PT1581254E

PT1581254E - Vitrectomia farmacológica utilizando plasmina truncada

Info

Publication number: PT1581254E
Application number: PT03812818T
Authority: PT
Inventors: Steve Pakola; Marc De Smet
Original assignee: Thrombogenics Nv
Priority date: 2002-12-06
Filing date: 2003-12-05
Publication date: 2012-02-06
Also published as: DK1581254T3; US20150064161A1; US20130302304A1; IL213838A0; US8460655B2; GB0228409D0; US20050118158A1; JP5996026B2; US20110171190A1; US20080050356A1; PT2327416T; IL202851A0; NO2013016I2; JP2010222369A; US7803368B2; ES2377965T3; SI1581254T1; EP1581254A4; ATE534400T1; NO20121170A1

Description

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DESCRIÇÃO "VITRECTOMIA FARMACOLÓGICA UTILIZANDO PLASMINA TRUNCADA"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção fornece geralmente métodos para tratamento ou prevenção de uma doença, ou de uma complicação de uma doença, do olho dos mamíferos. Mais especificamente, a presente invenção é destinada à utilização de uma proteína de plasmina truncada compreendendo um domínio catalítico na preparação de um medicamento que trata ou que previne uma doença, ou de uma complicação de uma doença, do olho dos mamíferos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 0 olho humano adulto é uma esfera ligeiramente assimétrica com um diâmetro sagital aproximado de 24 a 25 mm, um diâmetro transversal de 24 mm, e um volume de cerca de 6,5cc. 0 olho humano pode ser dividido em três camadas diferentes nomeadamente, uma camada externa, uma camada intermédia e uma camada interna. A camada externa do olho composta pela esclera, que é muitas vezes referida como o "branco do olho", e na córnea, que cobre a parte da frente do olho. A camada intermédia é dividida numa zona anterior e numa zona posterior; a zona anterior composta pela íris circular pigmentada, na lente cristalina e no corpo ciliar, enquanto a zona posterior composta pela camada coroide. A camada interna composta pela retina, que é a parte sensorial do olho. A retina é essencialmente uma camada de tecido nervoso, que está ao longo da superfície interna traseira do leito da coroide e pode ser dividida numa zona ótica e numa zona não-ótica. A zona ótica, que participa no mecanismo visual, contém os bastonetes e os cones que são os órgãos efetivos da visão. 2 0 olho humano também pode ser dividido em três câmaras. A câmara anterior entre a córnea e a íris, e a câmara posterior entre a íris e a lente cristalina, estão preenchidas com humor aquoso. Por outro lado, a câmara vítrea entre a lente cristalina e a retina está preenchida com um líquido mais viscoso, chamado vítreo (também conhecido como corpo vítreo ou humor vítreo). 0 humor vítreo num olho normal é um gel claro que ocupa cerca de 80% do volume do globo ocular. A luz que entra no olho através da córnea, da pupila, e da lente, é transmitida através do vítreo para a retina. O humor vítreo de um olho humano normal é um gel que é cerca de 99% de água e 1% de macromoléculas. Estas macromoléculas incluem uma rede de fibrilhas de colagénio, de ácido hialurónico, de glicoproteínas solúveis, de açúcares e de outros metabolitos de baixo peso molecular. O colagénio de tipo II é o colagénio fibrilar principal do vítreo, mas o vítreo também contém colagénio dos tipos V, IX, e XI. A zona posterior do corpo vítreo, a superfície hialoide posterior (também conhecida como córtex vítreo posterior), está em contacto direto com a superfície da retina interna mais proeminentemente na base vítrea, no disco ótico, e ao longo dos principais vasos retinais. A adesão normal do vítreo à retina é mediada por interações celulares e moleculares entre o córtex vítreo posterior e a membrana limitante interna (ILM) da retina. A ILM é essencialmente a membrana base das células retinais de Mueller. A ILM contém colagénio dos tipos I e IV, glicoproteínas tais como a laminina e a fibronectina e outros glicoconjugados. Estes componentes são pensados de forma a construírem uma ponte e a ligarem as fibras de colagénio entre o vítreo e a ILM. 3

Com a idade, o humor vítreo muda de gel para líquido e ao fazer isso, encolhe gradualmente e separa a ILM da retina. Este processo é conhecido como "descolamento vítreo posterior" (PVD) e é uma ocorrência normal depois dos 40. No entanto, as mudanças degenerativas no vítreo também podem ser induzidas por condições patológicas tais como a diabetes, a doença de Eale e a uveíte. Além disso, o PVD pode ocorrer mais cedo do que o normal em pessoas com miopia e naqueles que foram operados às cataratas. Geralmente, o vítreo provoca uma rutura limpa da retina. Ocasionalmente, no entanto, o vítreo adere firmemente à retina em certos locais. Estes pequenos focos de resistência, aderências anormalmente firmes do vítreo podem transmitir grandes forças de tração desde o vítreo até à retina no local da aderência. Este puxar persistente pelo vítreo resulta muitas vezes em ruturas em forma de ferradura na retina. A menos que as ruturas na retina sejam reparadas, o líquido vítreo pode escoar através desta rutura para dentro ou para baixo da retina e provocar um descolamento da retina, uma situação muito séria, ameaçando a visão. Além disso, a aderência persistente entre o vítreo e a ILM pode resultar em sangramento a partir da rutura de vasos sanguíneos, o que resulta no enevoamento e na opacificação do vítreo. O desenvolvimento de um PVD incompleto tem um impacto em muitas doenças do vítreo da retina incluindo o síndrome de tração macular vítreo, a hemorragia vítrea, os orifícios maculares, o edema macular, a diabetes retinopática, a diabetes maculopática, e o descolamento da retina. Desse modo, um objetivo importante da cirurgia vítrea é a separação do vítreo da retina numa forma que impeça a tração do vítreo. 4

De modo a remover o vítreo do olho, é geralmente executado um procedimento microcirúrgico chamado vitrectomia. Neste procedimento o vítreo é removido do olho com um dispositivo de manuseamento de corte diminuto enquanto substitui simultaneamente o vítreo removido com uma solução salina de modo a prevenir o colapso do olho. A remoção cirúrgica do vítreo utilizando este método está altamente dependente das competências técnicas, e a completa remoção do vítreo cortical continua a ser uma tarefa difícil. Além disso, a vitrectomia mecânica engloba o risco de complicações tais como a cicatrização, as ruturas e outros danos na retina. Obviamente, tais danos são altamente indesejáveis uma vez que podem comprometer a visão do paciente depois da cirurgia.

Desse modo, os métodos alternativos para remoção do vítreo da retina foram o foco da investigação recente. Esses métodos exploraram a utilização de enzimas e substâncias químicas, as quais podem ser utilizadas de modo a induzirem/ promoverem a liquefação do vítreo e/ou a separação da ligação entre o vítreo e a retina (PVD). Estas abordagens, que são referidas como "vitrectomia farmacológica", incluíram várias enzimas proteolíticas tais como a alfa-quimotripsina, a hialuronidase, a colagenase bacteriana, a condroitinase e a dispase, que foram injetadas intravítrealmente em experiências e/ou em testes clínicos de modo a induzirem o PVD. No entanto, a maioria destas técnicas não retiram completamente o hialoide posterior a partir da ILM sem complicações. Além disso, em vários destes casos, o risco de reações adversas é elevado. Por exemplo, a utilização de protéases bacterianas em sistemas de mamíferos gera uma resposta imune, que conduz a vitreoretinopatia proliferativa tendo por resultado o complexo re-deslocamento da retina. Foi relatado que a 5 colagenase liquefaz o vítreo, mas também se verificou que interrompe as camadas exteriores da retina. Foi relatado que a Alfa-quimotripsina produz hemorragia peripapilar e vítrea nos olhos injetados. Finalmente, foi relatado que a dispase provoca toxidade na camada interna da retina 15 minutos depois da injeção. Dependendo da concentração de dispase utilizada, podem-se desenvolver retinopatias proliferativas ou membranas celulares epiretinais nos olhos inj etados.

Dada a imunogenicidade e outros efeitos adversos das protéases bacterianas, pode ser desejável a vitreoctomia farmacológica utilizando protéases endógenas humanas derivadas. A plasmina é uma protéase de serina derivada a partir do plasminogénio. 0 plasminogénio é um componente importante do sangue dos mamíferos. 0 plasminogénio humano é uma glicoproteína de cadeia única consistindo em 791 aminoácidos, que tem um peso molecular de cerca de 92.000 daltons (ver Forsgren M. e outros, FEBS Lett. 213(2): 254 -60, 1987). O plasminogénio nativo com um ácido glutâmico de terminal amino (denominado "Glu-plasminogénio") é convertido por digestão limitada pela plasmina de ligações peptídeas de Arg6s - Met69, Lisw - L1S78, ou L1S78 - Val79 nas proteínas geralmente designadas por "Lis-plasminogénio." A ativação do plasminogénio por ativadores de plasminogénio tais como a uroquínase ou a estreptoquinase, quebra a ligação peptídica entre o Arg56i e o Val562 convertendo a molécula plasminogénia numa cadeia dupla, forma enzimaticamente ativa denominada plasmina. A plasmina contém dois polipeptídeos, uma cadeia A pesada ligada por duas ligações de dissulfeto a uma cadeia B leve; a cadeia B contém o domínio catalítico da protéase da serina. A atividade catalítica da protéase serina da plasmina foi 6 implicada na sua habilidade para dissolver coágulos de sangue in vivo.

Recentemente, a plasmina também foi sugerida como um suplemento para a vitrectomia. Adicionalmente, a enzima autóloga da plasmina (APE) foi sugerida como um agente para a vitrectomia farmacológica. No entanto, há várias desvantagens associadas com a utilização da plasmina. Primeiro, até agora todas as intervenções clinicas com plasmina assentaram na utilização do APE, em que o isolamento do qual necessita de um processo laborioso e demorado que envolve o desenho do sangue de um paciente, o isolamento do plasminogénio, a ativação do plasminogénio isolado da plasmina, e a purificação e os testes de esterilidade da enzima da plasmina. Além disso, este procedimento pode ser caro e a presença de patógenos do sangue podem complicar ainda mais este procedimento. Além disso, a plasmina é altamente propensa à degradação e desse modo não pode ser armazenada por períodos prolongados antes da sua utilização. Uma outra desvantagem é o elevado peso molecular da plasmina, que varia entre 65.000 e 83.000 daltons. Desse modo, a difusão de moléculas grandes tais como a plasmina a partir da sua posição injetada no vítreo para a ligação entre o vítreo e a retina seria impedida quando comparada com moléculas mais pequenas.

Assim sendo, há uma necessidade na técnica para métodos de tratamento ou de prevenção de doenças, ou complicações de doenças, do olho de um indivíduo que ultrapassem as desvantagens da plasmina, para a vitreoctomia farmacológica. Especificamente, há uma necessidade para métodos de tratamento ou de prevenção de uma doença, ou de uma complicação de uma doença, do olho utilizando moléculas mais pequenas que a plasmina, que se podem difundir mais 7 rapidamente do que a plasmina desde o vítreo até à ligação do vítreo com a retina, e que podem ser rapidamente obtidos em elevadas quantidades sem o atraso e outros problemas associados ao isolamento da enzima autóloga da plasmina numa base de paciente a paciente.

SUMARIO DA INVENÇÃO A presente invenção fornece métodos de tratamento ou de prevenção de uma doença, ou de uma complicação de uma doença, do olho de um indivíduo conforme definido na reivindicação 1 utilizando uma composição compreendendo uma proteína truncada de plasmina compreendendo um domínio catalítico da plasmina (TPCD). Numa forma de realização, um TPCD é selecionado a partir do grupo consistido por miniplasmina, miniplasmina recombinante, miniplasmina estabilizada, variantes da recombinante, miniplasmina estabilizada, recombinante, miniplasmina, microplasmina, microplasmina microplasmina estabilizada, microplasmina estabilizada, recombinante, variantes da microplasmina, e quaisquer combinações dessas. A presente invenção fornece métodos de tratamento ou de prevenção de uma doença, ou de uma complicação de uma doença, do olho de um indivíduo através do contacto de um humor vítreo e/ou aquoso do indivíduo com uma composição compreendendo um TPCD em que a doença do olho é selecionada a partir de, descolamento da retina, rutura da retina, hemorragia vítrea, hemorragia vítrea diabética, retinopatia diabética proliferativa, retinopatia diabética não-proliferativa, degeneração macular relacionada com a idade, aberturas maculares, tração vítrea macular, enrugamento macular, exsudação macular, edema macular cistoide, deposição da fibrina, oclusão da veia da retina, oclusão da artéria da retina, hemorragia subretinal, ambliopia, endoftalmite, retinopatia da prematuridade, glaucoma, retinite pigmentosa e algumas combinações desses. Os métodos da invenção podem ser praticados independentemente da vitrectomia, ou como um suplemento à vitrectomia. A presente invenção também fornece métodos de tratamento ou de prevenção de uma doença do olho, ou de uma complicação de uma doença do olho, de um indivíduo conforme definido na reivindicação 9 compreendendo a administração ao indivíduo de uma composição compreendendo pelo menos dois TPCDs. Numa forma de realização deste aspeto da invenção, uma composição deve ser administrada a um indivíduo através do contacto de um humor vítreo e/ou aquoso com uma composição compreendendo pelo menos dois TPCDs. A presente invenção também fornece métodos de tratamento ou de prevenção de uma doença do olho, ou de uma complicação de uma doença do olho conforme definido na reivindicação 9 compreendendo o fornecimento a um indivíduo de uma primeira composição compreendendo pelo menos um TPCD, e uma segunda composição compreendendo pelo menos um TPCD. Numa forma de realização deste aspeto da invenção, uma primeira composição compreendendo pelo menos um TPCD e uma segunda composição compreendendo pelo menos um TPCD são fornecidas a um indivíduo através do contacto de um humor vítreo e/ou aquoso. Numa outra forma de realização deste aspeto da invenção, os TPCDs da primeira composição compreendendo pelo menos um TPCD e a segunda composição compreendendo pelo menos um TPCD são o mesmo TPCD. Numa outra forma de realização deste aspeto da invenção, os TPCDs da primeira composição compreendendo pelo menos um TPCD e a segunda composição compreendendo pelo menos um TPCD são TPCDs diferentes. Numa outra forma de realização deste aspeto da invenção, a primeira composição compreendendo pelo menos um 9 TPCD e a segunda composição compreendendo pelo menos um TPCD devem ser administradas a um indivíduo substancialmente ao mesmo tempo. Numa outra forma de realização, a primeira composição compreendendo pelo menos um TPCD e a segunda composição das composições compreendendo pelo menos um TPCD devem ser administradas a um indivíduo em ocasiões separadas. A presente invenção adicionalmente fornece métodos de tratamento ou de prevenção de uma doença do olho, ou de uma complicação de uma doença do olho, conforme definido na reivindicação 1 de um indivíduo através da administração ao indivíduo de uma composição compreendendo pelo menos um TPCD e pelo menos um segundo agente. Um segundo agente inclui qualquer substância que seja útil tanto sozinha, ou em combinação com um TPCD, no tratamento ou na prevenção de uma doença do olho ou de uma complicação de uma doença do olho. Um segundo agente, inclui sem restrição, hialuronidase, dispase, condroitinase, colagenase, peptídeos contendo RGD, anticorpo anti-integrina, ureia, hidroxiureia, tioureia, agonistas de recetor P2Y, e quaisquer inibidores angiogénicos incluindo, mas não limitados a, inibidores de VEGF e de PIGF. A presente invenção também fornece métodos de tratamento ou de prevenção de uma doença do olho, ou de uma complicação de uma doença do olho, conforme definido na reivindicação 1 de um indivíduo através da administração ao indivíduo de uma composição compreendendo pelo menos um TPCD antes ou depois da administração de uma composição compreendendo um segundo agente.

Os métodos da invenção podem ser utilizados para tratar ou prevenir uma doença do olho, ou uma complicação de uma 10 doença do olho, de um indivíduo através da realização de um ou mais resultados incluindo, mas não limitados a, redução da viscosidade do vítreo, liquefação do vítreo, indução do descolamento vítreo posterior, limpeza ou redução do sangue hemorrágico do humor vítreo e/ou aquoso, limpeza ou redução de substâncias intraoculares estranhas do humor vítreo e/ou aquoso, limpeza ou redução dos materiais tóxicos à retina, aumento da difusão de um agente ou de uma composição administrada ao humor vítreo e/ou aquoso, redução da neovascularização extra-retinal e quaisquer combinações desses. A presente invenção também fornece métodos para executar uma vitrectomia compreendendo o contacto do vítreo de um indivíduo com uma composição compreendendo um TPCD. A etapa de contacto pode ser realizada antes ou ao mesmo tempo que a vitrectomia ou ser independente da vitrectomia. A presente invenção também fornece uma composição para utilização de acordo com a reivindicação 32 compreendendo pelo menos dois TPCDs. A presente invenção também fornece uma composição para utilização de acordo com a reivindicação 25 compreendendo pelo menos um TPCD e pelo menos um segundo agente.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A FIG. 1 apresenta as sequências de DNA (SEQ ID NO:9) e do aminoácido (SEQ ID NO: 10) do plasminogénio humano. A FIG. 2 apresenta as sequências de DNA (SEQ ID NO:3) e do aminoácido (SEQ ID NO: 4) do microplasminogénio humano. 11 A FIG. 3 apresenta as sequências de DNA (SEQ ID NO:7) e do aminoácido (SEQ ID NO: 8) do miniplasminogénio humano. A FIG. 4 mostra o efeito de tratar olhos suinos com microplasmina. 0 Painel A é uma imagem de baixa ampliação (1IX) da retina de média periferia depois da lenta desidratação de um olho suino tratado com 0,125 mg de microplasmina em 0,1 mL de BSS PLUS® durante 120 minutos. No centro desta imagem, está uma fibra vitrea. É provável que esta fibra vitrea seja vítreo que se colapsou na superfície da retina. A maioria da superfície da retina está livre de vítreo conforme mostrado nos restantes Painéis. O Painel B mostra uma área de retina descoberta adjacente a um vaso sanguíneo (ampliação 800X). São vistas poucas células na superfície da retina. A superfície irregular é a do próprio vaso. Os Painéis C e D são ampliações da área da retina em B em ampliações de 1.200X e 3.600X mostrando respetivamente uma superfície da retina lisa largamente desprovida de material vítreo ou celular. A 3.600x apenas são visíveis alguns fios fibrilares. O Painel E é uma imagem numa ampliação de 1.500X mostrando essencialmente o mesmo que se verificou no Painel C numa posição da retina mais central, enquanto o Painel F mostra a estrutura granular grosseira do vítreo, que perdeu a sua estrutura fibrilar. A estrutura do vítreo nos olhos tratados com microplasmina é muito diferente em aparência quando comparada com o vítreo nos olhos de controlo (dados não mostrados). A FIG. 5 mostra que os processos ciliares no olho suíno estão intactos depois do tratamento de 120 minutos com microplasmina (Painéis A e B). 12 A FIG. 6 apresenta micrográficos de exploração de eletrão (ampliação de 3.600x) da ligação do vítreo com a retina em olhos humanos pós-morte. A injeção intravítreal de 62,5 pg de microplasmina resultou no descolamento vítreo posterior (PVD) deixando restos descontínuos das fibrilhas de colagénio que cobrem a ILM (Painel A) . 125 pg (Painel B) e 188 pg (Painel C) da microplasmina produziram PVD completo e uma ILM descoberta. 0 Painel D mostra a compressão das fibrilhas de colagénio no sentido da ILM num olho tratado com 62,5 pg de microplasmina e gás. 0 Painel E mostra o PVD completo depois do tratamento com 125 pg de microplasmina e gás. Ao contrário do PVD observado nos olhos tratados com microplasmina, há uma densa rede de fibrilhas de colagénio no olho de controlo (Painel F). A FIG. 7 apresenta micrográficos de transmissão de eletrão da ILM nos olhos humanos pós-morte. De notar a ausência de fibrilhas de colagénio (setas) na ILM no olho tratado com microplasmina (Painel A, ampliação 13.600X). Em contraste, as fibrilhas de colagénio ainda estão presentes (setas) na ILM no olho de controlo (Painel B; ampliação 6.800X). A FIG. 8 apresenta micrográficos de exploração de eletrão (ampliação 3.600X) da ligação do vítreo com a retina em olhos de gato. A injeção intravítreal de 25 pg da microplasmina deixou restos de fibrilhas de colagénio na ILM um dia depois do tratamento (Painel A) . Três dias depois do tratamento, os 25 pg de microplasmina resultaram em PVD completo (Painel B) . Os restos das fibrilhas de colagénio foram observados três dias depois do tratamento com 14,5 pg de microplasmina (Painel C). Foi observada uma ILM descoberta três semanas depois da injeção de 14,5 pg de microplasmina (Painel D) e 25 pg de microplasmina (Painel 13 Ε) . Em contraste notável, o olho de controlo mostrou uma densa aderência do vítreo cortical (Painel F). A FIG. 9 apresenta os resultados de estudos de microscopia de luz de secções semi-finas de olhos de gato. Estes estudos mostraram que a citoarquitetura normal da retina observada nos olhos de controlo (Painel B) também foi observada nos olhos tratados com microplasmina (Painel A) . A microscopia de transmissão de eletrão revelou uma retina interna e uma ILM bem conservados nos olhos tratados com microplasmina (Painéis C e E) conforme observado nos olhos de controlo (Painéis D e F). A ampliação utilizada para os Painéis A e B foi de 250X; a ampliação para os Painéis C e D foi de 6.000X; enquanto a ampliação para os Painéis E e F foi de 30.000X. A FIG. 10 apresenta os resultados da microscopia de exploração de laser confocal com sondas para a proteína acídica fibrilica glial (Painéis A e B, a verde) e vimentina (Painéis C e D, a vermelho). Não há diferença nas manchas de GFAP e de vimentina entre os olhos tratados com microplasmina (Painéis A e C) e os olhos de controlo (Painéis B e D). A imunohistoquímica com dupla marcação com sondas para a sinaptofisina (a verde) e o neurofilamento (a vermelho) também não mostram qualquer diferença entre os olhos tratados com microplasmina (Painel E) e os olhos de controlo (Painel F) . A ampliação para os Painéis A, B e C foi de 400x; a ampliação para o Painel D foi de 250X; e a ampliação para os Painéis E e F foi de 160x. A FIG. 11 apresenta uma função de correlação do tempo (TCF) da totalidade do vítreo suíno quando comparado com uma solução de 20 nm de nanosferas de poliestireno. No vítreo há dois componentes para a curva. O primeiro componente 14 (rápido) é devido à presença de ácido hialurónico (HA) que é livremente difusivel e apresenta considerável movimento molecular (Brownian). 0 último componente (lento) é devido ao colagénio, que é maior e difunde menos livremente (mais duro), resultando num movimento Brownian mais lento. Por outro lado, a solução de nanosferas de poliestireno tem apenas um componente (monodisperso) que é muito rápido por causa do pequeno tamanho das nanosferas e da sua estrutura perfeitamente esférica permitindo movimentos muito rápidos na solução. A FIG. 12 apresenta funções de correlação de tempo normalizadas para 5 olhos suinos submetidos a vitreoctomia farmacológica de microplasmina (μΡΙί) em diferentes doses e uma solução de 20 nm de nanosferas de poliestireno. As medidas de DLS foram feitas no eixo central ótico, 4 mm abaixo da ligação ar/ vítreo. No (veículo) vítreo não tratado há dois componentes na curva. O primeiro componente (rápido) é devido à presença de ácido hialurónico (HA) que é livremente difusivel e apresenta considerável movimento molecular (Brownian). O último componente (lento) é devido ao colagénio, que é maior e difunde menos livremente (mais duro), resultando num movimento Brownian mais lento. Por outro lado, a solução de nanosferas de poliestireno tem apenas um componente (monodisperso) que é muito rápido por causa do pequeno tamanho das nanosferas e da sua estrutura perfeitamente esférica permitindo movimentos muito rápidos na solução. Com doses crescentes de μΡΙί há uma diminuição na inclinação do TCF com o desaparecimento do componente lento (espécies moleculares maiores) aproximando em último caso o TCF de nanosferas de 20 nm puras, isto é, todas as espécies moleculares de tamanho menor. 15 A FIG. 13 apresenta fotografias representativas dos olhos suínos depois da injeção da microplasmina e da fluoresceína. Ambas as imagens são do mesmo olho, tendo a imagem direita sido capturada 20 minutos depois da imagem esquerda, demonstrando a difusão da fluoresceína no vítreo. A FIG. 14 apresenta fotografias representativas dos olhos suíno depois da injeção da plasmina e da fluoresceína. Ambas as imagens são do mesmo olho, com a imagem de baixo capturada 20 minutos depois da imagem de cima, demonstrando a difusão da fluoresceína no vítreo num grau inferior do que o visto com os olhos tratados com microplasmina (Fig. 13) . 16

