NO333837B1 - Anvendelse av en sammensetning som omfatter et trunkert plasminprotein for fremstilling av et medikament for behandling av en lidelse i et øye samt sammensetning og sett. - Google Patents

Abstract

2005-09-05 Sammendrag Fremgangsmåte for behandling eller forebygging av en forstyrrelse, eller en komplikasjon ved en forstyrrelse, i et øye hos et individ, omfattende at et glasslegeme og/eller en vandig væske bringes i kontakt med et preparat omfattende en trunkert form av plasmin omfattende et katalytisk domene av plasmin (TPCD). TPCD innbefatter, men er ikke begrenset til, miniplasmin, mikroplasmin og derivater og varianter derav. Fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen kan anvendes til redusering av viskositeten av glasslegemet, flytendegjøring av glasslegemet, indusering av Iøsning av bakre glasslegeme, redusering av hemoragisk blod fra øyet, fjerning eller redusering av materialer som er toksiske for øyet, fjerning eller redusering av intraokulære fremmede substanser fra øyet, øking av diffusjon av et preparat administrert til et øye, redusering av ekstraretinal neovaskularisering, og hvilke som helst kombinasjoner derav. Fremgangsmåten kan anvendes i fravær av, eller som et supplement til, vitrektomi.

Description

Foreliggende oppfinnelse angår generelt anvendelse av en sammensetning som omfatter et trunkert plasminprotein for fremstilling av et medikament for behandling av en lidelse i et øye samt sammensetning og sett

Et fullt utviklet øye er en lett asymmetrisk kule med en omtrentlig sagittaldiameter på 24-25 mm, en transvers diameter på 24 mm og et volum på ca. 6,5 cm<3>. Det humane øye kan deles i tre forskjellige lag: et ytre lag, et mellomliggende lag og et indre lag. Øyets ytre lag består av sklera, som ofte omtales som "det hvite i øyet", og hornhinnen, som dekker øyets fremre del. Det mellomliggende lag deles i en fremre del og en bakre del; den fremre del består av den sirkulære pigmenterte iris, krystal-linsen og ciliarlegemet, mens den bakre del består av choroidealaget. Det indre lag består av retina, som er den sensoriske del av øyet. Retina er hovedsakelig et lag av nervevev, som går langs den indre bakre overflate av choroidealaget og kan deles i en optisk del og en ikke-optisk del. Den optiske del, som deltar i synsmekanismen, inneholder stavene og konusene som er de virksomme synsorganer.

Øyet hos et menneske kan også deles i tre kamre. Det fremre kammer mellom hornhinnen og iris, og det bakre kammer mellom iris og krystall-linsen, er fylt med vandig væske. I motsetning til dette er glasskammeret mellom krystall-linsen og retina fylt med en mer viskøs væske, kalt glasslegemet (også kjent som glassvæsken). Glasslegemet i et normalt øye er en klar gel som opptar ca. 80% av volumet av øyeeplet. Lys som kommer inn i øyet gjennom hornhinnen, pupillen og linsen, overføres gjennom glasslegemet til retina.

Glasslegemet i et normalt menneskeøye er en gel som er omtrent 99% vann og 1% makromolekyler. Disse makromolekyler innbefatter et nettverk av kollagenfibriller, hyaluronsyre, løselige glykoproteiner, sukkerarter og andre lavmolekylære metabolitter. Kollagen type II er det viktigste fibrillære kollagen i glasslegemet, men glasslegemet inneholder også kollagentypene V, IX og XI. Den bakre del av glasslegemet, den bakre hyaloide overflate (også kjent som den bakre glass-korteks), er i direkte kontakt med den indre retinaoverflate som er mest fremtredende ved glasslegeme-basis, den optiske skive og langs hoved-retinakarene. Normal adhesjon av glasslegemet til retina formidles ved cellulære og molekylære interaksjoner mellom den bakre glasskorteks og den indre begrensende membran (ILM) på retina. ILM er hovedsakelig basismembranen for retinale Muller-celler. ILM inneholder kollagen typene I og IV, glykoproteiner så som laminin og fibronektin og andre glykokonjugater. Disse komponenter antas å danne broer og binde kollagenfibrer mellom glasslegemet og ILM.

Med alderen forandres glassvæsken fra gel til væske, og når dette skjer, krymper den gradvis og skilles fra ILM på retina. Denne prosess er kjent som "løsning av bakre glasslegeme" (PVD) og er en normal hendelse etter at man har passert 40. Imidlertid kan det også induseres degenerative forandringer i glasslegemet ved patologiske tilstander så som diabetes, Eales sykdom og uveitt. PVD kan også oppstå tidligere enn normalt hos nærsynte mennesker og hos slike som har hatt kataraktoperasjon. Vanligvis skjer det en ren fraskillelse av glasslegemet fra retina. Leilighetsvis kleber imidlertid glasslegemet fast til retina på bestemte steder. Disse små foki av motstandsdyktige, unormalt faste tilklebinger av glasslegemet kan overføre store tiltrekkingskrefter fra glasslegemet til retina på tilheftingsstedet. Denne vedvarende napping av glasslegemet resulterer ofte i hesteskoformede rifter i retina. Dersom ikke retinariftene repareres, kan det sive glassvæske gjennom denne rift inn i eller under retina og forårsake en retinal løsning, en meget alvorlig, synstruende tilstand. Dessuten kan vedvarende tilhefting mellom glasslegemet og ILM resultere i blødning fra brist av blodkar, noe som resulterer i uklarhet og opasifikasjon av glasslegemet.

Utvikling av en ufullstendig PVD har virkning på mange vitreoretinale sykdommer innbefattende vitreomakulært traksjonssyndrom, glasslegeme-blødning, makulahuller, makulaødem, diabetisk retinopati, diabetisk makulopati og løsning av retina. Følgelig er et viktig mål med glasslegemekirurgi å skille glasslegemet fra retina på en måte som forhindrer glasslegemetraksjon.

For fjerning av glasslegemet fra øyet utføres vanligvis en mikrokirurgisk prosess kalt vitrektomi. Ved denne prosess fjernes glasslegemet fra øyet med en håndholdt miniatyr-skjæreinnretning mens man samtidig erstatter det fjernede glasslegeme med saltoppløsning for forhindring av at øyet faller sammen. Kirurgisk fjerning av glasslegemet ved anvendelse av denne metode er sterkt avhengig av kyndighet, og fullstendig fjerning av det kortikale glasslegeme er en vanskelig oppgave. Videre medfører mekanisk vitrektomi risiko for komplikasjoner så som arrdannelse, rivning og annen ødeleggelse av retina. Slik ødeleggelse er selvfølgelig meget uønsket siden det kan utgjøre en fare for pasientens syn etter operasjonen.

Følgelig har det ved senere undersøkelser vært fokusert på alternative metoder for fjerning av glasslegemet fra retina. Ved slike metoder har man undersøkt anvendelse av enzymer og kjemiske substanser som kan anvendes til å indusere/befordre væskedannelse av glasslegemet og/eller separasjon av den vitreoretinale grenseflate (PVD). Disse fremgangsmåter, som omtales som "farmakologisk vitrektomi", har innbefattet flere proteolytiske enzymer så som alfa-kymotrypsin, hyaluronidase, bakteriell kollagenase, kondroitinase og dispase, som er blitt injisert intravitrealt i eksperimentelle og/eller kliniske forsøk for indusering av PVD. Imidlertid frigjør ikke de fleste av disse teknikker det bakre hyaloid fra ILM fullstendig eller uten komplikasjoner. Dessuten er risikoen for uheldige reaksjoner høy ved flere av disse tilfeller. For eksempel fremkaller anvendelse av bakterielle proteaser i pattedyrsystemer en immunrespons som fører til proliferativ vitreoretinopati, noe som resulterer i en kompleks ny løsrivelse av retina. Kollagenase er angitt å gjøre glasslegemet flytende, men det er også vist å rive opp de ytre lag av retina. Alfa-kymotrypsin er angitt å frembringe peripapillær blødning og blødning i glasslegemet i de injiserte øyne. Endelig er det rapportert at dispase forårsaker toksisitet for det indre lag av retina 15 minutter etter injeksjon. Avhengig av konsentrasjonen av dispase som anvendes, kan det utvikles proliferativ retinopati eller epiretinale cellemembraner i de injiserte øyne.

På bakgrunn av immunogeniteten og andre uheldige virkninger av bakterielle proteaser, kan det være ønskelig med farmakologisk vitreolyse ved anvendelse av endogene proteaser med human opprinnelse. Plasmin er en serinprotease som fås fra plasminogen. Plasminogen er en viktig komponent i blodet hos pattedyr. Humant plasminogen er et enkeltkjedet glykoprotein bestående av 791 aminosyrer, som har en molekylvekt på ca. 92 000 dalton (se M. Forsgren et al., FEBS Lett. 213(2):254-60, 1987). Nativt plasminogen med en aminoterminal glutaminsyre (betegnet "Glu-plasminogen") omdannes ved begrenset digerering med plasmin av Arg68-Met69-, Lys77-Lys78- eller Lys78-Val79-peptidbindingene til proteiner med felles betegnelse "Lys-plasminogen". Aktivering av plasminogen med plasminogenaktivatorer så som urokinase eller streptokinase spalter peptidbindingen mellom Arg56iog Val562, hvorved plasminogenmolekylet omdannes til en dobbeltkjedet, enzymatisk aktiv form kalt plasmin. Plasmin inneholder to polypeptider, en tung A-kjede knyttet ved to disulfidbindinger til en lett B-kjede; B-kjeden inneholder det serinprotease-katalytiske doméne. Den serinprotease-katalytiske aktivitet av plasmin har vært innblandet i dets evne til å løse opp blodkoagler in vivo.

US 5304118 A beskriver bruk av plasmin ved vitrektomi, men omfatter ikke et trunkert plasmin.

Plasmin er nylig også blitt foreslått som et hjelpemiddel for vitrektomi. Dessuten er autologt plasminenzym (APE) blitt foreslått som et middel for farmakologisk vitrektomi. Det er imidlertid flere ulemper knyttet til anvendelsen av plasmin. For det første har alle kliniske intervensjoner med plasmin så langt vært basert på anvendelse av APE, hvis isolering nødvendiggjør en arbeidskrevende og tidkrevende prosess som innbefatter tapping av en pasients blod, isolering av plasminogen, aktivering av det isolerte plaminogen til plasmin og rensing og sterilitetstesting av plasminenzymet. Videre kan denne prosess være kostbar, og tilstedeværelsen av blodbårne patogener kan komplisere denne prosess ytterligere. Plasmin er dessuten meget utsatt for nedbrytning og kan således ikke oppbevares i langvarige tidsrom før anvendelse. En ytterligere ulempe er plasmins høye molekylvekt, som er i området mellom 65 000 og 83 000 dalton. Således vil diffusjon av store molekyler så som plasmin fra sin injiserte posisjon i glasslegemet til den vitroretinale grenseflate hemmes sammenliknet med mindre molekyler.

Det er følgelig behov på området for sammenstninger for behandling eller forebygging av forstyrrelser, eller komplikasjoner ved forstyrrelser, i øyet hos et individ, som overvinner ulempene med plasmin, for farmakologisk vitreolyse. Spesifikt er det behov for anvendelse av mindre molekyler enn plasmin, som kan diffundere gjennom glasslegemet til den vitreoretinale grenseflate hurtigere enn plasmin, og som uten vanskelighet kan fås i store mengder uten forsinkelsen og andre tilknyttede problemer som følger med isolering av autologt plasminenzym på pasient-etter-pasient-basis.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer anvendelse av en sammensetning som omfatter et trunkert plasminprotein som omfatter en katalytisk domene av plasmin (TPCD) for fremstilling av et medikament for behandling eller forebygging av en forstyrrelse, eller en komplikasjon ved en forstyrrelse, i et øye til et individ, hvor forstyrrelsen i øyet er valgt fra gruppen bestående av retinaløsning, retinarifter, glasslegemeblødning, diabetisk glasslegemeblødning, proliferativ diabetisk retinopati, ikke-proliferativ diabetisk retinopati, alderstilknyttet makula- degenerasjon, makulahull, vitreomakulær traksjon, muskularrynker, muskula-eksudater, cytoid makulaødem, fibrinavsetning, retinal veneokklusjon, retinal arterieokklusjon, subretinalblødning, amblyopi, endoftalmitt, prematur retinopati, glaukom, retinis pigmentosa og hvilken som helst kombinasjon av disse.

Ved én utførelsesform omfatter oppfinnelsen anvendelse hvor TPCD har en molekylvekt på mindre enn 40.000 dalton, mellom 20.000 og 30.000 dalton, 26.500 dalton i redusert form eller 29.000 dalton in uredusert form, eller mindre enn 20.000 dalton. Videre anvendelse hvor nevnte TPCD er valgt fra gruppen bestående av miniplasmin, stabilisert miniplasmin, rekombinant miniplasmin, stabilisert, rekombinant miniplasmin, mikroplasmin, stabilisert mikroplasmin, rekombinant mikroplasmin, stabilisert, rekombinant mikroplasmin og en variant av mikroplasmin.

Ved én utførelsesform omfatter oppfinnelsen anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 3, hvor behandlingen eller forebyggingen resulterer i en av følgende: reduserting av viskositeten til glasslegeme, flytendegjøring av glasslegeme, indusering av oppløsning av bakre glasslegeme, fjerning eller redusering av hemorragisk blod fra glasslegeme og/eller vandig tumor, fjerning eller redusering av intraokulære fremmede substanser fra glasslegeme og/eller vandig tumor, økning av diffusjonen av et middel eller en sammensetning administrert til glasslegeme og/eller vandig humor, og redusering av ekstraretinal neovaskulisering, eller en hvilken som helst kombinasjon derav. Idet sammensetning er en flytende løsning. Ved én utførelsesform er individet et menneske.

Ved én utførelsesform ifølge anvendelsene blir behandlingen eller forebyggingen blir utført i fravær av vitrektomi, eller hvor behandlingen eller forebyggingen blir utført som et tillegg til vitrektomi.

Ved én utførelsesform ifølge anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7, omfatter sammensetningen en effektiv mengde av TPCD som skal bli administrert per øye i et område på 0,005 mg til 0,2 mg.

Foreliggende oppfinnelse omfatter videre anvendelse av en sammensetning som omfatter minst to TPCD for fremstilling av et medikament for behandling eller forebygging av en forstyrrelse, eller en komplikasjon av en forstyrrelse, i øyet til et individ, hvor øyeforstyrrelsen er valgt fra gruppen bestående av retinaløsning, retinarifter, glasslegemeblødning, diabetisk glasslegemeblødning, proliferativ diabetisk retinopati, ikke-proliferativ diabetisk retinopati, alderstilknyttet makula-degenerasjon, makulahull, vitreomakulær traksjon, muskularrynker, muskula-eksudater, cytoid makulaødem, fibrinavsetning, retinal veneokklusjon, retinal arterieokklusjon, subretinalblødning, amblyopi, endoftalmitt, prematur retinopati, glaukom, retinis pigmentosa og hvilken som helst kombinasjon av disse. Idet de i det minste to TPCD er valgt fra gruppen bestående av miniplasmin, rekombinant miniplasmin, stabilisert miniplasmin, stabilisert, rekombinant miniplasmin, varianter av miniplasmin, mikroplasmin, rekombinant mikroplasmin, stabilisert mikroplasmin, stabilisert, rekombinant mikroplasmin, varianter av mikroplasmin og hvilke som helst kombinasjoner derav.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også sett for anvendelse i en fremgangsmåte for behandling eller forebygging av en forstyrrelse, eller en komplikasjon av en forstyrrelse, i øyet til et individ, idet fremgangsmåten omfatter kontakting av glasslegeme og/eller en vandig humor med en første sammensetning og en andre sammensetning hvor øyeforstyrrelsen er valgt fra gruppen bestående av retinaløsning, retinarifter, glasslegemeblødning, diabetisk glasslegemeblødning, proliferativ diabetisk retinopati, ikke-proliferativ diabetisk retinopati, alderstilknyttet makula-degenerasjon, makulahull, vitreomakulær traksjon, muskularrynker, muskula-eksudater, cytoid makulaødem, fibrinavsetning, retinal veneokklusjon, retinal arterieokklusjon, subretinalblødning, amblyopi, endoftalmitt, prematur retinopati, glaukom, retinis pigmentosa og hvilken som helst kombinasjon av disse, hvor nevnte sett omfatter en første sammensetning omfattende minst en TPCD og en andre sammensetning omfattende minst en

TPCD.

I overnevnte sett for anvendelse ifølge krav 11, omfatter den første sammensetningen minst en TPCD og den andre sammensetningen omfatter minst en TPCD er valgt fra gruppen bestående av miniplasmin, rekombinant miniplasmin, stabilisert miniplasmin, stabilisert, rekombinant miniplasmin, varianter av miniplasmin, mikroplasmin, rekombinant mikroplasmin, stabilisert mikroplasmin, stabilisert, rekombinant mikroplasmin, varianter av mikroplasmin og hvilke som helst kombinasjoner derav. Idet den første sammensetningen omfatter minst en TPCD og den andre sammensetningen omfatter minst en TPCD blir administrert til individet ved vesentlig samme tidspunkt eller ved forskjellige tidspunkter.

Foreliggende oppfinnelse omfatter videre anvendelse av en effektiv mengde av sammensetning som omfatter minst en TPCD for fremstilling av et medikament for anvendelse ved utførelse av en vitrektomi i et individ. Idet nevnte medikament blir anvendt før vitrektomi, eller blir anvendt ved samme tidspunktet som vitrektomi. Idet TPCD er valgt fra gruppen bestående av minplasmin, rekombinant miniplasmin, stabilisert miniplasmin, stabilisert, rekombinant miniplasmin, varianter av miniplasmin, mikroplasmin, rekombinant mikroplasmin, stabilisert mikroplasmin, stabilisert, rekombinant mikroplasmin, varianter av mikroplasmin og hvilke som helst av kombinasjonene derav. Idet individet er et menneske.

I en utførelsesform av anvendelsen ifølge et hvilket som helst av kravene 14 til 17, blir vitrektomi utført for å behandle eller forebygge en forstyrrelse, eller en komplikasjon av en forstyrrelse i et øye, hvor forstyrrelsen av øyet er valgt fra gruppen bestående av retinaløsning, retinarifter, glasslegemeblødning, diabetisk glasslegemeblødning, proliferativ diabetisk retinopati, ikke-proliferativ diabetisk retinopati, alderstilknyttet makula-degenerasjon, makulahull, vitreomakulær traksjon, muskularrynker, muskula-eksudater, cytoid makulaødem, fibrinavsetning, retinal veneokklusjon, retinal arterieokklusjon, subretinalblødning, amblyopi, endoftalmitt, prematur retinopati, glaukom, retinis pigmentosa og hvilken som helst kombinasjon av disse.

I en utførelsesform av anvendelsen ifølge et hvilket som helst av kravene 14 til 18, blir vitrektomi utført for en grunn som er valgt fra gruppen bestående av redusering av viskositeten til glasslegeme, flytendegjøring av glasslegeme, indusering av oppløsning av bakre glasslegeme, fjerning eller redusering av hemorragisk blod fra glasslegeme og/eller vandig tumor, fjerning eller redusering av intraokulære fremmede substanser fra glasslegeme og/eller vandig tumor, økning av diffusjonen av et middel eller en sammensetning administrert til glasslegeme og/eller vandig humor, og redusering av ekstraretinal neovaskulisering, eller en hvilken som helst kombinasjon derav. Idet medikamentet er flytende løsning.

