へのプラスミンのような高分子の拡散が妨げられる。
つのTPCDを含む第2の組成物を被験体に投与する工程を含む、眼の障害または眼の障害の合併症を治療または予防する方法を含む。本発明のこの態様の1つの実施形態では、硝子体液および/または房水との接触によって少なくとも1つのTPCDを含む第1の組成物および少なくとも1つのTPCDを含む第2の組成物を被験体に投与する。本発明のこの態様の別の実施形態では、少なくとも1つのTPCDを含む第1の組成物および少なくとも1つのTPCDを含む第2の組成物のTPCDは同一のTPCDである。本発明のこの態様のさらに別の実施形態では、少なくとも1つのTPCDを含む第1の組成物および少なくとも1つのTPCDを含む第2の組成物のTPCDは異なるTPCDである。本発明のこの態様のさらなる実施形態では、少なくとも1つのTPCDを含む第1の組成物および少なくとも1つのTPCDを含む第2の組成物のTPCDを、実質的に同時に被験体に投与する。さらに別の実施形態では、少なくとも1つのTPCDを含む第1の組成物および少なくとも1つのTPCDを含む第2の組成物のTPCDを、異なる時間で被験体に投与する。
「処置」は、任意の内科的疾患の任意の程度への軽減または改善を意味し、障害の完全な治癒が含まれるが、その必要はない。
Pharmaceutical Sciences(20th Edition,A.Gennaro(ed.),Lippincott,Williams & Wilkins,2000)に見出される。
タンパク質を意味する。このようなアミノ酸の欠失は、N末端(例えば、配列番号10のアミノ酸444〜791、543〜791、または562〜791からなるTPCDが得られる)および/またはC末端および/または配列番号10のアミノ酸79〜791の任意の内部の一部または位置に存在し得る。配列番号10由来の短縮タンパク質が酵素的に不活性な形態として作製された場合、プラスミノゲンアクチベーターを使用して短縮タンパク質の対応する活性形態に活性化しなければならないと理解すべきである。例えば、配列番号10のアミノ酸543〜791からなるタンパク質を組換えによって作製する場合、タンパク質はその酵素活性形態ではない可能性が非常に高い。したがって、Arg561とVal562との間のペプチド結合を切断してタンパク質を活性化するために、タンパク質をプラスミノゲンアクチベーターで処理すべきである。TPCDの非限定的な例には、ミニプラスミン、組換えミニプラスミン、安定化ミニプラスミン、安定化組換えミニプラスミン、ミニプラスミンの変異型、マイクロプラスミン、組換えマイクロプラスミン、安定化マイクロプラスミン、安定化組換えマイクロプラスミン、およびマイクロプラスミンの変異型(マイクロプラスミンおよびミニプラスミンの変異型はプラスミンの触媒ドメインを含む)が含まれる。
する。本発明のこの態様の別の実施形態では、硝子体の液化により、網膜外新血管形成が減少する。本発明のこの態様のさらに別の実施形態では、硝子体の液化により、硝子体液および/または房水に投与した薬剤または組成物の拡散が増加する。本発明のこの態様のさらなる実施形態では、硝子体の液化は、標準的な硝子体切除または25ゲージ(またはより小さな)硝子体切除中の硝子体の除去の一助となる。
位置に存在し得る。配列番号10(ヒトプラスミノゲン)のアミノ酸79〜791の短縮に起因するタンパク質が酵素的に不活性な形態で作製された場合、プラスミノゲンアクチベーターを使用してタンパク質をTPCDと見なされる活性形態に変換しなければならないと理解すべきである。プラスミノゲンアクチベーターは、Arg561とVal562との間のペプチド結合を切断して、タンパク質を活性化する。1つの実施形態では、TPCDには、本質的に配列番号10のアミノ酸444〜791からなるタンパク質が含まれる。別の実施形態では、TPCDには、得られたタンパク質がセリンプロテアーゼ触媒活性を有する、ヒトプラスミノゲンのアミノ酸444〜791中の1つまたは複数のアミノ酸が欠失したタンパク質が含まれる。別の実施形態では、TPCDには、本質的に配列番号10のアミノ酸543〜791からなるタンパク質が含まれる。さらに別の実施形態では、TPCDには、得られたタンパク質がセリンプロテアーゼ触媒活性を有する、ヒトプラスミノゲンのアミノ酸543〜791中の1つまたは複数のアミノ酸が欠失したタンパク質が含まれる。別の実施形態では、TPCDには、本質的に配列番号10のアミノ酸562〜791からなるタンパク質が含まれる。別の実施形態では、TPCDには、得られたタンパク質がセリンプロテアーゼ触媒活性を有する、ヒトプラスミノゲンのアミノ酸562〜791中の1つまたは複数のアミノ酸が欠失したタンパク質が含まれる。欠失は、N末端、C末端、または配列番号10(ヒトプラスミノゲン)のアミノ酸444〜791、543〜791、および562〜791の内部の位置に存在し得る。タンパク質中のアミノ酸の欠失方法は当業者に周知である(例えば、Current Protocols
in Molecular Biology,Ausubel et al.(eds.),John Wiley & Sons,2001;およびMolecular Cloning:A Laboratory Manual,Third Edition,Sambrook and Russell,2000)。呈色基質S2403(Chromogenix,Antwerp,Belgium)(実施例2を参照のこと)または任意の他の呈色基質を使用したTPCDのアミド分解活性の測定または当該分野で公知の任意の他の方法によってTPCDの触媒活性を決定することができる。
Biology,supra;およびMolecular Cloning:A Laboratory Manual,supraを参照のこと)。これらの修飾により、元のドメインの触媒活性を増加、減少、または変化しないままにできる。呈色基質S2403(Chromogenix,Antwerp,Belgium)(実施例2を参照のこと)または当該分野で公知の任意の他の方法を使用したTPCDのアミド分解活性の測定によって、修飾TPCDの触媒活性を決定することができる。
