CN103205410B

CN103205410B - 重组微纤维蛋白溶酶及其制备方法和应用

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Publication number: CN103205410B
Application number: CN201210009986.XA
Authority: CN
Inventors: 蔺新力
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2012-01-13
Filing date: 2012-01-13
Publication date: 2018-03-06
Anticipated expiration: 2032-01-13
Also published as: CN103205410A

Abstract

本发明涉及一种重组微纤维蛋白溶酶及其制备方法和应用。重组微纤维蛋白溶酶原多肽，具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。本发明采用大肠杆菌生产重组µPlm，通过眼部的玻璃体腔注射µPlm可以有效解除玻璃体黄斑粘连，具有特异性强、免疫原性低、副作用小等优点。利用本发明采用大肠杆菌表达系统生产的重组µPlm，制备治疗玻璃体黄斑粘连的药物，具有表达量高，生产工艺简便，生产成本低，和表达蛋白活性稳定，制品使用安全等特点。应用本发明可开发出经济安全，非手术治疗玻璃体黄斑粘连的药物，以克服目前外科切除手术所面临的费用高、手术难度大和并发症多等问题。

Description

重组微纤维蛋白溶酶及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于微生物学药物领域，具体地涉及一种应用于眼科疾病方面的重组微纤维蛋白溶酶及其制备方法和应用。

背景技术

病理性纤维增殖导致的后玻璃体粘连变形是增殖型玻璃体视网膜病变等疾病发展的结果。由病理性纤维增殖膜及玻璃体后皮质对视网膜的粘连、牵拉，成为影响黄斑性目盲疾病治疗和预后的重要因素。玻璃体切除术是现今治疗增殖型玻璃体视网膜病变等疾病的一种医疗手段。但是在这些疾病中，病理性纤维增殖膜和玻璃体后皮质与视网膜紧密粘连，难于完整剥离，手术难度大，并发症多。因此探寻分离玻璃体后皮质、松解病理性纤维增殖膜与视网膜之间的粘连的新方法成为当前亟待解决的难题。

糖尿病引起的视网膜病变是目前的多发病之一。糖尿病已成为威胁人类健康的第三大杀手，中国的糖尿病患者人数第一、增长速度最快，目前患病人数接近一个亿。糖尿病严重时可累及全身各个器官，引起多种并发症，致死致残。视网膜病变是糖尿病的主要并发症，已成为主要致盲眼病。玻璃体黄斑粘连是其病变和预后的主要因素。如上所述，现今治疗方案是用外科手术完全切除玻璃体后皮质及病理性纤维增殖膜，解除其对视网膜黄斑的粘连和牵拉。此手术方法具有费用高、手术难度大，及因剥离不完全而导致术后并发症多等缺点。因此现在有广大的糖尿病患者因得不到治疗而导致盲目。非手术、简便和经济的药物治疗玻璃体黄斑粘连是当前的迫切需求。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种重组微纤维蛋白溶酶，通过对患者的眼部玻璃体或/和水状体施加一定有效量的包括重组微纤维蛋白溶酶的药物组合物，以溶解玻璃体和/或引起玻璃体后脱离。本发明可用于降低玻璃体粘性，溶解玻璃体，诱导玻璃体后脱离，降低眼内出血，清除或降低对眼睛有毒的物质，增加眼部用药的扩散，减低外视网膜新血管生成及任何以上病状的复合。本发明可辅助或者代替传统的机械玻璃体切除术。应用本发明的酶解法可避免手术，应用简单，使病理性纤维增殖膜及玻璃体后皮质对视网膜的粘连剥离完全，无并发症，及治疗费用低廉。

本发明采用的技术方案是：一种重组微纤维蛋白溶酶原多肽，具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

一种利用大肠杆菌表达系统生产上述的重组微纤维蛋白溶酶原多肽的方法，步骤如下：

（1）将编码重组微纤维蛋白溶酶原多肽的DNA序列插入基于质粒的大肠杆菌E.coli表达载体pET11中，然后传导到大肠杆菌宿主中，并用氨苄青霉素选择抗性克隆；所述的编码重组微纤维蛋白溶酶原多肽的DNA序列如SEQ ID NO.1所示；