I en utførelsesform av anvendelsen ifølge et hvilket som helst av kravene 14 til 20, skal en effektiv mengde av TPCD bli administrert per øye i området på 0,05 mg til 0,2 mg.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også sammensetning omfattende et trunkert plasminprotein omfattende en katalytisk domene av plasmin (TPCD) for anvendelse ved behandling eller forebygging av en forstyrrelse, eller en komplikasjon av en forstyrrelse, av et øye i et individ, hvor forstyrrelsen av øyet er valgt fra gruppen bestående av retinaløsning, retinarifter, glasslegemeblødning, diabetisk glasslegemeblødning, proliferativ diabetisk retinopati, ikke-proliferativ diabetisk retinopati, alderstilknyttet makula-degenerasjon, makulahull, vitreomakulær traksjon, muskularrynker, muskula-eksudater, cytoid makulaødem, fibrinavsetning, retinal veneokklusjon, retinal arterieokklusjon, subretinalblødning, amblyopi, endoftalmitt, prematur retinopati, glaukom, retinis pigmentosa og hvilken som helst kombinasjon av disse.

En utførelsesform omfatter sammensetning for anvendelse ifølge krav 22, hvor TPCD har en molekylvekt på mindre enn 40.000 dalton, mellom 20.000 og 30.000 dalton, 26.500 dalton i redusert form eller 29.000 dalton i ikke-redusert form, eller mindre enn 20.000 dalton.

En utførelsesform omfatter sammensetning for anvendelse ifølge krav 22, hvor nevnte TPCD er valgt fra gruppen bestående av miniplasmin, stabilisert miniplasmin, rekombinant miniplasmin, stabilisert, rekombinant miniplasmin, mikroplasmin, stabilisert mikroplasmin, rekombinant mikroplasmin, stabilisert, rekombinant mikroplasmin og en variant av mikroplasmin.

En utførelsesform omfatter sammensetning for anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 22 til 24 som videre omfatter minst et andre middel.

En utførelsesform omfatter sammensetning for anvendelse ifølge krav 25, hvor det andre middelet er valgt fra gruppen bestående av hyaluronidase, dispase, kondroitinase, kollagenase, RGD inneholdende peptider, anti-integrin antistoff, urea, hydroksyurea, urea, tiourea, P2Y reseptor antagonister, angiogene inhibitorer, VEGF inhibitorer, P1GF1 inhibitorer og hvilke som helst kombinasjoner derav.

En utførelsesform omfatter sammensetning for anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 22 til 26, hvor behandlingen eller forebyggingen resulterer i en av følgende: reduserting av viskositeten til glasslegeme, flytendegjøring av glasslegeme, indusering av oppløsning av bakre glasslegeme, fjerning eller redusering av hemorragisk blod fra glasslegeme og/eller vandig tumor, fjerning eller redusering av intraokulære fremmede substanser fra glasslegeme og/eller vandig tumor, økning av diffusjonen av et middel eller en sammensetning administrert til glasslegeme og/eller vandig humor, og redusering av ekstraretinal neovaskulisering, eller en hvilken som helst kombinasjon derav.

En utførelsesform omfatter sammensetning for anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 22 til 27, hvor sammensetningen er en flytende løsning.

En utførelsesform omfatter sammensetning for anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 22 til 28, hvor individet er et menneske.

En utførelsesform omfatter sammensetning for anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 22 til 29, hvor behandlingen eller forebyggingen blir utført i fravær av vitrektomi, eller hvor behandlingen eller forebyggingen blir utført som en medhjelper til vitrektomi.

En utførelsesform omfatter sammensetning for anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 22 til 30, hvor sammensetningen omfatter en effektiv mengde TPCD som skal bli administrert per øye i området på 0,005 mg til 0,2 mg.

Foreliggende oppfinnelse omfatter videre sammensetning omfattende

minst to TPCD for anvendelse ved behandling eller forebygging av en forstyrrelse, eller en komplikasjon ved en forstyrrelse, i øyet til et individ, hvor øyeforstyrrelsen er valgt fra gruppen bestående av retinaløsning, retinarifter, glasslegemeblødning, diabetisk glasslegemeblødning, proliferativ diabetisk retinopati, ikke-proliferativ diabetisk retinopati, alderstilknyttet makula-degenerasjon, makulahull, vitreomakulær traksjon, muskularrynker, muskula-eksudater, cytoid makulaødem, fibrinavsetning, retinal veneokklusjon, retinal arterieokklusjon, subretinalblødning, amblyopi, endoftalmitt, prematur retinopati, glaukom, retinis pigmentosa og hvilken som helst kombinasjon av disse.

En utførelsesform omfatter sammensetning for anvendelse ifølge krav 32, hvor minst to TPCD er valgt fra gruppen bestående av miniplasmin, rekombinant miniplasmin, stabilisert miniplasmin, stabilisert, rekombinant miniplasmin, varianter av miniplasmin, mikroplasmin, rekombinant miniplasmin, stabilisert mikroplasmin, stabilisert, rekombinant mikroplasmin, varianter av mikroplasmin og hvilke som helst kombinasjoner derav.

Foreliggende oppfinnelse omfatter videre anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 8 eller 14 til 21, sett for anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 11 til 13, eller sammensetning for anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 22 til 33 hvor nevnte TPCD er humant mikroplasmin.

Foreliggende oppfinnelse omfatter videre anvendelse ifølge krav 9 eller 10 eller sammensetningen for anvendelse ifølge kravene 32 eller 33, hvor en av nevnte minst to TPCD er human mikroplasmin.

Foreliggende oppfinnelse omfatter videre anvendelse, sett for anvendelse eller sammensetning for anvendelse ifølge krav 34 eller 35, hvor aminosyresekvensen til nevnte humane mikroplasmin består av aminosyrene 543 til 791 i SEKV ID NR:10 hvor peptidbindingen mellom Arg561 og Val562 blir spaltet av en plasminogenaktivator.

Foreliggende oppfinnelse omfatter videre anvendelse, sett for anvendelse eller sammensetning for anvendelse ifølge krav 34 eller 35, hvor nevnte humane mikroplasmin er et aktivert mikroplasminogen hvor nevnte mikroplasminogen blir kodet av SEKV ID NR:3.

Foreliggende oppfinnelse omfatter videre anvendelse, sett for anvendelse eller sammesetning for anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 34 til 37, hvor nevnte humane mikroplasmin blir produsert ved rekombinant ekspresjon i en metylotrof gjær.

Foreliggende oppfinnelse omfatter videre anvendelse, sett for anvendelse eller sammensetning for anvendelse ifølge krav 38, hvor nevnte metylotrofe gjær er Pichia pastoris.

Det vises nå til tegningene.

FIG. 1 viser DNA (SEKV ID NR:9) og aminosyresekvensen (SEKV ID NR:10) i humant plasminogen. FIG. 2 viser DNA (SEKV ID NR:3) og aminosyresekvensen (SEKV ID NR:4) i humant mikroplasminogen. FIG. 3 viser DNA (SEKV ID NR:7) og aminosyresekvensen (SEKV ID NR:8) for humant miniplasminogen. FIG. 4 viser virkningen av behandling av griseøyne med mikroplasmin. Felt A er et bilde i liten forstørrerlse (11X) av midtre perifere retina etter langsom dehydratasjon av et griseøye behandlet med 0,125 mg mikroplasmin i 0,1 ml BSS PLUS® i 120 minutter. I sentrum av dette bilde er en glasslegemestreng. Det er sannsynlig at denne glasslegemestreng er glasslegeme som har falt sammen på retinaoverflaten. Størstedelen av retinaoverflaten er fri for glasslegeme, som vist på de gjenværende feltene. Felt B viser et område av ren retina i umiddelbar nærhet av et blodkar (forstørrelse 800X). Få celler sees på retinaoverflaten. Den uregelmessige overflate er overflaten av selve karet. Felt C og D er forstørrelser av retinaområdet i B med henholdsvis 1200X og 3600X forstørrelse, som viser en glatt retinaoverflate som i stor grad er fri for glasslegeme eller cellemateriale. Ved 3600x er bare noen få fibrillærstrenger synlige. Felt E er et bilde i forstørrelse 1500X som hovedsakelig viser de samme funn som i felt C på et mer sentralt retinasted, mens felt F viser den grove granulastruktur av glasslegemet, som har mistet sin fibrillære struktur. Strukturen av glasslegemet i de mikroplasmin-behandlede øyne har meget annerledes utseende sammenliknet med glasslegemet i kontrolløyne (data ikke vist). FIG. 5 viser at ciliarprosesser i griseøyet er intakt etter 120 minutters behandling med mikroplasmin (feltene A og B). FIG. 6 viser skanning-elektronmikroskopibilder (forstørrelse 3600x) av den vitreoretinale grenseflate i humane post-mortem-øyne. Intravitreal injeksjon av 62,5 fag mikroplasmin resulterte i løsning av bakre glasslegeme (PVD) som etterlot diskontinuerlige rester av kollagenfibriller som dekker ILM (felt A). 125 ug (felt B) og 188 ug (felt C) mikroplasmin ga fullstendig PVD og en ren ILM. Felt D viser kompresjon av kollagenfibriller mot ILM i et øye behandlet med 62,5 ug mikroplasmin og gass. Felt E viser fullstendig PVD etter behandling med 125 ug mikroplasmin og gass. I motsetning til PVD observert i mikroplasminbehandlede øyne, er det et tett nettverk av kollagenfibriller i kontrolløyet (felt F). FIG. 7 viser transmisjonselektronmikroskopibilder av ILM i humane post-mortem-øyne. Legg merke til fraværet av kollagenfibriller (piler) på ILM i det mikroplasmin-behandlede øye (felt A, forstørrelse 13 600X). I motsetning til dette er kollagenfibriller fremdeles til stede (piler) på ILM i kontrolløyet (felt B; forstørrelse 6800X). FIG. 8 viser skanning-elektronmikroskopibilder (forstørrelse 3600X) av den vitreoretinale grenseflate i katteøyne. Ved intravitreal injeksjon av 25 ug mikroplasmin ble det tilbake rester av kollagenfibriller på ILM én dag etter behandling (felt A). Tre dager etter behandling resulterte 25 ug mikroplasmin i fullstendig PVD (felt B). Rester av kollagenfibriller ble observert i tre dager etter behandling med 14,5 \ ig mikroplasmin (felt C). En ren ILM ble observert tre uker etter injeksjon av 14,5 ug mikroplasmin (felt D) og 25 ug mikroplasmin (felt E). I sterk motsetning til dette viste kontrolløyet et tett tilknyttet kortikalt glasslegeme (felt F). FIG. 9 viser resultatene av lysmikroskopiundersøkelser av halvtynne snitt av katteøyne. Disse studier viste at den normale celleoppbygning av retina observert i kontrolløyne (felt B) også ble observert i mikroplasminbehandlede øyne (felt A). Transmisjonselektronmikroskopi viste en godt bevart indre retina og ILM i mikroplasminbehandlede øyne (feltene C og E) som observert i kontrolløyne (feltene D og F). Forstørrelsen anvendt for feltene A og B var 250X; forstørrelsen for feltene C og D var 6000X; mens forstørrelsen for feltene E og F var 30 000X. FIG.10 viser resultatene av konfokal laserskanningmikroskopi med prober til surt gliafibrillprotein (feltene A og B, grønne) og vimentin (feltene C og D, røde). Det er ingen forskjell i fargingen av GFAP og vimentin mellom mikroplasmin-behandlede øyne (feltene A og C) og kontrolløyne (feltene B og D). Dobbeltmerkings-immunhistokjemi med prober til synaptofysin (grønne) og neurofilament (røde) viser heller ingen forskjell mellom mikroplasminbehandlede øyne (felt E) og kontrolløyne (felt F). Forstørrelse for feltene A, B og C var 400x; forstørrelse for felt D var 250X; og forstørrelse for feltene E og F var 160x. FIG. 11 viser en tidskorrelasjonsfunksjon (TCF) for helt grise-glasslegeme sammenliknet med en oppløsning av 20 nm polystyren-nanokuler. I glasslegemet er det to komponenter til kurven. Den tidlige (hurtige) komponent skyldes tilstedeværelse av hyaluronan (HA) som er fritt diffunderbart og oppvisr betydelig molekylbevegelse (brownsk). Den sene (langsomme) komponent skyldes kollagen, som er større og diffunderer mindre fritt (stivere), noe som resulterer i mer langsom brownsk bevegelse. I motsetning til dette har oppløsningen av polystyren-nanokuler bare én komponent (monodispers) som er meget hurtig på grunn av den lille størrelse av nanokulene og deres fullkomment sfæriske struktur, som muliggjør meget hurtige bevegelser i oppløsningen. FIG. 12 viser normaliserte tidskorrelasjonsfunksjoner for 5 griseøyne som gjennomgår farmakologisk mikroplasmin (uPli)-vitreolyse i forskjellige doser, og en oppløsning av 20 nm polystyren-nanokuler. DLS-målinger ble utført i den optiske akse, 4 mm under luft/glasslegeme-grenseflaten. I det ubehandlede (bærer-) glasslegeme er det to komponenter til kurven. Den tidlige (hurtige) komponent skyldes tilstedeværelse av hyaluronan (HA) som er fritt diffunderbart og oppviser betydelig molekyl- (brownsk) bevegelse. Den sene (langsomme) komponent skyldes kollagen, som er større og diffunderer mindre fritt (stivere), noe som resulterer i mer langsom brownsk bevegelse. I den andre ytterende har oppløsningen av polystyren-nanokuler bare én komponent (monodispers) som er meget hurtig på grunn av den lille størrelse av nanokulene og deres fullkomment sfæriske struktur som muliggjør meget hurtige bevegelser i oppløsningen. Med økende doser av uPli er det en reduksjon i helningen av TCF med forsvinning av den langsomme komponent (større molekyltype) som til slutt nærmer seg TCF for rene 20 nm nanokuler, dvs. alle molekyltyper med mindre størrelse. FIG. 13 viser representative fotografier av griseøyne etter injeksjon av mikroplasmin og fluorescein. Begge bilder er av samme øye, og det høyre bilde er tatt 20 minutter etter venstre bilde, noe som viser fluoresceindiffusjon i glasslegemet. FIG. 14 viser representative fotografier av griseøyne etter injeksjon av plasmin og fluorescein. Begge bilder er av det samme øye, idet det nedre bilde er tatt 20 minutter etter det øvre bilde, noe som viser fluoresceindiffusjon i glasslegemet i mindre grad enn det som sees for mikroplasminbehandlede øyne (Fig. 13).

Følgende detaljerte beskrivelse og de medfølgende eksempler er tilveiebrakt for de formål å beskrive og forklare kun visse foretrukne utførelsesformer av oppfinnelsen.

Før oppfinnelsen beskrives detaljert, kan det være nyttig for en forståelse av den å gi definisjoner av visse betegnelser som vil bli anvendt i det følgende.

Definisjoner

"behandling" angir reduksjon eller lindring av hvilken som helst medisinsk forstyrrelse i hvilket som helst omfang, og innbefatter, men fordrer ikke, en fullstendig helbredelse for forstyrrelsen.

"forebygging" betyr å beskytte mot utvikling av en forstyrrelse, dvs. å funksjonere som en profylakse.

"forstyrrelse" angir hvilken som helst sykdom, dysfunksjon, syndrom, tilstand, smerte, eller hvilken som helst kombinasjon av disse. Forstyrrelse innbefatter også

hvilke som helst komplikasjoner ved hvilken som helst sykdom, dysfunksjion, syndrom, tilstand, smerte eller hvilken som helst kombinasjon av disse.

"individ" angir hvilket som helst pattedyr, spesielt et menneske.

"bringe i kontakt" angir hvilken som helst administreringsmåte som resulterer i interaksjon mellom et preparat og et objekt som det bringes i kontakt med (f.eks. glasslegeme, vandig væske, osv.). Interaksjonen mellom preparatet og objektet som det bringes i kontakt med, kan finne sted hovedsakelig samtidig som administreringen av preparatet, i et langvarig tidsrom som starter omtrent fra tidspunktet for administreringen av preparatet, eller forsinkes fra tidspunktet for administrering av preparatet.

"preparat" angir en kombinasjon eller blanding av én eller flere substanser.

"substans" angir noe som har en masse og opptar et rom.

"fremmed substans" angir hvilken som helst substans som en lege, kliniker, veterinær eller forsker fastslås å være skadelig eller toksisk for et individs øye og/eller å være en substans som nomalt finnes i et friskt øye hos et pattedyr.

"oftalmologisk akseptabel bærer" er en substans med hvilken en andre substans (f.eks. et TPCD) kan kombineres, uten at den andre substans gjøres uegnet (fastslått av en lege, kliniker, veterinær eller forsker) for sin påtenkte anvendelse i et individs øye. Ikke-begrensende eksempler på en oftalmologisk akseptabel bærer innbefatter balansert saltoppløsning (BSS) og BSS-PLUS®.

"farmasøytisk akseptabel bærer" innbefatter, uten begrensning, vann, bufret saltoppløsning, polyol (f.eks. glycerol, propylenglykol, flytende polyetylenglykol) eller egnede blandinger av disse. Andre eksempler på farmasøytisk akseptable bærere og metoder for å lage slike bærere og utformninger av disse finnes for eksempel i Remington's Pharmaceutical Sciences (20. utgave, A. Gennaro (red.), Lippincott, Williams & Wilkins, 2000).

"en effektiv mengde" angir en mengde av en substans eller et preparat som fremkaller en respons i et øye hos et menneske eller annet pattedyr som søkes av en forsker, veterinær, lege eller annen kliniker.

"bevirkning" betyr å frembringe eller stimulere fremkomst av et ønsket resultat,

"redusere" betyr å minske i hvilket som helst omfang.

"toksiske virkninger på øyet" betyr en hver uheldig virkning på øyet hos et individ som av en forsker, veterinær, lege eller annen kliniker fastslås å være skadelig for individet.

"glasslegeme" angir glassvæsken som opptar kammeret mellom øyets krystall-linse og retina.

"TPCD" er et akronym for "trunkert plasminprotein omfattende et katalytisk doméne av plasmin". Et "trunkert plasminprotein" angir hvilket som helst plasminprotein oppnådd ved delesjon av én eller flere aminosyrer av Val79-plasmin (dvs. aminosyrene 79-791 i humant plasminogen), hvor det resulterende protein har serinprotease-katalytisk aktivitet. Slike aminosyredelesjoner kan være i den N-terminale ende (som resulterer i TPCD bestående for eksempel av aminosyrene 444-791, 543-791 eller 562-791 i SEKV ID NR: 10) og/eller i den C-terminale ende og/eller i hvilken som helst indre posisjon eller posisjoner i aminosyrene 79-791 i

SEKV ID NR:10. Det må være klart at hvis et trunkert protein avledet fra SEKV ID NR: 10 lages som en enzymatisk inaktiv form, må den aktiveres under anvendelse av en plasminogenaktivator for omdannelse av den til den tilsvarernde aktive form av det trunkerte protein. Hvis for eksempel et protein bestående av aminosyrene 543-791 av SEKV ID NR:10 gjøres rekombinant, er det meget sannsynlig at proteinet ikke vil være i sin enzymatisk aktive form. Følgelig bør proteinet behandles med en plasminogenaktivator til spaltning av peptidbindingen mellom Arg56i og VaU62, hvorved proteinet aktiveres.

"plasminprotein" angir hvilket som helst protein dannet eller avledet fra aminosyresekvensen av humant plasminogen (SEKV ID NR: 10) som har en

spaltning av peptidbindingen mellom Arg56iog Val562av humant plasminogen. Spaltningen av peptidbindingen mellom Arg56iog Val562kan utføres under anvendelse av plasminogenaktivatorer. Ikke-begrensende eksempler på plasminproteiner innbefatter Lys-plasmin, miniplasmin og mikroplasmin.