スミンおよびミニプラスミンと同一の触媒活性レベルを有さない場合でさえセリンプロテアーゼ触媒活性を有すると予想される。したがって、マイクロプラスミンおよびミニプラスミンの全変異型は、ヒトプラスミノゲンのプラスミンセリンプロテアーゼドメインの触媒三つ組み、すなわち、His603、Asp646、およびSer741を含む配列番号10のアミノ酸603〜741を含むことが必要である。1つの実施形態では、ミニプラスミンの変異型には、得られたタンパク質がセリンプロテアーゼ触媒活性を有する、ヒトプラスミノゲンのアミノ酸444〜791中の1つまたは複数のアミノ酸が欠失したタンパク質が含まれる。別の実施形態では、マイクロプラスミンの変異型には、得られたタンパク質がセリンプロテアーゼ触媒活性を有する、ヒトプラスミノゲンのアミノ酸543〜791中の1つまたは複数のアミノ酸が欠失したタンパク質が含まれる。さらに別の実施形態では、マイクロプラスミンの変異型には、得られたタンパク質がセリンプロテアーゼ触媒活性を有する、ヒトプラスミノゲンのアミノ酸562〜791中の1つまたは複数のアミノ酸が欠失したタンパク質が含まれる。欠失は、N末端、C末端、または配列番号10のアミノ酸444〜791、543〜791、および562〜791の内部の位置に存在し得るが、マイクロプラスミンおよびミニプラスミンの全変異型は、配列番号10のアミノ酸603〜741を含む必要がある。マイクロプラスミンおよびミニプラスミンの変異型には、これらのタンパク質のアミノ酸の挿入および/または置換が含まれるが、これらに限定されない。マイクロプラスミンまたはミニプラスミンのアミノ酸置換は好ましくは保存的置換であると想定される。マイクロプラスミンおよびミニプラスミンまたは任意の他のTPCDの変異型を、組換え法によって調製し、プラスミノゲンアクチベーターを使用して活性プラスミン形態に活性化することができる。あるいは、マイクロプラスミンおよびミニプラスミンまたは任意の他のTPCDの変異型を、当該分野で周知の任意の他の手段(ヒトプラスミノゲンのエラスターゼでの消化またはプラスミン、マイクロプラスミン、もしくはミニプラスミンの部分的還元およびアルキル化などであるが、これらに限定されない)によって調製することができる。マイクロプラスミン、ミニプラスミン、またはさらに言えば任意のTPCDのこれらの変異型を、呈色基質S2403または任意の他の呈色基質を使用してセリンプロテアーゼ触媒活性についてアッセイすることができる。さらに、マイクロプラスミン、ミニプラスミン、または任意の他のTPCDの変異型を、ブタ、ネコ、または死後ヒトの眼への異なる用量の変異型を含む任意の平衡塩類溶液の注射によってPVDを誘導する能力および/または硝子体液化能力について試験することができる。TPCDにより任意のこれらの眼のPVD誘導および/または硝子体液化が可能である場合、このTPCDを哺乳動物の眼の障害の治療に有用であると見なす。好ましくは、TPCDは、注射した眼に有毒ではない。マイクロプラスミン変異型の非限定的な例を、表1に示す。
以下に列挙したマイクロプラスミンの変異型は、アミノ酸1〜791からなるヒトプラスミノゲンのアミノ酸配列および番号に対応する(図1、配列番号10を参照のこと)。
、プラスミノゲンのフィブリンなどの基質への特異的結合を媒介するリジン結合部位を含む。プラスミノゲンのプロ酵素形態は、Arg561とVal562との間のペプチド結合の切断によってその酵素活性形態に活性化されて対応するタンパク質のジスルフィド結合二本鎖形態が得られる。プラスミノゲンタンパク質の活性化産物は、プラスミンと呼ばれる。したがって、Lys−プラスミノゲンの活性化産物はLys−プラスミンと呼ばれ、ミニプラスミノゲンおよびマイクロプラスミノゲンの活性化産物はそれぞれミニプラスミンおよびマイクロプラスミンと呼ばれる。Lys−プラスミンのその非グリコシル化形態の分子量は65,000であり、その完全にグリコシル化された形態の分子量は約83,000ダルトンであり、ミニプラスミンの分子量は約38,000であり、マイクロプラスミンの分子量は、還元形態で約26,500ダルトンであり、非還元形態で約29,000ダルトンである。プラスミンと同様に、ミニプラスミンおよびマイクロプラスミンは触媒活性を有する。プラスミンを超えるミニプラスミンおよびマイクロプラスミンの利点は、プラスミンと比較してそのサイズが小さいことである。したがって、マイクロプラスミンおよびミニプラスミンは共にプラスミンよりも硝子体中での拡散速度が速いと予想される(Xu,J.et al.,Pharmaceutical Research 17:664−669,2000)。
n Purification Methods:A Practical Approach,Harris,E.L.V and Angal,S.(eds.),IRL Press,1989;A Guide to Protein Isolation(Second Edition),Clive Dennison,Kluwer Academic Publications,2003;and Protein Methods(Second Edition),Daniel M.Bollag,Michael D.Rozycki,Stuart J.Edelstein(eds.),Wiley,1996を参照のこと)。
方法によって、硝子体液および/または房水をTPCDと接触させることができる。硝子体内移植可能デバイス(OCUSERT(登録商標)(Alza Corp.,Palo
Alto,Calif.)およびVITRASERT(登録商標)(Bausch and Lamb,Inc.,Rochester,N.Y.)が含まれるが、これらに限定されない)の移植によって、TPCDを含む組成物を投与することもできる。本発明は、TPCDが継続的に供給されるように、持続性製剤、徐放性処方物、または任意の移植可能なデバイスを使用して、硝子体液および/または房水をTPCDに接触させることができることも想定する。
血管形成薬(血管内皮成長因子(VEGF)インヒビター(例えば、抗VEGF抗体、VEGFアプタマー、可溶性VEGF受容体など)および胎盤成長因子(PlGF)インヒビター(例えば、抗PlGF抗体、PlGFアプタマー、可溶性VEGF受容体など)が含まれるが、これらに限定されない)が含まれる。これらのほとんどの第2の薬剤自体が、硝子体液化の促進および/または後部硝子体剥離の誘導が可能である。第2の抗血管形成薬は、眼の新血管形成の防止に有用であり得る。低酸素性網膜からのVEGFおよび/またはPIGFの発現により、網膜外新血管形成が起こり得る。したがって、VEGFおよび/またはPIGFの阻害は、新血管形成の防止に有効な方法である。