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A seguinte descrição detalhada e os exemplos anexos são fornecidos para propósitos de descrição e explicação apenas de determinadas formas de realização preferidas da invenção, e não se pretende limitar o âmbito da invenção de nenhuma forma. A menos que definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos utilizados neste documento têm os mesmos significados que geralmente entendidos por aqueles com conhecimentos normais na técnica à qual pertence esta invenção.

Antes de apresentar a invenção em detalhe, pode ser útil uma compreensão da mesma para apresentar definições de certos termos que serão utilizados daqui para a frente.

Definições "tratamento" significa a redução ou a melhoria de qualquer doença médica em qualquer extensão, e inclui, mas não requer, uma cura completa da doença. "prevenir" significa defender ou proteger contra o desenvolvimento de uma doença, isto é, funcionar como um profilático. "doença" significa qualquer doença, disfunção, síndrome, condição, dor, ou qualquer combinação desses. A doença também inclui quaisquer complicações a partir de qualquer doença, disfunção, síndrome, condição, dor ou de qualquer combinação desses. "indivíduo" significa qualquer mamífero, particularmente um ser humano. 17 "contactar" significa qualquer modo de administração que resulta na interação entre uma composição e um objeto que estão em contacto (por exemplo, humor vítreo, aquoso, etc.) . A interação da composição com o objeto que está em contacto pode ocorrer substancialmente ao mesmo tempo que a administração da composição, durante um período de tempo prolongado desde cerca do momento de administração da composição, ou ser atrasado a partir do momento de administração da composição. "composição" significa uma combinação ou mistura de uma ou mais substâncias. "substância" significa aquilo que tem massa e ocupa espaço. "substância estranha" significa qualquer substância que é determinada por um médico, por um clínico, por um veterinário ou por um investigador médico como sendo prejudicial ou tóxica ao olho de um indivíduo e/ou como sendo uma substância que normalmente não seja encontrada num olho mamífero saudável. "portador aceitável oftalmologicamente" é uma substância com a qual uma segunda substância (por exemplo, um TPCD) pode ser combinado, sem tornar a segunda substância imprópria (conforme determinado por um médico, por um clínico, por um veterinário ou por um investigador) para a sua utilização pretendida no olho de um indivíduo. Exemplos não limitativos de um portador aceitável oftalmologicamente incluem a solução de sal equilibrada (BSS) e o BSS-PLUS®. "portador" inclui, sem restrição, água, salino tamponizado, poliol (por exemplo, glicerol, glicol de propileno, glicol de polietileno líquido), ou misturas apropriadas desses. 18

Outros exemplos de portadores aceitáveis oftalmologicamente e de métodos para fazer esses portadores e formulação dos mesmos são encontrados, por exemplo, em Remington's Pharmaceutical Sciences (20a edição, A. Gennaro (ed.), Lippincott, Williams & Wilkins, 2000) . "uma quantidade eficaz" significa uma quantidade de uma substância ou de uma composição que elicie uma resposta num olho de um ser humano ou de outro mamífero que está a ser procurada por um investigador, por um veterinário, por um médico ou por outro clínico. "induzir" significa provocar ou estimular a ocorrência de um resultado desejado. "reduzir" significa diminuir em qualquer extensão. "efeitos tóxicos para o olho" significa qualquer efeito adverso para o olho de um indivíduo que é determinado ser prejudicial para o indivíduo por um investigador, por um veterinário, por um médico ou por outro clínico. "vítreo" significa o humor vítreo, também referido como o corpo vítreo, que ocupa a câmara entre a lente cristalina do olho e a retina. "TPCD" é um acrónimo para "proteína truncada de plasmina compreendendo um domínio catalítico de plasmina." Uma "proteína truncada de plasmina" significa qualquer proteína de plasmina obtida através da eliminação de um ou mais aminoácidos da Valvg-plasmina (isto é, aminoácidos 79 - 791 do plasminogénio humano), em que a proteína resultante possui atividade catalítica da protéase serina. Tal eliminação do aminoácido pode ser no término-N (resultando 19 em TPCDs que consistem por exemplo em, aminoácidos 444 -791, 543 - 791, ou 562 - 791 da SEQ ID NO: 10) e/ou no término-N e/ou em qualquer posição ou posições internas dos aminoácidos 79 - 791 da SEQ ID NO: 10. Deve ser compreendido que se uma proteína truncada derivada da SEQ ID NO: 10 for feita como uma forma enzimaticamente inativa, essa deve ser ativada utilizando um ativador plasminoqénio de modo a convertê-la na correspondente forma ativa da proteína truncada. Por exemplo, se uma proteína que consiste em aminoácidos 543 - 791 da SEQ ID NO: 10 for feita recombinantemente, é altamente provável que a proteína não esteja na sua forma enzimaticamente ativa. Desse modo, a proteína deve ser tratada com um ativador plasminoqénio para quebrar a ligação peptídica entre Arg56i e Val562/· ativando desse modo a proteína. Exemplos não limitativos de um TPCD incluem miniplasmina, miniplasmina recombinante, miniplasmina estabilizada, miniplasmina estabilizada, recombinante, variantes da miniplasmina, microplasmina, microplasmina recombinante, microplasmina estabilizada, microplasmina estabilizada, recombinante e variantes da microplasmina em que, as variantes da microplasmina e da miniplasmina incluem um domínio catalítico da plasmina. "proteína de plasmina" significa qualquer proteína feita ou derivada a partir da sequência do aminoácido do plasminogénio humano (SEQ ID NO: 10) que tem uma quebra da ligação peptídica entre Arg56i e Val562 do plasminogénio humano. A quebra da ligação peptídica entre Arg56i e Vals62 pode ser conseguida utilizando ativadores plasminogénios. Exemplos não limitativos de proteínas de plasmina incluem a Lis-plasmina, a miniplasmina e a microplasmina. 20 "domínio catalítico da plasmina" significa uma sequência de aminoácidos de cerca de 130 - 240 aminoácidos derivados a partir dos aminoácidos 543 a 791 da SEQ ID NO: 10 (plasminogénio humano), os quais incluem a tríade catalítica da plasmina nomeadamente, His6o3, Asp646 e Ser74i, em que a sequência do aminoácido possui a atividade da protéase da serina. "domínio catalítico modificado da plasmina" significa um domínio catalítico da plasmina que foi alterado através da alteração da sequência do aminoácido do domínio catalítico através da adição e/ou da eliminação e/ou da substituição de um ou mais aminoácidos. Claro que se deve compreender que os aminoácidos que correspondem à tríade catalítica da plasmina nomeadamente, His6o3, Asp646 e Ser74i, não são alterados. A modificação pode aumentar, diminuir ou deixar inalterada a atividade catalítica do tipo plasmina da proteína. Por exemplo, o domínio catalítico modificado da microplasmina e da miniplasmina pode aumentar, diminuir ou deixar inalterada a atividade catalítica destas proteínas. "TPCD modificado" é um TPCD contendo um domínio catalítico modificado de plasmina, em que o TPCD possui uma atividade catalítica da protéase serina do tipo plasmina. "segundo agente" significa qualquer substância que possa ser utilizada, tanto por ela própria, ou em combinação com um TPCD, no tratamento ou na prevenção de uma doença do olho ou de uma complicação de uma doença do olho de um indivíduo. Preferivelmente o segundo agente não previne a atividade catalítica de um TPCD. 21 "estabilizar uma proteína" significa proteger uma proteína da degradação e/ou da inativação através da utilização de um ou mais agentes de estabilização.

Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos neste documento possam ser utilizados na prática ou em testes da presente invenção, os métodos e os materiais preferidos são descritos abaixo. A vitreoctomia farmacológica é um método para utilização de um ou mais agentes proteicos do ácido e/ou químicos e/ou ácidos nucleicos de modo a tratar ou a prevenir uma doença, ou de uma complicação de uma doença, de um olho de um indivíduo. A presente invenção fornece métodos de vitreoctomia farmacológica utilizando pelo menos uma proteína truncada de plasmina compreendendo um domínio catalítico (TPCD). Especificamente, a presente invenção fornece métodos de tratamento ou de prevenção de doenças dos olhos, ou complicações de doenças dos olhos, através do contacto do humor vítreo e/ou aquoso com uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo um TPCD. Estes métodos resultam em resultados tais como, mas não limitados a, liquefação do vítreo, descolamento posterior do vítreo, redução ou limpeza do sangue hemorrágico do humor vítreo e/ou aquoso, redução ou limpeza de substâncias intraoculares estranhas do humor vítreo e/ou aquoso, aumento da difusão de um agente ou de uma composição administrada ao humor vítreo e/ou aquoso, diminuição da neovascularização extra-retinal, e quaisquer combinações desses. Estes métodos tanto podem ser utilizados como um suplemento à vitrectomia, ou como na ausência da vitrectomia. 22

De acordo com isso, a presente invenção fornece, como um primeiro aspeto, um método de tratamento ou de prevenção de uma doença, ou de uma complicação de uma doença, do olho de um indivíduo conforme definido na reivindicação 1 compreendendo o contacto do humor vítreo e/ou aquoso com uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo um TPCD. Numa forma de realização, um TPCD tem um peso molecular menor do que cerca de 40.000 daltons. Numa outra forma de realização, um TPCD tem um peso molecular de cerca de 26.500 daltons na forma reduzida ou de cerca de 29.000 daltons na forma não reduzida. Ainda numa outra forma de realização um TPCD tem um peso molecular entre cerca de 20.000 e 30.000 daltons. Numa forma de realização adicional, um TPCD tem um peso molecular de menos do que cerca de 20.000 daltons.

Num segundo aspeto, a presente invenção fornece um método de tratamento ou de prevenção de uma doença, ou de uma complicação de uma doença, do olho de um indivíduo conforme definido na reivindicação 9 compreendendo o contacto do humor vítreo e/ou aquoso com uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo pelo menos dois TPCDs.

Num terceiro aspeto, a presente invenção fornece um método de tratamento ou de prevenção de uma doença, ou de uma complicação de uma doença, do olho de um indivíduo conforme definido na reivindicação 9 compreendendo o contacto do humor vítreo e/ou aquoso com uma quantidade eficaz de uma primeira composição compreendendo pelo menos um TPCD e uma quantidade eficaz de uma segunda composição compreendendo pelo menos um TPCD. Numa forma de realização deste aspeto da invenção, a primeira composição compreendendo pelo menos um TPCD e a segunda composição compreendendo pelo menos um TPCD podem compreender o mesmo TPCD. Numa outra forma de 23 realização deste aspeto da invenção, a primeira composição compreendendo pelo menos um TPCD e a segunda composição compreendendo pelo menos um TPCD podem compreender TPCDs diferentes. Numa forma de realização adicional deste aspeto da invenção, as primeiras e segundas composições podem ser administradas a um indivíduo substancialmente ao mesmo tempo ou em momentos diferentes.

Num quarto aspeto, a presente invenção fornece um método de tratamento ou de prevenção de uma doença, ou de uma complicação de uma doença, do olho de um indivíduo conforme definido na reivindicação 1 compreendendo o contacto do humor vítreo e/ou aquoso com uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo pelo menos um TPCD e pelo menos um segundo agente. Neste aspeto da invenção, não é pretendido que o segundo agente seja um TPCD.

Num quinto aspeto, a presente invenção fornece um método de tratamento ou de prevenção de uma doença, ou de uma complicação de uma doença, do olho de um indivíduo conforme definido na reivindicação 1 compreendendo o contacto do humor vítreo e/ou aquoso com uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo pelo menos um TPCD antes de, ao mesmo tempo que, ou depois do contacto do humor vítreo e/ou aquoso com uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo pelo menos um segundo agente.

Num sexto aspeto, a presente invenção permite um método de liquefação do vítreo compreendendo o contacto do humor vítreo e/ou aquoso com uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo pelo menos um TPCD. Numa forma de realização deste aspeto da invenção, a liquefação do vítreo diminui a viscosidade do humor vítreo. Em outras formas de realização da invenção, a liquefação do vítreo aumenta a 24 taxa de limpeza da cavidade vítrea e/ou do humor aquoso do sangue, do material depositado, das substâncias estranhas e/ou dos materiais tóxicos para o olho, especialmente para a retina. Numa outra forma de realização deste aspeto da invenção, a liquefação do vítreo diminui a neovascularização extra-retinal. Numa outra forma de realização deste aspeto da invenção, a liquefação do vítreo aumenta a difusão de um agente ou composição administrada ao humor vítreo e/ou aquoso. Numa forma de realização adicional deste aspeto da invenção, a liquefação do vítreo auxilia na remoção do vítreo durante a vitrectomia padrão ou vitrectomiade Calibre 25 (ou inferior).

Num sétimo aspeto, a presente invenção permite um método de indução do descolamento vítreo posterior compreendendo o contacto do humor vítreo e/ou aquoso com uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo pelo menos um TPCD.

Em qualquer um do primeiro ao sétimo aspeto da invenção descritos acima, a etapa de contacto do humor vítreo e/ou aquoso com uma composição compreendendo um TPCD pode ser executada como um suplemento, ou na ausência da vitrectomia.

Num oitavo aspeto, a presente invenção fornece um método de execução de uma vitrectomia compreendendo a etapa de contacto do humor vítreo e/ou aquoso com uma composição compreendendo pelo menos um TPCD. A etapa de contacto pode ser executada ao mesmo tempo que, ou antes da vitrectomia.

Num nono aspeto, a presente invenção fornece uma composição para utilização de acordo com a reivindicação 32 compreendendo pelo menos dois TPCDs. 25

Num décimo aspeto, a presente invenção fornece uma composição para utilização de acordo com a reivindicação 25 compreendendo pelo menos um TPCD e pelo menos um segundo agente.

Numa forma de realização de todos os aspetos da presente invenção, um TPCD é selecionado a partir do grupo consistido por miniplasmina, miniplasmina recombinante, miniplasmina estabilizada, miniplasmina estabilizada, recombinante, variantes da miniplasmina, microplasmina, microplasmina recombinante, microplasmina estabilizada, microplasmina estabilizada, recombinante, variantes da microplasmina, e de quaisquer combinações desses. Numa outra forma de realização de todos os aspetos da invenção, os métodos de tratamento ou de prevenção da acima mencionada doença do olho, ou das complicações de uma doença do olho, e os métodos de execução de uma vitrectomia resultam na melhoria de uma doença do olho através de um ou mais dos seguintes resultados: redução da viscosidade do vitreo, liquefação do vítreo, indução do descolamento vítreo posterior, limpeza ou redução do sangue hemorrágico do vítreo, da cavidade vítrea e/ou do humor aquoso, limpeza ou redução de substâncias intraoculares estranhas da cavidade vítrea, do vítreo e/ou do humor aquoso, limpeza ou redução dos materiais tóxicos para a retina a partir do vítreo, da cavidade vítrea e/ou do humor aquoso, aumento da difusão de um agente ou de uma composição administrada ao humor vítreo e/ou aquoso, ou redução da neovascularização da retina. A doença do olho ou a complicação de uma doença do olho que se pretende tratar ou prevenir de acordo com a invenção é selecionada a partir do grupo que consiste no descolamento da retina, na rutura da retina, na hemorragia vítrea, na hemorragia vítrea diabética, na retinopatia diabética proliferativa, na retinopatia diabética não 26 proliferativa, na degeneração macular relacionada com a idade, em orifícios maculares, na tração vitreomacular, no enrugamento macular, na exsudação macular, no edema macular cistoide, na deposição da fibrina, na oclusão das veias da retina, na oclusão das artérias da retina, na hemorragia subretinal, na ambliopia, no endoftalmite, na retinopatia da prematuridade, no glaucoma, na retinite pigmentosa, e em qualquer combinação desses.

Um TPCD inclui qualquer proteína truncada de plasmina compreendendo um domínio catalítico da plasmina. Uma proteína truncada de plasmina abrange qualquer proteína de plasmina obtida através da eliminação de um ou mais aminoácido de Val7g-plasmina (isto é., aminoácidos 79 - 791 do plasminogénio humano), em que a proteína resultante possui atividade catalítica da protéase serina. Desse modo, todos os TPCDs devem conter a tríade catalítica do domínio da protéase da serina da plasmina nomeadamente, His603, Asp646 e Ser74i. Podem ser feitos truncamentos de Val79_ plasmina através da eliminação de um ou mais aminoácidos nos aminoácidos 79 - 791 da SEQ ID NO: 10 (plasminogénio humano). Tais eliminações podem ser no término-N, no término-C ou numa posição interna dos aminoácidos 79 - 791 da SEQ ID NO: 10. Deve-se compreender que se for feita uma proteína resultante de um truncamento dos aminoácidos 79 -7 91 da SEQ ID NO: 10 (plasminogénio humano) numa forma enzimaticamente inativa, a proteína deve ser convertida na sua forma ativa utilizando um ativador plasminogénio, para ser considerado um TPCD. Os ativadores plasminogénios quebram a ligação peptídica entre o Arg56i e o Vals62/ ativando desse modo uma proteína. Numa forma de realização um TPCD inclui proteínas que consistem essencialmente nos aminoácidos 444 - 791 da SEQ ID NO: 10. Numa outra forma de realização, um TPCD inclui proteínas com uma ou mais 27 eliminações de aminoácidos nos aminoácidos 444 - 791 do plasminogénio humano, em que a proteína resultante possui atividade catalítica da protéase serina. Numa outra forma de realização, um TPCD inclui proteínas que consistem essencialmente nos aminoácidos 543 - 791 da SEQ ID NO: 10. Ainda numa outra forma de realização um TPCD inclui proteínas com uma ou mais eliminações nos aminoácidos 543 -791 do plasminogénio humano, em que a proteína resultante possui atividade catalítica da protéase serina. Numa outra forma de realização, um TPCD inclui proteínas que consistem essencialmente nos aminoácidos 562 - 791 da SEQ ID NO: 10. Numa outra forma de realização um TPCD inclui proteínas com uma ou mais eliminações nos aminoácidos 562 - 7 91 do plasminogénio humano, em que a proteína resultante possui atividade catalítica da protéase serina. As eliminações podem ser no término-N, término-C ou numa posição interna dos aminoácidos 444 - 791, 543 - 791 e 562 - 791 da SEQ ID NO: 10 (plasminogénio humano), respetivamente. Os métodos de realização da eliminação do aminoácido numa proteína são bem conhecidos por aqueles com conhecimentos normais na técnica (por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel e outros (eds.), John Wiley & Sons, 2001; e Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Terceira Edição, Sambrook e Russell, 2000). A atividade catalítica de um TPCD pode ser determinada através da medição da atividade amidolítica do TPCD, utilizando o substrato cromogénico S2403 (Chromogenix, Antuérpia, Bélgica) (ver o Exemplo 2), qualquer outro substrato cromogénico, ou por quaisquer outros métodos conhecidos na técnica.