"katalytisk doméne av plasmin" angir en aminosyresekvens på ca. 130-240 aminosyrer avledet fra aminosyrene 543 til 791 av SEKV ID NR:10 (humant plasminogen), som innbefatter den katalytiske triade av plasmin, nemlig HiS603, Asp646 og Ser74i, hvor aminosyresekvensen har serinproteaseaktivitet.

"modifisert katalytisk doméne av plasmin" angir et katalytisk doméne av plasmin som er blitt forandret ved forandring av aminosyresekvensen av det katalytiske doméne ved addisjon og/eller delesjon og/eller substitusjon av én eller flere aminosyrer. Det er selvfølgelig underforstått at aminosyrene svarende til den katalytiske triade av plasmin, nemlig HiS503, Asp646og Ser74i, ikke er forandret. Modifikasjonen kan øke eller redusere proteinets katalytisk aktivitet, eller la den forbli uforandret. For eksempel kan det modifiserte katalytiske doméne av mikroplasmin og miniplasmin øke eller redusere den katalytiske aktivitet av disse proteiner eller la den være uforandret.

"modifisert TPCD" er et TPCD inneholdende et modifisert katalytisk doméne av plasmin, hvor TPCD har plasmin-liknende serinprotease-katalytisk aktivitet.

"andre middel" angir hvilken som helst substans som kan anvendes, enten i seg selv eller i kombinasjon med et TPCD, til behandling eller forebygging av en øyeforstyrrelse eller en komplikasjon ved en øyeforstyrrelse hos et individ. Det andre middel forhindrer fortrinnsvis ikke den katalytiske aktivitet av et TPCD.

"stabilisering av et protein" angir beskyttelse av et protein mot nedbrytning og/eller inaktivering ved anvendelse av ett eller flere stabiliseringsmidler.

Skjønt hvilke som helst metoder og materialer som likner eller er ekvivalent med dem som er beskrevet her, kan anvendes ved utøvelse eller testing av foreliggende oppfinnelse, er de foretrukne metoder og materialer beskrevet nedenfor.

Farmakologisk vitreolyse er en metode med anvendelse av ett eller flere proteinholdige og/eller kjemiske og/eller nukleinsyremidler til behandling eller forebygging av en forstyrrelse, eller en komplikasjon ved en forstyrrelse, i et individs øye. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer metoder for farmakologisk vitreolyse med anvendelse av minst ett trunkert plasminprotein omfattende et katalytisk doméne (TPCD). Det er mulig å behandle eller forebygge forstyrrelser i øyet, eller komplikasjoner ved forstyrrelser i øyet, ved at glasslegemet og/eller den vandige væske bringes i kontakt med en effektiv mengde av et preparat omfattende et TPCD. Dette resulterer i utbytter så som, men ikke begrenset til, flytendegjøring av glasslegemet, løsning av det bakre glasslegeme, reduksjon eller fjerning av hemoragisk blod fra glasslegemet og/eller den vandige væske, reduksjon eller fjerning av intraokulære fremmede substanser fra glasslegemet og/eller den vandige væske, øking av diffusjonen av et middel eller preparat administrert til glasslegemet og/eller den vandige væske, reduksjon av ekstraretinal neovaskularisering, og hvilke som helst kombinasjoner av disse. Disse metoder kan anvendes enten som supplement til vitrektomi eller i fravær av vitrektomi.

Et TPCD innbefatter hvilket som helst trunkert plasminprotein omfattende et katalytisk doméne av plasmin. Et trunkert plasminprotein omfatter hvilket som helst plasminprotein oppnådd ved delesjon av én eller flere aminosyrer av Val79-plasmin (dvs. aminosyrene 79-791 av humant plasminogen), hvor det resulterende protein har serinprotease-katalytisk aktivitet. Følgelig må alle TPCD inneholde den katalytiske triade av plasmin-serinprotease-doménet, nemlig HiS603, Asp646og Ser74i. Trunkeringer av Vata-plasmin kan utføres ved delesjoner av én eller flere aminosyrer i aminosyrene 79-791 av SEKV ID NR:10 (humant plasminogen). Slike delesjoner kan være i den N-terminale ende, den C-terminale ende eller på et indre sted i aminosyrer 79-791 av SEKV ID NR:10. Det må være klart at hvis et protein som er et resultat av en trunkering av aminosyrer 79-791 av SEKV ID NR: 10 (humant plasminogen) dannes i en enzymatisk inaktiv form, må proteinet omdannes til sin aktive form ved anvendelse av en plasminogenaktivator for å anses som et TPCD. Plasminogenaktivatorer spalter peptidbindingen mellom Arg56iog Val562, hvorved et protein aktiveres. Delesjonene kan være i den N- terminale ende, den C-terminale ende eller på et indre sted i henholdsvis aminosyrene 444-791, 543-791 og 562-791 av SEKV ID NR:10 (humant plasminogen). Metoder for utføring av aminosyredelesjoner i et protein er velkjente for vanlige fagfolk på området (f.eks. Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al. (red.), John Wiley & Sons, 2001; og Molecular Cloning: A Laboratory Manual, tredje utgave, Sambrook og Russell, 2000). Den katalytiske aktivitet av et TPCD kan bestemmes ved måling av den amidolytiske aktivitet av TPCD, under anvendelse av det kromogene substrat S2403 (Chromogenix, Antwerpen, Belgia) (se eksempel 2), hvilket som helst annet kromogent substrat, eller ved hvilke som helst andre metoder kjent på området.

Det er videre mulig å anvende et modifisert TPCD. Et modifisert TPCD er et TPCD med en modifisert form av det katalytiske doméne av plasmin, hvor det modifiserte TPCD har plasminliknende serinprotease-katalytisk aktivitet. Modifikasjoner av det katalytiske doméne innbefatter aminosyreinnsettinger og/eller -delesjoner og/eller -substitusjoner i det katalytiske doméne av plasmin. Aminosyrene svarende til den katalytiske triade av plasmin-serinprotease-doménet, nemlig Histidin6o3, Asparaginsyre646 og Serin74ier imidlertid ikke forandret. Fortrinnsvis innbefatter modifikasjonene av det katalytiske doméne én eller flere konserverende substitusjon(er) av aminosyrer som ikke er en del av den katalytiske triade. Konserverende aminosyre-substitusjoner og metoder for utføring av slike konserverende aminosyre-substitusjoner er velkjente for en vanlig fagperson på området (se f.eks. Current Protocols in Molecular Biology, supra; og Molecular Cloning: A Laboratory Manual, supra). Disse modifikasjoner kan øke eller redusere den katalytiske aktivitet av det opprinnelige doméne eller la den være uforandret. Den katalytiske aktivitet av et modifisert TPCD kan bestemmes ved måling av den amidolytiske aktivitet av TPCD, under anvendelse av det kromogene substrat S2403 (Chromogenix, Antwerpen, Belgia) (se eksempel 2) eller ved hvilke som helst andre metoder kjent på området.

TPCD innbefatter, men er ikke begrenset til, miniplasmin, rekombinant miniplasmin, stabilisert miniplasmin, stabilisert, rekombinant miniplasmin, varianter av miniplasmin, mikroplasmin, rekombinant mikroplasmin, stabilisert mikroplasmin, stabilisert, rekombinant mikroplasmin og varianter av mikroplasmin. Varianter av mikroplasmin og miniplasmin innbefatter mikroplasmin og miniplasmin i kortere former som kan fremstilles ved aminosyredelesjoner fra disse proteiner. Alle varianter av mikroplasmin og miniplasmin er ventet å ha serinprotease-katalytisk aktivitet, selv om de ikke har det samme nivå av katalytisk aktivitet som henholdsvis mikroplasmin og miniplasmin. Følgelig må alle varianter av mikroplasmin og miniplasmin inneholde aminosyrene 603-741 av SEKV ID NR: 10, som inneholder den katalytiske triade av plasmin-serinprotease-doménet, nemlig HiS603, Asp646og Ser74iav humant plasminogen. En variant av miniplasmin proteiner kan inneholde én eller flere aminosyre-delesjoner i aminosyrene 444-791 av humant plasminogen, hvor det resulterende protein har serinprotease-katalytisk aktivitet. Videre en variant av mikroplasmin proteiner inneholdende én eller flere delesjoner i aminosyrene 543-791 av humant plasminogen, hvor det resulterende protein har serinprotease-katalytisk aktivitet. En ytterligere variant av mikroplasmin proteiner inneholder én eller flere delesjoner i aminosyrene 562-791 av humant plasminogen, hvor det resulterende protein har serinprotease-katalytisk aktivitet. Delesjonene kan være i den N-terminale ende, den C-terminale ende eller på et indre sted i henholdsvis aminosyrene 444-791, 543-791 og 562-791 av SEKV ID NR:10; imidlertid må alle varianter av mikroplasmin og miniplasmin inneholde aminosyrene 603-741 av SEKV ID NR:10. Varianter av mikroplasmin og miniplasmin innbefatter også, men er ikke begrenset til, aminosyreinnskudd og/eller -substitusjoner i disse proteiner. Det er påtenkt at aminosyresubstitusjoner utført i mikroplasmin eller miniplasmin fortrinnsvis er konserverende substitusjoner. Hvilken som helst variant av mikroplasmin og miniplasmin eller hvilket som helst annet TPCD kan fremstilles ved rekombinante metoder og aktiveres til den aktive plasminform med en plasminogenaktivator. Alternativt kan varianter av mikroplasmin og miniplasmin eller hvilket som helst annet TPCD fremstilles på hvilken som helst annen måte som er velkjent på området, så som, men ikke begrenset til, digerering av humant plasminogen med elastase eller partiell reduksjon og alkylering av plasmin, mikroplasmin eller miniplasmin. Disse varianter av mikroplasmin, miniplasmin, eller for den saks skyld hvilket som helst TPCD kan analyseres med henblikk på serinprotease-katalytisk aktivitet under anvendelse av det kromogene substrat S2403 eller hvilket som helst annet kromogent substrat. Dessuten kan variantene av mikroplasmin, miniplasmin eller hvilket som helst annet TPCD testes med hensyn til sin evne til å bevirke PVD og/eller bevirke flytendegjøring av glasslegemet ved injisering av forskjellige doser av varianten i hvilken som helst balansert saltoppløsning i grise- eller katteøyne eller humane post-mortem-øyne. Hvis et TPCD kan bevirke PVD og/eller bevirke flytendegjøring av glasslegemet i noen av disse øyne, anses dette TPCD for å være anvendelig for behandling av forstyrrelser i øyet hos pattedyr. TPCD resulterer fortrinnsvis ikke i toksisitet for det injiserte øye. Eksempler på varianter av mikroplasmin er gitt i tabell 1.

Miniplasmin og mikroplasmin dannes ved aktivering av miniplasminogen og mikroplasminogen ved plasminaktivatorer så som, men ikke begrenset til, streptokinase, stafylokinase, vevstype-plasminogenaktivator eller urokinase. Miniplasminogen og mikroplasminogen er avledet fra plasminogen, som er et enkeltkjedet glykoprotein som er en viktig komponent i blodet hos pattedyr. Humant plasminogen er et multidoméneprotein med 791 rester (SEKV ID NR: 10), bestående av et N-terminalt preaktiveringsdoméne, fem homologe kringledoméner hvert med ca. 80 aminosyrer, et serinprotease-katalytisk doméne og interdoméne-sammenknyttende sekvenser. Plasmin eller plasminogenaktivatorer spalter

peptidbindingene mellom Arg68-Met.69, eller Lys77-Lys78eller Lys78-Val79i den N-terminale ende av humant plasminogen, noe som resulterer i kortere proenzymer

kalt Lys-plasminogener (for eksempel proteiner bestående av aminosyrene 69-791 eller 78-791 eller 79-791). Ytterligere spaltning med enzymet elastase fjerner de første fire kringledoméner som danner proenzymet, miniplasminogen (typisk aminosyrer 442-791). Ytterligere spaltning av den femte kringle gir proenzymet, mikro-plasminogen (typisk aminosyrene 543-791). Kringlene i plasminogen inneholder lysinbindende seter som formidler spesifikk binding av plasminogen til substrater så som fibrin. Proenzymformene av plasminogen aktiveres til sin enzymatisk aktive form ved spaltning av peptidbindingen mellom Arg56iog Val562under dannelse av en disulfidbundet dobbeltkjedeform av det tilsvarende protein. Produktet av aktivering av et plasminogenprotein kalles et plasmin. Følgelig kalles produktet av Lys-plasminogenaktivering Lys-plasmin, mens produktene av aktivering av miniplasminogen og mikroplasminogen omtales som henholdsvis miniplasmin og mikroplasmin. Lys-plasmin har en molekylvekt på ca. 65 000 i ikke-glykosylert form og en molekylvekt på ca. 83 000 dalton i fullstendig glykosylert form, mens miniplasmin har en molekylvekt på ca. 38 000 dalton, og mikroplasmin har en molekylvekt på ca. 26 500 dalton i redusert form og ca. 29 000 dalton i ikke-redusert form. I likhet med plasmin har miniplasmin og mikroplasmin katalytisk aktivitet. En fordel med miniplasmin og mikroplasmin fremfor plasmin er deres mindre størrelse sammenliknet med plasmin. Følgelig er det ventet at både mikroplasmin og miniplasmin har hurtigere diffusjonshastigheter i glasslegemet enn plasmin (Xu, J. et al., Pharmaceutical Research 17: 664-669, 2000).

Ved én utførelsesform har et TPCD en molekylvekt på mindre enn ca.

40 000 dalton. Ved en annen utførelsesform har et TPCD en molekylvekt på mellom ca. 20 000 og ca. 30 000 dalton. Ved enda en annen utførelsesform har et TPCD en molekylvekt på ca. 26 500 dalton i redusert form og ca. 29 000 dalton i ikke-redusert form. Ved en ytterligere utførelsesform har et TPCD en molekylvekt på under ca. 20 000 dalton.

Mikroplasmin kan fremstilles ved autolytisk reaksjon mellom plasmin og plasminogen i sterkt alkalisk oppløsning med en pH i området fra ca. 9,5 til 11,5, som beskrevet i US-patent nr. 4 774 087. Alternativt kan mikroplasmin og miniplasmin fremstilles ved rekombinante metoder som beskrevet i PCT-patentsøknad WO 02/50290. Kort angitt blir DNA som koder for miniplasminogen og mikroplasminogen, uavhengig klonet i en gjærsopp-ekspresjonsvektor (f.eks. pPICZa A-sekresjonsvektor fra Invitrogen Corporation) som kan anvendes til å uttrykke disse proteiner i metylotropiske gjærsopptyper (f.eks. Hansenula, Pichia, Candida og Torulopsis). Gjærsoppkloner som danner proteiner med den høyeste miniplasmin- og mikroplasminaktivitet, utvelges for produksjon i stor målestokk. Disse kloner kan dyrkes i hvilken som helst målestokk, med typisk i en målestokk på fra ca. 20 liter til ca. 500 liter. Det utskilte miniplasminogen eller mikroplasminogen renses ved en tretrinnsprosess omfattende kationebytting, ekspandert sjikt-kromatografi, hydrofob kromatografi og affinitetskromatografi. Det rensede mikroplasminogen og miniplasminogen oppnådd ved denne prosess aktiveres til sine aktive former under anvendelse av et molart forhold av en plasminogenaktivator (f.eks. urokinase, streptokinase, stafylokinase, SY162-stafylokinasevarianten, osv.). Det skal bemerkes at den rekombinante prosess for fremstiling av miniplasmin og mikroplasmin kan utvides til å fremstille hvilket som helst TPCD. En fordel med å anvende et rekombinant TPCD sammenliknet med autologt plasminenzym er at de rekombinante proteiner kan fremstilles fra store produksjonssatser, noe som resulterer i enzymer med jevn aktivitet. På grunn av at disse proteiner har jevn aktivitet, kan standardiserte protokoller implementeres. En ytterligere fordel er at disse proteiner kan være lett tilgjengelige uten den forsinkelse og andre tilknyttede problemer som er forbundet med isolering og rensing av plasmin fra hver pasient.

TPCD oppnådd ved prosessene beskrevet ovenfor kan konsentreres, stabiliseres og/eller lyofiliseres. Metoder for konsentrering av proteiner er velkjente for vanlige fagfolk på området (se for eksempel Protein Purification Methods: A Practical Approach, Harris, E.L.V og Angal, S. (red.), IRL Press, 1989; A Guide to Protein Isolation (andre utgave), Clive Dennison, Kluwer Academic Publications, 2003; og Protein Methods (andre utgave), Daniel M. Bollag, Michael D. Rozycki, Stuart J. Edelstein (red.), Wiley, 1996).

Stabilisering er en metode for beskyttelse av et protein mot nedbrytning og/eller inaktivering ved anvendelse av ett eller flere stabiliseringsmidler (f.eks. ved at et TPCD bringes i kontakt med et stabiliseringsmiddel, eller ved rensing av et TPCD i nærvær av et stabiliseringsmiddel). Stabiliseringsmidler innbefatter, uten begrensning, traneksaminsyre, heksansyre, lysin, serin, treonin, metionin, glutamin, alanin, glycin, isoleucin, valin, alanin, asparaginsyre, flerverdig alkohol, farmasøytisk akseptable karbohydrater, glukosamin, tiamin, niacinamid, hvilken som helst sur buffer omfattende citronsyre, eddiksyre, saltsyre, karboksylsyre, melkesyre, eplesyre, vinsyre eller benzosyre, og salter så som natriumklorid, kaliumklorid, magnesiumklorid, kalsiumklorid og hvilke som helst derivater eller kombinasjoner derav. Én fordel med anvendelse av stabilisert, rekombinant fremstilt TPCD sammenliknet med autologt plasminenzym er at disse proteiner er mer stabile enn autologt plasminenzym, som fås ved tapping av blod og rensing, preparering og oppbevaring av plasminenzym på pasient-for-pasient-basis. I motsetning til autologt plasminenzym, som må anvendes meget snart etter fremstilling av det, kan stabilisert, rekombinant TPCD anvendes selv etter et signifikant tidsrom fra rensingstidspunktet.

Lyofilisering av et TPCD ifølge oppfinnelsen kan utføres umiddelbart etter konsentrering av de rensede proteiner eller etter stabilisering. Metoder for lyofilisering av proteiner er velkjente for vanlige fagfolk på området. Det lyofiliserte TPCD kan oppbevares i medisinglass (f.eks. av glass) i hvilken som helst mengde, men fortrinnsvis i mengder som lett kan rekondisjoneres for bruk.

Lyofilisert mikroplasmin, miniplasmin eller hvilket som helst annet TPCD kan rekondisjoneres i en oftalmologisk akseptabel bærer før det anvendes til å bringes i kontakt med glasslegemet og/eller den vandige væske. Ved én utførelsesform er en oftalmologisk akseptabel bærer et sterilt løsningsmiddel med en pH og osmolaritet som er kompatibel med individets glasslegeme. Ikke-begrensende eksempler på oftalmologisk akseptable bærere er isotonisk saltoppløsning, balansert saltoppløsning (BSS) og BSS PLUS®. En balansert saltoppløsning inneholder typisk: 0,64% natriumklorid, 0,075% kaliumklorid, 0,048% kalsiumklorid-dehydrat, 0,03% magnesiumklorid-heksahydrat, 0,39% natriumacetat-trihydrat, 0,17% natriumcitrat-dihydrat, natriumhydrid/saltsyre for justering av pH, og vann.