（2）重组微纤维蛋白溶酶原多肽的表达、复性以及纯化：① 将（1）中选择的培养携带表达质粒的E.coli抗性克隆在培养基中培养到A600=0.6-0.9的生长期；② 加入IPTG诱导蛋白以包涵体形式表达，37 ^oC下继续培养3-5小时；③ 离心收获细菌，然后通过冻融和漂洗得到纯化的包涵体；④ 在pH 8-10的8M尿素缓冲液中溶解包涵体；⑤ 将含有包涵体的尿素缓冲液快速稀释到20倍的20 mM Tris， 0.2 M 精氨酸， pH 9.0的缓冲液中，得复性蛋白；⑥ 采用分子排阻色谱法将复性蛋白完全分离出来；⑦ 采用离子交换和亲和层析进一步纯化复性蛋白，即为重组微纤维蛋白溶酶原多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

一种重组微纤维蛋白溶酶：是将上述的重组微纤维蛋白溶酶原多肽经活化酶激活成重组微纤维蛋白溶酶。所述的激活酶是尿激酶、组织纤溶酶原激活物、链激酶、或普激酶。

上述的重组微纤维蛋白溶酶作为有效成分用于制备治疗玻璃体黄斑牵引综合症、黄斑裂洞、视网膜脱离、视网膜撕裂、视网膜新生血管形成、视网膜出血、视网膜水肿、或者处理玻璃体后脱离不完全的手术并发症的药物。重组微纤维蛋白溶酶的用量为：每只眼睛0.005毫克-0.2毫克。

本发明的重组微纤维蛋白溶酶(µPlm)可以溶解造成后玻璃体粘连的纤维蛋白，包括fibronectin和laminin，从而达到酶解法后玻璃体脱离的治疗效果。本发明采用大肠杆菌生产重组µPlm，通过眼部的玻璃体腔注射µPlm可以有效解除玻璃体黄斑粘连，具有特异性强、免疫原性低、副作用小等优点。

利用本发明采用大肠杆菌表达系统生产的重组µPlm，制备治疗玻璃体黄斑粘连的药物，具有表达量高，生产工艺简便，生产成本低，和表达蛋白活性稳定，制品使用安全等特点。应用本发明可开发出经济安全，非手术治疗玻璃体黄斑粘连的药物，以克服目前外科切除手术所面临的费用高、手术难度大和并发症多等问题。

附图说明

图1是重组微纤维蛋白溶酶原多肽（mPlg）在用尿激酶激活成重组微纤维蛋白溶酶（mPlm）前的 SDS-PAGE电泳图。线道1，标准分子量；线道2，非还原的mPlg；线道3，还原的mPlg。

图2是重组微纤维蛋白溶酶原多肽的氨基酸序列。图中标记了酶原的激活健（R²⁰/V²¹）。

图 3是本发明复性的重组微纤维蛋白溶酶与市场纤维蛋白溶酶（Sigma， St.Louis， MO）的酶动力学参数比较（Hanes plot kinetic comparison）。酶解底物是发色作用物S-2403 (Chromogenix，Goteberg， Sweden)。

图4是图三中动力学常数的总结。

具体实施方式

实施例1 重组微纤维蛋白溶酶

（一）重组微纤维蛋白溶酶原多肽的制备

（1）本发明的重组微纤维蛋白溶酶原多肽在大肠杆菌中表达。将编码所需重组微纤维蛋白溶酶原多肽（氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示）的DNA序列（如SEQ ID NO:1所示）插入基于质粒的大肠杆菌（E.coli）表达载体（如pET11载体）中，然后传导到合适的大肠杆菌宿主（如BL21(DE3)）中，并用氨苄青霉素（Ampicillin）选择抗性克隆。

（2）重组微纤维蛋白溶酶原多肽（µPlg）的表达、复性以及纯化。具体流程如下：1)将（1）中选择的培养携带表达质粒的E.coli抗性克隆在培养基（如LB/Ampicillin）中培养到一定的生长期（如A600=0.6-0.9）；2)加入IPTG诱导蛋白以包涵体形式表达，继续培养一定的时间（如3-5小时， 37 ^oC）；3)通过离心等方法收获细菌，然后通过冻融和漂洗等方法得到纯化的包涵体；4) 在8M尿素缓冲液中溶解包涵体，此缓冲液包括一种或多种还原剂，和使溶液缓冲至约pH 8-10的缓冲剂，如20 mM Tris；5) 用复性方法将变性蛋白复性成它的天然构象，如用快速稀释法将包含体缓冲液稀释到20倍的20 mM Tris， 0.2 M精氨酸，pH 9.0的缓冲液中，得复性蛋白；6) 采用分子排阻色谱（size ExclusionChromatography， SEC）法从部分或全部未折叠的µPlg或它的多聚体中将复性蛋白完全分离出来，示例性的SEC柱层析包括Superdex 200和Superdex 75，示例性的层析柱缓冲液为20 mM Tris， 0.2 M 精氨酸， 0.2 M NaCl， pH 8.0；7) 采用离子交换和亲和层析技术进一步纯化复性蛋白，即为重组微纤维蛋白溶酶原多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；8) SEC纯化的µPlg可以进一步用其他层析柱如离子交换柱和输水柱等方法纯化。图1显示了纯化后的重组微纤维蛋白酶原多肽。