Também é divulgada a utilização de um TPCD modificado. Um TPCD modificado é um TPCD com uma forma modificada do domínio catalítico da plasmina, em que o TPCD modificado possui atividade catalítica da protéase serina do tipo 28 plasmina. As modificações no domínio catalítico incluem inserções e/ou eliminações e/ou substituições do aminoácido no domínio catalítico da plasmina. No entanto, os aminoácidos que correspondem à tríade catalítica do domínio da protéase da serina da plasmina não são alterados, nomeadamente, a Histidina6o3, o Ácido Aspártico646 e a Serina74i. Preferivelmente as modificações do domínio catalítico envolvem uma ou mais substituições conservativas dos aminoácidos que não fazem parte da tríade catalítica. As substituições conservativas dos aminoácidos e os métodos de realização de tais substituições conservativas dos aminoácidos são bem conhecidos por aqueles com conhecimentos normais na técnica {ver, por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology, supra; e Molecular Cloning: A Laboratory Manual, supra). Estas modificações podem aumentar, diminuir ou deixar inalterada a atividade catalítica do domínio original. A atividade catalítica de um TPCD modificado pode ser determinada através da medição daa atividade amidolítica do TPCD, utilizando o substrato cromogénico S2403 (Chromogenix, Antuérpia, Bélgica) (ver o Exemplo 2) ou por quaisquer outros métodos conhecidos na técnica. TPCD inclui, mas não está limitado a, miniplasmina, miniplasmina recombinante, miniplasmina estabilizada, miniplasmina estabilizada, recombinante, variantes da miniplasmina, microplasmina, microplasmina recombinante, microplasmina estabilizada, microplasmina estabilizada, recombinante, e variantes da microplasmina. As variantes da microplasmina e da miniplasmina incluem formas mais curtas de microplasmina e de miniplasmina que podem ser produzidas por eliminação de aminoácido a partir destas proteínas. Espera-se que todas as variantes da microplasmina, e da miniplasmina tenham atividade catalítica da protéase 29 serina, mesmo se não possuírem o mesmo nível de atividade catalítica que a microplasmina e a miniplasmina, respetivamente. Desse modo, é requerido que todas as variantes da microplasmina e da miniplasmina contenham aminoácidos 603 - 741 da SEQ ID NO: 10, o qual contém a tríade catalítica do domínio da protéase da serina da plasmina nomeadamente, His603/ Asp646 e Ser74i do plasminogénio humano. Numa forma de realização uma variante da miniplasmina inclui as proteínas que contêm a eliminação de um ou mais aminoácido nos aminoácidos 444 - 791 do plasminogénio humano, em que a proteína resultante possui atividade catalítica da protéase serina. Numa outra forma de realização, uma variante da microplasmina inclui as proteínas que contêm uma ou mais eliminações nos aminoácidos 543 - 791 do plasminogénio humano, em que a proteína resultante possui atividade catalítica da protéase serina. Ainda numa outra forma de realização, uma variante da microplasmina inclui as proteínas que contêm uma ou mais eliminações nos aminoácidos 562 - 791 do plasminogénio humano, em que a proteína resultante possui atividade catalítica da protéase serina. As eliminações podem ser no Término-N, Término-C ou numa posição interna dos aminoácidos 444 - 791, 543 - 791 e 562 - 791 da SEQ ID NO: 10, respetivamente/ no entanto, é requerido que todas as variantes da microplasmina e da miniplasmina contenham aminoácidos 603 - 741 da SEQ ID NO: 10. As variantes da microplasmina e da miniplasmina também incluem, mas não estão limitadas a, inserções de aminoácido e/ou substituições nestas proteínas. É de prever que as substituições do aminoácido feitas na microplasmina ou na miniplasmina são substituições preferivelmente conservativas. Qualquer variante da microplasmina e da miniplasmina ou qualquer outro TPCD pode ser preparada por métodos recombinante e ser ativada para a forma ativa da 30 plasmina com um ativador plasminogénio. Alternativamente, as variantes da microplasmina e da miniplasmina ou qualquer outro TPCD podem ser preparados através de quaisquer outros meios bem conhecidos na técnica como, mas não limitadas a, digestão do plasminogénio humano com elastase ou redução parcial e alquilação da plasmina, da microplasmina ou da miniplasmina. Estas variantes da microplasmina, da miniplasmina, ou para esse caso qualquer TPCD, podem ser doseados para a atividade catalítica da protéase serina utilizando o substrato cromogénico S2403 ou qualquer outro substrato cromogénico. Adicionalmente, as variantes da microplasmina, da miniplasmina ou de qualquer outro TPCD podem ser testados para a sua habilidade de indução de PVD e/ou efetuar a liquefação vítrea através da injeção de diferentes doses da variante em qualquer solução salina equilibrada em olhos suínos, felinos ou humanos pós-morte. Se um TPCD pode induzir o PVD e/ou efetuar a liquefação vítrea em qualquer um destes olhos, esse TPCD é considerado como sendo útil no tratamento de doenças do olho dos mamíferos. Preferivelmente, o TPCD não resulta em toxicidade para o olho injetado. Exemplos não limitativos das variantes da microplasmina são fornecidos na tabela 1. TABELA 1

Exemplos Não Limitativos das Variantes da Microplasmina

As variantes da microplasmina listadas abaixo correspondem à sequência do aminoácido e à numeração do plasminogénio humano, que consiste nos aminoácidos 1 - 791 (ver, Fig.l, SEQ ID NO: 10). 31 S42-741, S42-742, S42-743, 542-744, 542-7¾ 542-754. 542-7S5, 542-7¾ 542-7¾ 542-78®, 542:-787, 542-7¾ 542-777, 942-773. 542-77$, 542-760, 542- 7¾ 542-780., 842-7S1:; 543- 741, 543-742, 543-743, 543-744, 543-753, 543-754. 543-755, 543-75®, 543-7¾ 543-7¾ .543-7¾ 543-733, 543-777, 543-773, 543-77¾ 543-730. 543- 7¾ 543-740, 544-701. 544- 741, 544-742, 544-743, 544-744, 544-753, 544-754. 544-755, 544-75®, 544-7¾ 544-788, 544-787, 544-788, 544-777, 544-778, 544-778, 544-780, 544- 769,544-790,. 544-701; 545- 741, 545-742, 545-743, 545-744, 545-753, 545-754, 545-755, 545-758. 545-785, 545-788. 545-787, 545-76®, 545-777, 545-778, 548770, 545-788, 545- 78®, 545-730, 545-78?:; 548-741, 548-742, 548-743, 548-744, 543-753, 546-754, 548-755, 548-758, 548-785, 548-788, 548-787, 546-788, 54-8-777, 54-8-778, 543-77¾ 548-780, 546- 789, S48-790. 548-78?; 547- 741, 547-742. 547-743, 547-744, 547-753, 547-754, 547-755, 547-75®, 547-785, 547-788. 547-787, 547-76®, 547- 777, 547-778, 547-778, 547-780, 847-7¾ 547-730,547-731 548- 741, 548-742, 548-743, 548-744, 54-8-7¾ 54-8-754, S48-75S, 548-75-8, 546-785, 5-46-76®, 548-767, 548-768, 546-777, 546-778, 546-773, 546-760, 546-789, M8-738. 548-73?; 546-741, 540-742. 543-743, 543-744, 549- 7¾ 549-754, 548-75®, 549-750, 544¾¾ 548-7¾ 640-787, 540-780, 549-777, 549-778, 548-778, 548-780, 54- 8-7¾ 540-790,543-731; 55- 0-741, 550-742, 553-743, 559-744. 556-783, 550-754, 556-755, 553-75®, 556-7¾ 550-768, 553-767, 559-76®. 556-777, 556-773. 553-773, 553-760, 558-7¾ 550-780,,553-791; 551-741, 551-742. 531-743, 551-744, 551-753, 551-754, 551-758, 551-750, 551-7¾ 551-7¾ 551-767, 551-780, 551-777, 551-773, 551-779, 551-763, 551- 7¾ 551-790,551-731; 552- 741, 552-742, 552-743, 552-744. 552-753, 552-754. 552-735, 552-75®, 552-7¾ 552-788, 552-787, 552-780, 552-777, 552-773, 552-773, 552-760, 552- 7¾ 552-780,552-791; 853-741, 653-742, 553-743, 553-744, 553- 753, 553-754, 5S3-7S5, 553-75®, 55-3-7¾ 553-7¾ 553-787, 553-760. 542-74®, 542-748, 542-747, 542-748, 542-757, 942-758, 542-753, 542-700, 542-780, 542-770, 542-771, 542-772, 542- 761, 542-762, 542-763, 542-764, 543- 745. 543-746, 543-747, 543-743 543-757. 543-75®, 543-759, 543-768, 543-780, 543-779, 543-771, 543-772 543- 761. 543-732, 543-733, 543-784, 544- 745, 544-746, 544-747, 544-743, 944- 757, 944-75®, 544-75®, S44-780, 544-760, 544-779, 544-771, 544-77.2 544- 781. 544-732, 544-783, 544-784, 545- 745, 545-746, 549-747, 545-746, 545-757. 545-758, 545-7¾ 545-768, 945- 76®, 945-778, 545-771, 545-772;. 545- 781, 545-782, 545-783, 545-784, 548-745, 548-748, 548-747, 548-743, 548-757. 548-756. 546-753. 548-780, 548-760, 548-779, 548-771, 548-772 546- 731. 548-782, 543-783, 548-784, 947-745, 947-746, 547-747, 547-748, 547- 757, S47-75®, 547-7¾ 547-780, 947-76®, 947-776, 547-771, 547-772;. 547- 781, 547-782, 547-783, 547-784-, 548- 745, 548-746, 548-747, 548-743, 548-757, 548-79B, 548-7¾ 548-780 543-76®. 543-779, 543-771, 543-772, 946- 761, 543-762, 543-783, 543-734, 940-745, 943-746, 543-747, 549-748, 548- 757, 548-7¾ 548-750, 548-789, 549- 768, 549-779, 549-771, 549-772 548-781, 548-782, 548-783, 548-7¾ 559-74®. 550-746, 559-747, 559-748, 550- 757, 550-756, 583-75®, 550-739, S59-76®. 550-779, 550-771, 559-772, 950- 761, 953-762, 950-763, 550-7¾ 951- 745, 951-746, 551-74?, 5S1-748, 551- 787, 551-7¾ 581-7¾ 551-780, 551- 769, 531-779, 551-771, 551-772, 851- 761, 851-732, 851-733, 881-734, 852- 74®, 852-748, 852-747, 552-748, 952- 757, 552-7¾ 552-7¾ 952-730, 552- 760, 552-779, 592-771, 552-772 952-761, 952-762, 952-763, 952-7¾ 553- 74®, 553-746, 553-747, 553-746 853- 757, 853-7¾ 853-75®, 553-768, 553-768, 553-779, 553-771, 553-77¾ 842- 748. 842756 842-751, 842-752, 942-731. 942762, 942-763. 942764. 542- 773, 542:-774, 542-775, 542-776, 942-735. 542-768, 542-767. 54278®. 543- 740, 543-756 543-751, 543-792, 843- 731. 843-792, 843-793, 543-794. 543- 776, 543-774, 543-778, 543-779, 843-788, 843-796 543-797, 84279®, 544- 740, 544-783, 544-781 544-782, 542731 544-762, 544-763. 544-764. 544-773, 544-774, 544-775, 544-779, 544- 735, 544-7¾. 544-787, 544-788, 545- 746 545-756 545-751, 545-752, 845- 791, 845-792, 545-793, S4®-794, 545- 773, 545-774, 545-779, 545-77®, 548-735, 545-789, 545-787, 545-786, 548-740, 548-783, 5-48-781 548-782, 548-781, 548-782, 548-783, 548-784, 548-773, 548-774, 548-775, 549-776, 548-7¾ 548-786 548-787, 548-788, 547-740, 547-753, 547-751 547-752, 847-791, 847-792, 847-793, 847-794, 547-773, 547-774. 547-779. 547-77®. 547- 785, 547-713, 547-787, 547-711, 548- 740, 548-783, 548-781 549-782, 548-781, 548-786 548-783, 548-784, 846- 773. 849-774, 849-775, 548-77®, 546- 735, 540-76®, 543-767, 546-7¾ 543-74®. 542753. 549-751 542752. 542781 542712, 542713, 542784, 548-776. 542774, 548-775, 548-778, 542785, 542718, 548-717, 542786, 859-74®, 859-750, 859-751 559-752, 552731 552762, .552763, .550-764, 852773, 852774, 850-775, 850-77®, 552739, 552721, .552767, .552783, 551-74®. 551-753. 551-751 551-752. 551- 781, 551-712, 581-713, 551-714, 591-776 591-774, 551-775, 551-77®, 851- 795. 851-7SS, 851-767, 851-76®, 852- 740. 852750, 852-751 852-752, 582-761 582:-762, 5524763, 552764, 552- 773, 552:-774, 552-775, 552-77®, 582-735, 58276®, 582-767. 55276®. 892740, 852756 553-751, 553-752, 853- 761. 853-792, 853-763, 853-794, 553- 776 553-774, 553-778, 553-77®, 32 553-777, 553-778, 553-77«, 553-780, S53-761. §53-782, 553-7¾¾ 553-784, 553-785. 553-7¾ 553-787, 55:3-788, 553- 78¾ §53-790,553-791; 554- 741 554-742. 554-743. 554-744, 554-745,. 554-748, 554-747, 554-748, 554-741 554-750, 554-751. 554-752, 554-7¾ 554-754, 554-755. S54-7S8, 554-757, 554-758, 554-75¾ 554-788, 554-78 1 554-782. 854-793. 554-784, 554-785, 554-788, 554-787, 554-788, 554-788, 554-778, 554-771 554-772, 554-771. 554-774, 554-775, 554-778, 5S4-777', 554-778, 554-778, 554-788, 5544-781, 554-782, 544-733, 554-784, 554-785. 554-7Β8, 554-787, 554-7BS, 554- 780, 554-790. 554-731; 555- 741 555-742, 555-741. 555-744, 555-745, 555-748, 555-747, 555-748, 555-748, 555-750, 555-751, 555-752, 555-753, 555-754. 555-755. 555-758, 555-757,. 555-758, 555-759; 555-7¾ 555:-781 555-782, 555-763, 55-5-764, 555-765, 555-706, 5SS-7S?. 555-788, 555-769. 555-770, 555-771, 555-772, 555-773. 555-774 , 555-775, 555-776, 555- 777, 555-778, 555-77¾ §55-780, 565-701, 565-732, 555-783, 556-784. 565-705, 555-786, 555-787,. 556-780, 655-789; 55S-789,555-791; 558-741, 556-742, 556-741 §58-744, 568-745, 568-746, 556-747, 556-748, 558-746, 556-750, 556-751, 558-752, 556- 753, 556-754, 556-755, 556-758, 556-757,. 556-750, 556-759; 556-7¾ 556-761, 556782, 568-763, 560-704, 5S6-765, 558-768, SS6-7&7, 558-763, 556-769, 558-779. 558-771, 558-7¾ 556-773, 556774, 558-775, 556776, - 556- 777, 558-778, «17?! 556780, 556-781, 558-782, 556769; 558-730,556791; 557- 741, 557-742, 557-743. 557-744, 557-745,. 557-746, 557-753, 557-754, 557-755, 557-756, 557-757, 557-7¾ 557-765; 557-780. 557-767, 557-708, 557-789,. 557-770, 557-777, 557-77¾ 507-771 557-780, 557-761 557-762. 557- 7£9; 557-790, 557-791; 560-741 553-742, 558-743, 556744, 558-745, 550-748, 558- -75¾ 558-754, 556-755. §58-758, 558-757, 558-756, 558-766, 653-7¾ 5S&787, 556708, S58-789, §58-770, 550-777, 550-778, 308-771 556780, 556701, 556-762, 556-769; 558-709,553-791; 550-741, 559-742, 559-741, 553-744, 558-745, 559-748, 558- 753; 558-754, 556755, 553-758, 558-757, 558-750, 559- 765. 558-7¾ 558-787, 551768, 551-769. 559-770, 559- 777, 553-778, 556771, 551-70S, S51-781, 556-732, 5S6769; 558-700,656791; 560- 741, 568-742. 586743. §60-744, 560-745,. 500-746, 589-753, 569-759, 586755, 5S&-758, 506-757, 508-750, 560- 785, 5867¾ 566767. §60-708, 560-7¾. 568-776, 589-777; 569-77¾ 566771 506780, 589-761 560-732, 566709; 560-790,506791; 581-741, 561-742. 581-743, 561:-744. 561-7 ¾ 561-748, 581-753, 501-754, 501-755. §61-750, 561-757, 50:1-753, 581- 785, 581-788, 581-707, 581-708, 581-7¾. 561-770, 561- 777; 561-77¾ 561-771 581-780, 531-761 531-732, 561- 788:, 561-790,501-791; 562- 741, 362-742, 562-741. 562-744, 5321745,, 532-743, 562-753, 582-754, 532-755. §62-758, 562-757. 562-750, 582- 785, 562-7¾ 582-707, 532,788, §62-760, 562-779, 582-777, 532-773, 582-771 §92-769, 532-701, 532-762, 582- 769; 562-709, §62-791; 583- 741, 583-742, 503-743. §63-744, 583-745, 583-746, 583-753, §83-754, 581-755, 583-758, £03-757, £63-7¾ 583-765, 563-7¾ 568-787, 583-766, §63-769, §66-770, §83-777, §63-778, 582-771, 583-700, £03-781, §83-782, 583- 769, 56 3-790,581-731 564- 741 564-742, 504-743. §64-744, 564-745,. 5-84-746, 584- 753, 564-754, 564-755, 584-758, 584-757. 584-758, 584-785, 584-788, 584-767, 584-708, 504-789, £84-776, 584-777; 564-77¾ 564-7?! 684-760. §64-761 §64-732, 584-7¾. £64-790. 584-791; 565- 741, 565-742, §65-741 585-744, §65-746, §6-5-748, 558-783, 550-7Μ, £5ΐ?δ£. §58-788, 568-787, 560-788, §§7-747, 557-74¾ 567-741 657-750, §57-751 §5-7-752. 557-7¾ 557-7¾ 557-761. §57-762, 567-7S3, 557-704, §§7-771, 537-772. 557-773, 557-774, §57-775, 327-775. 557- 783, 557-784, 587-785. §57-768, .§§7-787, 557-788, 558- 747, 55Β-746, 556-741, §58-750, £58-751, £58-752, 5S8-75-S; 556-7¾ 568:-701, 55Β-702, 558-763. 556-764, 558-771, 550-772, 5:56-773, §58-774 , 5583775,. 558-778, 558- 783, §§8-784.. 556-785, 553-708, £58-787, £58-788, 559- 747, 559-748, 559-741, 55!?«, 551-751,. £59-752, 559-729. 559-7¾ £68-781, 551762, §£1763, §£9-764, 550-771, 550-772, 501-773. §50-774, £50-7725, 540-77Ô, 551783, 559-7S4, 5§!7δ£. 551788, 5617S7, 559-768, 509-747; 566-74¾ §60-741 501750, §69-761 §66-752, 583-7¾. 580-7¾ 501781, §61762, 560-783, 589-704, 509-771, §66-772, §60-773, £01774, §60-775, §60-778, 580- 783; 580-764, 500-785. §61768, £61707,. 560-708, 581- 747, 561-74¾ §61-741 581-750, §61-751. §01-752, §61-759; £61-7¾ 561-781, 581-702, 861-763. 861-764, 581- 771, 581-772, £01-773. §61-774, 561-775, 561-778, 561-783, 581-704, 581-785. §61-768, §61-787,. §81738, §82-747, 582-748, 582:-741, 582-750, £02-751, §82-752, 502-759; £6:2-7¾ §62-781, §02-762, §62-763, §62-764, 582- 771, 582-772, 862-773. §62-774, £62-775, 562-776, 582- 783, 562-784, 582-735, 532-708, £02-787, £82-768, §03-747. £63-74¾ 5638741, 503-750, 8Β3-751 863-752, 5617¾. 583-7¾ §63-781, §61762:, 588-783, 561784, 583- 771, 583-772, 503-773. §63-774, §63-775, 503-776, 583- 783, «3-784, 501788. §81768, »81787, 581788, 504-747', £64-74¾ §64-741 501758, «4-751. §64-752, 584- 7¾ 584-7¾ 504-761. §64-762, 564-783, 584-7Β4, 584-771, £64-772, §84-771 §04-774, «4-775, «4-776, 584- 78! 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A miniplasmina e a microplasmina são produzidas sobre a ativação do miniplasminogénio e do microplasminogénio através de ativadores plasminogénios tais como, mas não limitados a, estreptoquinase, estafiloquinase, ativador plasminogénio do tipo tecido ou por uroquinase. O miniplasminogénio e o microplasminogénio são derivados a partir do plasminogénio, que é uma glicoproteina de cadeia simples que é um componente importante do sangue dos mamíferos. O plasminogénio humano é uma proteína de multi-domínio de 791 resíduos (SEQ ID NO: 10), composto por um domínio de pré ativação do terminal-N, cinco domínios kringle homólogos, cada um com cerca de 80 aminoácidos, um domínio catalítico da protéase da serina e sequências de ligação interdomínios. A plasmina ou os ativadores plasminogénios quebram as ligações peptídicas entre Arg68 -Met69, ou LÍS77 - Li s 78 ou Lís78- Val79 no terminal-N do plasminogénio humano, resultando em proenzimas mais curtas chamadas Lis-plasminogénios (por exemplo, proteínas que consistem em aminoácidos 69 - 791 ou 78 - 791 ou 79 - 791). A quebra adicional através da enzima elastase remove os primeiros quatro domínios kringle produzindo a proenzima, miniplasminogénio (tipicamente aminoácidos 442 - 791) . A quebra adicional do quinto kringle origina a proenzima, microplasminogénio (tipicamente aminoácidos 543 - 791) . Os kringles do plasminogénio contêm locais de ligação de 37 lisina que medeiam a ligação especifica do plasminogénio aos substratos tais como a fibrina. As formas de proenzima de plasminogénio são ativadas nas suas formas enzimaticamente ativas através da quebra da ligação peptidica entre o Arg56i e o VaÍ562 gerando uma forma de cadeia dupla de ligação de dissulfeto da proteína correspondente. 0 produto da ativação de uma proteína plasminogénia é chamado uma plasmina. Desse modo, o produto da ativação de Lis-plasminogénio é chamado Lis-plasmina, enquanto os produtos da ativação do miniplasminogénio e do microplasminogénio, são referidos como miniplasmina e microplasmina, respetivamente. A Lis-plasmina tem um peso molecular de cerca de 65.000 na sua forma não glicosilada e um peso molecular de cerca de 83.000 daltons na forma totalmente glicosilada, enquanto a miniplasmina tem um peso molecular de cerca de 38.000 daltons, e a microplasmina tem um peso molecular de cerca de 26.500 daltons na forma reduzida e de cerca de 29.000 daltons na forma não reduzida. Tal como a plasmina, a miniplasmina e a microplasmina possuem atividade catalítica. Uma vantagem da miniplasmina e da microplasmina sobre a plasmina são os seus menores tamanhos comparados com a plasmina. Desse modo, espera-se que tanto a microplasmina como a miniplasmina tenham mais rápidas taxas de difusão no vítreo do que a plasmina (Xu, J. e outros, Pharmaceutical Research 17: 664 - 669, 2000).