Metoden for sammenbringing av glasslegemet og/eller den vandige væske ved anvendelse av preparater omfattende et TPCD vil avhenge av det bestemte individ, graden av tilstanden som behandles og doseringen som kreves for terapeutisk effektivitet, og kan bestemmes av en lege på pasient-for-pasient-basis. Hvilken som helst metode for sammenbringing av glasslegemet og/eller den vandige væske som tilveiebringer en effektiv mengde av et TPCD til glasslegemet og/eller den vandige væske, kan anvendes. Det må være klart at slik kontakt med glasslegemet og/eller den vandige væske ikke må finne sted samtidig med administrering av et preparat omfattende et TPCD. Sammenbringingen kan forsinkes eller finne sted over et langvarig tidsrom fra administreringstidspunktet. Én metode for sammenbringing av glasslegemet og/eller den vandige væske er ved én eller flere intraokulære injeksjoner direkte i henholdsvis glasslegemet og/eller den vandige væske. Sammenbringing av glasslegemet og/eller den vandige væske kan også skje ved subkonjunktivale, intramuskulære eller intravenøse injeksjoner. Hvilken som helst av disse injeksjoner kan tilveiebringes under anvendelse av en flytende oppløsning omfattende et TPCD i henhold til metoder som er velkjente på området. Alternativt kan glasslegemet og/eller den vandige væske imidlertid bringes i kontakt med et TPCD ved hvilken som helst annen egnet metode, som resulterer i tilstrekkelig distribusjon av TPCD til glasslegemet og/eller den vandige væske til behandling eller forebygging av forstyrrelsen, eller en komplikasjon ved en forstyrrelse, i et individs øye. Et preparat omfattende et TPCD kan også administreres ved anbringelse at en intravitreal implantabel innretning innbefattende, men ikke begrenset til, OCUSERT®

(Alza Corp., Palo Alto, Calif.) og VITRASERT® (Bausch and Lomb, Inc., Rochester, N.Y.). Glasslegemet og/eller den vandige væske kan bringes i kontakt med et TPCD under anvendelse av et depot, en utformning med langvarig frigjøring, eller hvilken som helst implantabel innretning slik at et TPCD tilføres kontinuerlig.

Doseringsregimener for TPCD kan lett bestemmes av en vanlig fagperson på området og vil variere avhengig av pasienten og virkningen som vil oppnås. TPCD kan anvendes i hvilken som helst dose som frembringer ønskelige terapeutiske virkninger, innbefattende, men ikke begrenset til, glasslegeme-flytendegjøring, løsning av bakre glasslegeme og/eller fjerning av blod, toksiske materialer eller fremmede substanser fra glasslegemehulen, uten at det forårsakes noen signifikant toksisitet for øyet (spesielt retina) eller tilknyttede anatomiske strukturer. Dessuten kan et TPCD administreres som enkeltdose eller i multiple doses. En typisk TPCD-dosering er i området fra ca. 0,005 mg til ca. 0,2 mg pr. øye. Hvis injisert, kan TPCD tilveiebringes i et avgivelsesvolum på fra ca. 0,05 ml til ca. 0,3 ml av et sterilt løsningsmiddel (f.eks. steril BSS eller BSS PLUS®) pr. øye. I de tilfeller hvor det skal utføres en vitrektomi, får TPCD være i glasslegemet og/eller den vandige væske i mellom ca. 15 og 120 minutter før fjerning av glasslegemet. Det kan avgis en dose på 0,125 mg TPCD i 0,1 ml steril BSS eller BSS PLUS® pr. øye. Videre kan det avgis en dose på 0,125 mg TPCD i 0,1 ml steril BSS eller BSS PLUS® pr. øye i ca. 15-120 minutter før vitrektomi.

Det kan anvendes preparater omfattende mer enn ett TPCD. Glasslegemet og/eller den vandige væske bringes i kontakt med et preparat omfattende et første TPCD og et andre TPCD. Det første og andre TPCD er valgt fra gruppen bestående av miniplasmin, rekombinant miniplasmin, stabilisert miniplasmin, stabilisert, rekombinant miniplasmin, varianter av miniplasnlin, mikroplasmin, rekombinant mikroplasmin, stabilisert mikroplasmin, stabilisert, rekombinant mikroplasmin, varianter av mikroplasmin og hvilke som helst kombinasjoner av disse. Glasslegemet og/eller den vandige væske kan bringes i kontakt med et første preparat omfattende minst ett TPCD og med et andre preparat omfattende minst ett TPCD. TPCD kan være de samme eller forskjellige proteiner og kan administreres hovedsakelig samtidig eller på forskjellige tidspunkter. Dessuten kan et TPCD også administreres som et preparat som videre omfatter minst ett andre middel. Videre kan glasslegemet og/eller den vandige væske bringes i kontakt med et preparat omfattende minst ett TPCD fulgt av et preparat omfattende minst ett andre middel, eller vice versa. Dette kan være nødvendig hvor tiden som trenges for hvert av disse preparater, er forskjellig, dvs. hvor ett preparat trenger mer tid for å virke sammenliknet med det andre. Et andre middel er hvilket som helst protein (men ikke et TPCD), kjemisk eller annen substans som er anvendelig til behandling eller forebygging av forstyrrelser i øyet, eller komplikasjoner ved en øyeforstyrrelse. Slike andre midler er beskrevet i US-patenter nr.: 4 820 516; 5 292 509; 5 866 120; 6 051 698; 6 462 071; 6 596 725; og 6 610 292. Andre midler som er anvendbare innbefatter glykosaminoglykanase-enzymer så som hyaluronidaser, kondroitinase ABC, kondroitinase AC, kondroitinase B, kondroitin-4-sulfatase, kondroitin-6-sulfatase og B-glukuronidase; kollagenase-enzymer; dispase; RGD-holdige peptider så som RGD, GRGDS, SEQ ID NO:11 GRGDTP, SEQ ID NO: 12 Echistatin og Falvoridin; anti-integrin-antistoff; P2Y-reseptor-antagonister; urea, hydroksyurea, tiourea og anti-angiogene midler så som vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF)-inhibitorer (f.eks. anti-VEGF-antistoffer, VEGF-aptamerer, løselige VEGF-reseptorer, osv.) og placenta-vekstfaktor (PIGF) inhibitorer (f.eks. anti-PIGF antistoffer, PIGF-aptamerer, løselige VEGF-reseptorer, osv.). De fleste av disse andre midler er i seg selv i stand til å befordre glasslegeme-flytendegjøring og/eller bevirkning av løsning av bakre glasslegeme. Anti-angiogene andre midler kan være anvendelige ved forebygging av neovaskularisering i øyet. Ekspresjon av VEGF og/eller PIGF fra en hypoksisk retina antas å resultere i utvikling av ekstraretinal neovaskularisering. Følgelig vil inhibering av VEGF og/eller PIGF være en effektiv måte til forhindring av neovaskularisering.

Et preparat omfattende et TPCD er anvendelig til å bevirke flytendegjøring av glasslegemet og/eller fjerning eller løsning av glasslegemet fra retina og andre vev (f.eks. epiretinale membraner, makula). Som et resultat av denne glasslegeme-flytendegjøring og/eller glasslegemeløsning minimaliseres strekk-kreftene av glasslegemet på retina og andre vev, og hastigheten av naturlig utskiftning av fluider i glasslegemet akselereres. Således er preparater omfattende et TPCD spesielt egnet for behandling eller forebygging av mange forstyrrelser i øyet, som drar fordel av glasslegeme-flytendegjøring, løsning av bakre glasslegeme, reduksjon av ekstraretinal neovaskularisering og/eller akselerert fjerning av toksiner eller andre skadelige substanser (f.eks. angiogene faktorer, ødemfluider, hemoragisk blod osv.) fra øyets bakre kammer og/eller vev i umiddelbar nærhet av det bakre kammer (f.eks. retina eller makula). Eksempler på slike forstyrrelser i øyet innbefatter retinaløsning, retinarifter, glasslegemeblødning, diabetisk glasslegemeblødning, proliferativ diabetisk retinopati, ikke-proliferativ diabetisk retinopati, alderstilknyttet makula-degenerasjon, makulahuller, vitreomakulær traksjon, makularynker, makula-eksudater, cystoid makulaødem, fibrinavsetning, retinalveneokklusjon, retinalarterieokklusjon, subretinal blødning, amblyopi, endoftalmitt, prematur retinopati, glaukom og retinitis pigmentosa og andre hvor de kliniske symptomer på disse forstyrrelser responderer overfor TPCD-administrering. Det er mulig å forebygge eller inhibere inntreden av forskjellige forstyrrelser i øyet som er et resultat av, eller som forverres av, glasslegemeadhesjon til retina og glasslegemekontraksjon. Det er mulig å forebygge eller inhibere forstyrrelsene, eller komplikasjoner som er et resultat av en forstyrrelse, i et individs øye uten at glasslegemet fjernes.

Mange oftalmiske forstyrrelser har som årsakskomponent en destabilisering av blod-retina-membranen. Denne destabilisering muliggjør at forskjellige komponenter (f.eks. serumkomponenter, lipider, proteiner) i koriokapillærene kommer inn i glaslegemekammeret og ødelegger retinaoverflaten. Denne destabilisering er også en forløper for vaskulær infiltrasjon av glasslegeme-kammeret, kjent som neovaskularisering. Neovaskularisering av glasslegemet avhenger av glasslegemets matriks. Således blokkerer flytendegjøring av glasslegemet, som fjerner matriksen i form av det polymeriserte glasslegeme, neovaskularisering.

Flere oftalmologiske forstyrrelser innbefattende diabetisk retinopati og traume resulterer i brist eller lekkasje i retinale blodkar med resulterende blødning inn i glasslegemet (dvs. glasslegemeblødning). Glasslegemeblødning viser seg typisk som uklarhet eller opasifisering av glasslegemet, og er noen ganger, men ikke alltid, ledsaget av opprivning eller løsning av retina. I tilfeller hvor glasslegemeblødningen ledsages av retinaopprivning eller -løsning, er det viktig at slik retinaopprivning eller -løsning straks diagnostiseres og repareres kirurgisk. Svikt ved umiddelbar diagnostisering og reparering av retinariften eller -løsningen kan gjøre at fotoreseptorceller i retina, i området for riften eller løsningen, blir nekrotisk. Nekrose av fotoreseptorcellene i retina kan resultere i synstap. Hvis retinaløsningen får forbli ureparert i et slikt langvarig tidsrom, kan dette videre resultere i ytterligere glasslegemeblødning og/eller dannelse av fibrøst vev på blødningsstedet. Fibrøst vev kan resultere i dannelse av en uønsket permanent fibrøs forbindelse mellom glasslegemet og retina. I fravær av en hver behandling kan det ta 6-12 måneder eller lenger å fjerne hermoragisk tilsløring av glasslegemet i tilstrekkelig grad til at det muliggjøres transvitreal besiktigelse av retina. I slike tilfeller, hvor en lege vil måtte reparere én eller annen del av retinaoverf laten, eller hvor en lege vil måtte undersøke retinaoverf laten hos en pasient som forhindres av et opakt eller uklart glasslegeme, må man kanskje utføre en mikrokirurgisk prosedyre kjent som vitrektomi. Denne prosedyre innbefatter fjerning av hele eller en del av glasslegemet med en mikrokirurgisk skjæreanordning og erstatning av glasslegemet med en klar væske eller annen substans som muliggjør at øyehulen kan beholde sin form. Kirurgiske standard-vitrektomimetoder er velkjente for vanlige fagfolk på området. Ved én utførelsesform er det ved oppfinnelsen påtenkt å bringe glasslegemet i kontakt med et preparat omfattende minst ett TPCD som supplement til vitrektomi. Ved andre utførelsesformer blir glasslegemet brakt i kontakt med preparatet som omfatter minst ett TPCD, i fravær av utførelse av vitrektomi.

Oppfinnelsen er ytterligere illustrert ved følgende eksempler.

EKSEMPEL 1

Vektorkonstruksjon for ekspresjon av humant mikroplasminogen og humant miniplasminogen i Pichia pastoris

( a) pPICZa A- vektoren

pPICZa A-sekresjonsvektoren anskaffet fra Invitrogen Corporation (Carlsbad, California) ble anvendt til å styre ekspresjonen og sekresjonen av rekombinant humant mikroplasminogen og miniplasminogen i Pichia pastoris. Bemerkelsesverdige trekk ved denne vektor innbefatter: (i) et 942 bp fragment inneholdende alkoholoksidase 1 (<y>AOX^-promoteren som muliggjør metanol-induserbar høynivåekspresjon av rekombinant protein i Pichia, samt målsøkt plasmidintegrering til<y>40X7-kromosomstedet; (ii) det native transkripsjons-terminerings- og polyadenyleringssignal fra<y>40X7-genet; (iii) en ekspresjons-kassett som gir Escherichia coil og Pichia pastoris zeocinresistens; (iv) et ColE1-replikasjonsorigo for formering og opprettholdelse av plasmidet i Escherichia coli; (v) en c-myc-epitop og en polyhistidin (6X His) SEQ ID NO: 13merkesubstans, som kan anvendes for proteindeteksjon og -rensing; og (vi) unike restriksjonsseter (for eksempel Sac I, Pme I, BstXI) som muliggjør linearisering av vektoren i AOX1-lokuset for effektiv integrering i P/'c/7/'a-genomet.

I tillegg til ovennenvte trekk inneholder dette vektor-sekresjonssignalet fra Saccharomyces cerevisiae a-faktor-prepropeptidet, noe som muliggjør ekspresjon av heterologe proteiner som utskilte proteiner i mediet. Bearbeidingen av a-faktor-paringssignalsekvensen i pPICZa finner sted i to trinn: 1. den midlertidige spaltning av signalsekvensen med KEX2-genproduktet som finnes mellom arginin og glutamin i sekvensen Glu-Lys-Arg<*>Glu-Ala-Glu-Ala SEQ ID NO: 14, hvor<*>er spaltningsstedet. Glu-Ala-repeteringer, er imidlertid ikke alltid nødvendige for spaltning ved Kex2. 2. Glu-Ala-repeteringene spaltes ytterligere ved STE73-genproduktet. I noen tilfeller hvor Ste13-spaltning ikke er effektiv, forblir Glu-Ala-repeteringene på den NH2-terminale ende av det aktuelle uttrykte protein.

Umiddelbart nedstrøms for a-faktor-signalsekvensen i pPICZa A-vektoren blir det konstruert et multi-kloningssete med gjenkjennelsessekvenser for enzymene EcoR I, Sfi I, Kpn I, Xho I, Sac H og Xba I for å gjøre kloning av fremmede gener lettere. I tillegg til Xho l-setet i det multiple kloningssete, er det en Xho l-gjenkjennelsessekvens i den karbonylterminale ende av a-faktor-sekresjonssignalet, umiddelbart oppstrøms for Lys-Arg Kex2-spaltningssetet. Dette Xho l-restriksjonssete kan anvendes til å klone det aktuelle gen i flukt med Kex2-spaltningssetet ved anvendelse av en PCR-kloningsfremgangsmåte og en passende foroverprimer til gjenoppbygging av sekvensen fra Xho l-setet til argininkodonet. Det aktuelle rekombinante protein vil så bli uttrykt med en nativ NH2-terminal ende.

( b) Ekspresjonsvektorkonstruksjon for makroplasminogen

Nukleinsyresekvensen som koder for det humane mikroplasminogenprotein (aminosyrene 543 til 791 (SEKV ID NR: 4)) ble amplifisert ("PCR-berging") fra vektoren Fmyc-uPli (Lasters et al. i Eur. J. Biochem. 244:946, 1997) under anvendelse av Advantage cDNA-polymeraseblandingen som leveres av Clontech (Palo Alto, California). Etter et DNA-templat-denatureringstrinn på 3 minutter ved 94°C, ble det utført 30 runder termisk syklisering (30 sekunder ved 94°C, 30 sekunder ved 50°C, 30 sekunder ved 72°C), fulgt av et 2 minutters endelig forlengelsestrinn ved 72°C. Følgende oligonukleotidprimere LY-MPLG1 (sense) og LY-MPLG2 (antisense) ble anvendt i denne reaksjon:

LY-MPLG1 -primeren hadde en koplingsregion svarende til restene 543-548 av humant plasminogen (Ala-Pro-Ser-Phe-Asp-Cys) SEQ ID NO: 15 etter en ikke-koplings-ekstensjon som innbefattet de siste fire rester av a-faktor-paringssignalet (Leu-Glu-Lys-Arg) SEQ ID NO: 16.1 denne ekstensjon bestemmer Leu-Glu-kodonene Xho l-restriksjonssetet (understreket) som muliggjør kloning av det aktuelle gen i flukt med Kex2-spaltningssetet. LY-MPLG2-primeren hadde en koplingsregion svarende til de siste sju rester av plasminogen, fulgt av et TAA- stoppkodon og en ikke-koplings-region omfattende en Xba I-gjenkjennelsessekvens (understreket).

Det amplifiserte fragment med den ventede størrelse (~780 bp) ble digerert med Xho I og Xba I og retningsklonet i vektoren pPICZa A. Mottakervektorfragmentet ble fremstilt ved Xho I- og Xba l-restriksjon og renset fra agarosegel under anvendelse av gelekstraksjonssettet Qiaquick (Qiagen GmbH, Tyskland). £.co//'-stammen TG1 (DSMZ-samling nr. 1208, Tyskland) ble transformert med ligeringsblandingen, og zeocin-resistente kloner ble selektert. Basert på restriksjonsanalyse ble et plasmidklon inneholdende et innskudd med den ventede størrelse bibeholdt for ytterligere karakterisering. Sekvensbestemmelse av vektoren pPICZa-MPLG1 (klon nr. 5) under anvendelse av primerne 5'AOX og 3'AOX, som ble tilveiebrakt i EasySelect P/cft/a-ekspersjonssettet fra Invitrogen Corporation (Carlsbad, California), bekreftet nøyaktig innsetting av mikroplasminogen-kodingsregionen koplet til a-faktor-paringssignalet, samt fravær av uønskede mutasjoner i kodingsregionen.

Den bestemte nukleotidsekvens og den utledede aminosyresekvens i anvendt humant mikroplasminogen er representert i henholdsvis SEKV ID NR: 3 og SEKV ID NR: 4. Sammenliknet med sekvensen tidligere bestemt av Forsgren et al. i FEBS Lett. 213:254, 1987, er nukleotidsekvensen forskjellig i 10 posisjoner. Imidlertid var aminosyresekvensen identisk.

( c) Ekspresjonsvektor- konstruering for miniplasminogen

En pPICZa-avledet sekresjonsvektor ble konstruert som følger for miniplasminogen-ekspresjon, idet man gjorde bruk av den ovenfor beskrevne pPICZa-MPLG1-vektor.

Et 500 bp DNA-fragment som koder for kringle fem og en del av det katalytiske doméne av miniplasminogenproteinet (aminosyrer 444 til 604 av SEKV ID NR:10) ble amplifisert ("PCR-berging") fra vektoren FdTet-SN-miniPIg (Lasters et al., angitt ovenfor). Etter et DNA templat-denatureringstrinn på 3 minutter ved 94°C, ble det utført 30 runder termisk syklisering (10 sekunder ved 94°C, 10 sekunder ved 50°C, 15 sekunder ved 72°C), fulgt av et 2 minutters slutt-forlengelsestrinn ved 72°C. Følgende oligonukleotidprimere LY-MINPLG1 (sense) og LY-MINPLG2 (antisense) ble anvendt i denne reaksjon:

LY-MINPLG1-primeren haren koplingsregion svarende til restene 444-452 av plasminogen (Ala-Pro-Pro-Pro-Val-Val-Leu-Leu-Pro) SEQ ID NO: 17 som etterfølger en ikke-koplings-ekstensjon som innbefattet de siste fire rester av faktor-paringssignalet (Leu-Glu-Lys-Arg). I denne ekstensjon bestemmer Leu-Glu-kodonene Xho l-restriksjonssetet (understreket) som muliggjør kloning av det aktuelle gen i flukt med Kex2-spaltningssetet.