（3）µPlg的活化：

以上所纯化的重组微纤维蛋白溶酶原多肽（µPlg）可以用不同的方法激活成重组微纤维蛋白溶酶（µPlm）。激活重组微纤维蛋白溶酶原多肽的活化酶可以是尿激酶，组织纤溶酶原激活物（tPA），链激酶，及普激酶。激活的过程采用本领域的常规知识，是本领域技术人员所共知的。激活后所得到的µPlm可以用离子交换柱层析方法纯化，然后传入到稳定缓冲液中。稳定缓冲液包括：20 mM 柠檬酸，10%蔗糖，pH 3.1。此缓冲液中的微纤维蛋白溶酶可以作为一种药物组合物制备成药物剂型。

（二）酶动力学及实验分析

（1）重组µPlm与商用纤溶酶在动力学方面的比较。如图3和图4所示，本发明复性纯化的μPlm与市场的血纤维蛋白溶酶的特异活性及动力学性质都相似。具体动力学测定方法是本领域技术人员所周知的。下面是一个简单的描述。用固定浓度的μPlm，在21°C环境下，与不同浓度的一系列纤溶酶底物S-2403混合。用酶标仪测定各反应速度并具此计算动力学数据。图3和图4用此处所描述的显色法比较了重组型μPlm与商业的血纤维蛋白溶酶（Sigma， Cat # P1867)动力学特性。原始数据被转换为μM单位，并采用Hanes plot方法进行分析工作。如图3所示。µPlm和血纤维蛋白溶酶按照固定的浓度混合成一系列浓度的s-2403(200-2000μM) ，分成四组用titertek公司的微量洗液管移到96孔板中。每间隔5~15分钟使用384板的酶标仪(Molecular Devices， Sunnyvale， CA)测试A405nm 30秒，数据被转换成μM格式并使用Hanes plot进行分析。如图4所示，µPlm和血纤维蛋白溶酶的Km’s andKcats非常相似。总的来说，µPlm的催化效率比血纤维蛋白溶酶(15.2 μM min-1 vs. 11.9μM min-1)的效率要高1.27以上。

（2）动物实验:

（a）毒理学的动物物种选择。下列动物可以用于本发明的动物实验。

·采用猪作为非啮齿类动物，可以获得有效的数据；

·采用兔子作为啮齿类动物，因为兔子已被广泛的应用于眼科研究的试验中，并且兔子眼睛的尺寸更易于在玻璃体内给药和取样；

·选择小鼠作为系统性的毒性物种，因为小鼠是一种可以获得有效数据的物种。

（b）猪动物实验示例

下列是重组微纤维蛋白溶酶的实验剂量：在0.1毫升的体积中，包括剂量为0.0625，0.125，0.156， 0.25 和 0.390 毫克。上述重组微纤维蛋白溶酶分别注射入新鲜宰杀的猪眼睛的玻璃体内液中。在室温（约24 ^oC）注射量为0.0625毫克，约1小时后可观察到玻璃体后剥离，但注射量为0.125毫克约半小时后即可观察到玻璃体后剥离。另外，在注射量低于0.25毫克的情况下观察不到任何眼睛或视网膜的毒性，说明有效浓度是在毒性浓度以下。

（c）玻璃腔体内单次和重复给药的毒理研究总结

单次给药：在兔子和猪的玻璃腔体内单次给药以获得急性毒性数据，最高剂量设为3mg/eye(60mg/ml，0.050ml/eye)，低剂量和中间剂量为高剂量的1/2递减(1 mg/eye或者0.3mg/eye)，同时设置未给药的对照组用于评估玻璃腔体注射对眼睛损伤。给药后采集眼睛中玻璃体的基底膜样本，用于测定药物的残留，同时采集血浆样本用于评估玻璃腔体注射之后，药物的系统性分布。

重复给药：兔子和猪每周给药一次，连续5周，给药剂量与单次给药的剂量一致，同时设置未给药的对照组用于评估玻璃腔体注射对眼睛损伤。每次给药后采集血浆样，连续给药后采集眼睛中玻璃体的基底膜样本，用于测定药物积累效果。