Numa forma de realização, um TPCD tem um peso molecular menor do que cerca de 40.000 daltons. Numa outra forma de realização, um TPCD tem um peso molecular entre cerca de 20.000 e cerca de 30.000 daltons. Ainda numa outra forma de realização, um TPCD tem um peso molecular de cerca de 26.500 daltons na forma reduzida e de cerca de 29.000 daltons na forma não reduzida. Numa forma de realização 38 adicional um TPCD tem um peso molecular menor do que cerca de 20.000 daltons. A microplasmina pode ser preparada pela reação autolitica da plasmina e do plasminogénio em solução alcalina elevada tendo um pH que varia de cerca de 9,5 a 11,5, conforme descrito na Patente dos E.U.A. N° 4,774,087.

Alternativamente, a microplasmina e a miniplasmina podem ser preparadas através de métodos recombinantes conforme descrito no pedido PCT WO 02/50290. Brevemente, o miniplasminogénio e o microplasminogénio de DNA de codificação são independentemente clonados num vetor de expressão de levedura (para por exemplo, o vetor de secreção pPICZa A da Invitrogen Corporation) que pode ser utilizado de forma a expressar estas proteínas em leveduras metilotrópicas (por exemplo, Hansenula, Pichia, Candida, e Torulopsis). Os clones de levedura que produzem proteínas do produto com a atividade da miniplasmina e da microplasmina mais elevadas são selecionados para produção em grande escala. Estes clones podem ser produzidos em qualquer escala, mas tipicamente numa escala de cerca de uns 20 litros a cerca de uns 500 litros. 0 miniplasminogénio ou o microplasminogénio segregado são purificados num processo de três etapas compreendendo cromatografia de leito expandido de troca de catiões, na cromatografia hidrofóbica, e cromatografia por afinidade. O microplasminogénio e o miniplasminogénio purificados obtidos por este processo são ativados para as suas formas ativas utilizando uma relação molar de um ativador plasminogénio (por exemplo, uroquinase, estreptoquinase, estafiloquinase, a variante do estafiloquinase SY162, etc.). Deve-se notar que o processo recombinante para produção da miniplasmina e da microplasmina pode ser estendido de forma a produzir qualquer TPCD. Uma vantagem 39 da utilização de um TPCD recombinante comparado com a enzima autóloga da plasmina é que as proteínas recombinantes podem ser preparadas a partir dos lotes de grandes produções resultando em enzimas de atividade uniforme. Uma vez que estas proteínas são de atividade uniforme, podem ser implementados protocolos padronizados. Uma vantagem adicional é que estas proteínas poderiam estar rapidamente disponíveis sem o atraso e outros problemas acessórios associados com o isolamento e a purificação da plasmina de cada paciente. 0 TPCD obtido pelos processos descritos acima pode ser concentrado, estabilizado e/ou liofilizado. Os métodos de concentração de proteínas são bem conhecidos por aqueles de conhecimentos comuns na técnica (ver por exemplo, Protein Purification Methods: A Practical Approach, Harris, E.L.V e Angal, S. (eds.), IRL press, 1989; A Guide to Protein Isolation (Segunda Edição), Clive Dennison, Publicações Académicas de Kluwer, 2003; e Protein Methods (Segunda Edição), Daniel M. Bollag, Michael D. Rozycki, Stuart J. Edelstein (eds.), Wiley, 1996). A estabilização é um método de proteção de uma proteína da degradação e/ou da inativação através da utilização de um ou mais agentes de estabilização (por exemplo, através do contacto de um TPCD com um agente de estabilização, ou purificando um TPCD na presença de um agente de estabilização). Os agentes de estabilização incluem sem restrição, ácido tranexâmico, ácido hexanoico, lisina, serina, treonina, metionina, glutamina, alanina, glicina, isoleucina, valina, ácido aspártico de alanina, poliálcool, hidratos de carbono farmaceuticamente aceitáveis, glucosamina, tiamina, niacinamida, qualquer tampão acídico compreendendo ácido cítrico, ácido acético, ácido 40 clorídrico, ácido carboxílico, ácido láctico, ácido málico, ácido tartárico, ou ácido benzoico, e sais tais como o cloreto de sódio, o cloreto de potássio, o cloreto de magnésio, o cloreto de cálcio, e quaisquer derivativos ou combinações desses. Uma vantagem da utilização do TPCD estabilizado, recombinantemente produzido comparado com a enzima autóloga da plasmina é que estas proteínas são mais estáveis do que a enzima autóloga da plasmina, a qual é obtida através da recolha do sangue e, purificação, e preparação e armazenamento da enzima da plasmina numa base de paciente por paciente. Ao contrário da enzima autóloga da plasmina, a qual necessita de ser utilizada muito cedo depois da sua preparação, o TPCD estabilizado, recombinante pode ser utilizado mesmo depois de um período de tempo significativo depois do momento da purificação. A liofilização de um TPCD da invenção pode ser executada imediatamente depois da concentração das proteínas purificadas ou depois da estabilização. Os métodos de liofilização de proteínas são bem conhecidos por aqueles de conhecimentos comuns na técnica. O TPCD liofilizado pode ser armazenado em frascos (por exemplo, de vidro) em qualquer quantidade, mas preferivelmente, em quantidades que possam ser prontamente reconstituídas para a utilização. A microplasmina, a miniplasmina liofilizada ou qualquer outro TPCD, podem ser reconstituídos num portador oftalmologicamente aceitável antes de serem utilizados para o contacto do humor vítreo e/ou aquoso. Numa forma de realização um portador oftalmologicamente aceitável é um solvente estéril que tem um pH e uma osmolaridade que são compatíveis com o vítreo do indivíduo. Exemplos não limitativos de portadores oftalmologicamente aceitáveis são 41 a solução salina isotónica, a solução de sal equilibrada (BSS) e BSS PLUS®. Uma solução de sal equilibrada tipicamente contém: 0,64% de cloreto de sódio, 0,075% de cloreto de potássio, 0,048% de cloreto de cálcio desidratado, 0,03% cloreto de magnésio hexahidrato, 0,39% de acetato de sódio trihidrato, 0,17% de citrato de sódio dihidrato, ácido clorídrico/ hidreto de sódio para ajustar o pH, e água. O método de contacto do humor vítreo e/ou aquoso utilizando as composições compreendendo um TPCD dependerá do indivíduo particular, da severidade da condição a ser tratada e da dosagem requerida para a eficácia terapêutica, e pode ser determinado por um médico numa base paciente por paciente. Pode ser utilizado qualquer método de contacto do humor vítreo e/ou aquoso que fornece uma quantidade eficaz de um TPCD ao humor vítreo e/ou aquoso. Deve-se compreender que tal contacto com o humor vítreo e/ou aquoso não tem que ocorrer simultaneamente com a administração de uma composição compreendendo um TPCD. O contacto pode ser atrasado ou ocorrer durante um período de tempo prolongado a partir do momento da administração. Um método de contacto do humor vítreo e/ou aquoso é administrar uma ou mais injeções intraoculares diretamente no humor vítreo e/ou aquoso respetivamente. O humor vítreo e/ou aquoso também pode ser contactado por injeções subconjuntivas, intramusculares ou intravenosas. Qualquer uma destas injeções pode ser conferida utilizando uma solução líquida compreendendo um TPCD de acordo com os procedimentos bem conhecidos na técnica. Alternativamente, no entanto, o humor vítreo e/ou aquoso pode ser contactado com um TPCD por qualquer outro método apropriado, o que resulta na distribuição suficiente do TPCD no humor vítreo e/ou aquoso de forma a tratar ou a prevenir a doença, ou de uma 42 complicação de uma doença, do olho de um indivíduo. Uma composição compreendendo um TPCD também pode ser administrada através da colocação de dispositivos implantáveis no interior do vítreo incluindo, mas não limitados a, OCUSERT® (Alza Corp., Paio Alto, Califórnia) e VITRASERT® (Bausch e Lomb, Inc., Rochester, Nova Iorque). A presente invenção também prevê que o humor vítreo e/ou aquoso possa ser contactado com um TPCD utilizando um depósito, uma forma sustentada de libertação, ou qualquer dispositivo implantável de modo que um TPCD seja fornecido continuamente.

Regimes de dosagens para TPCD podem ser rapidamente determinados por alguém com conhecimentos comuns na técnica e variará dependendo do paciente e do efeito desejado. 0 TPCD pode ser utilizado em qualquer dose, o que trás efeitos terapêuticos desejáveis, incluindo mas não limitados à liquefação vítrea, descolamento vítreo posterior, e/ou à limpeza do sangue, de materiais tóxicos ou de substâncias estranhas da cavidade vítrea, sem provocar toxicidade significativa ao olho (especialmente à retina) ou às estruturas anatómicas associadas. Adicionalmente, um TPCD pode ser administrado como uma única dose ou em doses múltiplas. Uma dosagem típica de TPCD está na escala de cerca de 0,005 mg a cerca de 0,2 mg por olho. Se injetado, o TPCD pode ser fornecido num volume de entrega de cerca de 0,05 mL a cerca de 0,3 mL de um solvente estéril (por exemplo, BSS estéril ou BSS PLUS®) por olho. Nos casos onde deve ser executada uma vitrectomia, o TPCD é deixado no humor vítreo e/ou aquoso durante entre cerca de 15 e 120 minutos antes da remoção do vítreo. Numa forma de realização da invenção, uma dose de 0, 125 mg de TPCD é entregue em 0, 1 mL de BSS estéril ou de BSS PLUS® por olho. Numa outra forma de realização, uma 43 dose de 0,125 mg de TPCD é entregue em 0,1 mL de BSS estéril ou de BSS PLUS® por olho durante cerca de 15 - 120 minutos antes de vitrectomia. A presente invenção também contempla a utilização das composições compreendendo mais do que um TPCD. De acordo com isso, num aspeto da invenção, o humor vítreo e/ou aquoso é contactado com uma composição compreendendo um primeiro TPCD e um segundo TPCD. Numa forma de realização particular deste aspeto da invenção, os primeiros e segundos TPCD são selecionados do grupo consistido por miniplasmina, estabilizada, variantes da recombinante, miniplasmina recombinante, miniplasmina miniplasmina estabilizada, recombinante, miniplasmina, microplasmina, microplasmina microplasmina estabilizada, microplasmina estabilizada, recombinante, variantes da microplasmina, e de quaisquer combinações desses. Num outro aspeto da invenção, o humor vítreo e/ou aquoso é contactado com uma primeira composição compreendendo pelo menos um TPCD e com uma segunda composição compreendendo pelo menos um TPCD. O TPCD pode ser as mesmas ou proteínas diferentes e pode ser administrado substancialmente ao mesmo tempo ou em momentos diferentes. Adicionalmente, um TPCD também pode ser administrado como composição que também compreende pelo menos um segundo agente. Além disso, o humor vítreo e/ou aquoso pode ser contactado com uma composição compreendendo pelo menos um TPCD seguido por uma composição compreendendo pelo menos um segundo agente ou vice-versa. Isto pode ser necessário onde o tempo requerido para cada uma destas composições é diferente, isto é, onde uma das composições necessita de mais tempo para atuar quando comparada com a outra. Um segundo agente é qualquer proteína (mas não um TPCD), substância química ou outra que é útil no tratamento ou na prevenção de doenças do olho, ou as complicações de 44 uma doença do olho. Tais segundos agentes são descritos nas Patentes dos E.U.A. N°s: 4,820,516; 5,292,509; 5, 866, 120; 6, 051, 698; 6, 462,071; 6, 596, 725; e 6, 610,292. Exemplos não limitativos dos segundos agentes utilizáveis com a presente invenção incluem enzimas glicosaminoglicanas tais como hialuronidases, condroitinase ABC, condroitinase AC, condroitinase B, condroitina 4-sulfatase, condroitina 6-sulfatase e B-glucuronidase; enzimas de colagenase; dispase; RGD que contém peptídeos tais como RGD, GRGDS, GRGDTP, Equistatina e Falvoridin; anticorpo de anti-integrina; Antagonistas receptores de P2Y; ureia, hidroxiureia, tioureia e agentes anti-angiogénicos tais como, mas não limitado a, inibidores do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) {por exemplo, anticorpos anti-VEGF, aptâmeros de VEGF, recetores de VEGF solúveis, etc.) e inibidores do fator de crescimento da placenta (P1GF) (por exemplo, anticorpos de anti-PIGF, aptâmeros de P1GF, recetores de VEGF solúveis, etc.), A maioria destes segundos agentes são eles próprios capazes de promover a liquefação vítrea e/ou a indução do descolamento vítreo posterior. Os segundos agentes Antiangiogénicos podiam ser úteis na prevenção da neovascularização no olho. A expressão de VEGF e/ou P1GF a partir de uma retina hipóxica é pensada de forma a resultar no desenvolvimento da neovascularização extra-retinal. Desse modo, inibir o VEGF e/ou o P1GF seria uma forma eficaz de prevenir a neovascularização.

Uma composição compreendendo um TPCD é útil de forma a efetuar a liquefação do vítreo e/ou a desinserção ou o descolamento do vítreo da retina e de outros tecidos (por exemplo, membranas epiretinais, macula). Como um resultado desta liquefação vítrea e/ou do descolamento vítreo, as forças fracionais do vítreo na retina e noutros tecidos são 45 minimizadas e a taxa do retorno natural dos líquidos dentro do vítreo é acelerada. De acordo com isso, as composições compreendendo um TPCD são particularmente apropriadas para o tratamento ou a prevenção de muitas doenças do olho, as quais beneficiam da liquefação vítrea, do descolamento vítreo posterior, da neovascularização extra-retinal diminuída e/ou da limpeza acelerada das toxinas ou de outras substâncias prejudiciais (por exemplo, fatores angiogénicos, fluidos do edema, sangue hemorrágico etc.) a partir da câmara posterior do olho e/ou dos tecidos adjacentes à câmara posterior (por exemplo, retina ou macula) . Exemplos de tais doenças do olho incluem, mas não são limitados a, descolamento da retina, rutura da retina, hemorragia vítrea, hemorragia vítrea diabética, retinopatia diabética proliferativa, diabética não proliferativa, degeneração macular relacionada com a idade, orifícios maculares, tração vitreomacular, enrugamento macular, exsudação macular, edema macular cistoide, deposição de fibrina, oclusão da veia da retina, oclusão da artéria da retina, hemorragia subretinal, ambliopia, endoftalmite, retinopatia da prematuridade, glaucoma e retinite pigmentosa, e outras em que os sintomas clínicos destas doenças respondem à administração de TPCD. A presente invenção contempla o tratamento de doenças do olho compreendendo o contacto do vítreo com uma composição compreendendo um TPCD. É esperado que tal contacto liquefique o vítreo e/ou induza o descolamento do vítreo posterior e/ou a limpeza da cavidade vítrea de sangue ou de outras substâncias tóxicas e/ou a diminuição da neovascularização extra-retinal, desse modo tratando ou prevenindo a doença. A presente invenção também permite métodos de prevenção ou de inibição do início de várias doenças do olho que são o 46 resultado, ou exacerbadas por, adesão vítrea à retina e a contração vítrea. Numa forma de realização, os métodos são capazes de prevenir ou inibir as doenças, ou as complicações resultantes de uma doença no olho de um indivíduo sem remover o vítreo do olho. Em particular, a invenção permite um processo de tratamento de um paciente com doenças proliferativas ou em risco de desenvolver doenças proliferativas, tais como, mas não limitado a, um paciente diabético, através da indução do descolamento vítreo posterior como uma etapa profilática na prevenção ou no retardar do início das doenças associadas com a contração vítrea ou a neovascularização no vítreo. Numa forma de realização da invenção, a composição deve ser introduzida no olho de um paciente diabético de modo a inibir a progressão da retinopatia diabética. Preferivelmente, a composição deve ser introduzida no olho antes que as doenças proliferativas ocorram. Numa forma de realização, a composição deve ser introduzida no vítreo do olho antes do início das doenças proliferativas e ser permitido que permaneça indefinidamente no olho sem remover o vítreo do olho. Em formas de realização adicionais, a invenção permite que um processo iniba as complicações na oclusão da veia central e periférica da retina, tal como a neovascularização da retina e o edema macular induzindo o descolamento vítreo posterior num paciente com necessidade de tal tratamento. A presente invenção fornece um processo para o tratamento próximo ou o orifício macular da totalidade da espessura (tanto idiopática como traumática) induzindo o descolamento vítreo posterior. A prevenção ou a redução da incidência do descolamento da retina, das ruturas da retina e da hemorragia da retina provocados pela contração vítrea podem ser conseguidas através da indução do descolamento vítreo posterior antes que tais doenças ocorram e sem remover o vítreo do olho. 47

Muitas doenças oftálmicas têm como um componente causador, uma destabilização da membrana de sangue da retina. Esta destabilização permite que vários componentes {por exemplo, componentes do soro, lipidos, proteínas) dos coriocapilares entrem na câmara vitreal e danifiquem a superfície da retina. Esta destabilização também é um precursor da infiltração vascular da câmara vitreal, conhecida como a neovascularização. A neovascularização do vítreo é dependente da matriz do vítreo. Desse modo, a liquefação do vítreo, que remove a matriz na forma do vítreo polimerizado, bloqueia a neovascularização. Numa forma de realização, a invenção fornece um método de tratamento ou de prevenção das doenças do olho acima mencionadas através da prevenção ou redução da incidência da neovascularização da retina compreendendo o contacto do vítreo com uma composição compreendendo um TPCD. Várias doenças oftalmológicas incluindo a retinopatia diabética e de trauma resultam na rutura ou no vazamento dos vasos sanguíneos da retina com resultante sangramento no vítreo (isto é, hemorragia vítrea). A hemorragia vítrea manifesta-se tipicamente como enevoamento ou opacificação do vítreo e por vezes, mas não sempre, é acompanhada pela rutura ou pelo descolamento da retina. Nos casos onde a hemorragia vítrea é acompanhada por uma rutura ou por um descolamento da retina, é importante que tal rutura ou descolamento da retina seja rapidamente diagnosticada e cirurgicamente reparada. A falha no rápido diagnóstico e reparação da rutura ou do descolamento da retina pode permitir que as células fotorrecetoras da retina, na região da rutura ou do descolamento, se tornem necróticas. A necrose das células fotorrecetoras da retina pode resultar na perda da visão. Além disso, permitir que o descolamento 48 da retina permaneça por corrigir por um período de tempo prolongado pode resultar numa hemorragia vítrea adicional e/ou na formação de tecido fibroso no local da hemorragia. 0 tecido fibroso pode resultar na formação de uma aderência fibrosa indesejável permanente entre o corpo vítreo e a retina. Na ausência de qualquer tratamento, o enevoamento hemorrágico do vítreo pode durar entre 6-12 meses ou mais para limpar suficientemente de forma a permitir a visão trans-vitreal da retina. Em tais casos, onde um médico necessitaria de reparar qualquer parte da superfície da retina, ou onde um médico necessitaria de ver a superfície da retina de um paciente que esteja prevenido por um vítreo opaco ou enevoado, pode ser necessário executar um procedimento microcirúrgico conhecido como vitrectomia. Este procedimento envolve a remoção da totalidade ou de uma zona do vítreo com um cortador microcirúrgico e a recolocação do vítreo com um líquido limpo ou outra substância que permita que a cavidade ocular mantenha a sua forma. Os procedimentos cirúrgicos padrão de vitrectomia são bem conhecidos por aqueles de conhecimentos comuns na técnica. Numa forma de realização, a presente invenção contempla o contacto do vítreo com uma composição compreendendo pelo menos um TPCD como um suplemento da vitrectomia. Noutras formas de realização, o vítreo deve ser contactado com a composição compreendendo pelo menos um TPCD na ausência da execução de uma vitrectomia. A invenção é ilustrada adicionalmente pelos seguintes exemplos, que não devem ser interpretados como limitantes da invenção no âmbito dos procedimentos específicos descritos neste documento. Pelo contrário, deve ser claramente compreendido que o recurso pode ser adicionado a várias outras formas de realização, modificações, e equivalentes das mesmas que, depois da leitura da descrição 49 49 aos das neste documento, se podem sugerir elas mesmas conhecedores da técnica sem saírem do âmbito reivindicações adicionadas. EXEMPLO 1

Construção de vetor para a expressão do microplasminogénio humano e do miniplasminogénio humano em Plchla pastoris (a) O vetor pPICZocA 0 vetor da secreção do pPICZaA comprado à Invitrogen Corporation (Carlsbad, Califórnia) foi utilizado de forma a dirigir a expressão e a secreção do microplasminogénio e do miniplasminogénio humano recombinante em Pichia pastoris. As características notáveis deste vetor incluem: (i) um fragmento de 942 bp que contém o promotor do álcool oxidase 1 (A0X1) que permite metanol induzível, elevada expressão nivelada da proteína recombinante em Pichia, bem como integração do plasmido desejado no locus cromossomais A0X1; (ii) a terminação da transcrição nativa e o sinal de poliadenilação do gene A0X1; (iii) uma gaveta de expressão confererindo resistência do zeocina à Escherichia coli e Pichia pastoris; (iv) uma origem ColEl da replicação para a propagação e manutenção do plasmido na Escherichia coli; (v) Um epitopo c-myc e uma marca poli-histidina (6X His) , que podem ser utilizados para a deteção e purificação proteica; e (vi) locais de restrição única (por exemplo, Sac I, Pme I, BstXI) que permitem a linearização do vetor do locus A0X1 para a integração eficiente no genoma Pichia.