LY-MINPLG2-primeren haren koplingsregion svarende til restene 596-604 av humant plasminogen (Glu-Trp-Val-Leu-Thr-Ala-Ala-His-Cys) SEQ ID NO: 18. Denne koplingsregion av det katalytiske doméne, som også finnes i mikroplasminogen-ekspresjonsvektoren, omfatter en unik Pst I-gjenkjennelsessekvens (understreket).

Det amplifiserte fragment med den ventede størrelse ble digerert med Xho I og Pst I og retningsklonet i mottakervektorfragmentet avledet fra pPICZa-MPLG1 (beskrevet ovenfor). Mottakervektorfragmentet ble fremstilt ved Xho I- og Pst I-restriksjon og renset fra agarosegel under anvendelse av Qiaquick-gelekstraksjonssettet (Qiagen GmbH, Tyskland). E. co//'-stammen TG1 (DSMZ samling nr. 1208, Tyskland) ble transformert med ligeringsblandingen, og zeocin-resistente kloner ble selektert. Basert på restriksjonsanalyse ble et plasmidklon inneholdende et innskudd med den ventede størrelse holdt tilbake for ytterligere karakterisering. Sekvensbestemmelse av vektoren pPICZa-KMPLGI (klon nr. 3) med anvendelse av primerne 5'AOX og 3'AOX bekreftet nøyaktig innsetting av det amplifiserte fragment koplet til a-faktor-paringssignalet, samt fravær av en hver mutasjon i den klonede region.

EKSEMPEL 2

Fremgangsmåte for fremstilling av rekombinant, stabilisert mikroplasmin

(a) Transformering av Pichia med pPICZa- MPLG1

Ti u,g av vektoren pPICZa-MPLG1 ble digerert med Pme I, som lineariserer vektoren i 5' AOX1-regionen. DNA ble utfelt og konsentrert til ca. 0,33 jag/ul i sterilt destillert vann, og 5 ul ble anvendt til transformering av kompetente Pichia pastoris X33-celler preparert i henhold til manualen som finnes i EasySelect Pichia-ekspresjonssettet.

(b) Seleksjon av en høyekspresjonsstamme

Seleksjon av en høyekspresjonsstamme ble utført som følger. Zeocin-resistente transformanter ble selektert på YPDSZ-plater (1% gjærekstrakt, 2% pepton, 2% glukose, 1M sorbitol, 2% agar, 100 ug/ml zeocin). Trettifire enkeltkolonier ble inokulert i 10 ml BMYZ-glycerolmedium (1% gjærekstrakt, 2% pepton, 1% glycerol, 100 mM kaliumfosfat, pH 6,0, 1,34% gjærsopp-nitrogenbasis, 4x10"<5>% biotin, 100 ug/ml zeocin) i 50 ml Falcon-rør og dyrket i 16 timer ved 30°C. Cellene ble pelletert og gjenoppslemmet i 2 ml BMYZ-metanol-medium (samme som BMYZ-glycerol, men med 0,5% metanol i stedet for glycerol) for bevirkning av ekspresjon fra<y>40X7-promoteren, og dyrket i 40 timer. 4 pulser av 0,5% metanol ble tilført til kulturene i løpet av dette tidsrom (etter 6, 22, 26 og 30 timer). Ved slutten av induksjonsdyrkningen ble tilstedeværelse av mikro-plasminogen i dyrkningssupernatanten vurdert som beskrevet av Lijnen et al. i Eur. J. Biochem. 120:149,1981. Kort angitt ble mikroplasminogenet i rene eller 10 ganger fortynnede supernatanter inkubert med urokinase i 30 minutter for aktivering av mikroplasminogen til mikroplasmin. Den frembrakte mikroplasminaktivitet, bestemt ved dens amidolytiske aktivitet målt med det kromogene substrat S2403 (som leveres av Chromogenix, Antwerpen, Belgia) på forskjellige tidspunkter, ble sammenliknet med aktiviteten av kjente mengder av rensede plasmin- eller mikroplasmin-preparater. Klonen X33-MPLG1 nr. 5, om viste den høyeste mikroplasminaktivitet etter urokinaseaktivering, ble selektert for påfølgende produksjon i stor målestokk. Denne klon ble deponert under forskriftene ifølge Budapest-Traktaten i Belgian Coordinated Collections of Microorganisms (BCCM-MUCL-COLLECTION) 12. desember 2001, under adkomstnummer MUCL 43676.

( c) Fermentering

Fermentering av X33-MPLG1 nr. 5 i 50 liters målestokk ble utført i fire trinn som følger: Celledyrkninger i toliterskolber ble utført i 23 timer ved 30°C i 400 ml YSG+ (6 g/l gjærekstrakt, 5 g/l soyapepton, 20 g/l glycerol) under anvendelse av et inokulum av 0,7 ml (av cellebank ampullenummer glycerol OOC17) og agitasjon ved 270 omdr. pr. min., hvorved man fikk (ved slutten av for-dyrkningstrinnet) en OD600på 15. Fermentering ble deretter utført i en MRP80 fermenteringsinnretning i 30 I basalmedium (26,7 ml/l H3P0485%, 1,05 g/l CaS04.2H20,18,2 g/l K2S04, 14,9 g/l MgS04.7H20, 4,13 g/l KOH, 40 g/l av 100% glycerol og 4,76 ml/l PTM1-saltoppløsning [omfattende 6 g/l CuS04.5H20, 0,08 g/l Nal, 3,36 g/l MnS04.H20, 0,2 g/l NaMo04.2H20, 0,02 g/l borsyre, 0,82 g/l CoCI2.6H20, 20 g/l ZnCI2, 65 g/l FeS04.7H20, 0,2 g/l d-biotin og 5 ml/l H2S04]), under anvendelse av 600 ml inokulum ved 30°C med en luftstrømning på 50 l/min ved atmosfæretrykk, oppløst oksygen (DO) >20% og 200-500 omdr. pr. min. agitasjon, idet pH ble holdt på 5,8 med 12,5% ammoniakk. Etter 24 timer og ved OD6oo50 (slutten av satstrinnet) ble glyceroluttømming tilkjennegitt ved en hurtig økning av oppløst oksygen. Glyceroltilførsel (632 g/l glycerol 100% og 12 ml/l PTM1) økte OD60otil 258 på 24 timer. Metanoltilførsel ble så utført med en økende strøm av opp til 250 ml/t i løpet av 6 timer, som ble opprettholdt i 66 timer under anvendelse av 988 ml/l metanol og 12 ml/l PTM1 for å nå en OD600på 352 ved slutten av dyrkningen. Fermentering av X33-MPLG1 nr. 5 i 350 liters målestokk ga proporsjonalt liknende resultater.

( d) Rensing

Det høstede produkt ble deretter renset i en tretrinnsprosess omfattende ekspandert sjikt-kationebyttingskromatografi, hydrofob kromatografi og affinitetskromatografi som følger:

i) Kationebvtting- ekspandert siikt- kromatografi

Kationebytting-ekspandert sjikt-adsorpsjonskromatografi ble utført med Streamline SP (som leveres av Pharmacia Biotechnology, kat. nr. 17-0993-01/02) pakket i en Streamline 200-kolonne (Pharmacia Biotechnology kat. nr. 18-1100-22) med et sjiktvolum på 5 120 cm<3>, ekspandert og ekvilibrert ved påføring av en oppoverstrøm av 1 M NaCI, 25 mM natriumacetat (CH3COONa.3 H20)-buffer, pH 6,0, for to kolonnevolumer fulgt av kolonnevolumer av 25 mM natriumacetatbuffer, pH 6,0, Fermenteringsbuljongen ble fortynnet on-line (7x) med vann og og ledet oppover gjennom det ekspanderte sjikt med en strømningshastighet på 1000 ml/min. Løst bundet materiale ble vasket ut med oppoverstrømmen av 25 mM natriumacetatbuffer pH 6,0. Kolonneadapteren ble så senket til overflaten av det bunnfelte sjikt i en høyde på 16,3 cm. Strømmen ble reversert og de oppfangede proteinet eluert med 2 kolonnevolumer av 0,5 M NaCI, 25 mM natriumacetatbuffer, pH 6,0. Fast ammoniumsulfat ble tilsatt til den eluerte strømningslinje ("streamline")-fraksjon under oppnåelse av 30% metning (164 g ammoniumsulfat pr. liter eluert strømningslinjefraksjon) og blandingen ble forsiktig omrørt ved 4-8°C i 1 time.

ii) Hydrofob kromatografi

Hydrofob kromatografi ble utført med Hexyl TSK 650C (som leveres av Toso-Haas kat. nr. 19027) pakket i en Vantage 180/500-kolonne (som leveres av Millipore, kat. nr. 87018001) med et pakket volum på 2 700 cm<3>ved 4-8°C. Den eluerte strømningslinjefraksjon ble påsatt på kolonnen med en strømnings-hastighet på 38 l/time. Kolonnen ble deretter vasket med 1,5 kolonnevolumer av 25 mM natriumacetatbuffer, pH 6,0, inneholdende 164 g/l ammoniumsulfat, og eluert fra kolonnen med 7 kolonnevolumer 25 mM natriumacetatbuffer, pH 6,0,

iii) Affinitetskromatografi

Affinitetskromatografi ble utført med Blue Sepharose 6 Fast Flow (som leveres av Pharmacia Biotechnology, kat. nr. 17-0948-02/03) pakket i en Vantage 130/500-kolonne (som leveres av Millipore, kat. nr. 87013001) med et pakket volum på 3 186 cm<3>ved 4-8°C. Den eluerte fraksjon ble påsatt på kolonnen med en strømningshastighet på 20 l/time og vasket med ett kolonnevolum av 25 mM dinatriumhydrogenfosfat (Na2HP04.12 H20)-buffer, pH 7,0. Mikroplasminogen-proteinfraksjonen ble eluert fra kolonnen med 5 kolonnevolumer 0,5 M NaCI, 25 mM dinatriumhydrogenfosfatbuffer, pH 7,0, og holdt frosset ved -20°C. Materialets renhet var over 98% ifølge påvisning ved SDS-gel-elektroforese.

( e) Kvantitativ aktivering til og stabilisering av mikroplasmin i) Kvantitativ aktivering

Aktiveringen av mikroplasminogen til mikroplasmin ble utført ved 23°C i 30 minutter i et molforhold på 0,5% av en stafylokinasevariant SY162 i 0,5 M NaCI, 25 mM dinatriumhydrogenfosfat (Na2HP04.12 H20)-buffer, pH 7,0. SY162 er en stafylokinasevariant med redusert immunogenitet omfattende 12 aminosyre- substitusjoner (K35A, E65Q, K74R, E80A, D82A, T90A, E99D, T101S, E108A, K109A, K130T og K135R) sammenliknet med villtype, som beskrevet i WO 99/40198. Fast ammoniumsulfat ble tilsatt til mikroplasmin i en sluttkonsentrasjon på 1 M (132 g/l), og blandingen ble omrørt ved 4 - 8°C i 15 minutter.

ii) Hydrofob kromatografi

Hydrofob kromatografi ble utført med Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (som leveres av Pharmacia Biotechnology, kat. nr. 17-0965-03/05) pakket i en BPG 100/500-kolonne (som leveres av Pharmacia Biotechnology, kat. nr. 18-1103-01) med et pakket volum på 1 738 cm<3>, ekvilibrert med 4 kolonnevolumer av 25 mM Na2HP04.12 H20-buffer, pH 7,0, inneholdende 0,1 M av stabiliseringsmidlet, traneksaminsyre (som leveres av Bournonville Pharma, Braine-UAIIeud, Belgia), og 1 M (NH4)2S04pH 7,0, ved 4-8°C. Det aktiverte produkt ble påsatt på kolonnen ved en lineærstrømningshastighet på 18 l/time og vasket med 4,5 kolonnevolumer 25 mM Na2HP04.12 H20-buffer, pH 7,0, inneholdende 0,1 M traneksaminsyre og 1 M (NH4)2S04. Mikroplasmin ble eluert fra kolonnen med en lineærstrømnings-hastighet på 6 l/time med 5 kolonnevolumer av 25 mM Na2HP04.12 H20-buffer, pH 7,0, inneholdende 0,1 M traneksaminsyre og 0,7 M (NH4)2S04, og ekvilibrert med fosfatbufret saltoppløsning inneholdende 0,1 M traneksaminsyre. Stafylokinase-variant SY162 ble eluert fra kolonnen med 25 mM Na2HP04.12H20-buffer, pH 7,0, inneholdende 0,1 M traneksaminsyre. Denne prosess fjernet over 99% stafylokinase fra mikroplasmintoppen, ifølge påvisning ved en spesifikk ELISA-analyse.

iii) Konsentrering og diafiltrering ved tangential ultrafiltrering

I dette trinn ble eluatet fra trinn (ii) konsentrert, og bufferen ble byttet ut med citronsyrebufferen med lav pH. Traneksaminsyren fra trinn (ii) ble fjernet i løpet av dette trinn, og mikroplasmin ble stabilisert med citronsyrebufferen med lav pH.

Ultrafiltrering ble utført med 2 Pellicon 2 Biomax-membraner (5 kDa, 2,5 um, som leveres av Millipore, Bedford, Massachusetts, kat. nr. P2B005A25) ved 2-8°C. Membranene ble innsatt i en Pellicon 2 Process-holder tilknyttet til et Microgon Pump Cart-system (som leveres av Microgon, Laguna Hills, California). Membranene ble vasket med renset vann og membranenes helhet testet før drift. Rengjøring ("sanitization") ble utført ved kontinuerlig resirkulering med 0,5 M NaOH i 60 minutter og med 0,1 M NaOH i løpet av 60 minutter. Rengjøringstrinnet dyprenser membranen under eliminering av hvert potensielt spor av protein som er tilbake på membranen før prøven påsettes. Membranene ble deretter skyllet med 5 mM citronsyre, pH 3,1, til permeatet nådde en pH på 3,1. pH i Phenyl Sepharose-eluatet ble justert til 3,1, og proteinet ble konsentrert til 4 mg/ml ved ultrafiltrering. Diafiltrering ble utført i 60 til 90 minutter mot 5 volumer 5 mM citronsyre, pH 3,1. Utbytter (uttrykt i gram) av tre kjøringer utført på et 50 liters fermenteringsapparat er oppsummert i tabell 2.

iv) Sterilfiltrering ( 0, 2 um)

Dette trinn ble utført for å sikre fravær av mikrobiell forurensning.

Mannitol ble tilsatt ved 2-8°C til en konsentrasjon på 1,5 g/g protein og sterilfiltrering utført ved 23°C på et Millipak 100-filter (størrelse 500 cm) (som leveres av Millipore, kat. nr. MPGL10CA3) og skyllet med ca. 500 ml 5 mM citronsyre, pH 3,1, med en peristaltisk pumpe ved en strømningshastighet på 500 ml/minutt. Filtratet ble oppsamlet i en steril og pyrogenfri pose og oppbevart ved -20°C.

EKSEMPEL 3

Fremgangsmåte for fremstilling av et rekombinant, stabilisert miniplasmin

Ca. 15[jg av vektoren pPICZa-KMPLGI ble digerert i en 20 \ i\ reaksjon med Pme I, som lineariserer vektoren i 5' AOX1 -regionen. Det lineære DNA (3 ug) ble anvendt til transformering av kompetente Pichia pastoris X33-celler tilberedt i henhold til manualen som følger med EasySelect P/cft/a-ekspresjonssettet.

Seleksjon av høyekspresjonsstamme ble utført hovedsakelig som følger. Zeocin-resistente transformanter ble selektert på YPDSZ-plater (som definert i eksempel 2). Femte isolerte kolonier ble inokulert i 15 ml BMYZ-glycerolmedium (som definert i eksempel 2) i 50 ml Falcon-rør og dyrket i 16 timer ved 30°C. Cellene ble pelletert og gjenoppslemmet i 1,5 ml BMYZ-metanol-medium (som definert i eksempel 2) for induksjon av ekspresjon fra<y>40X7-promoteren, og dyrket i 40 timer. 3 eller 4 pulser av 0,5 % metanol ble regelmessig tilført til kulturene i dette tidsrom. Ved slutten av induksjonsdyrkningen ble tilstedeværelse av miniplasminogen i dyrkningssupernatanten vurdert som beskrevet av Lijnen et al.

(angitt ovenfor). Kort angitt ble miniplasminogenet i 10 ganger fortynnede supernatanter inkubert med streptokinase i 10 minutter under dannelse av et aktivt kompleks. Den frembrakte miniplasminaktivitet, bestemt med det kromogene substrat S2403 (se eksempel 2) på forskjellige tidspunkter, ble sammenliknet med aktiviteten av kjente mengder av et renset plasminogen-preparat. Ved disse betingelser dannet alle testede kloner miniplasminogen med utbytter som varierte mellom 3 og 15 mg/l. De to kloner X33-KMPLG1 nr. 6 og X33-KMPLG1 nr. 25, som viste den høyeste miniplasminaktivitet, ble selektert for påfølgende produksjon i stor målestokk. Disse to kloner ble deponert under forskriftene ifølge Budapest-Traktaten i Belgian Coordinated Collections of Microorganisms (BCCM-MUCL-COLLECTION) 4. desember 2003 og er blitt gitt adkomstnummer MUCL 45309 (klon X33-KMPLG1 nr. 6) og adkomstnummer MUCL 45308 (klon X33-KMPLG1 nr. 25).

EKSEMPEL 4

Ny fikseringsmetode

Dette forsøk ble utført for opprettelse av en fikseringsteknikk som er pålitelig til undersøkelse av virkningene av medier og forskjellige midler på løsning av bakre glasslegeme (PVD) i normale griseøyne.

Nyisolerte griseøyne anskaffet fra slakterhuset ble enten umiddelbart bearbeidet eller fikk stå ved romtemperatur i opp til 6 timer. Hornhinnen ble fjernet for å gjøre fikseringen lettere. Øynene ble fiksert i Peter's oppløsning (1,25% glutaraldehyd/1 % paraformaldehyd i 0,08 M cacodylatebuffer pH 7,4) ved 0°C i 24 til 36 timer for å stoppe enzymatiske reaksjoner. Øynene ble deretter vasket med 0,1 M cacodylatbuffer pH 7,4 og progressivt dehydratisert i progressivt høyere konsentrasjoner av etanol opp til 100%.

Verken de nylig bearbeidede øyne eller øynene som hadde fått stå i 6 timer, viste noen signifikant forandring i ultrastrukturen av retina, og glasslegemet forble festet til retinaoverflaten. Følgelig tilveiebringer denne metode en ikke-traumatisk fikseringsmetode for øyevev og minimaliserer muligheten for fraskillelse av glasslegemet fra retinaoverflaten. Videre muliggjør denne prosess at hele retinaoverflaten, fra synsnerven til retina-periferien, kan undersøkes.

EKSEMPEL 5

Virkning av mikroplasmin på den vitreoretinale grenseflate i post-mortem-griseøyne

Dette forsøk ble utført for bestemmelse av mikroplasmins evne til å fjerne den bakre glasslegeme-korteks fra den indre begrensende membran på retinaoverflaten.

Mikroplasmin ble anvendt i følgende doser: 0,0625, 0,125, 0,156, 0,25 og 0,390 mg, i et volum på 0,1 ml av den intraokulære irrigeringsoppløsning, BSS PLUS®. pH i disse mikroplasminoppløsninger var i området fra 7,92 for dosen på 0,0625 mg dose til 6,52 for dosen på 0,390 mg.