形態の基質を除去する硝子体の液化により新血管形成が遮断される。1つの実施形態では、本発明は、硝子体をTPCDを含む組成物と接触する工程を含む、網膜新血管形成の発症の防止または減少による眼の障害を治療または防止する方法を提供する。
ノゲンおよびヒトミニプラスミノゲンの発現のためのベクター構築
(a)pPICZαAベクター
InvitorogenCorporation(Carlsbad,California)から購入したpPICZαA分泌ベクターを使用して、ピキア・パストリス中での組換えヒトマイクロプラスミノゲンおよびミニプラスミノゲンの発現および分泌を行った。このベクターの顕著な特徴には、(i)ピキア属において組換えタンパク質のメタノール誘導性高レベル発現が可能なアルコールオキシダーゼ1(AOX1)プロモーターを含む942bpフラグメントおよびAOX1染色体遺伝子座へのプラスミド組み込みのターゲティング;(ii)天然の転写終結およびAOX1遺伝子由来のポリアデニル化シグナル;(iii)大腸菌(Escherichia.coli)およびピキア・パストリスにゼオシン耐性を付与する発現カセット、(iv)大腸菌中でのプラスミドの増殖および維持のためのColE1複製起点、(v)タンパク質の検出および精製に使用することができるc−mycエピトープおよびポリヒスチジン(6×His)タグ、および(vi)ピキアゲノムへの有効な組み込みのためにAOX1遺伝子座でベクターを線状化可能な固有の制限部位(例えば、SacI、PmeI、BstXI)が含まれる。
CZ中でのα因子接合シグナル配列のプロセシングは以下の2工程で起こる。
Clontech(Palo Alto,California)から市販されているAdvantage cDNAポリメラーゼミックスを使用して、ヒトマイクロプラスミノゲンタンパク質(アミノ酸543〜791(配列番号4))をコードする核酸配列を、ベクターFmyc−pPliから増幅した(PCRレスキュー)(Lasters et
al.in Eur.J.Biochem.244:946,1997)。94℃で3分間のDNAテンプレートの分解後、30ラウンドの熱サイクリングを行い(94℃で30秒間、50℃で30秒間、72℃で30秒間)、その後72℃で2分間の最終伸長を行った。以下のオリゴヌクレオチドプライマーLY−MPLG1(センス)およびLY−MPLG2(アンチセンス)を本反応で使用した:
LY−MPLG1:5’GGGGTATCT CTC GAG AAA AGA GCC CCT TCA TTT GAT TG(配列番号1)
LY−MPLG2:5’GTTTTTGT TCT AGA TTA ATT ATT TCT CAT CAC TCC CTC(配列番号2)。
で形質転換し、ゼオソン耐性クローンを選択した。制限分析に基づいて、予想サイズのインサートを含むプラスミドクローンをさらなる特徴付けのために保持した。Invitrogen Corporation(Carlsbad,California)のEasySelectピキア発現キットに含まれるプライマー5’AOXおよび3’AOXを使用したベクターpPICZα−MPLG1(クローン番号5)の配列決定により、α因子接合シグナルに融合したマイクロプラスミノゲンコード領域の正確な挿入およびコード領域中の望ましくない変異の不在を確認した。
上記pPICZα−MPLG1ベクターを使用して、ミニプラスミノゲンの発現のためのpPICZα由来の分泌ベクターを以下のように構築した。
LY−MINPLG1:5’GGGGTATCT CTC GAG AAA AGA GCA CCT CCG CCT GTT GTC CTG CTT CC(配列番号5)LY−MINPLG2:5’GCA GTG GGC TGC AGT CAA CAC
CCA CTC(配列番号6)。
特徴付けのために保持した。プライマー5’AOXおよび3’AOXを使用したベクターpPICZα−KMPLG1(クローン番号3)の配列決定により、α因子接合シグナルに融合した増幅フラグメントの正確な挿入およびコード領域中にいかなる変異も存在しないことを確認した。
(a)pPICZα−MPLG1でのピキア属の形質転換。10μgのベクターpPICZα−MPLG1を、5’AOX1領域中でベクターを線状化するPmeIで消化した。DNAを沈殿させ、滅菌蒸留水中に0.33μg/μlに濃縮し、5μlを使用してEasySelectPichia発現キットに含まれるマニュアルにしたがって調製したコンピテントピキア・パストリスX33細胞を形質転換した。
高発現株の選択を以下のように行った。ゼオシン耐性形質転換体を、YPDSZプレート(1%酵母抽出物、2%ペプトン、2%グルコース、1Mソルビトール、2%寒天、100μg/mlゼオシン)上で選択した。34個の単一コロニーを、10ml BMYZ−グリセロール培地(1%酵母抽出物、2%ペプトン、1%グリセロール、100mMリン酸カリウム(pH6.0)、1.34%酵母窒素塩基、4×10−5%ビオチン、100μg/mlゼオシン)を含む50ml Falconチューブ中でインキュベートし、30℃で16時間培養した。細胞をペレット化し、AOX1プロモーター由来の発現を誘導するために、2mlのBMYZ─メタノール培地(BMYZ−グリセロールと同一であるが、グリセロールの代わりに0.5%メタノールを含む)中に再懸濁し、40時間培養した。この期間中(6、22、26、および30時間後)に培養物に4パルスの0.5%メタノールを供給した。インキュベーション培養後、培養上清中のマイクロプラスミノゲンの存在を、Lijnen et al.in Eur.J.Brochent.120:149,1981に記載のように評価した。簡単に述べれば、無希釈または10倍希釈の上清中のマイクロプラスミノゲンを、ウロキナーゼと30分間インキュベートして、マイクロプラスミノゲンをマイクロプラスミンに活性化した。異なる時間の呈色基質S2403(Chromogenix,Antwerp,Belgium)によって決定されたそのアミド分解活性によって決定された、得られたマイクロプラスミン活性を、既知量の精製プラスミンまたはマイクロプラスミン調製物の活性と比較した。その後の大量産生のために、ウロキナーゼ活性化後に高マイクロプラスミン活性を示すクローンX33−MPLG1番号5を選択した。2001年12月12日にブダペスト条約の条項にしたがってこのクローンをBelgian Coordinated Collections of Microorganisms(BCCM−MUCL−COLLECTION)に寄託し、アクセッション番号MUCL43676で受託された。