Além das características acima, este vetor contém o sinal de secreção do prepropeptido do α-fator da Saccharomyces cerevísiae, permitindo a expressão de proteínas heterólogas como proteínas segregadas no meio. 0 processamento da sequência de encaixe do sinal do fator α no pPICZa ocorre em duas etapas: 50 1. a quebra preliminar da sequência do sinal pelo produto do gene KEX2 que ocorre entre a arginina e a glutamina na sequência Glu-Lis-Arg * Glu-Ala-Glu-Ala, onde * é o local da quebra. No entanto, as repetições Glu-Ala não são sempre necessárias para a quebra por Kex2 . 2. as repetições Glu-Ala são posteriormente quebradas pelo produto do gene STE13. Em alguns casos onde a quebra Stel3 não é eficiente, as repetições Glu-Ala são deixadas no término-NH2 da proteina expressada de interesse.

Projetadas imediatamente a jusante da sequência do sinal do fator α no vetor pPICZaA está um local de multi-clonagem com sequências de reconhecimento para as enzimas EcoR I, Sfi I, Κρη I, Xho I, Sac II e Xba I de modo a facilitar a clonagem de genes estranhos. Além do local do Xho I no local múltiplo de clonagem, está uma sequência de reconhecimento de Xho I no término carboxilo do sinal de secreção do fator a, imediatamente a jusante do local de

quebra de Lis-Arg Kex2. Este local de restrição de Xho I pode ser utilizado para clonar o gene de interesse escoado com a quebra do local Kex2 através da utilização de uma aproximação de clonagem de PCR e um encaminhamento apropriado antes de reconstruir a sequência a partir do local de Xho I até ao códão da arginina. A proteína recombinante de interesse será então expressa com um término NH2 nativo. (b) Construção do vetor da expressão para micro plasminogénio 51 A sequência do ácido nucleico que codifica a proteína humana do microplasminoqénio (aminoácidos 543 a 791 (SEQ ID NO: 4)) foi amplificada ("recuperação PCR") a partir do vetor Fmyc-μΡΙί (Lasters e outros, em Eur. J. Biochem. 244: 946, 1997) utilizando a vantaqem da mistura da polimerase do cDNA comercialmente disponível pela Clontech (Paio Alto, Califórnia). Depois de uma etapa de desnaturação do molde do DNA de 3 minutos a 94 °C, foram executados 30 ciclos de um ciclo térmico (30 segundos a 94 °C, 30 segundos a 50 °C, 30 segundos a 72 °C) , seguidos por uma etapa final de um alongamento de 2 minutos a 72 °C. Nesta reação foram utilizados os seguintes primários oligonucleótidos LY-MPLG1 (sentido) e LY-MPLG2 (anti-sentido): LY-MPLG1: 5' GGGGTATCT CTC GAG AAA AGA GCC CCT TCA TTT GAT TG (SEQ ID NO:1) LY-MPLG2: 5' GTTTTTGT TCT AGA TTA ATT ATT TCT CAT CAC TCC CTC (SEQ ID NO: 2) O primário LY-MPLG1 teve uma região de recozimento correspondente aos resíduos 543 - 548 do plasminogénio humano (Ala-Pro-Ser-Phe-Asp-Cis) precedido por uma extensão de não recozimento que incluísse os últimos quatro resíduos do sinal de ligação do fator α (Leu-Glu-Lis Arg) . Nesta extensão, os códãos de Leu-Glu determinam o local da restrição de Xho I (sublinhado) que permite a clonagem do gene de interesse escoado com o local de quebra Kex2. O primário LY-MPLG2 teve uma região de recozimento correspondente aos últimos sete resíduos do plasminogénio, seguidos por um códão de paragem TAA e uma região de não recozimento compreendendo uma sequência de reconhecimento de Xba I (sublinhada). 52 0 fragmento amplificado que tem o tamanho previsto (~ 780 bp) foi digerido com Xho I e Xba I, e direcionalmente clonado no pPICZaA do vetor. O recipiente do vetor-fragmento foi preparado por restrição de Xho I e Xba I, e purificado a partir do gel de agarose utilizando o conjunto de extração do gel de Qiaquick (Qiagen GmbH, Alemanha). A estirpe de E. coli TG1 (coleção #1208 de DSMZ, Alemanha) foi transformada com a mistura de ligação, e foram selecionados os clones resistentes de zeocina. Com base na análise da restrição, um clone plasmido que contém uma inserção do tamanho esperado foi retido para uma caracterização adicional. A determinação da sequência do vetor pPICZa-MPLGl (clone #5) que usa os primários 5ΆΟΧ e 3'AOX, que foram fornecidos no conjunto de expressão de EasySelect Pichia a partir da Invitrogen Corporation (Carlsbad, Califórnia), confirmou a inserção precisa da região de codificação do microplasminogénio fundida com o sinal de acoplamento do fator a, tão bem quanto a ausência de mutações não desejadas na região de codificação. A sequência determinada do nucleótido e a sequência deduzida do aminoácido do microplasminogénio humano utilizadas são representadas na SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4, respetivamente. Comparado com a sequência determinada previamente por Forsgren e outros, em FEBS Lett. 213: 254, 1987, a sequência do nucleótido difere em 10 posições. No entanto, a sequência do aminoácido era idêntica. (c) Construção do vetor de expressão para o mlnlplasmlnogénlo

Um vetor de secreção derivado de pPICZa foi construído conforme se segue para a expressão do miniplasminogénio, fazendo utilização do vetor pPICZa-MPLGl descrito anteriormente neste documento. 53

Um fragmento de DNA de 500 bp codificando cinco kringle e parte do dominio catalítico da proteína do miniplasminogénio (aminoácidos 444 a 604 da SEQ ID NO: 10) foi amplificado ("Recuperação PCR") a partir do vetor FdTet-SN-miniPlg (Lasters e outros, citado acima). Depois de uma etapa de desnaturação do molde do DNA de 3 minutos a 94 °C, foram executadas 30 voltas do ciclo térmico (10 segundos a 94 °C, 10 segundos a 50 °C, 15 segundos a 72 °C) , seguidas por uma etapa final de um alongamento de 2 minutos a 72 °C. Foram utilizados os seguintes primários de oligonucleótidos LY-MINPLG1 (sentido) e LY-MINPLG2 (antisense) nesta reação: LY-MINPLG1: 5'GGGGTATCT CTC GAG AAA AGA GCA CCT CCG CCT GTT GTC CTG CTT CC (SEQ ID NO: 5)

LY-MINPLG2: 5' GCA GTG GGC TGC AGT CAA CAC CCA CTC (SEQ ID NO: 6) O primário LY-MINPLG1 tem uma região de recozimento que corresponde aos resíduos 444 - 452 do plasminogénio (Ala-Pro-Pro-Pro-Val-Val-Leu-Leu-Pro) precedido por uma extensão de não recozimento que incluía os últimos quatro resíduos do sinal de acoplamento do fator (Leu-Glu-Lis-Arg). Nesta extensão, os codãos Leu-Glu determinam o local da restrição de Xho I (sublinhado) permitindo a clonagem do gene de interesse escoado com o local da quebra Kex2. O primário LY-MINPLG2 tem uma região de recozimento correspondente aos resíduos 596 - 604 do plasminogénio humano (Glu-Trp-Val-Leu-Thr-Ala-Ala-His-Cis). Esta região de recozimento do domínio catalítico, também presente no vetor da expressão do microplasminogénio, compreende uma sequência de reconhecimento de Pst I única (sublinhada). 54 0 fragmento amplificado que tem o tamanho previsto foi digerido com Xho I e Pst I, e clonado direcionalmente para dentro do fragmento do vetor recipiente derivado a partir de pPICZa-MPLGl (descrito acima). 0 fragmento do vetor recipiente foi preparado por restrição de Xho I e de Pst I, e purificado a partir do gel do agarose utilizando o conjunto da extração do gel de Qiaquick (Qiagen GmbH, Alemanha) . A estripe E. coli TG1 (coleção #1208 de DSMZ, Alemanha) foi transformada com a mistura de ligação, e os clones zeocina resistentes foram selecionados. Com base na análise da restrição, um clone plasmido que contém uma inserção do tamanho esperado foi retido para caracterização adicional. A sequência de determinação do vetor pPICZa-KMPLG1 (clone #3), utilizando os primários 5' AOX e 3' AOX, confirmaram a inserção precisa do fragmento amplificado fundido com o sinal de acoplamento do fator a, bem como a ausência de quaisquer mutações na região clonada. EXEMPLO 2 Método De Preparação De Microplasmina Recombinante, Estabilizada (a) Transformação de Píchia com pPICZa-MPLGl

Dez pg do vetor pPICZa-MPLGl foram digeridos com Pme I, os quais linearizaram o vetor na região 5' AOX1. 0 DNA foi precipitado e concentrado a cerca de 0,33 pg/μΐ em água destilada estéril, e foram utilizados 5 μΐ de forma a transformar as X33 células competente de Pichia pastoris preparadas de acordo com o manual fornecido no conjunto de expressão de Pichia da EasySelect. (b) Seleção de uma estirpe de Elevada Expressão A seleção de uma estirpe de elevada expressão foi executada conforme se segue. Os transformantes resistentes de Zeocina 55 foram selecionados em placas de YPDSZ (1% de extrato de levedura, 2% de peptona, 2% de glucose, 1M de sorbitol, 2% de agar, 100 pg/mL de zeocina). Foram inoculadas trinta e quatro colónias no meio de 10 mL de BMYZ-glicerol (1% de extrato de levedura, 2% de peptona, 1% de glicerol, 100 mM de fosfato de potássio, pH 6,0, 1,34% de base de nitrogénio de levedura, 4 x 10“5% de biotina, 100 pg/mL de zeocina) nos tubos de Falcon de 50 mL e cultivado durante 16 horas a 30 °C. As células foram granuladas e re-suspensas em 2 mL de meio de BMYZ-metanol (o mesmo que o BMYZ-glicerol mas com 0,5% de metanol em vez de glicerol) de modo a induzir a expressão do promotor AOX1, e foram cultivadas durante 40 horas. Foram fornecidos 4 pulsos de 0,5% de metanol às culturas durante este período (depois de 6, 22, 26 e 30 horas) . No final da cultura da indução, a presença do microplasminogénio na cultura sobrenadante foi estimada conforme descrito por Lijnen e outros, em Eur. J. Biochem. 120: 149, 1981. Brevemente, o microplasminogénio em sobrenadantes puros ou diluídos 10 vezes foi incubado com uroquinase durante 30 minutos de forma a ativar o microplasminogénio em microplasmina. A atividade da microplasmina gerada, conforme determinada pela sua atividade amidolítica medida com o substrato cromogénico S2403 (comercialmente disponível pela Chromogenix, Antuérpia, Bélgica) em diferentes momentos, foi comparada com a atividade de quantidades conhecidas de preparações da plasmina ou da microplasmina purificada. O clone X33-MPLG1 #5, mostrando a atividade mais elevada da microplasmina depois da ativação da uroquinase, foi selecionado para a subsequente produção de elevada escala. Este clone foi depositado sob as provisões do tratado de Budapeste com Belgian Coordinated Collections of Microorganisms (BCCM-MUCL-COLLECTION) em 12 de dezembro, 2001, sob o Número de Entrada MUCL 43676. 56 c) Fermentação A fermentação de X33-MPLG1#5 numa escala de 50 litros foi efetuada em quatro etapas conforme se segue. Foram executadas culturas de células em frasco de dois litros durante 23 horas a 30 °C em 400 mL YSG+ (6 g/L do extrato de levedura, 5 g/L de peptona de soja, 20 g/L de glicerol) utilizando um inoculo de 0,7 mL (do frasco do banco de células glicerol número OOC17) e agitação a 270 rpm, rendendo (no final da etapa de pré-cultura) um OD600 de 15. A fermentação foi então executada num dispositivo de fermentação MRP80 num meio basal 30 L (26,7 mL/L H3PO4 85%, 1,05 g/L CaS04.2H20, 18,2 g/L K2S04, 14.9 g/L MgS04.7H20, 4,13 g/L KOH, 40 g/L de glicerol a 100% e 4,76 mL/L de solução salina de PTM1 [compreendendo 6 g/L CuS04.5H20, 0,08 g/L Nal, 3,36 g/L MnS04.H20, 0,2 g/L NaMo04.2H20, 0,02 g/L de ácido bórico, 0,82 g/L CoCl2.6H20, 20 g/L ZnC42, 65 g/L FeS04.7H20, 0,2 g/L de d-biotina e 5 mL/L HSS04] ) , utilizando 600 mL de inoculo a 30 °C com um fluxo de ar de 50 L/min à pressão atmosférica, dissolveu o oxigénio (DO) > 20% e agitação de 200 - 500 rpm, sendo o pH mantido a 5, 8 com 12,5% de amónio. Em 24 horas e em OD 600 de 50 (fim da etapa do grupo), a depleção do glicerol foi evidenciada por um aumento rápido do oxigénio dissolvido. A alimentação do glicerol (632 g/L de glicerol 100% e 12 mL/L PTM1) aumentou o OD 600 até 258 em 24 horas. Foi então efetuada a alimentação do metanol com um aumento do fluxo de até 250 mL/h dentro de 6 horas, o qual foi mantido durante 66 horas utilizando 988 mL/L de metanol e os 12 mL/L de PTM1 de forma a alcançar um OD 600 de 352 no final da cultura. A fermentação do X33-MPLG1#5 numa escala de 350 litros conferiu resultados proporcionais similares. (d) Purificação 57 A colheita foi então purificada num processo de três etapas compreendendo cromatografia de leito expandido de troca de catião, cromatografia hidrofóbica e cromatografia de afinidade conforme segue: i) Cromatografia de leito expandido de troca de catião A cromatografia de absorção de leito expandido de troca de catião foi efetuada com Streamline SP (comercialmente disponível pela Pharmacia Biotechnology, Cat. N° . 17-0993-01/02) embalado numa coluna Streamline 200 (da Pharmacia Biotechnology, Cat. N° . 18-1100-22) com um volume do leito de 5,120 cm3, expandido e equilibrado através da aplicação de um fluxo ascendente de 1 M de NaCl, 25 mM de tampão de acetato de sódio (CH3COONa.3H20) , pH 6,0, para dois volumes da coluna seguido por volume de coluna de 25 mM de tampão de acetato de sódio, pH 6,0. 0 concentrado da fermentação foi diluído em linha (7x) com água e passado a montante através do leito expandido a uma taxa de fluxo de 1.000 mL/min. O material limite solto foi escoado para fora com o fluxo ascendente do tampão de acetato de sódio de 25 mM pH 6,0. O adaptador da coluna foi então descido até à superfície do leito sedimentado a uma altura de 16,3 cm. O fluxo foi invertido e as proteínas capturadas eluídas com 2 volumes da coluna de 0,5 M de NaCl, 25 mM de tampão de acetato de sódio, pH 6,0. Foi adicionado sulfato de amónio sólido à fração Streamline eluída de forma a atingir 30% de saturação (164 g de sulfato de amónio por litro da fração Streamline eluída) e a mistura foi delicadamente agitada a 4 - 8 °C durante 1 hora. ii) Cromatografia Hidrofóbica A cromatografia Hidrofóbica foi efetuada com o Hexyl TSK 650C (comercialmente disponível pela Toso-Haas CAT. N° . 19027) embalado numa coluna Vantage 180/500 (comercialmente 58 disponível pela Millipore, Cat. N°. 87018001) com um volume embalado de 2,700 cm3 a 4 - 8 °C. A fração Streamline eluída foi carregada na coluna a uma taxa de fluxo de 38 L/hora. A coluna foi então lavada com 1,5 volumes da coluna de 25 mM de tampão de acetato de sódio, pH 6,0, contendo 164 g/L de sulfato de amónio e eluida a partir da coluna com 7 volumes da coluna de 25 mM de tampão de acetato de sódio, pH 6,0. iii) Cromatografia de afinidade A cromatografia de afinidade foi efetuada com Blue Sepharose 6 Fast Flow (comercialmente disponível pela Pharmacia Biotechnology, Cat. N°17-0948-02/03) embalado numa coluna Vantage 130/500 (comercialmente disponível pela Millipore, Cat. N°. 87013001) com um volume embalado de 3,186 cm3 a 4 - 8 °C. A fração eluída foi carregada na coluna a uma taxa de fluxo de 20 L/hora, e lavada com um volume da coluna de 25 mM de tampão hidrogenofosfatase dissódico (Na2HP04.12H2O) , pH 7,0. A fração da proteína do microplasminogénio foi eluída a partir da coluna com 5 volumes da coluna de 0,5 M de NaCl, 25 mM de tampão hidrogenofosfatase dissódico, pH 7,0, e mantida congelada a -20 °C. A pureza do material estava acima de 98% conforme demonstrado pela eletroforese de gel de SDS. (e) Ativação quantitativa para e estabilização da microplasmina i) Ativação quantitativa A ativação do microplasminogénio para microplasmina foi efetuada a 23 °C durante 30 minutos numa relação molar de 0,5% de uma variante SY162 do estafiloquinase em 0,5 M de NaCl, 25 mM de tampão hidrogenofosfatase dissódico (Na2HP04.12H20) , pH 7,0. SY162 é uma variante do estafiloquinase com a imunogenicidade reduzida 59 compreendendo 12 substituições de aminoácido (K35A, E65Q, K74R, E80A, D82A, T90A, E99D, T101S, E108A, K109A, K130T e K135R) em comparação com o tipo natural, conforme descrito pelo documento WO 99/40198. O sulfato de amónio sólido foi adicionado à microplasmina numa concentração final de 1 M (132 g/L) e a mistura agitada a 4 - 8 °C durante 15 minutos. ii) Cromatografia Hidrofóbica A cromatografia Hidrofóbica foi realizada com Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (comercialmente disponível pela Pharmacia Biotechnology, Cat. N°. 17-0965-03/05) embalada numa coluna BPG 100/500 (comercialmente disponível pela Pharmacia Biotechnology, Cat. N° . 18-1103-01) tendo um volume embalado de 1.738 cm3, equilibrado com 4 volumes da coluna de 25 mM de tampão Na2HP04· 12H20, pH 7,0, contendo 0,1 M do agente de estabilização, ácido tranexâmico (comercialmente disponível pela Bournonville Pharma, Braine-L'Alleud, Bélgica) e 1 M (NH^SCh pH 7,0, a 4 - 8 °C. O produto ativado foi carregado na coluna a uma taxa de fluxo linear de 18 L/hora e escoado com 4,5 volumes de coluna de 25 mM de Na2HP04.12H20, pH 7,0, contendo 0,1 M de ácido tranexâmico e 1 M (NH4)2SC>4. A microplasmina foi eluída a partir da coluna a uma taxa de fluxo linear de 6 L/hora com 5 volumes da coluna de 25 mM de tampão Na2HP04.12H20, pH 7,0, contendo 0,1 M de ácido tranexâmico e 0,7 M de (NH4)2S04 e equilibrada com tampão salino fosfato contendo 0,1 M de ácido tranexâmico. A variante SY162 de estafiloquinase foi então eluída a partir da coluna com 25 mM de tampão Na2HP04.12H20, pH 7,0 contendo 0,1 M de ácido tranexâmico. Este procedimento removeu acima de 99% da estafiloquinase do pico da microplasmina conforme demonstrado com um ensaio específico de ELISA. 60 iii) Concentração e diafiltração através de ultrafiltração tangential

Nesta etapa, o eluido da etapa (ii) foi concentrado e o tampão foi trocado pelo tampão de ácido cítrico de baixo pH. O ácido tranexâmico da etapa (ii) foi removido durante esta etapa e a microplasmina foi estabilizada através do tampão de baixo pH de ácido cítrico. A Ultrafiltração foi efetuada com membranas 2 Pellicon 2 Biomax (5 kDa, 2,5 pm comercialmente disponível pela Millipore, Bedford, Massachusetts, Cat. N°. P2B005A25) a 2 8 °C. As membranas foram instaladas num Pellicon 2 Process Holder conectado a um Microgon Pump Cart System (comercialmente disponível pela Microgon, Montes de Laguna, Califórnia). As membranas foram lavadas com água purificada e a integridade da membrana testada antes da operação. A limpeza foi efetuada através da recirculação contínua com 0,5 M de NaOH durante 60 minutos e com 0,1 M de NaOH durante 60 minutos. A etapa de limpeza limpa profundamente a membrana de forma a eliminar qualquer traço potencial de proteína restante na membrana antes de aplicar a amostra. As membranas foram então enxaguadas com 5 mM de ácido cítrico, pH 3,1, até que o permeato atinja um pH de 3,1. O pH do eluido Phenyl Sepharose foi ajustado para 3, 1 e a proteína foi concentrada até 4 mg/mL através da ultrafiltração. A Diafiltração foi realizada durante 60 a 90 minutos contra 5 volumes de 5 mM de ácido cítrico, pH 3,1. Os rendimentos (expressos em gramas) de três ciclos efetuados num instrumento de fermentação de 50 litros são sumarizados na Tabela 2. 61 TABELA 2