Mikroplasminoppløsningene beskrevet ovenfor ble injisert separat i glasslegemet i øyne tatt fra nyslaktede griser ved romtemperatur (24°C). Øynene ble fiksert som beskrevet i eksempel 4,15 minutter, 30 minutter, 60 minutter eller 120 minutter etter injeksjon av mikroplasmin. Løsning av bakre glasslegeme (PVD) ble observert 1 time etter behandling med 0,0625 mg mikroplasmin, mens PVD var synlig fra ca. 30 minutter etter injeksjonen for alle doser innbefattende og over 0,125 mg mikroplasmin. Denne løsning var mest synlig rundt 120 minutter etter injeksjon (fig. 4, felt A), i alle deler av retinaoverflaten, bortsett fra nær glasslegeme-basis (sonen som strekker seg fra den perifere retina til ora serrata hvor adhesjonen til glasslegemet er sterk). I tillegg til løsning av bakre glasslegeme (fig. 4, feltene B-E), viste elektronmikroskopi at strukturen av glasslegemet var forandret til å ha mindre fibrillærstruktur til stede. Fibrillær- strukturen var modifisert til en mer amorf, mattglass-konsistens, noe som tyder på flytendegjøring av glasslegemet (fig. 4, felt F).

Lavere doser enn 0,25 mg resulterte ikke i noen okulær eller retinal toksisitet ifølge bestemmelse ved grov-undersøkelse eller histopatologi, innbefattende elektronmikroskopi. Spesielt var det intet tegn til autolyse. Vakuolasjon av celler sees ofte som et tidlig tegn på autolyse, og ved lavere doser enn 0,390 mg ble det ikke observert noen vakuolasjon. Oppfinnerne undersøkte også andre okulærstrukturer ved elektronmikroskopi (fig. 5, feltene A og B). Det ble ikke observert noen strukturelle forandringer ved lavere doser enn 0,390 mg. I noen få øyne behandlet med 0,25 mg mikroplasmin var imidlertid retina-forhøyninger og små antall av inflammatoriske celler sparsomt fordelt på retinaoverflaten. Grov-histologi av øyet som var behandlet med den høyeste dose mikroplasmin (0,390 mg), tydet på at retina-grenseflaten hadde et hvitaktig utseende. Elektronmikroskopi av dette øye viste at det var multiple små forhøyninger i retinaoverflaten, noe som tyder på lokalisert retinaløsning.

Disse forsøk viser at mikroplasmin anvendt i en dose på 0,06-0,2 mg resulterte i konsekvent separasjon av bakre hyaloid uten bevirkning av noen ultrastrukturelle forandringer i retina. Separasjon av bakre hyaloid finnes ikke bare ved synsnerven, men også hele veien til glasslegemebasis. Separasjon av bakre hyaloid etterlater en klar, glatt retinaoverflate på hvilken ingen kollagenfibrer kan gjenkjennes ved anvendelse av høy-elektronmikroskopisk skanning (12 000 X forstørrelse), en forstørrelse som er høy nok til å utelukke muligheten for ikke-påviste fibrer.

EKSEMPEL 6

Løsning av bakre glasslegeme i humane post-mortem-øyne

Dette forsøk ble utført for bestemmelse av om hvorvidt mikroplasmin effektivt kunne bevirke vitreoretinal separasjon i menneskeøyne.

Metoder

( a) Dosering og behandling av post- mortem- øyne fra mennesker

Tjueseks humane øyeepler uten kjent øyepatologi ble anskaffet fra øyebanken i Munchen. Disse øyeepler var fjernet fra 13 donorer hvis alder var i området fra 34 til 69 år, innen 19 timer etter død. Etter høsting av hornhinnen med anvendelse av en trefin på 14 mm diameter ble de 26 øyeepler inkubert i et fuktekammer ved 37°C i 15 minutter. 0,2 ml mikroplasmin ble deretter injisert i glasslegemehulen i tretten øyne. Spesifikt ble 1,25 mg mikroplasmin fortynnet med 4 ml, 2 ml eller 1,5 ml av den intraokulære irrigeringsoppløsning, BSS PLUS®, under oppnåelse av konsentrasjoner på henholdsvis 0,3125 mg/ml, 0,625 mg/ml og 0,9375 mg/ml. Et totalt volum på 0,2 ml av disse oppløsninger ble injisert i glasslegemehulen, noe som resulterte i en sluttdose på henholdsvis 62,5 ug, 125 ug og 188 \ ig mikroplasmin i øyet. De 13 make-øyne, som tjente som kontroller, fikk en injeksjon på 0,2 ml balansert saltoppløsning (BSS PLUS®).

Av de 13 øyne behandlet med mikroplasmin ble 9 øyne behandlet med en intravitreal injeksjon av mikroplasmin alene. En dose på 62,5 ug mikroplasmin (pH 7,4) ble injisert i glasslegemehulen i to øyne; en dose på 125 ug mikroplasmin (pH 7,2) ble injisert i glasslegemehulen i 5 øyne; og en dose på 188 ug mikroplasmin (pH 7,2) ble administrert i 2 øyne. Av de gjenværende 4 øyne ble to behandlet med 62,5 ug mikroplasmin og 0,6 ml svovelheksafluorid (SF6), og to ble behandlet med 125 \ ig mikroplasmin og 0,6 ml svovelheksafluorid (SFe). Den ytterligere behandling med SF6ble utført på grunn av tidligere rapporter om at plasmin bare induserer PVD i kombinasjon med vitrektomi eller gassinjeksjon. Doseringen og behandlingen omtalt ovenfor er oppsummert i tabell 3.

Etter behandling ble alle øyne inkubert ved 37°C i 30 minutter. Etter denne tid ble øyeeplene anbrakt i 4% paraformaldehyd, og 0,1 ml fiksativ (4% paraformaldehyd) ble også injisert i glasslegemehulen for å stoppe enzymatisk virkning i øyet. Øyeeplene som ble behandlet med mikroplasmin og SFq, ble fiksert med bakre pol i opprettstående stilling.

( b) Skanning- og transmisjonselektronmikroskopi

Øyeeplene ble deretter delt i to langs pars plana, og det fremre segment ble kastet. En korneatrefin med diameter 12,5 mm ble langsomt beveget gjennom glasslegemet, og den bakre pol ble stanset ut. Retinaprøver for skanning og transmisjonselektronmikroskopi ble deretter tatt fra den bakre pol under anvendelse av en korneatrefin med diameter 4 mm.

Retinadisker for skanningelektronmikroskopi ble etter-fiksert i 2% osmiumtetroksid (Daltons fiksativ), dehydratisert i etanol, tørket til det kritiske punkt, sprutbelagt i gull og fotografert under anvendelse av et elektron mikroskop av typen ISM-35 CF (JEOL®, Tokyo, Japan).

Prøver for transmisjonselektronmikroskopi ble etter-fiksert i Daltons fiksativ, dehydratisrt og innstøpt i EPON™. Halvtynne snitt ble farget med 2% toluidinblått. Ultratynne snitt ble kontrastfarget med uranylacetat og blycitrat og analysert under anvendelse av et elektronmikroskop av typen Zeiss EM 9 (Zeiss, Jena, Tyskland).

To observatører evaluerte uavhengig av hverandre elektronmikroskopi-bildene. Hver observatør evaluerte graden av vitreoretinal separasjon ved å avgjøre om hvorvidt et kontinuerlig eller diskontinuerlig nettverk av kollagenfibriller dekket den indre begrensende membran (ILM), eller om hvorvidt enkelt- eller spredte kollagenfibriller var tilstede ved ILM, eller om hvorvidt ILM manglet kollagenfibriller (bare ILM).

Resultater

( a) Skanningelektronmikroskopi

Skanningelektronmikroskopi (SEM) av humane post-mortem-øyne injisert med 62,5 ug mikroplasmin viste løsning av bakre glasslegeme som etterlot et diskontinuerlig nettverk av kollagenfibriller som dekket ILM (fig. 6, felt A). SEM av øyne injisert med henholdsvis 125 ug (fig. 6, felt B) og 188 ug (fig. 6, felt C) mikroplasmin viste en ren ILM i overensstemmelse med fullstendig vitreoretinal separasjon. Begge disse høyere doser resulterte i en liknende ultrastruktur av den vitreoretinale grenseflate.

I øyne injisert med 62,5 jag mikroplasmin og SF6ble det observert rester av kortikalt glasslegeme som dekket ILM (fig. 6, felt D). I øyne injisert med 125 ug mikroplasmin fulgt av gasstamponering ble det imidlertid observert fullstendig vitreoretinal separasjon i overensstemmelse med en ren ILM (fig. 6, felt E).

I motsetning til de mikroplasminbehandlede øyne omtalt ovenfor, viste ikke kontrolløyne løsning av bakre glasslegeme ifølge bestemmelse ved SEM (fig. 6, felt F). Disse resultater er oppsummert i tabell 4.

( b) Transmisjonselektronmikroskopi

Den intraretrinale morfologi av alle mikroplasminbehandlede øyne var uforandret sammenliknet med kontrolløyne. Ultrastrukturen av ILM var godt konservert i mikroplasminbehandlede øyne (figur 7, felt A) sammenliknet med kontrolløyet (figur 7, felt B).

Konklusjon

Disse data tyder på at intravitreal injeksjon av mikroplasmin kan indusere spaltning mellom glasslegemkorteksen og den indre begrensende membran i det humane øye uten vitrektomi eller hvilken som helst annet kirurgisk inngripen. 125 ug mikroplasmin spalter den humane vitreoretinale forbindelse innen 30 minutter. Uttrykt som enzymatisk virkning er 125 ug mikroplasmin den ekvivalente dose til 2 E av plasmin (Sigma-Aldrich, Munchen, Tyskland), som ga fullstendig vitreoretinal separasjon i grisekadaverøyne og i humane donorøyne. Disse data viser også at tilføring av en gassboble i glasslegemet i et mikroplasminbehandlet øye ikke påvirket dosen som trengtes for spaltning av den vitreoretinale forbindelse.

EKSEMPEL 7

In V/Vo-analyse av mikroplasmin-indusert løsning av bakre glasslegeme

Formålet med disse forsøk var å bestemme anvendbarheten av mikroplasmin for PVD in vivo.

Metoder

( a) Kattemodellen

Katteretina er blitt grundig undersøkt av anatomer og fysiologer, noe som gjør dette til en anvendelig modell for å fastsette sikkerheten ved farmakologisk indusert PVD. I likhet med retina hos mennesker, er katteretina stavdominert og har en intraretinal sirkulasjon, utenfor fovea. Dette er i motsetning til kaninretina, som ikke har noen intraretinale kar. Den indre retina hos kanin er perfundert av vaskulatur som ligger på dens glasslegemeoverflate, og dette begrenser verdien av eksperimentelle undersøkelser som primært er fokusert på den vitreoretinale grenseflate hos kaninen. I årevis har kattemodellen gitt høykvalitetsdata angående cellulære responser hos retina overfor løsning. Følgelig anvendte vi en kattemodell til undersøkelse av anvendbarheten av mikroplasmin ved utføring av PVD in vivo.

Fem voksne huskatter i alderen mellom 12 og 23 måneder ble bedøvd med intramuskulær injeksjon av 0,5 ml ketamin (Ketaset, Park-Davis, Eastleigh, UK) og 0,3 ml medetomid (Dormitor, Pfizer, UK). De bedøvde katter fikk en intravitreal injeksjon av 14,5 ug eller 25 ug mikroplasmin, mens det andre øye hos disse katter fikk en injeksjon av balansert saltoppløsning (BSS-PLUS®) og tjente som kontroller. Blant de 5 katter som ble anvendt ved denne undersøkelse fikk 3 katter an intravitreal injeksjon av 25 ug mikroplasmin. Én av disse katter ble avlivet én dag etter at de fikk injeksjonen; den andre ble avlivet etter 3 dager og den tredje ble avlivet etter 3 uker. De to gjenværende katter fikk injisert 14,5 ug mikroplasmin. Av disse ble én avlivet etter 3 dager, mens den andre ble avlivet etter 3 uker.

( b) Skanning- og transmisjonselektronmikroskopi

Øyeeplene ble fjernet fra de avlivede katter, fiksert og bearbeidet for elektronmikroskopi som beskrevet for humane post-mortem-øyne i eksempel 6. Elektronmikroskopibilder ble evaluert uavhengig av to observatører. Hver observatør evaluerte graden av vitreoretinal separasjon ved å avgjøre om hvorvidt et kontinuerlig eller diskontinuerlig nettverk av kollagenfibriller dekket ILM, eller om hvorvidt enkelt- eller sparsomme kollagenfibriller var til stede ved ILM, eller om hvorvidt ILM manglet kollagenfibriller.

( c) Konfokal mikroskopi

Øyeprøvene ble skyllet i fosfatbufret saltoppløsning (PBS) og orientert i 5% agarose (Sigma, St Louis MO, USA) tilberedt i PBS. Ett hundre mikrometer tykke snitt ble kuttet under anvendelse av en vibratom (Technical Products International, Polysciences, Warrington, PA, USA) og inkubert i normalt eselserum (1:20; Dianova, Hamburg, Tyskland) i PBS inneholdende 0,5% bovint serumalbumin (BSA; Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA), 0,1% Triton X-100 (Roche

Boehringer, Mannheim, Tyskland) og 0,1% natriumazid (Sigma-Aldrich, Munchen, Tyskland) (denne PBS-oppløsning inneholdende BSA, Triton og azid omtales som PBTA) natten over ved 4°C på en rotator. Etter fjerning av blokkerende serum, ble primære antistoffer tilsatt i seks sett av par: anti-glialt fibrillært surt protein (GFAP; 1:500; DAKO, Hamburg, Tyskland) med anti-kollagen IV (1:50; DAKO); anti-vimentin (1:50; DAKO) med anti-fibronektin (1:400; DAKO); anti-synaptofysin (1:50; DAKO) med anti-neurofilament (1:25; DAKO); anti-laminin (1:25; DAKO) med anti-CD 68 (1:50; DAKO); anti-rød/grønt opsin (1:100; Santa Cruz Biotechnology, USA) med anti-rhodopsin (1:200; Santa Cmz Biotech); anti-blått opsin (1:100; Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA, USA) med anti-rhodopsin (1:200; Santa Cruz Biotech). Spesifisiteten av antistoffene anvendt i dette forsøk er oppregnet i tabell 5.

Etter inkubering natten over ved 4°C på en rotator ble snittene skyllet i PBTA og inkubert igjen natten over ved 4°C med det sekundære antistoff. Sekundære esel-antimus- og esel-antikanin-antistoffer ble anvendt for hver kombinasjon av primære antistoffer, konjugert til Cy2 eller Cy3 (Dianova, Hamburg, Tyskland). Alle sekundære antistoffer ble anvendt i en fortynning på 1:100, og alle antistoffene ble fortynnet i PBTA. Snittene ble deretter skyllet, montert i N-propylgallat i glycerol og undersøkt på et konfokalt laserskanningmikroskop (LSM 510, Zeiss, Tyskland).

Resultater

( a) Skanningelektronmikroskopi

Én dag etter intravitreal injeksjon av 25 fag mikroplasmin dekket spredte kollagenfibriller ILM (figur 8, felt A). Tre dager etter behandling resulterte 25 fag mikroplasmin i fullstendig vitreoretinal separasjon (figur 8, felt B); det var ingen

rester av kollagenfibriller tilbake på den vitreoretinale grenseflate. Øyet som fikk 14,5 fag mikroplasmin, viste sparsomt med kollagenfibriller som dekket ILM 3 dager etter injeksjonen (figur 8, felt C ). 21 dager etter behandling med 14,5 fag (figur 8, felt D) og 25 fag mikroplasmin (figur 8, felt E) ble det observert en ren ILM. Alle make-kontrolløyne hadde et tett nettverk av kollagenfibriller som dekket retina (figur 8, felt F). Disse data er oppsummert i tabell 6.

( b) Lys- og transmisjonselektronmikroskopi

Når det gjelder celleoppbygningen av retina, ble det ikke observert noen forskjell mellom mikroplasminbehandlede øyne (figur 9, felt A) og kontrolløyne (figur 9, felt B). Ultrastrukturen av indre retina og ILM hos mikroplasmin-behandlede øyne (figur 9, feltene C og E) var godt konservert sammenliknet med den indre retina og ILM hos kontrolløyne (figur 9, feltene D og F).

( c) Konfokal lasermikroskop!'

I mikroplasminbehandlede øyne og i kontrolløyne var "end-foot"-delen av Muller-celler tydelig merket med anti-GFAP (figur 10, feltene A og B) og anti-vimentin (figur 10, feltene C og D). Det var ingen utstrakt farging av Muller- celleprosesser ut over det indre kjernelag. Det ble ikke observert noen signifikant merking med anti-kollagen IV og anti-fibronektin (data ikke vist). Dette kan ha forbindelse med artsspesifisitet hos disse antistoffer. ILM var merket med anti-laminin. Få makrofager var til stede både i behandlede øyne og kontrolløyne. Gangliecelleaksonene og dendrittene, de horisontale celler, og det indre og ytre pleksiformlag var tydelig merket med anti-neurofilament og anti-synaptofysin (fig. 10, feltene E og F). Fotoreseptorlaget var merket med anti-neurofilament. Det var ingen forskjell mellom mikroplasminbehandlede øyne (feltene A, C, E) og kontrolløyne (fig.10, feltene B, D og F) på noe tidspunkt av undersøkelsen, med hensyn til hvilke som helst av de anvendte antistoffer.

Diskusjon

For fastsettelse av den spaltende effekt av mikroplasmin på den vitreoretinale grenseflate in vivo administrerte vi to forskjellige doser i glasslegemehulen hos fem voksne katter. Den første dose vi anvendte var 25 fag mikroplasmin, som er én femtedel av dosen som ble funnet tilstrekkelig til å indusere fullstendig PVD i humane post-mortem-øyne. Særlig er 25 ug mikroplasmin ekvivalent med 0,4 E plasmin (Sigma) og klinisk er 0,4 E autologt plasmin blitt påført på glasslegemehulen hos menneskeøyne med makulahuller og diabetisk retinopati. Den andre dose på 14,5 ug mikroplasmin er ekvivalent med en dose på 25 ug mikroplasmin i menneskeøyet, hvis man justerer for det mindre glasslegemevolum av katteøyet (grovt sett 60% av glasslegemvolumet av menneskeøyet).

Tre dager etter en intravitreal påføring av 25 ug mikroplasmin i katteøyet, var det fullstendig vitreoretinal separasjon, mens det én dag etter behandling fremdeles var til stede en del kollagenfibriller på den vitreoretinale grenseflate. Dette tyder på at virkningen av mikroplasmin fortsetter ut over 24 timer og står i sterk kontrast til den hurtige inaktivering av plasmin i blodet med dets naturlige antagonist alfa-2-antiplasmin. Én grunn til langvarigheten av mikroplasmin-aktiviteten kan være at alfa-2-antiplasmin er mettet med et annet substrat eller at mikroplasmin har en annen affinitet for antiplasmin-antagonisten sammenliknet med plasmin. En annen mulig grunn kan være at baner nedstrøms for mikroplasmin (for eksempel aktivering av kollagenaser eller matriks- metalloproteinaser) forblir aktive etter at mikroplasmin er inaktivert av alfa-2-antiplasmin.

Celleoppbygningen av retina hos mikroplasminbehandlede øyne var uforandret sammenliknet med kontrolløyne. Med hensyn til ultrastruktur var det ingen forskjell i retina-anatomien mellom mikroplasminbehandlede øyne og kontrolløyne. ILM og retina var godt konservert i alle prøver. Vi observerte heller ikke noen tegn til en inflammatorisk reaksjon etter mikroplasmininjeksjon. Spesifikt viste ikke elektronmikroskopi og konfokal lasermikroskopi noe tegn til inflammatorisk celleinfiltrasjon i retina.