以下の4つの工程で50リットル規模のX33−MPLG1番号5の発酵を行った。0.7mlの接種物(細胞バンクウイルス番号グリセロールOOC17)を使用して、400mlYSG+(6g/lの酵母抽出物、5g/lのダイズペプトン、20g/lのグリセロール)中にて、270rpmで震盪しながら2リットルフラスコでの細胞培養を30℃で23時間行い、OD600 15を得た(予備培養工程後)。次いで、600mlの接種物を使用して、大気圧で50l/分通気し、溶存酸素(DO)が20%超であり、200〜500rpmで震盪し、12.5%アンモニアでpH5.8に維持した30l基本培地(26.7ml/lの85%H3PO4、1.05g/1 CaSO4・2H2O、18.2g/l K2SO4、、14.9g/l MgSO4・7H2O、4.13g/l KOH、40g/l100%グリセロールならびに4.76ml/l PTM1塩溶液(6g/l CuSO4・5H2O、0.08g/l NaI、3.36g/l Mn
SO4・H2O、0.2g/l NaMoO4・2H2O、0.02g/lホウ酸、0.82g/l CoCl2・6H2O、20g/l ZnC12、65g/l FeSO4・7H2O、0.2g/l d−ビオチン、および5ml/l HSSO4を含む))を含むMRP80発酵デバイス中にて30℃で発酵させた。24時間後且つ50のOD600後(バッチ工程後)、溶存酸素の急速な増加によってグリセロールの枯渇が証明された。グリセロール供給(632g/lの100%グリセロールおよび12ml/PTM1)により、24時間でOD600が258まで増加した。次いで、6時間以内に250ml/時間まで流速を増加させてメタノールを供給し、988ml/lメタノールおよび12ml/l PTM1を使用して66時間維持し、培養終了時にOD600が325に達した。350リットル規模のX33−MPLG1番号5の発酵により、比例的に類似の結果が得られた。
次いで、回収物を、陽イオン交換流動層クロマトグラフィ、疎水性クロマトグラフィ、およびアフィニティクロマトグラフィを含む3工程プロセスで精製する。
Biotechnology,Cat.No.17−0993−01/02にて利用可能)を使用して陽イオン交換流動層吸着クロマトグラフィを行った。発酵ブロスを水でオンライン式にて希釈し(7倍)、流速1000ml/分で層流ベッドを上方へ通過させた。弱く結合した物質を、25mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)の上昇流で洗浄した。次いで、カラムアダプターを高さ16.3cmの沈殿ベッド表面まで低下させた。逆流させ、捕捉タンパク質を2カラム体積の0.5M NaCl、25mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)で溶離した。固体硫酸アンモニウムを、30%飽和に達するまで溶離Stremline画分に添加し(溶離Streamline画分1リットルあたり164gの硫酸アンモニウム)、混合物を4〜8℃で1時間ゆっくりと撹拌した。
−20℃で凍結保存した。SDSゲル電気泳動によって証明したところ、物質の純度は98%超であった。
i)定量的活性化。0.5%のスタフィロキナーゼ変異型SY162を含む0.5MNaCl、25mMリン酸一水素二ナトリウム(Na2HPO4・12H2O)緩衝液(pH7.0)のモル比で23℃で30分間マイクロプラスミノゲンのマイクロプラスミンへの活性化を行った。WO99/40198に記載のように、SY162は、野生型と比較して、12アミノ酸置換(K35A、E65Q、K74R、E80A、D82A、T90A、E99D、T101S、E108A、K109A、K130T、およびK135R)を含む免疫原性が減少したスタフィロキナーゼ変異型である。最終濃度1M(132g/l)までマイクロプラスミンに固体硫酸アンモニウムを添加し、混合物を4〜8℃で15分間撹拌した。
7.0)でマイクロプラスミンをカラムから溶離し、0.1Mトラネキサム酸を含むリン酸緩衝化生理食塩水で平衡化した。0.1Mトラネキサム酸を含む25mM Na2HPO4・12H2O緩衝液(pH7.0)でカラムからスタフィロキナーゼ変異型SY162を溶離した。特異的ELISAアッセイで証明されるように、この手順により、マイクロプラスミンピークから99%超のスタフィロキナーゼを除去した。
Process Holderにマウントした。メンブレンを精製水で洗浄し、操作前にメンブレンの完全性を試験した。0.5M NaOHで60分間および0.1M NaOHで60分間の連続的再循環によって浄化した。浄化工程によってメンブレンが深部まで浄化されて、サンプルの適用前にメンブレン上に残存するいかなる潜在的な微量タンパク質も除去する。次いで、通過物のpHが3.1に達するまで、メンブレンを5mMのクエン酸(pH3.1)でリンスした。Phenyl Sepharose溶離物のpHを、3.1に調整し、限外濾過によってタンパク質を4mg/mlに濃縮した。5倍体積の
5mMクエン酸(pH3.1)に対して60〜90分間ダイアフィルトレーションを行った。50リットルの発酵装置で実施した3つの運転の収量(gで示す)を、表2にまとめる。
20μlの反応物中の約15μgのベクターpPICZα−MPLG1を、5’AOX1領域中でベクターを線状化するPmeIで消化する。線状DNA(3μg)を使用して、EasySelectPichia発現キットに含まれるマニュアルにしたがって調製したコンピテントピキア・パストリスX33細胞を形質転換した。
ペスト条約の条項にしたがってこれら2つのクローンをBelgian Coordinated Collections of Microorganisms(BCCM−MUCL−COLLECTION)に寄託し、アクセッション番号MUCL45309(クローンX33−KMPLG1番号6)およびアクセッション番号MUCL45308(クローンX33−KMPLG1番号25)で受託された。