Ciclo 1 Ciclo 2 Ciclo 3 Fermentador 220 240 ND Streamline 50 79 130 Hexil 36 37 ND Blue 25 28 30 Fenil 17 20 26 Diafiltração - - 22 (Legenda: ND: não determinado) iv) Filtração Estéril (0,2 μπι)

Esta etapa foi efetuada de modo a assegurar a ausência de contaminação microbiana. 0 Manitol foi adicionado a 2 - 8 °C a uma concentração de 1,5 g/g de proteína e filtração estéril efetuada a 23 °C num filtro Millipak 100 (tamanho 500 cm2) (comercialmente disponível pela Millipore, Cat. N°. MPGL10CA3) e enxaguado com cerca de 500 mL de 5 mM de ácido cítrico, pH 3,1, com uma bomba peristáltica a uma taxa de fluxo de 500 mL/min. O filtrado foi recolhido num saco estéril e livre de pirógenos e armazenado a -20 °C. EXEMPLO 3 Método de preparação de um Miniplasmina Recombinante, Estabilizado

Cerca de 15 pg do vetor de pPICZa-KMPLG foram digeridos numa reação de 20 μΐ com Pme I, o que lineariza o vetor na região 5'AOX1. O DNA linear (3 pg) foi utilizado de forma a transformar as competente células Pichia pastoris X33 preparadas de acordo com o manual fornecido no Conjunto de expressão da EasySelect Pichia. 62 A seleção da estirpe de elevada expressão foi efetuada essencialmente conforme se segue. Os transformantes resistentes de Zeocina foram selecionados em placas de YPDSZ (conforme definido no exemplo 2). Cinquenta colónias isoladas foram inoculadas no meio de 15 mL de BMYZ-glicerol (conforme definido no exemplo 2) em tubos de Falcon de 50 mL e cultivadas durante 16 horas a 30 °C. As células foram granuladas e ressuspensas no meio de 1,5 mL de BMYZ-metanol (conforme definido no exemplo 2) de forma a induzir a expressão do promotor AOX1, e cultivadas durante 4 0 horas. Durante este período foram regularmente fornecidos 3 ou 4 pulsos de 0,5% de metanol às culturas. No final da cultura de indução, a presença do miniplasminogénio no sobrenadante da cultura foi estimada conforme descrito por Lijnen e outros, (citado supra). Rapidamente, o miniplasminogénio em sobrenadantes diluídos 10 vezes foi incubado com a estreptoquinase durante 10 minutos de modo a formar um complexo ativo. A atividade da miniplasmina gerada, conforme determinada com o substrato cromogénico S2403 (ver o exemplo 2) em momentos diferentes, foi comparada com a atividade de quantidades conhecidas de uma preparação de plasminogénio purificado. Nestas circunstâncias, todos os clones testado produziram miniplasminogénio com rendimentos que variam entre 3 e 15 mg/L. Foram selecionados os dois clones X33-KMPLG1 #6 e X33-KMPLG1 #25, mostrando a atividade mais elevada da miniplasmina, para subsequente produção de elevada escala. Estes dois clones foram depositados sob as provisões do Tratado de Budapeste com as Belgian Coordinated Collections of Microorganisms (BCCM-MUCL-COLLECTION) a 4 de dezembro de 2003 e foram reconhecidos com o Número de Entrada MUCL 45309(clone X33-KMPLG1 #6) e Número de Entrada MUCL 45308 (clone X33-KMPLG1 #25) . 63 EXEMPLO 4

Novo Método de Fixação

Esta experiência foi realizada de modo a estabelecer uma técnica de fixação que seja de confiança para investigar os efeitos dos meios e de diferentes agentes no descolamento vítreo posterior (PVD) em olhos suínos normais.

Os olhos suíno recentemente isolados obtidos a partir do matadouro ou foram imediatamente processados ou foi-lhes permitido manterem-se à temperatura ambiente durante até 6 horas. A córnea foi removida de modo a facilitar a fixação. Os olhos foram fixados na solução de Peter (1,25% de glutaraldeído/1% de paraformaldeído em 0,08 M do tampão de cacodilato de pH 7,4) a 0 °C durante 24 a 36 horas de forma a parar as reações enzimáticas. Os olhos foram então lavados com 0,1 M de tampão de cacodilato de pH 7,4 e progressivamente desidratados em concentrações progressivamente mais elevadas de etanol até 100%.

Tanto os olhos recentemente processados como os olhos aos quais foi permitido manterem-se à temperatura ambiente durante 6 horas não mostraram alterações significativas na ultraestrutura da retina, e o vítreo manteve-se unido à superfície da retina. Desse modo, este método fornece um procedimento de fixação não traumático para o tecido do olho e minimiza a possibilidade de separação do vítreo da superfície da retina. Além disso, este procedimento permite que a totalidade da superfície da retina, desde o nervo ótico até à periferia da retina seja estudada. EXEMPLO 5

Efeito Da Microplasmina Na Relação Vítreoretinal Em Olhos Suinos Pós-Morte 64

Esta experiência foi efetuada de modo a determinar a capacidade da microplasmina de desinserir o córtex vítreo posterior da membrana limitante interna da superfície da retina. A microplasmina foi utilizada nas seguintes doses: 0,0625, 0, 125, 0, 156, 0, 25 e 0, 390 mg, num volume de 0,1 mL de solução de irrigação intraocular, BSS PLUS@. O pH destas soluções da microplasmina variou desde 7,92 para as doses de 0,0625 mg até 6,52 para as doses de 0,390 mg.

As soluções da microplasmina acima divulgadas foram injetadas separadamente no humor vítreo dos olhos obtidos a partir de porcos recentemente abatidos à temperatura ambiente (24 °C) . Os olhos foram fixados conforme descrito no Exemplo 4, após 15 minutos, 30 minutos, 60 minutos ou 120 minutos depois da injeção de microplasmina. O descolamento vítreo posterior (PVD) foi observado 1 hora depois do tratamento com 0,0625 mg da microplasmina, uma vez que o PVD era visível a partir de cerca de 30 minutos depois da injeção para todas as doses que incluíam e acima de 0,125 mg da microplasmina. Este descolamento foi mais aparente cerca de 120 minutos depois da injeção (Fig. 4, Painel A) , em todas as secções da superfície da retina, exceto perto da base vítrea (a zona que se estende desde a retina periférica até à ora serrata onde a adesão ao vítreo é forte). Além disso o descolamento vítreo posterior (Fig. 4, Painéis B - E) , a microscopia de eletrão mostrou que a estrutura do vítreo foi alterada de modo a ter presente menos da estrutura fibrilar. A estrutura fibrilar foi modificada para uma consistência de vidro mais amorfa, mais granulada, que indicasse a liquefação do humor vítreo (Fig. 4, Painel F). 65

Doses inferiores a 0,25 mg não resultaram em qualquer toxicidade ocular ou da retina conforme determinado por exame grosseiro ou pela histopatologia, incluindo a microscopia de eletrão. Em particular, não havia qualquer sinal de levedura. A vacuolização das células é frequentemente vista como um primeiro sinal da levedura e em doses abaixo de 0,390 mg, não é observada qualquer vacuolização. Também examinámos outras estruturas oculares através da microscopia de eletrão (Fig. 5, Painéis A e B) . Não foi observada qualquer alteração estrutural à retina em doses inferiores a 0, 390 mg. No entanto, em poucos olhos tratados com 0,25 mg de microplasmina, as elevações da retina e um pequeno número de células inflamatórias estavam escassamente distribuídas na superfície da retina. A histologia grosseira do olho tratado com a dose mais elevado de microplasmina (0,390 mg), indicou que o interface da retina teve uma aparência esbranquiçada. A microscopia de eletrão deste olho revelou que havia múltiplas pequenas elevações na superfície da retina, o que sugere o descolamento da retina localizado.

Estas experiências mostram que a microplasmina utilizada numa dosagem de 0,06 a 0,2 mg resultou na separação consistente do hialoide posterior sem induzir quaisquer alterações ultraestruturais na retina. A separação hialoide posterior não é apenas no nervo ótico mas também em todo o sentido da base vítrea. A separação hialoide posterior deixa uma superfície da retina clara, suave na qual não podem ser reconhecidas quaisquer fibras de colagénio utilizando a exploração de microscopia de elevado eletrão (ampliação de 12.000X), uma ampliação que é suficientemente elevada para excluir a possibilidade de fibras não detetadas. 66 EXEMPLO 6

Descolamento Vitreo Posterior em Olhos Humanos Pós-Morte

Esta experiência foi efetuada de modo a determinar se a microplasmina poderia induzir eficientemente a separação do vitreo e da retina em olhos humanos. Métodos (a) Dosagem e Tratamento de Olhos Humanos Pós-Morte

Vinte e seis globos oculares humanos sem qualquer patologia do olho conhecida foram obtidos do banco de olhos de

Munique. Estes globos oculares foram removidos de 13 doadores, cujas idades variaram de 34 a 69 anos, no espaço de 19 horas depois da sua morte. Depois da colheita da córnea utilizando uma trefina de 14 mm de diâmetro, os 26 globos oculares foram incubados numa câmara húmida a 37 °C durante 15 minutos. Foram então injetados 0,2 mL de microplasmina na cavidade vitrea de treze olhos.

Especificamente, foram diluídos 1,25 mg de microplasmina com 4 mL, 2 mL, ou 1,5 mL da solução de irrigação intraocular, de BSS PLUS@ de forma a atingir concentrações de 0,3125 mg/mL, de 0,625 mg/mL, e de 0,9375 mg/mL respetivamente. Um volume total de 0,2 mL destas soluções foi injetado na cavidade vítrea, resultando numa dose final de 62,5 pg, 125 pg, e 188 pg respetivamente de microplasmina dentro do olho. Os 13 olhos restantes, que serviram como controlos, receberam uma injeção de 0,2 mL de solução de sal equilibrada (BSS PLUS®) .

Dos 13 olhos tratados com microplasmina, 9 olhos foram tratados através de uma injeção intravítreal de microplasmina apenas. Uma dose de 62,5 pg de microplasmina (pH 7,4) foi injetada dentro da cavidade vítrea de dois olhos; uma dose de 125 pg de microplasmina (pH 7,2) foi 67 injetada na cavidade vítrea de 5 olhos; e uma dose de 188 μg de microplasmina (pH 7,2) foi administrada em 2 olhos. Dos 4 olhos restantes, dois foram tratados com 62,5 pg de microplasmina e 0,6 mL de hexafluoreto de enxofre (SF6) e dois foram tratados com 125 pg de microplasmina e 0, 6 mL de hexafluoreto de enxofre (SF6) . 0 tratamento adicional com SF6 foi efetuado por causa dos relatórios anteriores de que a plasmina induzia apenas o PVD em combinação com a vitrectomia ou injeção de gás. A dosagem e o tratamento discutidos acima são resumidos na tabela 3. TABELA 3 Número de olhos Dose de microplasmina an yg Tratamento 2 62,5 Injeção Intravítreal 5 125 Injeção Intravítreal 2 188 Injeção Intravítreal 2 62,5 Injeção Intravítreal e tarrponamento de gás (0,6 mL SF6) 2 125 Injeção Intravítreal e tarrponamento de gás (0,6 mL SF6)

Depois do tratamento, todos os olhos foram incubados a 37 °C durante 30 minutos. Depois desse tempo, os globos oculares foram colocados em 4% de paraformaldeído, e 0,1 mL de fixativo (4% de paraformaldeído) também foi injetado na cavidade vítrea para parar a ação enzimática dentro do olho. Os globos oculares que foram tratados com a microplasmina e SF6 foram fixados com o polo posterior numa posição direita. (b) Microscopia de Exploração e de Transmissão de Eletrão

Os globos oculares foram então hemiseccionados ao longo do plano das manchas oculares, e o segmento anterior foi rejeitado. Uma trefina de córnea de 12,5 mm de diâmetro foi lentamente movida através do vítreo e o polo posterior foi perfurado para fora. Foram então obtidos os espécimes da retina para a microscopia de exploração e de transmissão de 68 eletrão do polo posterior utilizando um Atrefina de córnea de 4 mm de diâmetro.

Os discos da retina para a microscopia de exploração de eletrão foram posteriormente fixados em 2% de tetroxido de ósmio (fixativo de Dalton), desidratados em etanol, secos até ao ponto critico, revestidos por pulverização com ouro, e fotografados utilizando um microscópio de eletrão ISM-35 CF (JEOL®, Tóquio, Japão).

Os espécimes para a microscopia de transmissão de eletrão foram posteriormente fixados no fixativo de Dalton, desidratados, e embebidos em EPON™. As secções de Semithin foram manchadas com 2% de azul de toluidina. As secções Ultrathin foram contrastadas com acetato de uranil e citrato de chumbo, e analisadas utilizando um microscópio de eletrão Zeiss EM 9 (Zeiss, Jena, Alemanha).

Dois observadores avaliaram independentemente os micrográficos de eletrão. Cada observador avaliou o grau da separação do vítreo e da retina através da decisão se uma rede contínua ou descontínua de fibrilhas de colagénio cobria a membrana limitante interna (ILM), ou se uma única ou escassas fibrilhas de colagénio estavam presentes na ILM, ou se a ILM estava desprovida de quaisquer fibrilhas de colagénio (ILM descoberta).

Resultados (a) Microscopia de Eletrão de Exploração A microscopia de eletrão de exploração (SEM) de olhos humanos pós-morte injetados com 62,5 pg de microplasmina revelou um descolamento vítreo posterior que sai de uma rede descontínua de fibrilhas de colagénio que cobrem a ILM (Fig. 6, Painel A) . A SEM dos olhos injetados com 125 pg 69 (Fig. 6, Painel B) e 188 pg (Fig. 6, Painel C) de microplasmina revelaram respetivamente uma ILM descoberta consistente com a separação completa do vítreo e da retina. Ambas estas doses mais elevadas resultaram numa ultraestrutura idêntica à da ligação do vítreo com a retina.

Nos olhos injetados com 62,5 pg de microplasmina e SF6, foram observados os restos da cobertura vítreo cortical que cobria a ILM (Fig. 6, Painel D) . Porém em olhos injetados com 125 pg da microplasmina seguidos pelo tamponamento do gás, foi observada a separação completa do vítreo e da retina consistente com uma ILM descoberta (Fig. 6, Painel E) .

Em contraste com os olhos tratados com microplasmina discutidos acima, os olhos controlo não exibiram o descolamento vítreo posterior conforme determinado por SEM (Fig. 6, Painel F) . Estes resultados são resumidos na tabela 4. TABELA 4

Dose de microplasmina em pg Tratamento Grau de vítreo cortical residual Olhos tratados Olhos de controlo 62,5 Injeção Intravítreal ++ +++ 125 Injeção Intravítreal — +++ 188 Injeção Intravítreal — +++ 62,5 Injeção Intravítreal e tarrponamento de gás ++ +++ 125 Injeção Intravítreal e tarrponamento de gás +++ [Legenda: +++ rede continua de fibrilhas de colagénio; -H- rede descontinua de fibrilhas de colagénio; + fibrilhas de colagénio escassas; - nenhumas fibrilhas de colagénio, ILM descoberta]_ (b) Mlcroscopla de transmissão de eletrão 70 A morfologia intraretinal de todos os olhos tratados com microplasmina ficou inalterada comparada com os olhos do controlo. A ultraestrutura da ILM foi bem preservada nos olhos tratados com microplasmina (Figura 7, Painel A), em comparação com os olhos de controlo (Figura 7, Painel B).

Conclusão

Estes dados indicam que a injeção intravitreal da microplasmina pode induzir uma quebra entre o córtex vítreo e a membrana limitante interna do olho humano sem vitrectomia ou qualquer outra intervenção cirúrgica. 125 pg de microplasmina quebra a junção humana do vítreo e da retina dentro de 30 minutos. Nos termos da ação enzimática, os 125 pg de microplasmina são a dose equivalente de 2 U de plasmina (Sigma-Aldrich, Munique, Alemanha), que provocou a completa separação do vítreo e da retina nos olhos de cadáveres de porcos e nos olhos de dadores humanos. Estes dados também mostram que a aplicação de uma bolha de gás no vítreo de um olho tratado com microplasmina não afetou a dose necessária para quebrar a junção do vítreo e da retina. EXEMPLO 7

Análise In Vivo do descolamento Vítreo Posterior induzido por Microplasmina O propósito destas experiências era determinar a utilidade da microplasmina para o PVD in vivo. Métodos (a) O modelo Felino A retina dos felinos foi extensivamente estudada pelos anatomistas e pelos fisiologistas fazendo dessa um modelo útil para avaliar a segurança do PVD farmacologicamente induzido. Tal como a retina humana, a retina do gato é 71 dominada por bastonetes e tem uma circulação intraretinal, fora da fóvea. Isto está em contraste com a retina do coelho, que não tem qualquer vaso intraretinal. A retina interna do coelho é perfundida pela vasculatura que se encontra na sua superfície vítreal, e isto limita o valor dos estudos experimentais primeiramente focalizados na ligação do vítreo com a retina no coelho. Durante anos, o modelo felino conferiu dados de elevada qualidade nas respostas celulares da retina ao descolamento. Desse modo, nós usámos um modelo felino para o estudo da utilidade da microplasmina em efetuar o PVD in vivo.

Cinco gatos domésticos adultos com idades entre 12 e 23 meses foram anestesiados com uma injeção intramuscular de 0,5 mL de cetamina (Ketaset, Park-Davis, Eastleigh, Reino Unido) e de 0,3 mL de medetomidina (Dormitor, Pfizer, Reino Unido). Os gatos anestesiados receberam uma injeção intravítreal de 14,5 pg ou 25 pg de microplasmina, enquanto os outros olhos destes gatos receberam uma injeção de solução salina equilibrada (BSS-PLUS®) e serviram como controlos. Dos 5 gatos utilizados neste estudo, 3 gatos receberam uma injeção intravítreal de 25 pg de microplasmina. Um destes gatos foi sacrificado um dia depois de receber a injeção; o segundo foi sacrificado 3 dias depois e o terceiro foi sacrificado 3 semanas depois. Os dois gatos restantes foram injetados com 14,5 pg de microplasmina. Destes, um foi sacrificado 3 dias depois enquanto o outro foi sacrificado 3 semanas depois. (b) Mlcroscopla de Exploração e de Transmissão de Eletrão

Os globos oculares foram removidos dos gatos sacrificados, fixados e processados para a microscopia de eletrão conforme descrito para os olhos humanos pós-morte no Exemplo 6. Os micrográficos de eletrão foram avaliados 72 independentemente por dois observadores. Cada observador avaliou o grau de separação do vitreo e da retina através da decisão se uma rede continua ou descontinua de fibrilhas de colagénio cobria a ILM, ou se uma única ou escassas fibrilhas de colagénio estavam presentes na ILM, ou se a ILM estava desprovida de quaisquer fibrilhas de colagénio. (c) Mlcroreprodução Confocal

Os espécimes do olho foram enxaguados em salino fosfato tamponizado (PBS) e orientados em 5% de agarose (Sigma, St Louis MO, EUA) preparado em PBS. Foram cortadas secções com espessura de cem micrómetros utilizando um vibratome (Technical Products International, Polysciences, Warrington, PA, EUA) e incubados em soro equídeo normal (1: 20; Dianova, Hamburgo, Alemanha) em PBS que contém 0,5% de albumina de soro bovideo (BSA; Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EUA), 0,1% Triton X-100 (Roche Boehringer, Mannheim, Alemanha) e 0,1% de azida sódica (Sigma-Aldrich, Munique, Alemanha) (esta solução de PBS contendo BSA, Triton e azida é referida como PBTA) durante a noite a 4 °C num rotador. Depois da remoção do soro de obstrução, foram adicionados anticorpos preliminares em seis conjuntos de pares: (GFAP; 1: 500; DAKO, Hamburgo, Alemanha) com anti- colagénio IV (1: 50; DAKO); anti-vimentina (1: 50; DAKO) com anti-fibronectina (1: 400; DAKO); anti-sinatofisina (1: 50; DAKO) com anti-neurofilamentos (1: 25; DAKO); anti- laminina (1: 25; DAKO) com anti-CD 68 (1: 50; DAKO); anti- opsina vermelho/verde (1: 100; Santa Cruz Biotechnology, EUA) com anti-rodopsina (1: 200; Santa Cruz Biotech); anti-opsina azul (1: 100; Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA,

EUA) com anti-rodopsina (1: 200; Santa Cruz Biotech) . A especificidade dos anticorpos utilizados nesta experiência é listada na tabela 5. 73 TABELA 5

Anticorpo Especificidade proteína acídica fibrilica anti-glial (GFAP) anti-vimentina Proteínas intermédias do filamento de células de Miiller Anti-neurofilamento Neurofilamentos em células de gânglios e em células horizontais Anti-sinaptofisina Vesículas Sinápticas em camadas de plexiformes Anti- opsina vermelho/verde Anti-opsina azul Cones Anti-rodopsina Bastonetes Anti-fibronectina Anti-laminina Fibronectina Laminina Anti-colagénio IV Colagénio do tipo IV Anti- CD 68 macrófagos

Depois da incubação durante a noite a 4 °C num rotador, as secções foram enxaguadas em PBTA e incubadas outra vez durante a noite a 4 °C com o anticorpo secundário. Foram utilizados anticorpos equídeos anti-rato e anticorpos equídeos secundários anti-coelho para cada combinação de anticorpos primários, conjugados com Cy2 ou com Cy3 (Dianova, Hamburgo, Alemanha). Todos os anticorpos secundários foram utilizados numa diluição de 1:100, e todos os anticorpos foram diluídos em PBTA. As secções foram então enxaguadas, montadas em gaiato N-propil em glicerol e vistos num scanner laser que faz a exploração do microscópio confocal (LSM 510, Zeiss, Alemanha).