I kattemodellen gir retinaløsning en signifikant proliferasjon av Muller-celler og en massiv oppregulering av intermdiærfilamentproteiner i sitt cytoplasma, så som surt gliafibrillprotein (GFAP) og vimentin. Denne Muller-celle-respons er alminnelig kjent som gliose og antas å spille en nøkkelrolle i de komplekse celleresponser hos retina overfor løsning. I den normale retina ser Muller-celler ut til å være hvilende og uttrykker meget små mengder av GFAP og vimentin. Imidlertid har selv vitrektomi uten indusering av retinaløsning blitt vist å gi oppregulering av GFAP. Nylig arbeid av vår gruppe viste markert oppregulering av intermediærfilamentproteiner etter forsøkt avskrelling av ILM i katteøyne (ikke-publiserte data). Disse data peker på den høye reaktivitet av Muller-celler overfor hvilken som helst form for kirurgisk traume.

Ved foreliggende undersøkelse observerte vi ikke noen forandring av Muller-celle-reaktivitet etter induksjon av PVD med mikroplasmin. Videre var det ingen forskjell mellom behandlede øyne og kontrolløyne med hensyn til hvilket som helst tilført antistoff. Den hvilende tilstand hos Muller-celler på et hvert tidspunkt i undersøkelsen i forbindelse med den uforandrede ultrastruktur og immunreaktivitet hos retina gir eksperimentelt bevis som peker mot sikkerheten av mikroplasmin når det gjelder indusering av PVD.

Det konkluderes med at disse undersøkelser viser av mikroplasmin er effektivt til indusering av PVD in vivo. Dessuten tyder disse undersøkelser på at mikroplasmin viser seg å være sikkert ved at det ikke ble observert noen retina-forandringer på ultrastrukturnivået.

EKSEMPEL 8

Evaluering av virkningene av mikroplasmin på grise-glasslegeme ved anvendelse av dynamisk lysspredning

Denne undesøkelse ble utført for evaluering av virkningene av mikroplasmin (jaPli) for karakterisering av de biofysiske virkninger av^Pli på friskt, post-mortem grise-glasslegeme in vitro og in situ under anvendelse av den ikke-invasive teknikk for spredning av dynamisk lys (DLS). DLS tilveiebringer informasjon om dynamikken for partikler og makromolekyler i oppløsninger og suspensjoner ved måling av tidssvingningene i intensiteten av det spredte lys.

I et DLS-forsøk sees et konstant fluktuerende broket mønster i det fjerne felt når lys passerer gjennom en samling av små partikler oppslemmet i et fluid (se Chu B., Laser light scattering: Basic priniciples and practice, Academic Press, New York, 1991). Dette brakede mønster er et resultat av interferens i lysbanene, og det fluktuerer etter hvert som partiklene i spredningsmediet utfører tilfeldige bevegelser i en tidsskala på > 1fasek på grunn av kollisjonene mellom seg selv og fluidmolekylene (Brownske bevegelser). I fravær av partikkel-partikkel-interaksjoner (fortynnede dispersjoner) fluktuerer lys som spres fra små partikler, hurtig, mens lys som spres fra store partikler, fluktuerer mer langsomt.

DLS-apparatet som er bygget for våre undersøkelser, tilveiebringer dynamisk informasjon så som diffusjonskoeffisient, størrelse, spredningsintensitet og polydispersitet (mål for heterogenitet). Vanligvis resulterer en økning i partikkelstørrelser (fra nanometer til noen få mikrometer) og en økning i antallet eller tettheten av disse partikler i en økning i intensiteten av spredt lys. Polydispersitet er et mål for antallet atskilte grupper av typer med forskjellig(e) størrelse(r). Ved en DLS-måling kan opptil tre grupper med forskjellig størrelse identifiseres siden de diffunderer i forskjellige tidsmålestokker (små partikler beveges hurtigere og større mer langsomt). En forandring i intensitet av spredt lys og polydispersitet kan derfor komplettere partikkelstørrelsesdataene. Hvis glasslegeme-partikkelstørrelsen reduseres og spredt intensitet øker etter farmakologisk intervensjon, er det sannsynligvis et øket antall molekyltyper med mindre størrelse i oppløsningen, enten på grunn av nedbrytning av større molekyltyper og/eller, som når det gjelder disse forsøk, en innstrømming av 20 nm polystyren-nanokuler som tidligere ble utelukket ved den iboende glasslegeme struktur. Hvis polydispersiteten minker, er den mest sannsynlige forklaring at det er øket homogenitet i populasjonen av molekyltyper i prøven, noe som igjen er et tegn på innstrømming av 20 nm polystyren-nanokuler som tidligere ble utelukket. De mest attraktive trekk ved DLS er at den er ikke-invasiv og kvantitativ, virker effektivt for partikkelstørrelser i området fra noen få nm til noen få^m, fordrer lite prøvevolum og virker rimelig godt for polydisperse eller multippelstørrelses- (opp til 2-3 komponenter) dispersjoner. Dataene presentert her i dokumentet ble analysert under anvendelse av de kumulerende og eksponensielle størrelsesfordelings-rutiner ervervet fra Brookhaven Instruments, NY. Disse skjemaer er gjennomgått av Stock og Ray (Stock R.S. og Ray W. H., J. Polym. Sei. 23:1393, 1985). Som et eksempel viser fig. 11 en typisk DLS-måling basert på en tidsautokorrelasjons-funksjon eller TCF for hele grise-glasslegemet (polydisperst system) og en oppløsning av polystyren-nanokuler med diameter 20 nm (monodisperst system).

Materialer og Metoder

( a) Fabrikasjon av DLS- apparat for glasslegemeundersøkelser

En ny kompakt fiberoptisk DLS-probe (US-patent nr. 5 973 779) ble fabrikert for glasslegemeundersøkelsene beskrevet her i dokumentet. Den omfatter et par 0,25 "pitch" Selfoc GRIN-linser og har en penetrasjonsdybde på~16 mm og en spredningsvinkel på 160°. En fiberoptisk probe omfattende to optiske monomodus-fibrer og to GRIN-linser gir et kompakt og fjernt hjelpemiddel for undersøkelse av de dynamiske egenskaper hos øyets makromolekyler. To optiske monomodusfibrer, som hver befinner seg i en hylse av rustfritt stål, monteres i en separat kasse av rustfritt stål. Man lar det være et luftmellomrom mellom fiberkassen og linsekassen for frembringelse av et nøye fokusert punkt i spredningsvolumet. De to optiske fibrer i kassene blir innrettet og festet i posisjon fri fra aksen med mikrolinsen. De to kasser anbringes inne i en tredje (ytre) kasse laget av rustfritt stål, og den bakre ende av kassen dekkes med en varmekrympings-rørledning. De to frie ender av de optiske fibrer ble terminert med FC/PC-ytterkoplingsstykker for lettvint tilpasssing med laser- og fotodektormodulen.

Forsøksoppsettets hovedkomponenter består av en kompakt fiberoptisk DLS-probe (beskrevet ovenfor), en datamaskin (Gateway PC 500S) inneholdende et digitalt korreleringskort (BI-9000 Brookhaven Instruments NY) og en fast 1 mW laser med bølgelengde 635 nm (OZ Optics, Canada) og en lavine-fotodiode-detektor (Perkin Eimer, Canada). Proben er montert på en optisk montasje sammenknyttet via translasjonsstadier manuelt kontrollert for at man skal ha adkomst til proben og styre den mot et ønsket sted i øyet.

Det tok 20 sekunder å samle opp hver temporal autokorrelasjons-funksjon (TCF) (bortsett fra filtrert kyvette-undersøkelsene, som tok 1 minutt). Forsinkelsestiden på 5 mikrosekunder ble holdt konstant for alle målingene. Før glasslegemeundersøkelsen ble startet, ble instrumentet grundig testet med hensyn til stabilitet, pålitelighet og reproduserbarhet ved anvendelse av vandige dispersjoner av polystyrenstandarder (lateks-nanokuler med diameter 20 nm).

( b) Dynamisk lysspredning av glasslegeme og viskositetsforhold

DLS er i stand til ikke-invasivt å tilveiebringe objektiv kvantifikasjon av den gjennomsnittlige diameter av partikler som er oppslemmet i en oppløsning, i dette tilfelle glasslegemet. For nøyaktig beregning av partikkelstørrelser er det nedvendig enten å kjenne eller anta løsningsmidlets viskositet. Som tidligere nevnt, er det for tiden ikke mulig nøyaktig å måle viskositeten av et ikke-newtonsk fluid, så det må gjøres antakelser. På bakgrunn av at glasslegemet består av omtrent 99% vann, er det rimelig å tilskrive glasslegemet viskositeten for vann. For å teste gyldigheten av denne antakelse ble det utført DLS-målinger for hel glasslegemegel, subfraksjonen av glasslegemet som ikke gikk gjennom en sil ("strainer") (gel), subfraksjonen av glasslegemet som gikk gjennom silen (ikke-gel) og subfraksjonen av glasslegemet som gikk gjennom et 0,22^m Millipore-filter (flytende glasslegeme). Disse undersøkelser ble utført i optiske kyvetter, og diffunderende 20 nm polystyren-nanokuler ble tilsatt som spormateriale med kjent diameter som er meget ensartet. DLS-målinger i helt glasslegeme og alle de forskjellige subfraksjoner ga liknende resultater, noe som tyder på at glasslegemets mikroviskositet faktisk er meget nær mikroviskositeten for rent vann. Mikroviskositeten i glasslegemet angir viskositeten av oppfanget vann hvor hyaluronan-(HA)-molekylene og kollagenbuntene er oppslemmet. Den brownske bevegelse av HA-molekyler er mye hurtigere enn for kollagenbuntene, som har en ganske stor størrelse sammenliknet med HA-molekyler. I DLS-spektraene er HA-molekylinformasjon innlagt med hurtigere (korte) forsinkelsestider og kollagenet ved mer langsomme (lengre) forsinkelsestider. Den utledede infomasjon er vist i partikkelstørrelsesfordelingen(e).

( c) Reagenser

Alle oppløsninger ble tillaget under anvendelse av BSS PLUS® (ALCON Labs, Ft. Worth, TX). Mikroplasmin ble anvendt i en konsentrasjon på 4 mg/ml forrådsoppløsning. Polystyren-nanokuler (Bangs Laboratories, Fisher, IN) med diameter 20 nm og oppslemmet i dobbeltdestillert avionisert vann ble tilsatt i et fastsatt forhold i alle prøver, noe som sikret et jevnt antall nanokuler i alle prøver.

( d) Åpen himmel- modell

Friske, ikke-fikserte griseøyne (n=11) gjennomgikk disseksjon av det fremre segment med et pars planar-innsnitt og skarp disseksjon av linse/iris-diafragma fra det bakre glasslegeme. Disseksjonen ble utført så nær den bakre linsekapsel som mulig, uten at det ble skåret i vevet. Øyene ble holdt i en holder med det bakre

segment nede.

Prøvene ble behandlet med kontroller og^Pli i doser på 0,08, 0,125, 0,4, 0,6 og 0,8 mg ved romtemperatur ved at oppløsningene (300^l) som inneholdt 60^l 20 nm polystyren-nanokule-oppløsning, ble anbrakt på den fremre overflate av det eksponerte glasslegeme. DLS ble utført på et enkelt punkt langs den sentrale optiske akse som befant seg 1, 2 og 4 mm under glasslegeme/luft-grenseflaten. Hvert 15. minutt ble det oppnådd en DLS-avlesning med en varighet på fra 90 til 360 minutter.

( e) Lukket øye- modell

En 30 G nål ble anvendt til injisering av 300^l forsøks- og kontroll-oppløsninger inneholdende polystyren-nanokuler og faPli i doser på 0,0125, 0,025, 0,05, 0,125, 0,25, 0,5, 0,6 og 0,8 mg via et stikk-innsnitt i pars plana i intakte griseøyne (n = 39). Øynene ble inkubert i en holder som holdt hornhinnen på over og det bakre segment på under (idet supinus-posisjonen ble etterliknet) 37°C Celsius i enten 30 eller 120 minutter. Før øyet ble anbrakt i det temperatur-regulerte vannbadet (idet man hele tiden unngikk en hver kontakt mellom prøven og vannet) og hvert 15. minutt deretter, ble øyet rotert rundt den optiske akse i 10- 15 sekunder. Etter inkubering gjennomgikk øynene fjerning av det bakre segment via et pars plana-innsnitt. DLS ble utført på flere punkter (middel = 18,6, s.d. = 11,8) langs den optiske akse og langs en horisontal akse (middel = 30,8 punkter, s.d. = 18,0) i en dybde på 4 mm bak glasslegeme/luft-grenseflaten.

Resultater

( a) Molekylmorfologi hos grise- glasslegeme

DLS-målinger av helt (intakt) glasslegeme tatt ved multiple punkter langs den optiske akse av øyekoppen ("eye cup") (bakre segment dissekert bort) viser meget like funn på alle punkter fra 1,25 mm til 4,75 mm under luft-glasslegeme-grenseflaten. Disse funn er også lik dem som ble oppnådd for utskåret helt glasslegeme anbrakt i en kyvette, i rest-glasslegemet som var tilbake etter siling ("straining"), og i subfraksjonen av glasslegeme som gikk gjennom silen. Alle viste nesten identiske partikkelstørrelsesfordelinger. Gruppen med større partikkel-størrelser (til høyre) har en gjennomsnittlig størrelse på ca. 1000 nm og representerer hovedsakelig kollagen. Partikkelstørrelsesfordelingen av mindre partikler (til venstre) representerer hovedsakelig hyaluronan (HA). Dette partikkelstørrelsesfordelingsmønster var det samme i øyne som fikk polystyren-nanokuleinjeksjon.

( b) Åpen himmel- modell

Fig. 12 viser TCF oppnådd fra et punkt 4 mm under luft/glasslegeme-grenseflaten i 5 forskjellige griseøyne og fra en oppløsning av 20 nm polystyren-nanokuler, for sammenlikning. Det kan sees at med økende doser av^Pli er det en reduksjon i helningen av TCF med forsvinning av den langsomme komponent (større molekyltyper) som til slutt nærmer seg TCF for rene 20 nm nanokuler, dvs. alle molekyltyper med mindre størrelse.

Resultatene av DLS-målinger (n=5) i en dybde på 1 mm etter behandling med forskjellige oppløsninger ved romtemperatur: Placebo og 0,08 var i det vesentlige like hele tiden. Med en dose på 0,125 mg var det omtrent én tredjedel reduksjon i den totale gjennomsnittlige partikkelstørrelse etter 210 minutter. Det var omtrent en 80% reduksjon i gjennomsnittlig partikkelstørrelse etter 60 minutter og nesten fullstendig reduksjon av gjennomsnittlige partikkelstørrelser (bare 20 nm polystyren-nanokuler ble påvist) med 0,6 mg-dosen.

Ved en målingsdybde på 2 mm bak luft/glasslegeme-grenseflaten (n=3) var det omtrent en én tredjedels reduksjon i den totale gjennomsnittlige partikkelstørrelse etter 180 minutter (data ikke vist). Inkubering av prøven ved 37 grader Celsius og opprettholdelse av denne temperatur under DLS-målingene resulterte i en 40% reduksjon i den totale gjennomsnittlige partikkelstørrelse etter behandling med 0,5 mg^Pli i 60 minutter i to separate øyne på to forskjellige tidspunkter. De totale intensitetsmålinger og polydispersitetsmålingene for alle disse prøver underbygget og stadfestet partikkelstørrelsesbestemmelsene.

( c) Lukket øye- modell

Etter en 30 minutters inkubering ved 37 grader Celsius med^Pli-doser i området fra 0,0125 til 0,8 mg var det signifikante forandringer både langs den optiske og horisontale akse. I den optiske akse var det en sju gangers forminskning i den normaliserte gjennomsnittlige partikkelstørrelse ved den høyeste dose på 0,8 mg. Dosen på 0,125 mg ga en forminskning i den normaliserte gjennomsnittlige partikkelstørrelse på ca. én tredjedel etter 30 minutter. Den laveste dose på 0,0125 mg så ikke ut til å ha noen signifikante virkninger. Over hele doseområdet var forminskningen i partikkelstørrelse omvendt proporsjonal med dosen av^Pli (korrelasjonskoeffisient = 0,93). Dataene ble tilpasset til en lineær (rettlinjet) tilpasningsrutine. De normaliserte totalintensitets-og polydispersitets-diagrammer understøtter videre påliteligheten avdisse data. Partikkelstørrelsesfordelingene viser en signifikant forskyvning til venstre i fordelingen av partikkelstørrelser med økende doser av^Pli. Dette tyder på at^Pli er effektivt til signifikant svekking og brytning av forskjellige kjemiske bindinger og lysering av den makromolekylære glasslegemestruktur. Liknende forandringer ble påvist langs den horisontale akse.

Det var også signifikante forandringer etter en 2 timers inkubering ved 37 grader Celsius med^Pli-doser i området fra 0,0125 til 0,6 mg. Ved den høyeste dose var det en 87,5% reduksjon i den normaliserte gjennomsnittlige partikkelstørrelse målt langs den optiske akse. Normaliserte spredningsintensitets-og normaliserte polydispersitets-diagrammer stadfester disse data. Partikkel- størrelsefordelingene viste en forskyvning til venstre med økende doser, med oppnåelse av signifikante forhold med de høyere doser. DLS-målinger langs en horisontal akse ved en dybde på 4 mm viste liknende resultater, med omkring en 85% forminskning i den normaliserte gjennomsnittlige partikkelstørrelse og understøttende funn angående normaliserte spredningsintensitets- og polydispersitetsdiagrammer.

Sammenlikning av resultatene etter 30 minutter og etter 2 timer viser en mer utstrakt grad av partikkelstørrelsesnedbrytning med lengre inkubering. For en dose på for eksempel 0,6 mg var den normaliserte gjennomsnittlige partikkeldiameter ca. 20% i 30 minutters inkuberingen og ca. 10% i 2 timers inkuberingen. Det var således en omtrent to ganger større reduksjon i partikkelstørrelse med lengre inkubering.

Den primære parameter som kommer fra DLS-målingene, er diffusjonskoeffisienten. En forandring i diffusjonskoeffisient viser en forandring i glasslegemets makromolekylstruktur som svar på^Pli-behandling. Med økendefaPli-doser er det en økning i glasslegemets diffusjonskoeffisient. Over området av nPli-doser var diffusjonskoeffisientene direkte proporsjonale med^Pli-dose. Med økende^Pli-dose var det således minkende diffusjonskoeffisienter, og i likhet med partikkelstørrelsesbestemmelser var denne korrelasjon statistisk signifikant (r = 0,93).

Diskusjon

I dette forsøk ble DLS anvendt til ikke-invasiv bedømmelse av molekyl-struktur i et glasslegeme ved måling av partikkelstørrelser, spredningsintensitet og polydispersitet. Resultatene viste at det er liknende DLS-profiler på forskjellige steder i hele glasslegemet. De mest uttalte virkninger av mikroplasmin var på hele glasslegemet inkubert ved 37 grader C i 30 minutter, spesielt i høyere doser. Det var en vesentlig forminskning i normalisert gjennomsnittlig partikkelstørrelse, og en statistisk signifikant doseresponsforbindelse ble etablert. Dette tyder på at^Pli vil være anvendelig som et supplement til vitreo-retinal kirurgi, siden en 30 minutters tidsramme er rimelig for en medikamenteffekt som ikke innvirker på någjeldende kirurgisk praksis. I forbindelse med dataene i tidligere eksempler som tyder på at H-Pli induserer dehiscens på den vitreoretinale grenseflate, ser det ut til at dette medikament oppnår de to ønskede komponenter for farmakologisk vitreolyse: løsning av bakre glasslegeme og en nedbrytning i glasslegeme-makromolekyler med påfølgende økninger i glasslegeme-diffusjonskoeffisienter og til slutt flytendegjøring.