正常なブタ眼における後部硝子体剥離(PVD)に対する培地および異なる薬剤の効果を調査するための信頼のおける固定技術を確立するために、本実験を行った。
網膜表面の内境界膜から後部硝子体皮質を解離するマイクロプラスミンの能力を決定するために、本実験を行った。
は、網膜の構造変化は認められなかった。しかし、0.25mgのマイクロプラスミンで処置したいくつかの眼では、網膜の隆起および少数の炎症細胞が網膜表面上に疎らに分布していた。最も高い用量のマイクロプラスミン(0.390mg)で処置した眼の肉眼的組織学は、網膜境界が白っぽい外観を有することを示した。この眼の電子顕微鏡法により、局在化網膜剥離が示唆される網膜表面の複数の小さな隆起が存在することが明らかとなった。
マイクロプラスミンがヒト眼の硝子体網膜分離を有効に誘導することができるかどうかを決定するために本実験を行った。
(a)ヒト死後の眼の投与および処置
眼の疾患が認められていない26個のヒトの眼球を、Munichアイバンクから得た。これらの眼球を、死後19時間以内に34〜69歳の範囲の13人のドナーから取り出した。直径14mmのトレフィンを使用した角膜の回収後、26個の眼球を37℃の湿室で15分間インキュベートした。次いで、0.2mlのマイクロプラスミンを、13個の眼の硝子体腔に注射した。詳細には、1.25mgのマイクロプラスミンを、それぞれ4ml、2ml、または1.5mlの眼内灌流溶液BBSPLUS(登録商標)にて0.3125mg/ml、0.625mg/ml、および0.9375mg/mlの濃度に希釈した。総体積が0.2mlのこれらの溶液を硝子体腔に注射し、眼内の最終マイクロプラスミン用量をそれぞれ62.5μg、125μg、および188μgとした。コントロールとして使用した13個の他方の眼に、0.2mlの平衡塩類溶液(BSSPLUS(登録商標))を注射した。
次いで、眼球を、扁平部に沿って二等分し、前部を破棄した。直径12.5mmの角膜トレフィンを硝子体を通過してゆっくり移動させ、後極を打ち抜いた。次いで、走査型および透過型電子顕微鏡法のための網膜試料を、直径4mmの角膜トレフィンを使用して後極から得た。
(a)走査型電子顕微鏡
62.5μgのマイクロプラスミンを注射した死後ヒトの眼の走査型電子顕微鏡法(SEM)により、ILMに覆われた不連続なコラーゲン原線維網が遊離した後部硝子体剥離が明らかとなった(図6、パネルA)。125μg(図6、パネルB)および188μg(図6、パネルC)のマイクロプラスミンをそれぞれ注射した眼のSEMにより、完全な硝子体網膜分離と一致する露呈したILMが明らかとなった。これらの両方のより高い用量により、硝子体網膜境界の類似の超微細構造が得られた。
全てのマイクロプラスミン処置眼の網膜内の形態学的性質は、コントロール眼と比較して変化しなかった。ILMの超微細構造は、コントロール眼(図7、パネルB)と比較してマイクロプラスミン処置眼(図7、パネルA)で十分に保存された。
これらのデータは、マイクロプラスミンの硝子体内注射によって、硝子体切除または任意の他の手術介入を行うことなくヒトの眼の硝子体皮質と内境界膜との間の切断を誘導することができることを示す。125μgのマイクロプラスミンにより、30分以内にヒト硝子体網膜接合部(junction)が切断される。酵素作用に関して、125μgのマイクロプラスミンは、2Uのプラスミン(Sigma−Aldrich,Munich,ドイツ)と同用量であり、ブタ死体眼およびヒトドナー眼において完全な硝子体網膜分離を引き起こす。これらのデータはまた、マイクロプラスミン処置眼の硝子体への気泡の適用は硝子体網膜接合部の切断に必要な用量に影響を与えなかったことを示す。
これらの実験の目的は、in vivoでのPVDに対するマクロプラスミンの有用性を決定することであった。
(a)ネコモデル
解剖学者および生理学者によってネコ網膜は広く研究されており、薬理学的誘導PVD
の安全性の評価に有用なモデルとなる。ヒト網膜と同様に、ネコ網膜は桿体細胞に支配されており、眼窩外側の網膜内循環を有する。これは、網膜内血管を有さないウサギと対照的である。ウサギ内部網膜は硝子体表面上に存在する脈管構造によって灌流しており、これはウサギの硝子体網膜境界に主に注目する実証研究の価値を制限する。何年もの間、ネコモデルから網膜の剥離に対する細胞応答に関する高品質のデータが得られている。したがって、本発明者らは、in vivoでのPVDの実施におけるマイクロプラスミンの有用性の研究にネコモデルを使用した。
実施例6のヒト死後眼について記載のように、屠殺したネコから眼球を取出し、固定し、電子顕微鏡法のために処理した。2人の観察者が個別に電子顕微鏡写真を評価した。各観察者は、ILMに覆われたコラーゲン原線維網が連続または不連続のいずれであるか、コラーゲン原線維がILMに単独または疎らに存在するかどうか、またはILMがいかなるコラーゲン原線維を欠くかどうかの決定によって硝子体網膜分離の程度を評価した。
眼の試料を、リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)でリンスし、PBS中で調製した5%アガロース(Sigma,St Louis MO,アメリカ)で泳動した。厚さ100μmの切片を、ビブラトーム(Technical Products International,Polysciences,Warrington,PA,アメリカ)を使用して切断し、0.5%ウシ血清アルブミン(BSA;Fisher Scientific,Pittsburgh,PA,アメリカ)、0.1%Triton X−100(Roche Boehringer,Mannheim,ドイツ)、および0.1%アジ化ナトリウム(Sigma−Aldrich,Munich,ドイツ)を含む正常なロバ血清(20倍;Dianova,Hamburg,ドイツ)を含むPBS(BSA、Triton、およびアジドを含むこのPBS溶液を、PBTAという)中で回転させながら4℃で一晩インキュベートした。ブロッキング血清の除去後、以下の6セットの対に一次抗体を添加した:抗グリア線維性酸性タンパク質(GFAP;500倍;DAKO,Hamburg,ドイツ)と抗IV型コラーゲン(50倍;DAKO)との対;抗ビメンチン(50倍;DAKO)と抗フィブロネクチン(400倍;DAKO)との対;抗シナプトフィジン(50倍;DAKO)と抗神経フィラメント(25倍;DAKO)との対;抗ラミニン(25倍;DAKO)と抗CD68(50倍;DAKO)との対;抗赤色/緑色オプシン(100倍;Santa Cruz Biotechnology,アメリカ)と抗ロドプシン(200倍;Santa Cruz Biotech)との対;抗青色オプシン(100倍;Santa Cruz Biotech,Santa Cruz,CA,アメリカ)と抗ロドプシン(200倍;Santa Cruz Biotech)との対。この実験で使用した抗体の特異性を表5に列挙する。