Resultados (a) Microscopia de eletrão da exploração

Um dia depois de uma injeção intravítreal de 25 pg de microplasmina, as escassas fibrilhas de colagénio cobriram a ILM (Figura 8, Painel A). Três dias depois do tratamento, 25 pg de microplasmina resultaram na separação completa do vítreo e da retina (Figura 8, Painel B); não havia qualquer resto de fibrilhas de colagénio permanecente na ligação do vítreo com a retina. O olho que recebeu os 14,5 pg de microplasmina revelou fibrilhas de colagénio escassas cobrindo a ILM 3 dias depois da injeção (Figura 8, Painel C) . 21 dias depois do tratamento, com 14,5 pg (Figura 8, 74

Painel D) e 25 pg de microplasmina (Figura 8, Painel E) foi observada uma ILM descoberta. Todos os outros olhos de controlo tinham uma rede densa de fibrilhas de colagénio cobrindo a retina (Figura 8, Painel F) . Estes dados estão resumidos na tabela 6. TABELA 6

Dose de microplasmina em pg Duração do tratamento em dias Grau de vítreo cortlcal residual Olhos tratados Olhos de controlo 14,5 3 + i +++ 14,5 21 +++ 25 1 + j +++ 25 3 I +++ 25 21 i +++ [Legenda: +++ rede contínua descontínua de fibrilhas de escassas; - nenhumas fibrilhas de fibrilhas colagénio; + de colagénio, de colagénio fibrilhas de ILM descoberta] ; ++ rede colagénio (b) Luz e microscopía de transmissão de eletrão

Tendo em conta a citoarquitetura da retina, não foram observadas quaisquer diferenças entre os olhos tratados com microplasmina (Figura 9, Painel A) e os olhos de controlo (Figura 9, Painel B). A ultraestrutura da retina interna e a ILM dos olhos tratados com microplasmina (Figura 9, Painéis C e E) foram bem preservadas comparadas com a retina interna e a ILM dos olhos de controlo (Figura 9, Painéis D e F). (c) Microcopia confocal laser

Nos olhos tratados com microplasmina e nos olhos de controlo, a zona terminal das células de Muller foi claramente marcada pelo anti-GFAP (Figura 10, Painéis A e B) e pela anti-vimentina (Figura 10, Painéis C e D) . Não havia qualquer mancha prolongada dos processos das células de Muller além da camada nuclear interna. Não foi observado 75 significativo manchar com anti-colagénio IV e anti-fibronectina (dados não mostrados) . Isto pode estar relacionado com a especificidade das espécies destes anticorpos. A ILM foi manchada pela anti-laminina. Estavam presentes poucos macrófagos tanto nos olhos tratados como nos olhos de controlo. Os axónios e as dendrites da célula do gânglio, as células horizontais, e a camada interna e externa do plexiforme foram claramente marcados pelo anti-neurofilamento e pelo anti-sinaptofisina (Figura 10,

Painéis E e F) . A camada do fotorrecetor foi marcada pelo anti-neurofilamento. Não houve qualquer diferença entre os olhos tratados com microplasmina (Painéis A, C, E) e os olhos de controlo (Fig. 10, Painéis B, D e F) em qualquer momento do estudo, em relação a qualquer dos anticorpos utilizados.

Discussão

Para avaliar o efeito de quebra da microplasmina na interface entre o vítreo e a retina in vivo, administrámos duas doses diferentes na cavidade vítrea de cinco gatos adultos. A primeira dose que usámos foi de 25 pg de microplasmina, que é um quinto da dose que foi verificada ser suficiente para induzir o PVD completo nos olhos humanos pós-morte. Notavelmente 25 pg de microplasmina é equivalente a 0,4 U de plasmina (Sigma), e clinicamente foram aplicados 0,4 U de plasmina autóloga à cavidade vítrea dos olhos humanos com orifícios maculares e retinopatia diabética. A segunda dose de 14,5 pg de microplasmina é equivalente a uma dose de 25 pg de microplasmina no olho humano, se for feito o ajuste para o menor volume vítreo do olho do gato (cerca de 60% do volume vítreo do olho humano). 76

Três dias depois de uma aplicação intravitreal de 25 pg de microplasmina no olho do gato, havia uma separação completa do vitreo e da retina, visto que um dia depois do tratamento algumas fibrilhas de colagénio ainda estavam presentes na ligação do vitreo com a retina. Isto indica que o efeito da microplasmina continua para além de 24 horas e está em forte contraste com a rápida inativação da plasmina no sangue através do seu antagonista natural alfa-2-antiplasmina. Um motivo para a longevidade da atividade da microplasmina pode ser por a alfa-2-antiplasmina ser saturada por outro substrato, ou por a microplasmina ter uma diferente afinidade para o antagonista antiplasmina comparado com a plasmina. Uma outra razão possível poderia ser o facto de os trajetos para jusante da microplasmina (por exemplo, ativação das colagenases ou das metaloproteinases da matriz) permanecerem ativos depois de a microplasmina ser inativada pela alfa-2-antiplasmina. A citoarquitetura da retina dos olhos tratados com microplasmina estava inalterada quando comparada com os olhos de controlo. Em termos ultraestruturais, não havia qualquer diferença na anatomia da retina entre os olhos tratados com microplasmina e os olhos de controlo. A ILM e a retina foram bem preservadas em todos os espécimes. Adicionalmente não observámos quaisquer sinais de uma reação inflamatória depois da injeção da microplasmina. Especificamente, a microscopia de eletrão e a microscopia confocal laser não mostraram qualquer evidência de infiltração celular inflamatória da retina.

No modelo felino, o descolamento da retina produz uma proliferação significativa de células de Miiller e um aumento maciço de proteínas do filamento intermédias no seu citoplasma, tal como a proteína acídica fibrilica glial 77 (GFAP) e a vimentina. Esta resposta da célula de Muller é amplamente conhecida como gliosis, e é suposto ter um papel chave nas respostas celulares complexas da retina ao descolamento. Na retina normal, as células de Muller parecem quiescentes e expressam quantidades muito pequenas de GFAP e de vimentina. No entanto, foi mostrado que mesmo a vitrectomia sem induzir o descolamento da retina provoca o aumento do GFAP. 0 trabalho recente do nosso grupo demonstrou o aumento marcado das proteínas do filamento intermédias seguindo a tentativa de escamar a ILM nos olhos do gato (dados não publicados). Estes dados apontam para a elevada reatividade das células de Muller a qualquer forma de trauma cirúrgico.

No presente estudo, não observámos qualquer mudança da reatividade da célula de Muller depois da indução de PVD pela microplasmina. Além disso, não havia qualquer diferença entre os olhos tratados e os olhos de controlo em relação a qualquer anticorpo aplicado. 0 estado quiescente das células de Muller em qualquer momento do estudo em associação com a ultraestrutura inalterada e a imunorreatividade da retina conferem evidência experimental que aponta para a segurança da microplasmina na indução do PVD.

Em conclusão, estes estudos mostram que a microplasmina é eficaz na indução do PVD in vivo. Além disso, estes estudos indicam que a microplasmina parece segura uma vez que não foram observadas quaisquer alterações na retina ao nível ultraestrutural. EXEMPLO 8

Avaliação dos Efeitos da Microplasmina no Vitreo Suino Através da Utilização de Dispersão de Luz Dinâmica 78

Este estudo foi conduzido de forma a avaliar os efeitos da microplasmina (μΡϋ) de modo a caracterizar os efeitos biofísicos da μΡϋ no vítreo suíno fresco, pós-morte in vitro e in-situ utilizando a técnica não invasiva da dispersão da luz dinâmica (DLS). A DLS fornece informação sobre a dinâmica das partículas e das macromoléculas em soluções e suspensões através da medição das flutuações do tempo na intensidade da luz dispersada.

Numa experiência de DLS, um padrão de mancha flutuando constantemente é visto no campo distante quando a luz passa através de um conjunto de partículas pequenas suspensas num líquido {ver, Chu B., Laser light scattering: Basic principies and practice, Academic Press, Nova York, 1991). Este padrão da mancha é o resultado da interferência nos trajetos da luz e flutua enquanto as partículas no meio de dispersão efetuam movimentos aleatórios numa escala de tempo de > 1 pseg devido às colisões entre elas próprias e as moléculas fluidas (movimento Browniano). Na ausência das interações partícula - partícula (dispersões diluídas) a luz dispersada a partir de pequenas partículas flutua rapidamente enquanto a luz dispersada a partir de grandes partículas flutua mais lentamente. 0 instrumento da DLS construído para os nossos estudos fornece informação dinâmica tal como o coeficiente de difusão, o tamanho, a intensidade de dispersão, e a polidispersidade (medida ou heterogeneidade). Em geral, um aumento nos tamanhos das partículas (de nanómetros até alguns mícrones) e um aumento no número ou na densidade destas partículas resultam num aumento na intensidade da luz dispersada. A polidispersidade é uma medida do número de grupos distintos de espécies com diferente (s) tamanho(s). Numa medida DLS podem ser identificados até 79 três grupos que diferem em tamanho uma vez que difundem em diferentes escalas de tempo (as partículas pequenas movem-se mais rapidamente e as maiores mais lentamente). Consequentemente, uma alteração na dispersão da intensidade da luz e na polidispersidade pode complementar os dados do tamanho de partícula. Se depois da intervenção farmacológica os tamanhos das partículas do vítreo diminuírem e a dispersão da intensidade aumentar, então há provavelmente um número aumentado de espécies moleculares de menor tamanho na solução, tanto devido à rotura das espécies moleculares maiores, e/ou, como no caso destas experiências, a um influxo de 20 nm de nanosferas de poliestireno que foram previamente excluídas pela estrutura vítrea inerente. Se a polidispersidade diminuir, então a explicação mais provável é que há uma homogeneidade aumentada na população das espécies moleculares na amostra, uma vez mais indicativa do influxo de 20 nm de nanosferas de poliestireno que foram previamente excluídas. As características mais atrativas da DLS são o facto de não ser invasiva e quantitativa, trabalhar eficazmente para os tamanhos de partícula que variam desde alguns nm até alguns pm, requerer amostras de pequeno volume, e trabalhar razoavelmente bem para polidispersões ou para dispersões de vários tamanhos (até 2-3 componentes) . Os dados apresentados neste documento foram analisados utilizando as rotinas de distribuição acumuladas e exponenciais do tamanho obtidas a partir da Brookhaven Instruments NY. Estes esquemas foram revistos por Stock e Ray (Stock R. S. e Ray W. H., J. Polym. Sei. 23: 1393, 1985) . Como um exemplo, a Figura 11 mostra uma medida típica da DLS em termos de uma função de auto-correlação de tempo ou TCF para a totalidade do vítreo suíno (sistema polidisperso) e uma solução de diâmetro de 20 nm de nanosferas de poliestireno (sistema monodisperso). 80

Materiais e métodos (a) Fabrico do Instrumento de DLS para Estudos do Vítreo

Uma nova e compacta sonda de fibra ótica de DLS (Patente dos E.U.A N°. 5, 973, 779) foi fabricada para os estudos vítreos descritos neste documento. Essa compreende um par de lentes de passo 0,25 Selfoc GRIN, e tem uma profundidade de penetração de ~16 mm e um ângulo de dispersão de 160°. Uma sonda de fibra ótica compreendendo duas fibras óticas monomodo e duas lentes GRIN conferem meios compactos e remotos para estudo das características dinâmicas das macromoléculas no olho. Duas fibras óticas monomodo, cada uma alojada num aro de aço inoxidável, são montadas numa estrutura separada de aço inoxidável. É intencionalmente deixada uma abertura de ar entre a estrutura da fibra e a estrutura da lente de forma a produzir um ponto firmemente focado no volume de dispersão. As duas fibras óticas nas suas estruturas estão alinhadas e fixadas na posição fora dos eixos com a micro lente. As duas estruturas são colocadas dentro de uma terceira estrutura (exterior) feita de aço inoxidável, e a extremidade traseira da estrutura é coberta com uma tubagem de encolhimento por calor. As duas extremidades livres das fibras óticas foram terminadas com conectores masculinos do tipo FC/PC para fácil encaixe com o módulo laser e de deteção da foto.

Os principais componentes de preparação experimentais consistem numa sonda de fibra ótica compacta de DLS (descrita acima), num computador (Gateway PC 500S) contendo um cartão digital de correlação (BI-9000 Brookhaven Instruments NY) , e num laser de estado sólido 1 mW de comprimento de onda de 635nm (OZ Optics, Canadá) , e um detetor de díodo de fotos em avalanche (Perkin Elmer,

Canadá). A sonda é montada num conjunto ótico conectado através dos estágios translacionais controlados manualmente 81 de modo a aceder e a direcionar a sonda para uma posição desejada no olho.

Cada função temporal de auto-correlação (TCF) demorou 20 segundos a coletar (à exceção dos estudos da cuba filtrada que demoraram 1 minuto) . 0 tempo de atraso de 5 microssegundos foi mantido constante para todas as medidas. Antes de se iniciar o estudo vítreo, o instrumento foi completamente testado para a sua estabilidade, confiabilidade, e reprodutibilidade através da utilização de dispersões aquosas de padrões de poliestireno (nanosferas de látex de 20 nm de diâmetro). (b) Dispersão Direita Dinâmica de festões de Vítreo e de Viscosidade A DLS é capaz de conferir de forma não invasiva a quantificação objetiva do diâmetro médio das partículas suspensas numa solução, neste caso no vítreo. Para calcular exatamente os tamanhos das partículas é necessário ou conhecer, ou assumir a viscosidade do solvente. Conforme mencionado previamente, não é presentemente possível medir exatamente a viscosidade de um líquido não Newtoniano, pelo que é necessário efetuar suposições. Uma vez que o vítreo é cerca de 99% de água, é razoável atribuir a viscosidade da água ao vítreo. Para testar a validade desta suposição, as medidas da DLS foram feitas na totalidade do gel vítreo, na sub-fração do vítreo que não passou através de um filtro (gel), na sub-fração de vítreo que passou através do filtro (não gel), e na sub-fração do vítreo que passou através de um filtro de Millipore de 0,22 pm (vítreo líquido) . Estes estudos foram feitos em cubas óticas e 20 nm de nanosferas de poliestirenos de difusão foram adicionados como um marcador com um diâmetro conhecido que é altamente uniforme. As medidas de DLS na totalidade do vítreo e todas 82 as diferentes sub-frações renderam resultados similares indicando que a microviscosidade do vítreo é de facto muito próxima daquela da água pura. A microviscosidade no vítreo refere-se à viscosidade da água retida na qual as moléculas de ácido hialurónico (HA) e os feixes de colagénio são suspensos. 0 movimento Browniano das moléculas do HA é muito mais rápido do que os feixes de colagénio que são razoavelmente grandes em tamanho quando comparados com as moléculas do HA. Nos espetros de DLS, a informação molecular do HA é embebida em tempos de atraso mais rápidos (mais curtos) e a do colagénio em tempos de atraso mais lentos (mais longos). A informação derivada é mostrada na(s) distribuição(ões) do tamanho da partícula. (c) Reagentes

Todas as soluções foram preparadas utilizando BSS PLUS® (ALCON Labs, Ft. Worth, TX) . Foi utilizada microplasmina a uma concentração de 4 mg/mL de solução em stock. As nanosferas de poliestireno (Bangs Laboratories, Fishers, IN) de 20 nm de diâmetro e suspensas em água desionizada e duplamente destilada foram adicionadas numa relação fixa em todas as amostras, assegurando um número uniforme de nanosferas em todas as amostras. (d) Modelo Céu Aberto

Olhos de suíno frescos, não fixados (n=ll) foram submetidos a dissecção do segmento anterior através de uma incisão planar do feixe e da dissecção afiada do diafragma das lente/íris fora do vítreo anterior. A dissecção foi efetuada o mais próximo possível da cápsula posterior da lente, sem incidir neste tecido. Os olhos foram mantidos num suporte com o segmento posterior abaixo. 83

Os espécimes foram tratados com controlos e o uPli em doses de 0, 08, 0, 125, 0, 4, 0, 6 e 0,8 mg à temperatura ambiente através da colocação das soluções (300 μΐ) que contiveram 60 pL da de solução 20 nm de nanosferas de poliestireno na superfície anterior do corpo vítreo exposto. Foi executada a DLS num único ponto ao longo do eixo central ótico

localizado 1, 2, e 4 mm abaixo do interface vítreo/ar. A cada 15 minutos foi obtida uma leitura da DLS durante uma duração de 90 a 360 minutos. (e) Modelo de Olho Fechado

Uma agulha de 30 G foi utilizada para injetar 300 pL das soluções experimentais e de controlo contendo nanosferas de poliestireno e pPli em doses de 0,0125, 0,025, 0,05, 0,125, 0,25, 0,5, 0,6, e 0,8 mg através de uma incisão em faixas nos planos dos feixes dos olhos suínos intactos (n = 39). Os olhos foram incubados num suporte que mantivesse a córnea acima e o segmento posterior abaixo (imitando a posição passiva) a 37 graus Célsius durante 30 ou 120 minutos. Antes de colocar o olho no banho de água de temperatura controlada (em todos os momentos evitando qualquer contacto entre o espécime e a água) e em cada 15 minutos depois disso, o olho foi rodado sobre o eixo central ótico durante 10 - 15 segundos. Depois da incubação, os olhos foram submetidos a excisão do segmento anterior através de uma incisão planar dos feixes. A DLS foi realizada em diversos pontos (média = 18,6, d. p. =11,8) ao longo do eixo central ótico e ao longo de um eixo central horizontal (média = 30,8 pontos, d. p. =18,0) a uma profundidade de 4 mm atrás do interface vítreo/ar.

Resultados (a) Morfologia Molecular do Vítreo Suíno 84

As medidas de DLS da totalidade do vítreo (intacto) obtidas em múltiplos pontos ao longo do eixo central ótico da órbita do olho (segmento anterior dissecado afastado) demonstraram descobertas muito similares em todos os pontos desde 1,25 mm a 4,75 mm abaixo da interface ar-vitreo. Estas descobertas também são similares àquelas obtidas em vítreos totalmente excisados colocados numa cuba, no vítreo residual retido depois de filtrar, e na sub-fração de vítreo que passou através do filtro. Todas mostraram distribuições do tamanho da partícula quase idênticas. 0 grupo de maiores tamanhos de partícula (à direita) tem um tamanho médio de cerca de 1.000 nm e representa primeiramente o colagénio. A distribuição das partículas de menor tamanho (à esquerda) representa primeiramente o ácido hialurónico (HA). Este padrão da distribuição do tamanho da partícula foi o mesmo nos olhos que receberam a injeção de nanosferas de poliestireno. (b) Modelo Céu Aberto A Figura 12 mostra os TCF obtidos a partir de um ponto 4 mm abaixo da interface ar/vítreo em 5 olhos suínos diferentes e a partir de uma solução de 20 nm de nanosferas de poliestireno, para comparação. Pode ser visto que com doses crescentes de μΡΙί há uma diminuição na inclinação do TCF com desaparecimento do componente lento (espécies moleculares maiores) que ultimamente aproximam o TCF de 20 nm de nanosferas puras, isto é, quaisquer espécies moleculares de tamanho inferior.

Resultados das medidas de DLS (n=5) a uma profundidade de 1 mm depois do tratamento com várias soluções à temperatura ambiente: O Placebo e 0,08 mg foram essencialmente e constantemente o mesmo. Com uma dose de 0,125 mg houve uma redução de cerca de um terço na totalidade do tamanho da 85 partícula média depois de 210 minutos. Houve uma redução de cerca de 80% no tamanho médio de partícula depois de 60 minutos e uma redução quase completa dos tamanhos médios das partículas (apenas foram detetadas 20 nm nanosferas de poliestireno) com a dose de 0,6 mg.

Numa profundidade de medida de 2 mm atrás da interface ar/vítreo (n=3) havia uma redução de cerca de um terço na totalidade do tamanho médio da partícula depois de 180 minutos (dados não mostrados). Incubando o espécime a 37 graus Célsius e mantendo que a temperatura durante as medidas da DLS resultou numa redução de 40% na totalidade do tamanho médio da partícula depois do tratamento com 0,5 mg μΡΙί durante 60 minutos em dois olhos separados em dois momentos diferentes. As medidas da intensidade totais e as medidas da polidispersidade para a totalidade destes espécimes suportaram e corroboram as determinações do tamanho de partícula. (c) Modelo de Olho Fechado

Depois de uma incubação de 30 minutos a 37 graus Célsius com as doses de μΡΙί a variar de 0,125 a 0,8 mg havia mudanças significativas ao longo, tanto dos eixos óticos como dos eixos horizontais. No eixo ótico havia uma diminuição de sete vezes no tamanho médio da partícula normalizado na dose mais elevada de 0,8 mg. A dose de 0,125 mg rendeu uma diminuição no tamanho médio da partícula normalizado de cerca de um terço depois de 30 minutos. A dose mais baixa de 0,0125 mg não aparentou ter quaisquer efeitos significativos. Através da totalidade da escala das doses, a diminuição no tamanho da partícula foi inversamente proporcional à dose do μΡΙί (coeficiente de correlação = 0,93). Os dados foram ajustados a uma rotina linear apropriada (em linha reta). A intensidade total 86 normalizada e os lotes de polidispersidade também suportam a confiança destes dados. As distribuições do tamanho da partícula demonstram um deslocamento significativo para a esquerda na distribuição dos tamanhos das partículas com doses crescentes de μΡΙί. Isto sugere que ο μΡΙί é eficaz no enfraquecimento significativo e na quebra de várias ligações químicas e no alisamento da estrutura macromolecular vítrea. Alterações similares foram detetadas ao longo do eixo horizontal.