结论：实验结果证明即使在高剂量，重组微纤维蛋白溶酶对眼睛组织也没有明显损伤。在中底剂量，重组微纤维蛋白溶酶对眼睛组织没有可观察到的毒性。

（d）单次和重复静脉给药的毒理研究

以小鼠来做静脉给药的毒性研究，首先是用血浆的PK端点做单次给药的测距研究。由于对眼睛的给药剂量很小，以mg/m²为基础，在老鼠的静脉给药中使用以超过人类用量100倍的高剂量，而不是使用最大耐受剂量（MTD）或者最高可行剂量（MFD）。所用的大剂量为122mg/kg(350mg/m²)，这个数值是人体内预计最高剂量（3 mg/kg，3.5 mg/m² ）的100倍以上，低剂量及中间剂量分别是10mg/kg和30 mg /kg。

结论：实验结果证明在100倍的高剂量情况下，静脉给药的重组微纤维蛋白溶酶对小鼠没有明显的溶血付作用。在中底剂量，重组微纤维蛋白溶酶对小鼠没有可观察到的毒性。

综上所述，经过以上动物实验证明本发明的重组微维纤蛋白溶酶安全有效，为临床实验和临床应用奠定了实验基础。

<110> 蔺莹莹

<120> 重组微纤维蛋白溶酶及其制备方法和应用

<160> 2

<210> 1

<211>

<212> DNA

<213> 重组微纤维蛋白溶酶原多肽基因

<400> 1

<210> 2

<211> 250

<212> PRT

<213> 重组微纤维蛋白溶酶原多肽

<400> 2

Claims

1.一种利用大肠杆菌表达系统生产重组微纤维蛋白溶酶的方法，其特征在于：包括如下合成步骤：

（1）将编码重组微纤维蛋白溶酶原多肽的DNA序列插入基于质粒的大肠杆菌E.coli表达载体pET11中，然后传导到大肠杆菌宿主BL21中，并用氨苄青霉素选择抗性克隆；所述的编码重组微纤维蛋白溶酶原多肽的DNA序列如SEQ ID NO.1所示；

（2）重组微纤维蛋白溶酶原多肽的表达、复性以及纯化：① 将（1）中选择的培养携带表达质粒的E.coli抗性克隆在LB/Ampicillin培养基中培养到A₆₀₀=0.6-0.9的生长期；② 加入IPTG诱导蛋白以包涵体形式表达，37 ^oC下继续培养3-5小时；③ 离心收获细菌，然后通过冻融和漂洗得到纯化的包涵体；④ 在pH 8-10的8M尿素缓冲液中溶解包涵体；所述的尿素缓冲液中含有20 mM Tris；⑤ 将含有包涵体的尿素缓冲液快速稀释到20倍的20 mMTris， 0.2 M 精氨酸， pH 9.0的缓冲液中，用复性方法将变性蛋白复性成它的天然构象，得复性蛋白；⑥采用分子排阻色谱法从部分或全部未折叠的重组微纤维蛋白溶酶原多肽或它的多聚体中将复性蛋白完全分离出来，所述的分子排阻色谱法包括Superdex 200和Superdex 75，层析柱缓冲液为20 mM Tris， 0.2 M 精氨酸， 0.2 M NaCl， pH 8.0；⑦ 采用离子交换和亲和层析进一步纯化复性蛋白，即为重组微纤维蛋白溶酶原多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；⑧ 分子排阻色谱法纯化的重组微纤维蛋白溶酶原多肽进一步用离子交换柱和疏水柱方法纯化；

（3）将纯化的重组微纤维蛋白溶酶原多肽经活化酶激活成重组微纤维蛋白溶酶，所述的活化酶是普激酶；

（4）将激活后得到的重组微纤维蛋白溶酶用离子交换柱层析法纯化，然后传入到稳定缓冲液中储存，所述的稳定缓冲液包括：20 mM 柠檬酸，10%蔗糖，pH 3.1。

2.按照权利要求1所述的方法制备的重组微纤维蛋白溶酶作为有效成分在制备治疗玻璃体黄斑牵引综合症、黄斑裂洞、视网膜脱离、视网膜撕裂、视网膜新生血管形成、视网膜出血、视网膜水肿或者处理玻璃体后脱离不完全的手术并发症药物中的应用。

3.按照权利要求2所述的应用，其特征在于：重组微纤维蛋白溶酶的用量为：每只眼睛0.005毫克-0.2毫克。