(a)走査型電子顕微鏡法
25μgマイクロプラスミンの硝子体内注射の1日後、疎らなコラーゲン原線維がILMを覆った(図8、パネルA)。治療3日後、25μgマイクロプラスミンにより完全な硝子体網膜分離が認められた(図8、パネルB);硝子体網膜境界上に残存するコラーゲン原線維の断片は存在しなかった。14.5μgのマイクロプラスミンを投与した眼は、注射3日後にILMを覆う疎らなコラーゲン原線維が明らかであった(図8、パネルC)。処置21日後、14.5μg(図8、パネルD)および25μgのマイクロプラスミン(図8、パネルE)では、露呈したILMが認められた。全ての他方のコントロール眼は、網膜を覆った密集したコラーゲン原線維網が認められた(図8、パネルF)。これらのデータを、表6にまとめる。
網膜の細胞構築に関して、マイクロプラスミン処置眼(図9、パネルA)とコントロール眼(図9、パネルB)との間に相違は認められなかった。マイクロプラスミン処置眼の内部網膜およびILMの超微細構造(図9、パネルCおよびE)は、コントロール眼の内部網膜およびILM(図9、パネルDおよびF)と比較して十分に保存されていた。
マイクロプラスミン処置眼およびコントロール眼では、ミューラー細胞の末端部分は、抗GFAP(図10、パネルAおよびB)および抗ビメンチン(図10、パネルCおよびD)で明白に標識された。内顆粒層上のミューラー細胞プロセスの広範な染色は存在しなかった。抗IV型コラーゲンおよび抗フィブロネクチンを使用して有意な染色は認められなかった(データ示さず)。これは、これらの抗体の種特異性に関し得る。ILMは、抗ラミニンによって染色された。処置眼およびコントロール眼の両方でマクロファージはほとんど存在しなかった。神経節細胞の軸索および樹状突起、水平細胞、ならびに内網状層および外網状層は、抗神経フィラメントおよび抗シナプトフィジンによって明白に標識された(図10、パネルEおよびF)。光受容細胞層は、抗神経フィラメントによって標識された。任意の使用抗体に関して、いかなる研究の測定点においてもマイクロプラスミン処置眼(パネルA、C、E)とコントロール眼(図10、パネルB、D、およびF)との間に相違は存在しなかった。
in vivoでの硝子体網膜境界におけるマイクロプラスミンの除去効果を評価するために、2つの異なる用量を5頭の成体ネコの硝子体腔に投与した。第1の使用用量は、ヒト死後眼における完全なPVDの誘導に十分であることが見出された用量の1/5である25μgのマイクロプラスミンであった。明らかに、25μgのマイクロプラスミンは0.4Uのプラスミン(Sigma)に等価であり、臨床的に0.4Uの自己プラスミンを黄斑円孔および糖尿病網膜症を罹患したヒトの眼の硝子体腔に適用した。ネコの眼のより小さな硝子体体積のために調整する場合(ヒト眼の硝子体体積の約60%)、第2の用量である14.5μgのマイクロプラスミンは、ヒト眼において25μgのマイクロプラスミンの用量に等価である。
ゲン原線維が依然として存在していた。これは、マイクロプラスミンの効果が24時間を超えて継続し、その天然のアゴニストであるα−2−抗プラスミンによる血中プラスミノゲンの急速な不活化と非常に対照的であることを示す。マイクロプラスミン活性の寿命についての1つの理由は、α−2−抗プラスミンが別の基質によって飽和するかマイクロプラスミンがプラスミンと比較して抗プラスミンアンタゴニストに対する親和性が異なることであり得る。別の可能性のある理由は、α−2−抗プラスミンによってマイクロプラスミンが不活化された後にマイクロプラスミンの経路の下流(例えば、コラゲナーゼまたは基質金属プロテイナーゼの活性化)が活性なままであることであり得る。
非浸襲性動的光散乱(DLS)技術を使用したin vivoおよびin situでの新鮮な死後ブタ網膜に対するμPiの生物物理学的効果を特徴づけるためのマイクロプラスミン(μPi)の効果を評価するために、本研究を行った。DLSにより、散乱光の強度における時間関数測定によって溶液および懸濁液中の粒子および高分子の力学に関する情報が得られる。
scattering:Basic prinicples and practice,Academic Press,New York,1991を参照のこと)。この斑点パターンは、光路中の干渉の結果であり、これは、散乱媒質中の粒子が、粒子自体と
流動物の分子との間の衝突に起因する1μ秒以上のタイムスケールで無作為に運動する(ブラウン運動)につれて変動する。粒子−粒子相互作用の非存在下で(希釈懸濁液)、小粒子から散乱した光が急速に変動し、大粒子から散乱した光はより遅く変動する。
(a)硝子体研究のためのDLS装置の組み立て
本明細書中に記載の硝子体研究のために新規の小型DLS光ファイバープローブ(米国特許第5,973,779号)を組み立てた。これは、1対の0.25ピッチのSelfocGRINレンズから構成され、侵入度が〜16mmであり、散乱角が160°である。2つの単一モードの光ファイバーおよび2つのGRINレンズを含む光ファイバープローブにより、眼における高分子の力学的特徴の研究のための小型のリモコン手段が得られる。それぞれステンレススチール性フェルールに格納された2つの単一モードの光ファイバーを個別のステンレススチールハウジングにマウントする。散乱体積中の強く集中した点を得るためにファイバーハウジングとレンズハウジングとの間に意図的に空気ガスを残す。そのハウジング中の2つの光ファイバーを整列させ、マイクロレンズと軸外の位置に固定する。2つのハウジングを、ステンレススチール製の第3の(外側の)ハウジングの内側に入れ、ハウジングの後部を熱収縮チューブで覆う。レーザーおよび光検出器モジュールとの容易な合わせのために、光ファイバーの2つの自由端をEC/PC型オス・コネクタで終端処理を行った。