Também houve mudanças significativas depois de uma incubação de 2 horas a 37 graus Célsius com doses de μΡΙί a variarem de 0,0125 a 0,6 mg. Na dose mais elevada houve uma diminuição de 87,5% no tamanho médio da partícula normalizado medido ao longo do eixo ótico. A intensidade de dispersão normalizada e os lotes de polidispersidade normalizados corroboram estes dados. As distribuições do tamanho das partículas mostraram um deslocamento para a esquerda com as doses crescentes, atingindo proporções significativas com as doses mais elevadas. As medidas da DLS ao longo do eixo horizontal a uma profundidade de 4 mm mostraram resultados similares, com uma diminuição de cerca de 85% nos tamanhos médios de partículas normalizados e descobertas de suporte na intensidade de dispersão normalizada e nos lotes de polidispersidade. A comparação dos resultados a 30 minutos e a 2 horas demonstra um grau mais extensivo de quebra do tamanho da partícula com incubação mais longa. Considere-se que numa dose de 0,6 mg o diâmetro médio da partícula normalizado era cerca de 20% na incubação de 30 minutos e cerca de 10% na incubação de 2 horas. Assim, houve um decréscimo de cerca de duas vezes o tamanho da partícula com incubação mais longa. 87 0 parâmetro preliminar que deriva das medidas de DLS é o coeficiente de difusão. Uma alteração no coeficiente de difusão indica uma alteração na estrutura macromolecular do vítreo na resposta ao tratamento com μΡϋ. Com doses crescentes de μΡϋ há um aumento no coeficiente de difusão do vítreo. Ao longo da escala das doses de μΡϋ, os coeficientes de difusão eram diretamente proporcionais à dose de μΡΙί. Assim, com dose crescente de μΡϋ havia diminuição dos coeficientes de difusão e, similar às determinações do tamanho da partícula, esta correlação era estatisticamente significativa (r = 0,93).

Discussão

Nesta experiência, a DLS foi utilizada para avaliar estrutura molecular não invasiva no vítreo medindo os tamanhos da partícula, a intensidade de dispersão, e a polidispersidade. Os resultados mostraram que existem perfis similares de DLS em várias posições dentro da totalidade do vítreo. Os efeitos mais pronunciados da microplasmina eram sobre a totalidade do vítreo incubado am 37 graus C durante 30 minutos, especialmente nas doses mais elevadas. Havia uma diminuição substancial no tamanho médio da partícula normalizado e foi estabelecida uma relação estatisticamente significativa da relação dose resposta. Isto sugere que ο μΡΙί seria útil como um suplemento para a cirurgia vitreo-retinal, uma vez que um intervalo de tempo de 30 minutos é razoável para um efeito do medicamento que não interfira com as atuais práticas cirúrgicas. Em conjunção com os dados nos Exemplos precedentes que sugerem que ο μΡΙί induz a deiscência no interface vitreo-retinal, este medicamento parece conseguir os dois componentes desejados para a vitreoctomia farmacológica: descolamento vítreo posterior e uma quebra nas macromoléculas vítreas com consequentes aumentos dos coeficientes de difusão vítrea e ultimamente na liquefação. EXEMPLO 9

Microplasmina como um Suplemento da Vitrectomia Cirúrgica

Um paciente apresentando doença do vítreo e da retina no qual a vitrectomia cirúrgica é indicada é tratado com uma injeção de microplasmina antes do procedimento da vitrectomia cirúrgica. 0 paciente deve receber um exame oftálmico total de forma a estabelecer uma linha de base da saúde ocular. 0 exame oftálmico inclui a oftalmoscopia indireta, a biomicroscopia de lâmpada de fenda, exame da retina periférica, medidas da pressão intraocular, sintomatologia da acuidade visual (não auxiliada e melhor corrigida), fotografia do fundo ocular, angiografia de fluoresceína, eletrorretinografia e medidas de A-scan.

Tanto até 30 minutos como até 1 dia antes do começo da vitrectomia, o olho a ser tratado é injetado com 0,025 a 0,125 mg de microplasmina em 0,2 mL de solução de irrigação intraocular, BSS PLUS® ou outra solução de irrigação de forma a promover a liquefação do vítreo e/ou a induzir o descolamento vítreo posterior.

Ao promover a liquefação do vítreo e/ou o descolamento vítreo posterior, a vitrectomia cirúrgica pode ser feito mais rapidamente e mais fácil com menor trauma da retina iatrogénico e risco de complicações cirúrgicas. Permitindo uma remoção mais completa do vítreo também pode diminuir o risco de complicações pós-operatória tais como a vitreoretinopatia proliferativa. EXEMPLO 10

Tratamento da Retinopatia Diabética com Microplasmina 89

Neste exemplo, um paciente diabético que manifesta retinopatia diabética é tratado através da injeção intravítreal de microplasmina. 0 paciente diabético deve receber um exame oftálmico total de forma a estabelecer uma linha base da saúde ocular. 0 exame oftálmico inclui oftalmoscopia indireta, a biomicroscopia de lâmpada de fenda, exame da retina periférica, medidas da pressão intraocular, sintomatologia da acuidade visual (não auxiliada e melhor corrigida), fotografia do fundo ocular, angiografia de fluoresceina, eletrorretinografia e medidas de A-scan.

Depois do exame preliminar, uma injeção intravítreal de microplasmina é dada ao olho afetado do paciente. Se ambos os olhos forem afetados, podem ser tratados separadamente. 0 olho a ser tratado é injetado com uma dose que varia de 0, 005 mg a 0,125 mg de microplasmina em 0,05 a 0,2 mL de BSS PLUS® ou outra solução de irrigação intravítrealmente de modo a promover a liquefação do vítreo.

Depois do tratamento, os olhos dos pacientes devem ser examinados periodicamente. A extensão da retinopatia diabética apresentada pelo paciente é monitorizada continuamente através de exames à retina e de angiogramas de fluoresceína periódicos de forma a monitorizar a extensão da obstrução venosa, IRMA, isquemia da retina, descolamento da retina de tração, hemorragia vítrea, necessidade para vitrectomia, ou outras complicações da retinopatia diabética. EXEMPLO 11 90

Efeito da Microplasmina Comparado com a Plasmina na Velocidade de Difusão da Fluoresceina em Olhos de Porcos Pós-morte A microplasmina é aproximadamente um terço do peso molecular da plasmina de comprimento total. Devido ao seu tamanho menor, é esperado que a microplasmina se difunda mais rapidamente no vítreo do que a plasmina (Xu, J. e

outros, supra citados). É esperado que uma difusão mais rápida conduza a um efeito farmacológico mais rápido. O presente estudo foi executado de modo a confirmar tanto que a microplasmina se difunde mais rapidamente do que a plasmina, como que a microplasmina é capaz de alterar o gel vítreo. Métodos

Foram utilizados olhos suínos recentemente isolados obtidos a partir de matadouros. Na primeira experiência, um olho foi injetado com microplasmina (0,125 mg) e o outro olho com controlo do veículo (BSS-PLUS®) . Depois de manter ambos os olhos à temperatura ambiente durante 2 horas, ambos os olhos foram então injetados com fluoresceina e incubados mais 30 minutos. Foram tiradas fotografias nos momentos de 0, 10, 20, e 30 minutos.

Na segunda experiência, os olhos foram injetados com microplasmina a 0,125 mg (N=2) ou plasmina 1U (fornecida pela Sigma, N=2), e foram incubados a 37 graus Célsius durante 2 horas. Todos os 4 olhos foram então injetados com fluoresceina e incubados durante mais 30 minutos, com fotografias tiradas nos momentos de 0, 10, 20, e 30 minutos.

Resultados 91

Na primeira experiência, no olho de controlo virtualmente não foi observada qualquer difusão da fluoresceina dentro do vítreo (dados não mostrados). No entanto, no olho tratado com microplasmina foi observada difusão da fluoresceina clara (dados não mostrados).

Na segunda experiência, os olhos tratados com microplasmina tiveram difusão da fluoresceina de 14% e 16%, respetivamente, depois de 20 minutos (Figura 13), enquanto o olho tratado com plasmina teve difusão da fluoresceina de menos do que 10% (Figura 14).

Discussão A microplasmina demonstrou uma clara facilitação da difusão da fluoresceina comparada com o controlo do veículo. Além disso, como predito com base no peso molecular da microplasmina, esta difusão da fluoresceina era de grande extensão do que aquela observada com administração de plasmina de total comprimento. Estas descobertas suportam a predição teórica de que a microplasmina difunde mais rapidamente do que a plasmina. Estas descobertas podem ter benefício clínico, ao permitirem um efeito farmacológico mais rápido.

Lisboa, 26 de Janeiro de 2012

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de uma composição compreendendo uma proteína truncada de plasmina compreendendo um domínio catalítico da plasmina (TPCD) na preparação de um medicamento para tratar ou prevenir uma doença, ou de uma complicação de uma doença, de um olho de um sujeito, em que a doença do olho é selecionada a partir do grupo consistido por descolamento da retina, rasgar da retina, hemorragia vítrea, hemorragia vítrea diabética, retinopatia diabética proliferativa, retinopatia diabética não proliferativa, degeneração macular relacionada com a idade, orifícios maculares, tração vitreomacular, enrugamento macular, exsudação macular, edema macular cistoide, deposição de fibrina, oclusão da veia da retina, oclusão da artéria da retina, hemorragia subretinal, ambliopia, endoftalmite, retinopatia da prematuridade, glaucoma, retinite pigmentosa, e qualquer combinação desses.

2. A utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o TPCD tem um peso molecular de menos do que 40.000 daltons, entre 20.000 e 30.000 daltons, 26.500 daltons na forma reduzida ou 29.000 daltons na forma não reduzida, ou menos do que 20.000 daltons.

3. A utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o referido TPCD é selecionado a partir do grupo consistido por miniplasmina, miniplasmina estabilizada, miniplasmina recombinante, miniplasmina estabilizada, recombinante, microplasmina, microplasmina estabilizada, microplasmina recombinante, microplasmina estabilizada, recombinante, e uma variante da microplasmina. 2

4. A utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que o tratamento ou a prevenção resultam num dos seguintes: redução da viscosidade do vitreo, liquefação do vítreo, indução do descolamento vítreo posterior, limpeza ou redução do sangue hemorrágico do humor vítreo e/ou aquoso, limpeza ou redução das substâncias intraoculares estranhas do humor vítreo e/ou aquoso, aumento da difusão de um agente ou de uma composição administrada ao humor vítreo e/ou aquoso, e diminuição da neovascularização extra- retinal , ou qualquer combinação desses.

5. A utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que a l composição é uma solução líquida

• 6. A utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que o indivíduo é um ser humano.

7. A utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que o tratamento ou a prevenção são executados na ausência de vitrectomia, ou em que o tratamento ou a prevenção são executados como um suplemento à vitrectomia.

8. A utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que a composição compreende uma quantidade eficaz de TPCD a ser administrado por olho na escala de 0,005 mg a 0,2 mg. 3

9. Utilização de uma composição compreendendo pelo menos dois TPCDs no fabrico de um medicamento para tratamento ou prevenção de uma doença, ou de uma complicação de uma doença, do olho de um indivíduo, em que a doença do olho é selecionada a partir do grupo consistido por descolamento da retina, rasgar da retina, hemorragia vítrea, hemorragia vítrea diabética, retinopatia diabética proliferativa, retinopatia diabética não proliferativa, degeneração macular relacionada com a idade, orifícios maculares, tração vitreomacular, enrugamento macular, exsudação macular, edema macular cistoide, deposição de fibrina, oclusão da veia da retina, oclusão da artéria da retina, hemorragia subretinal, ambliopia, endoftalmite, retinopatia da prematuridade, glaucoma, retinite pigmentosa, e qualquer combinação dos mesmos.

10. A utilização de acordo com a reivindicação 9, em que os pelo menos dois TPCDs são selecionados do grupo consistindo da miniplasmina consistindo do grupo, da miniplasmina recombinante, miniplasmina estabilizada, miniplasmina estabilizada, recombinante, das variantes da miniplasmina, microplasmina, microplasmina recombinante, microplasmina estabilizada, microplasmina estabilizada, recombinante, das variantes da microplasmina e de quaisquer combinações dos mesmos.

11. Um conjunto para a utilização num método de tratamento ou de prevenção de uma doença, ou de uma complicação de uma doença, do olho de um indivíduo, o método compreendendo o contacto de um humor vítreo e/ou aquoso com uma primeira composição e uma segunda composição em que a doença do olho é selecionada a 4 partir do grupo que consiste no descolamento da retina, rasgar da retina, hemorragia vítrea, hemorragia vítrea diabética, retinopatia diabética proliferativa, retinopatia diabética não proliferativa, degeneração macular relacionada com a idade, orifícios maculares, tração vitreomacular, enrugamento macular, exsudação macular, edema macular cistoide, deposição de fibrina, oclusão da veia da retina, oclusão da artéria da retina, hemorragia subretinal, ambliopia, endoftalmite, retinopatia da prematuridade, glaucoma, retinite pigmentosa, e qualquer combinação desses, em que o conjunto compreende uma primeira composição compreendendo pelo menos um TPCD e uma segunda composição compreendendo pelo menos um TPCD.

12. 0 conjunto para utilização de acordo com a reivindicação 11 em que a primeira composição compreende pelo menos um TPCD e as segundas composições compreendendo pelo menos um TPCD são selecionadas do grupo que consiste na miniplasmina, miniplasmina recombinante, miniplasmina estabilizada, miniplasmina estabilizada, recombinante, dos variantes da miniplasmina, microplasmina, microplasmina recombinante, microplasmina estabilizada, microplasmina estabilizada, recombinante, dos variantes da microplasmina e de quaisquer combinações dos mesmos.

13. 0 conjunto para a utilização de acordo com a reivindicação 11 ou 12, em que a primeira composição compreendendo pelo menos um TPCD e a segunda composição compreendendo pelo menos um TPCD são 5 administradas ao indivíduo substancialmente ao mesmo tempo ou em momentos diferentes.

14. Uso de uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo pelo menos um TPCD na preparação de um medicamento para a utilização na realização de uma vitrectomia num indivíduo.

15. A utilização de acordo com a reivindicação 14, em que o referido medicamento é utilizado antes da vitrectomia, ou é utilizado ao mesmo tempo que a vitrectomia.

16. A utilização de acordo com a reivindicação 14 ou 15, em que o TPCD é selecionado do grupo que consiste na miniplasmina, miniplasmina recombinante, miniplasmina estabilizada, miniplasmina estabilizada, recombinante, dos variantes da miniplasmina, microplasmina, microplasmina recombinante, microplasmina estabilizada, microplasmina estabilizada, recombinante, dos variantes da microplasmina e de quaisquer combinações desses.

17. A utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 16, em que o indivíduo é um ser humano.

18. A utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 17, em que a vitrectomia é efetuada de modo a tratar ou a prevenir uma doença, ou uma complicação de uma doença de um olho, em que a doença do olho é selecionada do grupo que consiste no descolamento da retina, rasgar da retina, hemorragia vítrea, hemorragia vítrea diabética, retinopatia 6 diabética proliferativa, retinopatia diabética não proliferativa, degeneração macular relacionada com a idade, orifícios maculares, tração vitreomacular, enrugamento macular, exsudação macular, edema macular cistoide, deposição de fibrina, oclusão da veia da retina, oclusão da artéria da retina, hemorragia subretinal, ambliopia, endoftalmite, retinopatia da prematuridade, glaucoma, retinite pigmentosa, e qualquer combinação desses.

19. A utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 18, em que a vitrectomia é efetuada com a finalidade selecionada do grupo que consiste na redução da viscosidade do vítreo, liquefação do vítreo, indução do descolamento vítreo posterior, limpeza ou redução do sangue hemorrágico do vítreo, limpeza ou redução das substâncias intraoculares estranhas do vítreo, limpeza ou redução do material tóxico para a retina, aumento da difusão de um agente ou de uma composição administrada ao humor vítreo e/ou aquoso, diminuição da neovascularização extra-retinal e qualquer combinação desses.

20. A utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 19, em que o medicamento é uma solução líquida.

21. A utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 20, em que uma quantidade eficaz de TPCD deve ser administrada por olho na escala de 0,005 mg a 0,2 mg. 7

22. Uma composição compreendendo uma proteína truncada de plasmina compreendendo um domínio catalítico da plasmina (TPCD) para utilização no tratamento ou na prevenção de uma doença, ou de uma complicação de uma doença, de um olho de um indivíduo, em que a doença do olho é selecionada do grupo que consiste no descolamento da retina, rasqar da retina, hemorraqia vítrea, hemorragia vítrea diabética, retinopatia diabética proliferativa, retinopatia diabética não proliferativa, degeneração macular relacionada com a idade, orifícios maculares, tração vitreomacular, enrugamento macular, exsudação macular, edema macular cistoide, deposição de fibrina, oclusão da veia da retina, oclusão da artéria da retina, hemorragia subretinal, ambliopia, endoftalmite, retinopatia da prematuridade, glaucoma, retinite pigmentosa, e qualquer combinação desses.

23. A composição para utilização de acordo com a reivindicação 22, em que o TPCD tem um peso molecular de menos de 40.000 daltons, entre 20.000 e 30.000 daltons, 26.500 daltons na forma reduzida ou 29.000 daltons na forma não reduzida, ou em menos do que 20.000 daltons.

24. A composição para utilização de acordo com a reivindicação 22, em que o referido TPCD é selecionado do grupo que consiste na miniplasmina, miniplasmina estabilizada, miniplasmina recombinante, miniplasmina estabilizada, recombinante, microplasmina, microplasmina estabilizada, microplasmina recombinante, microplasmina estabilizada, recombinante, e um variante da microplasmina. 8

25. A composição para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 24 também compreendendo pelo menos um segundo agente.

26. A composição para utilização de acordo com a reivindicação 25, em que o segundo agente é selecionado do grupo que consiste em hialuronidase, dispase, condroitinase, colagenase, peptideos contendo RGD, anticorpo de anti-integrina, ureia, hidroxiureia, tioureia, antagonistas do receptor de P2Y, inibidores angiogénicos, inibidores VEGF, inibidores de P1GF e quaisquer combinações desses.

27. A composição para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 26, em que o tratamento ou prevenção resultam num do seguinte: redução da viscosidade do vítreo, liquefação do vítreo, indução do descolamento vítreo posterior, limpeza ou redução do sangue hemorrágico do humor vítreo e/ou aquoso, limpeza ou redução das substâncias intraoculares estranhas do humor vítreo e/ou aquoso, aumento da difusão de um agente ou de uma composição administrada ao humor vítreo e/ou aquoso, e diminuição da neovascularização extra-retinal, ou qualquer combinação desses.

28. A composição para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 27, em que a composição é uma solução líquida.

29. A composição para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 28, em que o indivíduo é um ser humano. 9

30. A composição para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 29, em que o tratamento ou a prevenção são efetuados na ausência de vitrectomia, ou em que o tratamento ou a prevenção são efetuados como um suplemento à vitrectomia.

31. A composição para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 30, em que a composição compreende uma quantidade eficaz de TPCD a ser administrado por olho na escala de 0,005 mg a 0,2 mg.

32. Uma composição compreendendo pelo menos dois TPCDs para utilização no tratamento ou na prevenção de uma doença, ou de uma complicação de uma doença, do olho de um indivíduo, em que a doença do olho é selecionada do grupo que consiste no descolamento da retina, rasgar da retina, hemorragia vítrea, hemorragia vítrea diabética, retinopatia diabética proliferativa, retinopatia diabética não proliferativa, degeneração macular relacionada com a idade, orifícios maculares, tração vitreomacular, enrugamento macular, exsudação macular, edema macular cistoide, deposição de fibrina, oclusão da veia da retina, oclusão da artéria da retina, hemorragia subretinal, ambliopia, endoftalmite, retinopatia da prematuridade, glaucoma, retinite pigmentosa, e qualquer combinação desses.

33. A composição para utilização de acordo com a reivindicação 32, em que os pelo menos dois TPCDs são selecionados do grupo que consiste na miniplasmina, miniplasmina recombinante, miniplasmina estabilizada, miniplasmina estabilizada, recombinante, dos variantes da miniplasmina, microplasmina, microplasmina recombinante, microplasmina estabilizada, 10 microplasmina estabilizada, recombinante, dos variantes da microplasmina e de quaisquer combinações desses.

34. A utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8 ou 14 a 21, em que o conjunto para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 13, ou a composição para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 33 em que o referido TPCD é microplasmina humana.

35. A utilização de acordo com a reivindicação 9 ou 10, ou a composição para utilização de acordo com as reivindicações 32 ou 33, em que um dos referidos pelo menos dois TPCDs é microplasmina humana.

36. A utilização, conjunto para utilização, ou composição para utilização de acordo com a reivindicação 34 ou 35, em que a sequência do aminoácido da referida microplasmina humana consiste nos aminoácidos 543 a 791 da SEQ ID NO: 10 da figura 1 em que a ligação peptidica entre Arg56i e Val562 é quebrada por um ativador plasminogénio.

37. A utilização, conjunto para utilização, ou composição para utilização de acordo com a reivindicação 34 ou 35, em que a referida microplasmina humana é um microplasminogénio ativado em que o referido microplasminogénio é codificado pela SEQ ID NO: 3 da figura 2.

38. A utilização, conjunto para utilização, ou composição para utilização de acordo com qualquer uma das 11 reivindicações 34 a 37, em que a referida microplasmina humana dito é produzida por expressão recombinante numa levedura metilotrófica.

39. A utilização, conjunto para utilização, ou composição para utilização de acordo com a reivindicação 38, em que a referida levedura metilotrófica é Pichia pastoris. Lisboa, 26 de Janeiro de 2012