EKSEMPEL 9

Mikroplasmin som supplement til kirurgisk vitrektomi

En pasient med vitroretinal sykdom hvor kirurgisk vitrektomi er påkrevd, behandles med en injeksjon av mikroplasmin før den kirurgiske vitrektomiprosess. Pasienten må få en fullstendig oftalmisk undersøkelse for påvisning av en basislinje for okulær sunnhet. Den oftalmiske undersøkelse innbefatter indirekte oftalmoskopi, spaltelys-biomikroskopi, perifer retinal undersøkelse, målinger av intraokulært trykk, synsskarphets- (uten støtte og best korrigert)-symptomatologi, øyebunnsfotografi, fluorescein-angiografi, elektroretinografi og A-skanning-målinger.

Enten opp til 30 minutter eller opp til 1 dag før starten av vitrektomi injiseres øyet som skal behandles, med 0,025-0,125 mg mikroplasmin i 0,2 ml av den intraokulære irrigasjonsoppløsning, BSS PLUS® eller annen irrigasjonsoppløsning for befordring av flytendegjøring av glasslegemet og/eller indusering av løsning av bakre glasslegeme.

Ved befordring av flytendegjøring av glasslegemet og/eller løsning av bakre glasslegeme kan den kirurgiske vitrektomi utføres hurtigere og lettere med mindre iatrogent retinalt traume og risiko for kirurgiske komplikasjoner. At det muliggjøres mer fullstendig fjerning av glasslegemet kan også redusere risikoen for postoperative komplikasjoner så som proliferativ vitreoretinopati.

EKSEMPEL 10

Behandling av diabetisk retinopati med mikroplasmin

I dette eksempel behandles en diabetespasient som viser diabetisk retinopati, med intravitral injeksjon av mikroplasmin.

Diabetespasienten skal få en fullstendig oftalmisk undersøkelse for opprettelse av en basislinje for okulær sunnhet. Den oftalmiske undersøkelse innbefatter indirekte oftalmoskopi, spaltelys-biomikroskopi, perifer retina-undersøkelse, målinger av intraokulæt trykk, synsskarphets- (uten støtte og best korrigert)-symptomatologi, øyebunnsfotografi, fluorescein-angiografi, elektroretinografi og A-skanning-målinger.

Etter den foreløpige undersøkelse gis det en intravitreal injeksjon av mikroplasmin til pasientens rammede øye. Hvis begge øyne er rammet, kan de behandles atskilt. Øyet som skal behandles, injiseres med en dose i området fra 0,005 mg til 0,125 mg mikroplasmin i 0,05-0,2 ml BSS PLUS® eller annen irrigasjonsoppløsning intravitrealt for befordring av flytendegjøring av glasslegemet.

Etter behandling skal pasientenes øyne undersøkes periodisk. Omfanget av diabetisk retinopati som pasienten viser, blir kontinuerlig overvåket ved periodiske retina-undersøkelser og fluorescein-angiogrammer for overvåking av omfanget av venøs korrugering, IRMA, retina-iskemi, traksjons-retinaløsning, glasslegeme-blødning, behov for vitrektomi eller andre komplikasjoner ved diabetisk retinopati.

EKSEMPEL 11

Effekt av mikroplasmin sammenliknet med plasmin på hastigheten av

fluoresceindiffusjon i post mortem-griseøyne

Mikroplasmin er omtrent én tredjedel av molekylvekten av plasmin i hel lengde. På grunn av mikroplasminets mindre størrelse er det ventet å diffundere hurtigere i glasslegemet enn plasmin (J. Xu et al., angitt ovenfor). Hurtigere diffusjon vil ventes å føre til en hurtigere farmakologisk effekt. Foreliggende undersøkelse ble utført for å bekrefte både at mikroplasmin diffunderer hurtigere enn plasmin og at mikroplasmin er i stand til å forandre glasslegeme-gelen.

Metoder

Nyisolerte griseøyne anskaffet fra slakteriet ble anvendt. I det første forsøk ble ett øye injisert med mikroplasmin (0,125 mg), og det andre øye med bærerkontroll (BSS-PLUS®). Etter at begge øyne var holdt ved romtemperatur i 2 timer, ble begge øyne deretter injisert med fluorescein og inkubert i ytterligere 30 minutter. Det ble tatt fotografier etter 0, 10, 20, og 30 minutter.

I det andre forsøk ble øynene injisert med mikroplasmin 0,125 mg (N=2) eller plasmin 1E (levert av Sigma, N=2) og inkubert ved 37 grader Celcius i 2 timer. Alle 4 øyne ble deretter injisert med fluorescein og inkubert i ytterligere 30 minutter, og fotografier ble tatt etter 0, 10, 20 og 30 minutter.

Resultater

I det første forsøk ble det i kontrolløyet praktisk talt ikke observert noen fluoresceindiffusjon i glasslegemet (data ikke vist). I det mikroplasminbehandlede øye ble det imidlertid observert klar fluoresceindiffusjon (data ikke vist).

I det andre forsøk hadde mikroplasminbehandlede øyne en fluoresceindiffusjon på henholdsvis 14 og 16% i løpet av 20 minutter (fig. 13), mens det plasminbehandlede øye hadde en fluoresceindiffusjon på under 10% (fig. 14).

Diskusjon

Mikroplasmin viste at fluoresceindiffusjonen gikk tydelig lettere sammenliknet med bærerkontroll. Videre var denne fluoresceindiffusjon, som forutsett basert på molekylvekten av mikroplasmin, av større omfang enn den som ble observert med administrering av plasmin i hel lengde. Disse funn understøtter den teoretiske forutsigelse om at mikroplasmin diffunderer hurtigere enn plasmin. Disse funn kan ha klinisk fordel ved at det muliggjøres hurtigere farmakologisk effekt.

Claims (1)

1. Anvendelse av en sammensetning som omfatter et trunkert plasminprotein som omfatter en katalytisk domene av plasmin (TPCD) for fremstilling av et medikament for behandling eller forebygging av en forstyrrelse, eller en komplikasjon ved en forstyrrelse, i et øye til et individ, hvor forstyrrelsen i øyet er valgt fra gruppen bestående av retinaløsning, retinarifter, glasslegemeblødning, diabetisk glasslegemeblødning, proliferativ diabetisk retinopati, ikke-proliferativ diabetisk retinopati, alderstilknyttet makula-degenerasjon, makulahull, vitreomakulær traksjon, muskularrynker, muskula-eksudater, cytoid makulaødem, fibrinavsetning, retinal veneokklusjon, retinal arterieokklusjon, subretinalblødning, amblyopi, endoftalmitt, prematur retinopati, glaukom, retinis pigmentosa og hvilken som helst kombinasjon av disse.

2. Anvendelse ifølge krav 1, hvor TPCD har en molekylvekt på mindre enn 40.000 dalton, mellom 20.000 og 30.000 dalton, 26.500 dalton i redusert form eller

29.000 dalton in uredusert form, eller mindre enn 20.000 dalton.

3. Anvendelse ifølge krav 1, hvor nevnte TPCD er valgt fra gruppen bestående av miniplasmin, stabilisert miniplasmin, rekombinant miniplasmin, stabilisert, rekombinant miniplasmin, mikroplasmin, stabilisert mikroplasmin, rekombinant mikroplasmin, stabilisert, rekombinant mikroplasmin og en variant av mikroplasmin.

4. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 3, hvor behandlingen eller forebyggingen resulterer i en av følgende: reduserting av viskositeten til glasslegeme, flytendegjøring av glasslegeme, indusering av oppløsning av bakre glasslegeme, fjerning eller redusering av hemorragisk blod fra glasslegeme og/eller vandig tumor, fjerning eller redusering av intraokulære fremmede substanser fra glasslegeme og/eller vandig tumor, økning av diffusjonen av et middel eller en sammensetning administrert til glasslegeme og/eller vandig humor, og redusering av ekstraretinal neovaskulisering, eller en hvilken som helst kombinasjon derav.

5. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4, hvor sammensetning er en flytende løsning.

6. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 5, hvor individet er et menneske.

7. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 6, hvor behandlingen eller forebyggingen blir utført i fravær av vitrektomi, eller hvor behandlingen eller forebyggingen blir utført som et tillegg til vitrektomi.

8. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7, hvor sammensetningen omfatter en effektiv mengde av TPCD som skal bli administrert per øye i et område på 0,005 mg til 0,2 mg.

9. Anvendelse av en sammensetning som omfatter minst to TPCD for fremstilling av et medikament for behandling eller forebygging av en forstyrrelse, eller en komplikasjon av en forstyrrelse, i øyet til et individ, hvor øyeforstyrrelsen er valgt fra gruppen bestående av retinaløsning, retinarifter, glasslegemeblødning, diabetisk glasslegemeblødning, proliferativ diabetisk retinopati, ikke-proliferativ diabetisk retinopati, alderstilknyttet makula-degenerasjon, makulahull, vitreomakulær traksjon, muskularrynker, muskula-eksudater, cytoid makulaødem, fibrinavsetning, retinal veneokklusjon, retinal arterieokklusjon, subretinalblødning, amblyopi, endoftalmitt, prematur retinopati, glaukom, retinis pigmentosa og hvilken som helst kombinasjon av disse.

10. Anvendelse ifølge krav 9, hvor de i det minste to TPCD er valgt fra gruppen bestående av miniplasmin, rekombinant miniplasmin, stabilisert miniplasmin, stabilisert, rekombinant miniplasmin, varianter av miniplasmin, mikroplasmin, rekombinant mikroplasmin, stabilisert mikroplasmin, stabilisert, rekombinant mikroplasmin, varianter av mikroplasmin og hvilke som helst kombinasjoner derav.

11. Sett for anvendelse i en fremgangsmåte for behandling eller forebygging av en forstyrrelse, eller en komplikasjon av en forstyrrelse, i øyet til et individ, idet fremgangsmåten omfatter kontakting av glasslegeme og/eller en vandig humor med en første sammensetning og en andre sammensetning hvor øyeforstyrrelsen er valgt fra gruppen bestående av retinaløsning, retinarifter, glasslegemeblødning, diabetisk glasslegemeblødning, proliferativ diabetisk retinopati, ikke-proliferativ diabetisk retinopati, alderstilknyttet makula-degenerasjon, makulahull, vitreomakulær traksjon, muskularrynker, muskula-eksudater, cytoid makulaødem, fibrinavsetning, retinal veneokklusjon, retinal arterieokklusjon, subretinalblødning, amblyopi, endoftalmitt, prematur retinopati, glaukom, retinis pigmentosa og hvilken som helst kombinasjon av disse, hvor nevnte sett omfatter en første sammensetning omfattende minst en TPCD og en andre sammensetning omfattende minst en TPCD.

12. Sett for anvendelse ifølge krav 11, hvor den første sammensetningen omfatter minst en TPCD og den andre sammensetningen omfatter minst en TPCD er valgt fra gruppen bestående av miniplasmin, rekombinant miniplasmin, stabilisert miniplasmin, stabilisert, rekombinant miniplasmin, varianter av miniplasmin, mikroplasmin, rekombinant mikroplasmin, stabilisert mikroplasmin, stabilisert, rekombinant mikroplasmin, varianter av mikroplasmin og hvilke som helst kombinasjoner derav.

13. Sett for anvendelse ifølge krav 11 eller 12, hvor den første sammensetningen omfatter minst en TPCD og den andre sammensetningen omfatter minst en TPCD blir administrert til individet ved vesentlig samme tidspunkt eller ved forskjellige tidspunkter.

14. Anvendelse av en effektiv mengde av sammensetning som omfatter minst en TPCD for fremstilling av et medikament for anvendelse ved utførelse av en vitrektomi i et individ.

15. Anvendelse ifølge krav 14, hvor nevnte medikament blir anvendt før vitrektomi, eller blir anvendt ved samme tidspunktet som vitrektomi.

16. Anvendelse ifølge krav 14 eller 15, hvor TPCD er valgt fra gruppen bestående av minplasmin, rekombinant miniplasmin, stabilisert miniplasmin, stabilisert, rekombinant miniplasmin, varianter av miniplasmin, mikroplasmin, rekombinant mikroplasmin, stabilisert mikroplasmin, stabilisert, rekombinant mikroplasmin, varianter av mikroplasmin og hvilke som helst av kombinasjonene derav.

17. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 14 til 16, hvor individet er et menneske.

18. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 14 til 17, hvor vitrektomi blir utført for å behandle eller forebygge en forstyrrelse, eller en komplikasjon av en forstyrrelse i et øye, hvor forstyrrelsen av øyet er valgt fra gruppen bestående av retinaløsning, retinarifter, glasslegemeblødning, diabetisk glasslegemeblødning, proliferativ diabetisk retinopati, ikke-proliferativ diabetisk retinopati, alderstilknyttet makula-degenerasjon, makulahull, vitreomakulær traksjon, muskularrynker, muskula-eksudater, cytoid makulaødem, fibrinavsetning, retinal veneokklusjon, retinal arterieokklusjon, subretinalblødning, amblyopi, endoftalmitt, prematur retinopati, glaukom, retinis pigmentosa og hvilken som helst kombinasjon av disse.

19. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 14 til 18, hvor vitrektomi blir utført for en grunn som er valgt fra gruppen bestående av redusering av viskositeten til glasslegeme, flytendegjøring av glasslegeme, indusering av oppløsning av bakre glasslegeme, fjerning eller redusering av hemorragisk blod fra glasslegeme og/eller vandig tumor, fjerning eller redusering av intraokulære fremmede substanser fra glasslegeme og/eller vandig tumor, økning av diffusjonen av et middel eller en sammensetning administrert til glasslegeme og/eller vandig humor, og redusering av ekstraretinal neovaskulisering, eller en hvilken som helst kombinasjon derav.

20. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 14 til 19, hvor medikamentet er flytende løsning.

21. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 14 til 20, hvor en effektiv mengde av TPCD skal bli administrert per øye i området på 0,05 mg til 0,2 mg.

22. Sammensetning omfattende et trunkert plasminprotein omfattende en katalytisk domene av plasmin (TPCD) for anvendelse ved behandling eller forebygging av en forstyrrelse, eller en komplikasjon av en forstyrrelse, av et øye i et individ, hvor forstyrrelsen av øyet er valgt fra gruppen bestående av retinaløsning, retinarifter, glasslegemeblødning, diabetisk glasslegemeblødning, proliferativ diabetisk retinopati, ikke-proliferativ diabetisk retinopati, alderstilknyttet makula-degenerasjon, makulahull, vitreomakulær traksjon, muskularrynker, muskula-eksudater, cytoid makulaødem, fibrinavsetning, retinal veneokklusjon, retinal arterieokklusjon, subretinalblødning, amblyopi, endoftalmitt, prematur retinopati, glaukom, retinis pigmentosa og hvilken som helst kombinasjon av disse.

23. Sammensetning for anvendelse ifølge krav 22, hvor TPCD har en molekylvekt på mindre enn 40.000 dalton, mellom 20.000 og 30.000 dalton, 26.500 dalton i redusert form eller 29.000 dalton i ikke-redusert form, eller mindre enn 20.000 dalton.

24. Sammensetning for anvendelse ifølge krav 22, hvor nevnte TPCD er valgt fra gruppen bestående av miniplasmin, stabilisert miniplasmin, rekombinant miniplasmin, stabilisert, rekombinant miniplasmin, mikroplasmin, stabilisert mikroplasmin, rekombinant mikroplasmin, stabilisert, rekombinant mikroplasmin og en variant av mikroplasmin.

25. Sammensetning for anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 22 til 24 som videre omfatter minst et andre middel.

26. Sammensetning for anvendelse ifølge krav 25, hvor det andre middelet er valgt fra gruppen bestående av hyaluronidase, dispase, kondroitinase, kollagenase, RGD inneholdende peptider, anti-integrin antistoff, urea, hydroksyurea, urea, tiourea, P2Y reseptor antagonister, angiogene inhibitorer, VEGF inhibitorer, P1GF1 inhibitorer og hvilke som helst kombinasjoner derav.

27. Sammensetning for anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 22 til 26, hvor behandlingen eller forebyggingen resulterer i en av følgende: reduserting av viskositeten til glasslegeme, flytendegjøring av glasslegeme, indusering av oppløsning av bakre glasslegeme, fjerning eller redusering av hemorragisk blod fra glasslegeme og/eller vandig tumor, fjerning eller redusering av intraokulære fremmede substanser fra glasslegeme og/eller vandig tumor, økning av diffusjonen av et middel eller en sammensetning administrert til glasslegeme og/eller vandig humor, og redusering av ekstraretinal neovaskulisering, eller en hvilken som helst kombinasjon derav.

28. Sammensetning for anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 22 til 27, hvor sammensetningen er en flytende løsning.

29. Sammensetning for anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 22 til 28, hvor individet er et menneske.

30. Sammensetning for anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 22 til 29, hvor behandlingen eller forebyggingen blir utført i fravær av vitrektomi, eller hvor behandlingen eller forebyggingen blir utført som en medhjelper til vitrektomi.

31. Sammensetning for anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 22 til 30, hvor sammensetningen omfatter en effektiv mengde TPCD som skal bli administrert per øye i området på 0,005 mg til 0,2 mg.

32. Sammensetning omfattende minst to TPCD for anvendelse ved behandling eller forebygging av en forstyrrelse, eller en komplikasjon ved en forstyrrelse, i øyet til et individ, hvor øyeforstyrrelsen er valgt fra gruppen bestående av retinaløsning, retinarifter, glasslegemeblødning, diabetisk glasslegemeblødning, proliferativ diabetisk retinopati, ikke-proliferativ diabetisk retinopati, alderstilknyttet makula-degenerasjon, makulahull, vitreomakulær traksjon, muskularrynker, muskula-eksudater, cytoid makulaødem, fibrinavsetning, retinal veneokklusjon, retinal arterieokklusjon, subretinalblødning, amblyopi, endoftalmitt, prematur retinopati, glaukom, retinis pigmentosa og hvilken som helst kombinasjon av disse.

33. Sammensetning for anvendelse ifølge krav 32, hvor minst to TPCD er valgt fra gruppen bestående av miniplasmin, rekombinant miniplasmin, stabilisert miniplasmin, stabilisert, rekombinant miniplasmin, varianter av miniplasmin, mikroplasmin, rekombinant miniplasmin, stabilisert mikroplasmin, stabilisert, rekombinant mikroplasmin, varianter av mikroplasmin og hvilke som helst kombinasjoner derav.

34. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 8 eller 14 til 21, sett for anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 11 til 13, eller sammensetning for anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 22 til 33 hvor nevnte TPCD er humant mikroplasmin.

35. Anvendelse ifølge krav 9 eller 10 eller sammensetningen for anvendelse ifølge kravene 32 eller 33, hvor en av nevnte minst to TPCD er human mikroplasmin.

36. Anvendelse, sett for anvendelse eller sammensetning for anvendelse ifølge krav 34 eller 35, hvor aminosyresekvensen til nevnte humane mikroplasmin består av aminosyrene 543 til 791 i SEKV ID NR:10 hvor peptidbindingen mellom Arg561 og Val562 blir spaltet av en plasminogenaktivator.

37. Anvendelse, sett for anvendelse eller sammensetning for anvendelse ifølge krav 34 eller 35, hvor nevnte humane mikroplasmin er et aktivert mikroplasminogen hvor nevnte mikroplasminogen blir kodet av SEKV ID NR:3.

38. Anvendelse, sett for anvendelse eller sammesetning for anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 34 til 37, hvor nevnte humane mikroplasmin blir produsert ved rekombinant ekspresjon i en metylotrof gjær.

39. Anvendelse, sett for anvendelse eller sammensetning for anvendelse ifølge krav 38, hvor nevnte metylotrofe gjær er Pichia pastoris.