DLSは、溶液(この場合、硝子体)中に懸濁する粒子の平均直径を非侵襲性で客観的に定量することができる。粒子サイズを正確に計算するために、溶媒の粘度を知るか推測することが必要である。前に記載のように、現在非ニュートン流体の粘度を正確に測定することができないので、仮定しなければならない。硝子体が約99%の水を含む場合、硝子体の粘度を水の粘度とすることが妥当である。この仮定の妥当性を試験するために、全硝子体ゲル、濾過器を通過しない硝子体の亜分画(ゲル)、濾過器を通過する硝子体の亜画分(非ゲル)、および0.22μm Milliporeフィルターを通過した硝子体の亜画分(液体硝子体)についてDLSを測定した。光学キュベット中でこれらの研究を行い、極めて均一な既知の直径の拡散20nmポリスチレンナノスフェアをトレーサーとして添加した。全硝子体および全ての異なる亜画分におけるDLS測定により、硝子体の微小粘度(microviscosity)が実際に純粋のそれに非常に近いことを示す類似の結果が得られた。硝子体の微小粘度は、ヒアルロナン(HA)分子およびコラーゲン線維束が懸濁した捕捉された水の粘度をいう。HA分子のブラウン運動は、HA分子と比較してわずかにサイズが大きいコラーゲン線維束よりもはるかに速い。DLSスペクトルでは、HA分子情報をより速い(短い)遅延時間で組み込み、コラーゲンはより遅い(長い)遅延時間で組み込む。得られた情報を、粒子サイズ分布に示す。
BSSPLUS(登録商標)(ALCON Labs,Ft.Worth,TX)を使用して全ての溶液を調製した。マイクロプラスミンを、4mg/mlストック溶液の濃度で使用した。直径20nmであり且つ二重蒸留脱イオン水に懸濁したポリスチレンナノスフェア(Bangs Laboratories,Fishers,IN)を、全サンプル中のナノスフェア数が確実に一定になる固定比で全サンプル中に添加した。
新鮮な非固定ブタ眼(n=11)を、扁平面切開を介して後部セグメントを切開し、前部硝子体から離れてレンズ/虹彩絞りを鋭く切開した。この組織を切開することなくできるだけ水晶体後面の近くに切片を運んだ。眼を、以下の後部セグメントと共にホルダーに維持した。
インタクトなブタ眼(n=39)の扁平部での穿刺切開を介して30Gニードルを使用して、ポリスチレンナノスフェアおよび0.0125、0.0025、0.05、0.125、0.25、0.5、0.6、および0.8mgのμPiを含む300μLの実験溶液およびコントロール溶液を注射した。眼を、角膜を上にし且つ後部を下にして(仰臥位の模倣)保持したホルダー中にて37℃で30分間または120分間インキュベートした。眼を温度制御水浴中に入れる前(常に試料と水との間のいかなる接触も回避する)およ
びその後15分毎に、眼をほぼ光軸に対して10〜15秒間回転させた。インキュベーション後、扁平部切開を介して眼の前部を切開した。硝子体/空気境界の後ろの深さ4mmの光軸(平均=18.6、s.d.=11.8)および水平軸(平均=30.8ポイント、d.d.=18.0)に沿ったいくつかのポイントでDLSを行った。
(a)ブタ硝子体の分子形態学
アイカップ(eye cup)(前部を切開して除去したもの)の光軸に沿った複数のポイントから得た全(インタクトな)硝子体のDLS測定により、空気−硝子体境界の1.25mm〜4.75mm下の全てのポイントで非常に類似した所見が証明された。これらの所見はまた、キュベットに入れた切開した全硝子体、濾過後に保持された残存硝子体、および濾過器を通過した硝子体の亜画分で得られた所見と類似している。全てほぼ同一の粒子サイズ分布を示した。より大きな粒子サイズの群(右側)の平均サイズは約1000nmであり、主にコラーゲンを示す。より小さな粒子サイズ分布(左側)は主にヒアルロナン(HA)を示す。この粒子サイズ分布パターンは、ポリスチレンナノスフェア注射を受けた眼で同一であった。
図12は、比較のために、5つの異なるブタ眼中の空気/硝子体境界から4mm下のポイントおよび20nmポリスチレンナノスフェア溶液から得たTCFを示す。μPi用量が増加するにつれて遅い成分(より大きな分子種)の消滅と共にTCFの勾配が減少し、最終的に20nmナノスフェアのみ(すなわち、全てがより小さいサイズの分子種)のTCFに近づくことが認められる。
0.0125〜0.8mgの用量範囲のμPiとの37℃で30分間のインキュベーション後、光軸および水平軸の両方に沿って有意な変化は存在しなかった。光軸では、最も高用量の0.8mgで正規化平均粒子サイズは1/7に減少した。0.125mgの用量では、30分後に正規化平均粒子サイズは約1/3に減少した。最も低用量の0.0125mgではいかなる有意な効果も認められないようであった。全範囲の用量と通して、粒子サイズの減少はμPiの用量に反比例した(相関係数=0.93)。データを、線形(直線)フィッティングルーチンに適合させた。正規化全強度および多分散性プロットにより、このデータの信頼性がされに支持される。粒子サイズ分散は、漸増用量のμPiを使用して、粒子サイズ分布の左側への有意なシフトを証明する。これにより、μPiは、種々の化学結合の有意な脆弱化および破壊ならびに硝子体高分子構造の溶解に有効であることが示唆される。
この実験では、DLSを使用して、粒子サイズ、散乱強度、および多分散性の測定によって硝子体の分子構造を非浸襲的に評価した。結果は、全硝子体内の硝子体の位置において類似のDLSプロフィールが認められることを示した。マイクロプラスミンの最も顕著な効果は、特により高い用量で37℃で30分間インキュベートした全硝子体に対する効果であった。正規化平均粒子サイズが実質的に減少し、統計的に有意な用量−応答関係が確立された。これにより、現在の手術実施を妨害しない薬物効果に30分の時間枠が妥当であるので、μPiが硝子体−網膜手術のためのアジュバントとして有用であることが示唆される。μPiが硝子体−網膜境界の裂開を誘導することが示唆される前の実施例のデータと組み合わせて、この薬物は、以下の2つの薬理学的硝子体融解の所望の成分が達成されるようである:後部硝子体剥離および硝子体高分子の破壊、ならびにその後の硝子体の拡散係数の増加および最終的な液化。
外科的硝子体切除を必要とする硝子体網膜疾患を示す患者を、外科的硝子体切除手順の前にマイクロプラスミン注射で処置する。患者は、眼の健康のベースラインを確立するために全眼科試験を受けるべきである。眼科試験には、間接的検眼鏡検査、スリットランプ生体顕微鏡法、網膜周辺部試験、眼圧測定、視力(裸眼視力および矯正視力)、徴候学、眼底撮影法、フルオレセイン血管造影法、網膜電図写真、およびAスキャン測定が含まれる。
ることもできる。
本実施例では、糖尿病性網膜症を発症した糖尿病患者を、マイクロプラスミンの硝子体内注射によって処置する。
マイクロプラスミンは、全長プラスミンの分子量の約1/3である。そのより小さなサイズにより、マイクロプラスミンは、プラスミンよりも硝子体内でより迅速に拡散すると予想される(Xu,J.et al.,前出)。より迅速な拡散により、より迅速な薬理学的効果が誘導されると予想される。マイクロプラスミンがプラスミンより迅速に拡散することおよびマイクロプラスミンが硝子体ゲルを変化させることができることの両方を確認するために本研究を行った。
食肉処理場から得た新たに単離したブタ眼を使用した。第1の実験では、一方の眼にマイクロプラスミン(0.125mg)を注射し、他方の眼に賦形剤コントロール(BSS−PLUS(登録商標))を注射した。室温で2時間両眼の維持後、両眼にフルオレセインを注射し、さらに30分間インキュベートした。0、10、20、および30分後に写真撮影を行った。
第1の実験では、コントロール眼は事実上硝子体内フルオレセイン拡散は認められなかった(データ示さず)。しかし、マイクロプラスミン処置眼では、明らかなフルオレセイン拡散が認められた(データ示さず)。
マイクロプラスミンは、賦形剤コントロールと比較してフルオレセイン分散の明らかな促進を証明した。さらに、マイクロプラスミンの分子量の分子量に基づいて予想したところ、このフルオレセイン拡散は、全長プラスミン投与で認められた拡散よりも範囲が広い。この所見は、マイクロプラスミンはプラスミンよりも迅速に拡散するという予測を支持する。これらの所見は、より迅速に薬理学的効果が得られる臨床的利点を有し得る。
Claims (17)
- マイクロプラスミンを含み、(a)硝子体の網膜への抵抗性接着により生じるか、あるいは悪化する眼の疾患の発病の防止、阻害若しくは遅延又は発生率の減少に用いるための、(b)患者の眼の網膜における硝子体による牽引力の最小化に用いるための、又は(c)患者の眼の硝子体収縮による網膜剥離、網膜裂傷及び網膜出血の防止、阻害若しくは遅延、若しくは該疾患の発生率の減少に用いるための組成物。
- 前記患者の眼は、硝子体黄斑牽引、黄斑円孔、網膜剥離、網膜裂孔、網膜新血管形成、網膜出血、又は黄斑浮腫の発症リスクがある、請求項1記載の組成物。
- マイクロプラスミンを含み、患者の眼における硝子体中での血管新生に関連する疾患の発病の防止、阻害若しくは遅延、若しくは該疾患の発生率の抑制、又は患者の眼における眼性増殖性疾患の発病若しくは進行の防止、阻害若しくは遅延に用いるための組成物。
- 前記患者が糖尿病患者である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記増殖性疾患が増殖性網膜症である、請求項3記載の組成物。
- 前記増殖性疾患が糖尿病網膜症である、請求項3記載の組成物。
- 前記マイクロプラスミンは、安定化マイクロプラスミン、組換えマイクロプラスミン、安定化組換えマイクロプラスミン、及びセリンプロテアーゼ触媒活性を有するマイクロプラスミンの変異型から選択される、請求項1〜6のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記マイクロプラスミンがヒトプラスミンである、請求項1〜7のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記マイクロプラスミンは、SEQ ID NO.10の543〜791アミノ酸の二本鎖ポリペプチドからなり、且つArg 561 とVal 562 との間のペプチド結合がプラスミノーゲン活性化因子により開裂している、請求項1〜8のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記マイクロプラスミンが活性化マイクロプラスミノーゲンであり、該マイクロプラスミノーゲンは、SEQ ID NO.3によりコードされる、請求項1〜8のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記マイクロプラスミンは、酵母における組み換え体の発現によって産生される、請求項1〜10のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記酵母がピキア・パストリス(Pichia Pastoris)である、請求項11記載の組成物。
- 眼の硝子体に投与するための、請求項1〜12のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記投与は、
(i)マイクロプラスミン又は酸性緩衝液中でセリンプロテアーゼ活性を有するマイクロプラスミンの変異型を提供すること;
(ii)製剤化されたマイクロプラスミン又はマイクロプラスミンの変異型を製造するために、前記製剤化されたマイクロプラスミン又はマイクロプラスミンの変異型を眼の硝子体へ投与する前に、pHが約6.52〜約7.92である製剤に前記マイクロプラスミン又はマイクロプラスミンの変異型を添加すること;
(iii)前記製剤化されたマイクロプラスミン又はマイクロプラスミンの変異型を眼の硝子体へ投与すること;
を含む、請求項13記載の組成物。 - 前記マイクロプラスミンの有効量が0.005mg〜0.2mg/眼の範囲である、請求項1〜14のいずれか1項に記載の組成物。
- 更に第2の薬剤を含む、請求項1〜15のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記第2の薬剤が、眼の障害又は眼の障害の合併症の治療又は予防に有用なマイクロプラスミン以外のタンパク質、化学物質、又は他の物質である、請求項16記載の組成物。
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